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夏枯草消瘤合剂由中药夏枯草、牡蛎、生地黄、莪术、苍术、白术组成，是中医肿瘤学专家钱伯文教授的经验方。方中诸药配伍，以达化痰软坚，活血化瘀，补养气血的功效。其临床实验研究已证实，该药配合一线化疗方案治疗中晚期非小细胞肺癌患者，有助于提高患者的生存治疗和减少化疗所产生的毒副作用[1]。由该方制成的合剂在我院临床使用多年，前期研究对于组方中化学成分的研究仍限于迷迭香酸、咖啡酸的稳定性研究[2]。尽管方中一些单味药的化学成分已有报道[3-18]，但是整个复方制剂的化学成分未见报道。由于组分的复杂性，复方的成分分析比单味药更具有挑战性，明确夏枯草消瘤方色谱图中各个色谱峰归属对于该复方的质量控制及体内深入研究具有重要意义。
高效液相-高分辨飞行时间质谱（HPLC-TOF/MS）串联技术对于中药复杂体系中化学成分分析和鉴定非常有效。其灵敏度高、操作简便、耗时短，可以在短时间获得化合物准确的相对分子质量，通过与所建立的已知化学成分数据库比对，可以快速的对被测成分进行分析鉴别[19-20]。因此，本文采用HPLC-TOF/MS技术，首次对夏枯草消瘤方中化学成分进行鉴别，并且对各成分进行药材归属，以进一步阐明夏枯草消瘤方的化学物质基础。
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Agilent 1100系列高效液相色谱仪（美国安捷伦公司），配有在线脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱和二级管阵列检测器；Agilent 6220高分辨飞行时间质谱仪（美国安捷伦公司），配有标准电子喷雾离子源（ESI）；分析软件为 MassHunter 数据采集在线工作站和Qualiative Analysis 离线分析软件。
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咖啡酸（批号：110885-200102，纯度>98.5%）、迷迭香酸（批号：111871-201505，纯度>98.5%）对照品，均购自中国食品药品检定研究院，甲醇和甲酸为色谱纯（Fisher，USA），其余试剂均为分析纯，水为纯水。
夏枯草、生地黄、莪术、麸炒苍术、麸炒莪术、牡蛎、煅牡蛎均由上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院中药房提供（见表1）。药材及饮片均经第二军医大学药学院生药学教研室黄宝康教授鉴定。
表 1 药材信息
药材名称 批号 药材来源 夏枯草 180207 上海康桥药业有限公司 生地黄 180302 上海同济堂药业有限公司 莪术 180306 上海虹桥中药饮片有限公司 麸炒白术 2018031001 上海上药华宇药业有限公司 麸炒苍术 180407 上海虹桥中药饮片有限公司 牡蛎 2017102006 上海上药华宇药业有限公司 煅牡蛎 180301 上海同济堂药业有限公司 -
分别精密称取咖啡酸、迷迭香酸对照品3.22、5.68 mg置10 ml量瓶中，加甲醇稀释定容，配成浓度分别为322、568 μg/ml的母液，精密吸取母液 1 ml 置于 10 ml 量瓶，加甲醇定容后，即得对照品溶液。
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精密称取夏枯草4.2 g、牡蛎8.4 g、煅牡蛎8.4 g、地黄4.2 g、莪术4.2 g、白术（麸炒）2.1 g、苍术（麸炒）2.1 g，以上七味，充分润湿，分别加8倍量与4倍量水煎煮两次，每次煮沸后于85 ℃保温20 min，煎液滤过，合并滤液，滤液浓缩至相对密度1.10以上（80 ℃），离心，取上清液；精密吸取夏枯草消瘤方溶液上清液5 ml，置于50 ml容量瓶中，加甲醇定溶，摇匀，经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得夏枯草消瘤方样品溶液。
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色谱柱：ACE C18（3.0 mm×150 mm），流动相A相为甲醇，B相为水（含0.1%甲酸），梯度洗脱：0~5 min：5%A，5~10 min：5%~15%A，10~30 min：15%~45%A，30~40 min：45%~70%B，40~50 min：70%~90%B；进样量2 μl，流速为0.4 ml/min；柱温为25 ℃；运行时间为50 min。
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采用ESI离子源，正、负离子模式均进行检测，雾化器为高纯氮气，具体参数如下：正离子模式：毛细管电压3500 V，干燥器温度350 ℃，干燥器流速10L/min，雾化器压力40 psig，碎片电压160 V；参比离子m/z121.9856，1033.9881；扫描范围m/z100-1200。测定样品之前，使用调谐液校准质量轴，以保证质量精度误差小于1×10-6。
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根据国内外专业数据库中科院化学专业数据库、Pubmed、Chemspider等，以及国内外相关研究文献，收集了夏枯草消瘤合剂方中六味中药化学成分名称及分子式共760个。采用安捷伦“formula-database generator”软件（含各元素精确质量数），根据各成分碳、氢、氧的个数，计算精确相对分子质量、M+H和M-H准分子离子峰相对分子质量的相应的化学成分数据库。
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夏枯草消瘤方样品溶液的总离子流图见图1。其中图1A为正离子160 V模式，图1B为负离子160 V模式，图1C为负离子260 V模式。
图 1 夏枯草消瘤方 TOF/MS总离子图
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实验中利用已有的2个对照品，在负离子模式、碎片电压160 V条件下，无偏差的鉴别出咖啡酸、迷迭香酸，对照品总离子流图见图2。
图 2 对照品 TOF/MS总离子流图
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正离子模式下以图1中2号峰疣孢酚为例，说明夏枯草消瘤方色谱峰的鉴别过程。保留时间为24.032 min，色谱图中的准分子离子为267.1591。利用Qualiative Analysis数据分析软件的计算功能计算精确质量数的可能元素组成（5×10−6），并比对数据库中已知化合物的质荷比，初步确定元素组成为C15H22O4，为疣孢酚的(M+H)+。计算该准分子离子的核素分布情况，从图3A可以看出同位素分布的理论值（方框所示）与实际值（方框内峰所示）吻合良好，确定此峰为疣孢酚。同理可得负离子模式下图1中18号峰，地黄苷D的解析过程（图3B）。
图 3 夏枯草消瘤方同位素分布图
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根据飞行时间质谱测得精确的相对分子质量，比对所建立的数据库，应用Qualiative Analysis 质谱分析软件计算分子组成，将理论值与实测值进行比对，结合上述对照品鉴别结果及相关文献报道，对夏枯草消瘤合剂中药材在正、负离子模式下所得色谱图中色谱峰进行分析，初步鉴别出37个化学成分，结果见表2、表3。对于部分未见区分的同分异构体，后期可考虑调节碎片电压获得化合物的裂解规律进行区分。
表 2 夏枯草消瘤合剂中化学成分的正离子模式鉴别结果
序号 相对时间（min） 化合物 分子式 M+H 实验值（m/z） 理论值（m/z） 误差（×10–6） 来源 1 19.174 7-羟基异喹啉 C9H7NO [M+H]+ 146.060 8 146.052 8 –0.72 地黄. 2 24.032 Verrucarol C15H22O4 [M+H]+ 267.159 1 267.151 8 0.06 莪术 3 28.388 白术内酯Ⅱ C15H20O2 [M+H]+ 233.153 3 233.146 3 1.49 白术. 41) 30.653 芦丁 C27H30O16 [M+H]+ 611.160 8 611.153 4 –0.27 夏枯草 51) 30.703 槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷 C21H20O12 [M+H]+ 465.102 9 465.095 5 –0.25 夏枯草 61) 33.713 伞形酮 C9 H6 O3 [M+H]+ 163.038 7 163.031 7 1.54 夏枯草 7 38.337 白术内酯Ⅲ C15H20O3 [M+H]+ 249.148 2 249.141 2 2.05 白术 81) 41.969 十四烷基柠檬酸 C20H36O7 [M+H]+ 389.252 9 389.246 1 1.31 白术 注：1)表示正负模式下测得 表 3 夏枯草消瘤合剂中化学成分的负离子模式鉴别结果
序号 相对时间（min） 化合物 分子式 M+H 实验值（m/z） 理论值（m/z） 误差（×10–6） 来源 91) 1.999 精氨酸 C6H14N4O2 (M-H)– 173.104 3 173.111 7 0.56 地黄 101) 2.109 葡萄糖酸 C6H12O7 (M-H)– 195.051 1 195.058 3 –0.23 夏枯草 11 2.789 苹果酸 C4H6O5 (M-H)– 133.014 3 133.021 5 –0.61 夏枯草 12 2.842 柠檬酸 C7H12O6 (M-H)– 191.019 5 191.027 0 1.04 夏枯草 13 3.305 二氢梓醇 C15H24O10 (M+CHO2)– 409.134 8 409.136 9 0.88 地黄 141) 4.441 梓醇 C15H22O10 (M+CHO2)– 407.118 8 407.121 2 2.01 地黄 15 4.724 尿嘧啶核苷 C9H12N2O6 (M-H)– 243.062 2 243.069 5 0.43 地黄 16 5.869 络氨酸 C9H11NO3 (M-H)– 180.066 4 180.073 9 1.28 地黄 17 9.186 鸟苷 C10H13N5O5 (M-H)– 282.084 1 282.091 7 1.12 地黄 181) 12.586 地黄苷D C27H42O20 (M+CHO2)– 731.225 6 731.226 9 –0.57 地黄 191) 14.46 丁香酸 C9H10O5 (M-H)– 197.045 3 197.052 8 1.48 地黄 20 14.562 益母草苷 C15H24O9 (M+Cl)– 383.111 1 383.642 0.88 地黄 21 18.189 原儿茶酸 C7H6O3 (M-H)– 137.024 5 137.031 7 –0.75 夏枯草 22 19.253 2, 3-二氢 -7-甲氧基-4 -甲基 -1H-1,
5 -苯并二氮卓 -2-酮C11H12N2O2 (M-H)– 203.082 5 203.089 9 0.52 苍术 23 21.839 地黄苦苷 C16H26O8 (M-H)– 345.155 3 345.162 8 0.41 地黄 24 22.327 咖啡酸 C9H8O4 (M-H)– 179.035 1 180.049 5 –0.9 白术 251) 27.255 异迷迭香酸苷 C24H26O13 (M-H)– 521.130 8 521.137 3 –1.42 夏枯草 42) 28.487 芦丁 C27H30O16 (M-H)– 609.146 1 609.153 4 0.08 夏枯草 52) 28.61 槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷 C21H20O12 (M-H)– 463.088 1 463.095 5 0.26 夏枯草 261) 30.296 迷迭香酸 C18H16O8 (M-H)– 359.077 2 359.084 5 0.18 夏枯草 271) 38.237 异地黄苷 C31H40O15 (M-H)– 651.229 1 651.236 7 0.59 地黄 281) 52.394 表莪术酮 C15H28O2 (M-H)– 239.201 4 239.208 9 1.07 莪术 291) 52.687 肉豆蔻酸 C14H28O2 (M-H)– 227.201 7 227.208 9 –0.12 夏枯草 301) 52.748 熊果酸 C30H48O3 (M-H)– 455.353 455.306 3 0.17 夏枯草 311) 53.606 亚油酸 C18H32O2 (M-H)– 279.232 8 279.240 2 0.55 夏枯草 321) 53.911 软脂酸 C16H32O2 (M-H)– 255.233 4 255.240 2 –1.71 夏枯草 33 54.095 油酸 C18H34O2 (M-H)– 281.249 0 281.255 9 –1.43 夏枯草 341) 54.92 硬脂酸 C18H36O2 (M-H)- 283.264 5 283.271 5 –0.93 苍术 35 33.114 6-0-E阿魏酰基筋骨草醇 C25H32O12 (M-H)– 523.181 7 523.189 4 0.73 地黄 36 51.355 麝香草酚 C10H14O (M-H)– 149.097 1 149.104 5 0.28 夏枯草 37 54.305 11-十八烯酸- C18H34O2 (M-H)– 281.248 6 282.225 9 0.09 夏枯草 注：1)表示负模式下碎片电压160V和260V测得；2)表示正负模式下测得。 -
对色谱条件的摸索，考察了甲醇-水、乙腈-水系统，发现甲醇的洗脱效果优于乙腈，且各色谱峰分离效果更好，加入0.1%甲酸可以改善峰型，并提高质谱响应，故采用甲醇-0.1%甲酸水为流动相。由于本组方含有药材较多，组方内所含成分比较复杂，因此选择大梯度洗脱，以期最大程度地得到其中的化合物保留。质谱检测比较了正、负离子两种扫描模式，由于组方中所含多种化合物响应模式各有不同，因此，选择正、负离子两种扫描模式同时进行监测。对于碎片电压的选择，本方中大部分化学成分在160 V时以准分子离子峰形式稳定存在，有少量化学成分在负离子模式下260V时以准分子离子峰形式稳定存在，图谱本底较低，因此选择160 V、260 V的碎片电压可以最大限度地对复方中的成分进行鉴别。
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本研究运用 HPLC-TOF/MS 技术快速鉴别夏枯草消瘤合剂中37种化学成分，其中正离子模式碎片电压160 V条件下8个；负离子模式碎片电压160 V条件下28个，碎片电压260 V条件下19个；正负离子均有响应4个，负离子模式两种碎片电压下均有响应16个，并对成分进行了药材归属。该方法在传统的植物化学分离提取基础上对色谱峰进一步明确化，为夏枯草消瘤方的质量控制、体内的深入研究及临床应用奠定了良好的基础。
Identification of chemical constituents of Xiakucao Xiaoliu mixture by HPLC-TOF/MS
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摘要:
目的 应用高效液相-高分辨飞行时间质谱（HPLC-TOF/MS）技术鉴别夏枯草消瘤方的化学成分。 方法 色谱分离采用ACE（3.0 mm×150 mm）色谱柱；流动相为甲醇(A)和0.1%甲酸水(B)，梯度洗脱：0~5 min：5%A，5~10 min：5%~15%A，10~30 min：15%~45%A，30~40 min：45%~70%B，40~50 min：70%~90%B；进样量2 μl，流速为0.4 ml/min；柱温为25 ℃。质谱定性采用飞行时间质谱，采用ESI离子源，正、负离子模式共同监测，参比离子m/z 121.9856，1033.9881；扫描范围m/z 100-1200。 结果 共鉴别出夏枯草消瘤方中37种化学成分，正离子模式碎片电压160 V条件下8个；负离子模式碎片电压160 V条件下28个，碎片电压260 V条件下19个；正负离子均有响应4个，负离子模式两种碎片电压下均有响应16个，并对成分进行了药材归属。 结论 建立了一种基于HPLC-TOF/MS技术对夏枯草消瘤方的化学成分进行鉴别的有效方法，为其质量控制及体内的深入研究奠定了基础。 -
关键词:
- 夏枯草消瘤方 /
- 化学成分 /
- 鉴别 /
- 高效液相-高分辨飞行时间质谱
Abstract:Objective To identify the chemical constituents of Xiakucao Xiaoliu mixture by high performance liquid chromatography-high resolution time-of-flight mass spectrometry (HPLC-TOF/MS). Methods The chromatographic separation ACE (3.0mm×150 mm) column was used. The mobile phase was methanol (A) and 0.1% formic acid (B). The gradient elution was: 0-5 min, 5% A; 5-10 min, 5%-15% A; 10-30 min, 15%-45%A; 30-40 min, 45%-70%B; 40-50 min, 70%-90%B. The injection volume was 2 μl. The flow rate was 0.4 ml/min. The column temperature was 25°C. The mass spectrometry was characterized by time-of-flight mass spectrometry, using ESI ion source. The common monitoring was in positive and negative ion mode. The reference ion was m/z 121.9856, 1033.9881. The scanning range was m/z 100-1200. Results A total of 37 chemical constituents were identified in the Xiakucao Xiaoliu mixture, 8 in the positive ion mode fragment voltage of 160 V, 28 in the negative ion mode fragment voltage of 160 V, and 19 in the fragment voltage of 260 V. Both positive and negative ions had 4 responses. The negative ion mode has 16 responses under both fragment voltages. And the ingredients were medicinal. Conclusion An effective method for the identification of the chemical constituents of Prunella vulgaris L. by HPLC-TOF/MS was established, which laid a foundation for its quality control and in-depth study in vivo. -
生脉注射液临床上常用于辅助治疗心肌梗塞、心源性休克、脓毒症和感染性休克。心肌梗塞引起组织产生大量氧自由基，直接损伤心肌细胞并触发细胞凋亡，免疫介导的炎症损伤会加大心梗范围和心梗损伤[1]。心源性休克激活的炎症反应可诱导产生大量NO，促进细胞凋亡[2]。脓毒血症是由细菌引起的全身性炎症，大量致炎因子破坏机体的免疫平衡，从而导致机体代谢紊乱[3]，严重者可能引起感染性休克。本研究特选择抗氧化及抗炎能力作为生物效应指标，考察生脉注射液质量与生物效应之间的相关性。
课题组前期对生脉注射液中11种成分[4]进行了指认并进行了定量，均符合药典标准。药理学实验表明，生脉注射液中人参皂苷、木质素和麦冬皂苷等多种化学成分均在细胞及动物模型上表现出良好的抗炎效果[5-8]，且临床研究表明其可以通过抗炎通路发挥对器官损伤的保护作用[9-10]。现今生物效应评价在中药材和中成药质量控制研究中有所应用[11-12]，2015版《中国药典》收录了生物活性测定法作为质量控制标准，如洋地黄生物测定法和黄体生成素生物测定法，说明通过生物效应控制药品质量是可行的。
抗炎和抗氧化损伤是生脉注射液产生药理作用的重要机制，但现今的质量标准仅对化学成分进行定性定量分析，不能全面体现其整体的药效活性，为此，本研究尝试通过评价其抗氧化能力以及抗炎活性，建立有效的生脉注射液生物学质量控制方法。
1. 材料
1.1 试剂与药品
二苯基苦基苯肼（DPPH，质量分数≥97%，含10%～20%苯，批号：PRPDE-JO，梯希爱（上海）化成工业发展有限公司）；水溶性维生素E (Trolox)、DMEM培养基和磷酸盐缓冲液(PBS)均购自北京Solarbio公司；胎牛血清（FBS，德国PAN Seratech公司）；N-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）、NO检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；无水乙醇（北京化工厂）；水（屈臣氏）。
9批次生脉注射液分别由5个不同厂家生产，样品详细情况见表1。
表 1 生脉注射液样品来源、批号及有效成分含量(μg/ml)[4]编号 生产厂家 批号 规格 人参皂苷Rb1 人参皂苷Re 人参皂苷Rg1 五味子醇甲 麦冬皂苷D S1 A 16120401005 10 ml/支 61.16 51.39 84.69 51.43 1.48 S2 B 160502 10 ml/支 101.69 55.61 88.99 73.09 3.42 S3 C 17071014 10 ml/支 56.99 44.87 80.42 36.78 1.68 S4 C 17040423 20 ml/支 63.12 44.51 81.54 39.63 1.28 S5 D 1704252 20 ml/支 77.15 62.10 86.11 29.05 3.62 S6 E 17091302 10 ml/支 85.52 57.74 88.45 33.55 1.40 S7 E 17092903 10 ml/支 80.43 41.52 86.36 37.30 1.33 S8 E 17061103 20 ml/支 74.88 61.06 80.00 35.18 1.72 S9 E 17053005 20 ml/支 79.97 48.54 80.34 44.83 1.59 1.2 主要仪器及设备
电子分析天平（AB265-S，梅托勒-托利多有限公司）；超声波清洗仪（B25-12DT，宁波新芝生物科技股份有限公司）；TS-2000A脱色摇床（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；96孔板、多功能连续波长酶标仪（InfiniteM1000，TECAN公司）；低速离心机（SC-3610，安徽中科中佳科学仪器有限公司）；二氧化碳培养箱（MCO-15AC，三洋电机株式会社）。
1.3 细胞培养
RAW264.7细胞为小鼠单核巨噬细胞，购于中国医学科学院基础医学研究所细胞中心。培养条件：完全培养基为含10%FBS的DMEM培养基，在37℃含5% CO2的培养箱中培养。每天换液，细胞生长达对数生长期时，传代（传代比例为1:6）并开展实验，实验用细胞控制在10代以内。
2. 方法与结果
2.1 DPPH法评价生脉注射液质量
2.1.1 实验过程
取96孔板，每孔依次加入100 μl初浓度2.0%的受试液、100 μl 0.5 mmol/L DPPH溶液，震荡均匀后避光反应20 min。
测定方法：每孔依次加入100 μl受试液和DPPH溶液，在摇床上振荡均匀，避光反应20 min后，用酶标仪测定波长在517 nm处的吸光度。
2.1.2 方法学考察
考察内容：①线性关系：分别吸取样品编号为S9的药液，用纯水定容得到浓度为8%的生脉注射液受试液。逐级稀释，测定其吸光度并计算该浓度下的平均吸光度。以终浓度为横坐标（X），平均吸光度为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得到的线性关系方程为Y=-0.2081X+1.2209（r=0.9996）（图1-A），表明生脉注射液具有较强的DPPH自由基清除能力且具有浓度依赖性，体积浓度和平均吸光度具有良好的线性关系，在0%~2.0%范围内线性关系良好。②精密度：取样品S9，配制得到浓度2.0%的受试液，设置平行复孔，按照“2.1.1”项下操作测定吸光度，计算其吸光度的RSD值为2.25%（见表2），表明该方法满足方法学精密度要求。③重复性：取样品S9，配制得到浓度2.0%的受试液，设置平行复孔，按照"2.1.1“项下操作测定吸光度，计算其平均吸光度的RSD值为2.21%（见表2），表明该方法满足方法学重复性要求。④稳定性：取样品S9，分别于0、4、8、24、48和72 h，配制得到浓度2.0%的受试液，设置平行复孔，按照“2.1.1”项下操作测定吸光度，计算其平均吸光度的RSD值为2.47%（见表3），表明该方法在72 h内稳定性良好。
图 1 生脉注射液抗氧化生物活性评价A. 生脉注射液对DPPH清除作用的标准曲线；B. Trolox对DPPH清除作用的标准曲线；C. 1.0%各批次生脉注射液相当于Trolox的量（mmol/L）表 2 1.0%生脉注射液对DPPH清除作用的精密度和重复性考察编号 精密度试验 重复性试验 吸光度 均值 RSD(%) 吸光度 均值 RSD(%) 1 1.063 4 1.087 9 2.25 1.138 9 1.135 6 2.22 2 1.115 6 1.175 6 3 1.098 3 1.135 7 4 1.114 3 1.096 7 5 1.064 9 1.129 2 6 1.070 9 1.137 7 表 3 1.0%生脉注射液对DPPH的清除作用的稳定性时间 吸光度 均值 RSD(%) 0 1.038 5 1.078 8 2.47 4 1.105 7 8 1.072 2 24 1.080 5 48 1.065 7 72 1.110 0 2.1.3 生脉注射液抗氧化生物活性的质量评价
精密称定Trolox，加入100 μl无水乙醇溶解，纯水定容，得到初浓度为15.46 mmol/L的Trolox溶液。将其逐级稀释，按照“2.1.1“项下操作测定并计算平均吸光度，以终浓度为横坐标（X），平均吸光度为纵坐标（Y），绘制标准曲线。得到的线性关系方程为Y=–0.0789X+1.1674（r=0.9951）（见图1-B），表明Trolox清除DPPH能力在作用浓度0.43~5.56 mmol/L范围内具有良好线性关系。
将9批次生脉注射液清除DPPH自由基的结果与Trolox比较，折算得到各批次生脉注射液相当于水溶性Trolox的作用浓度（见图1-C）。结果表明，终浓度1.0%的各批次生脉注射液清除自由基能力相对于Trolox作用浓度范围为1.2~1.9 mmol/L，在清除自由基即抗氧化能力方各批次不存在较大差异。
2.2 Griess试剂盒评价生脉注射液的抗炎活性
2.2.1 Griess试剂盒测定生脉注射液抑制NO释放能力
使用完全培养基配制为1.2%的生脉注射液样品溶液，及初浓度100μg/ml的LPS样品溶液。
取对数生长期的RAW264.7细胞，制备成2×106个/ml的细胞悬液，以每孔100 μl注入96孔板。培养24 h后，弃去培养基，每孔加入100 μl样品溶液和100 μl的LPS溶液，孵育24 h后吸取50 μl上清液，按照Griess试剂盒说明书操作，用酶标仪测定波长540 nm处的吸光度。
2.2.2 方法学考察
考察内容：①线性关系：精密吸取样品编号为S6的药液，用完全培养基制成浓度为4.0%的溶液。逐级稀释，测定吸光度并计算该浓度下的平均吸光度。以终浓度为横坐标（X），平均吸光度为纵坐标（Y），绘制标准曲线。得到线性方程为Y=–0.033ln(X)+0.243（r=0.9961）（见图2-A），表明生脉注射液具有良好的NO分泌抑制能力并具有浓度依赖性，终浓度和平均吸光度之间具有良好的线性关系，在0.2%~2.0%范围内线性关系良好。②精密度：取样品S6，配制得到浓度为1.2%的受试液，设置平行复孔，按照“2.1.1“项下操作测定吸光度，计算其吸光度的RSD值为1.71%（见表4），表明该法满足方法学精密度要求。③重复性：取样品S6，配制得到浓度为1.2%的受试液，设置平行复孔，按照“2.1.1“项下操作测定吸光度，计算其平均吸光度的RSD值为2.79%（见表4），表明该法满足方法学重复性要求。④稳定性：取样品S6，分别于0、4、8、24和48 h时，配制得到浓度1.2%的溶液，设置平行复孔，按照“2.1.1”项下操作测定吸光度，计算其平均吸光度的RSD值为2.66%（见表5），表明该方法在48 h内稳定性良好。
图 2 生脉注射液抗炎活性评价A. 生脉注射液对RAW264.7细胞分泌NO的标准曲线；B. L-NAME对RAW 264.7细胞分泌NO的标准曲线；C. 0.60%各批次生脉注射液相当于L-NAME的量（mmol/L）表 4 1.2%生脉注射液对LPS刺激264.7细胞分泌NO的精密度和重复性考察编号 精密度试验 重复性试验 吸光度 均值 RSD(%) 吸光度 均值 RSD(%) 1 0.276 0 0.272 9 1.71 0.272 9 0.285 0 2.79 2 0.272 3 0.281 1 3 0.265 0 0.289 0 4 0.276 1 0.291 6 5 0.275 0 0.290 6 表 5 1.2%生脉注射液对LPS刺激264.7细胞分泌NO的稳定性考察时间 吸光度 均值 RSD(%) 0 0.264 5 0.262 3 2.66 2 0.273 6 4 0.257 4 24 0.257 4 48 0.258 6 2.2.3 生脉注射液抗炎生物活性的质量评价
精密称定eNOS抑制剂L-NAME，逐级稀释，按照“2.1.1“项下操作，测定并计算平均吸光度，以终浓度为横坐标（X），平均吸光度为纵坐标（Y），绘制标准曲线。得到线性关系方程为Y=–0.052ln(X)+0.152（r=0.9957）（见图2-B），表明L-NAME抑制NO分泌能力在0.05~0.55 mmol/L范围内具有良好线性关系。
将9批次生脉注射液抑制NO分泌能力的结果与L-NAME比较，折算得到各批次生脉注射液相对于L-NAME的作用浓度（见图2-C）。
结果显示，除S2和S8样品外，终浓度0.6%的各批次生脉注射液对应的L-NAME浓度范围均在0.06~0.16 mmol/L范围内，表明在抑制NO分泌能力即抗炎能力方面S2和S8与其他样品存在较大差异。其中S2对应的L-NAME浓度远高于其他样品，其抗炎活性远高于其他样品组，推测这可能与化学成分含量差异有关，需要后续的实验加以证实。
3. 讨论
3.1 实验方法及阳性对照药的选择
测定抗氧化活性常用的方法有氧化自由基吸收能力（ORAC）、二苯基苦基苯肼（DPPH）法和总抗氧化能力检测（ABTS）法等，本实验首先采用DPPH法测定抗氧化能力，该方法操作简便，常用于体外评价化合物的抗氧化活性，其中Trolox和维生素C是常用的抗氧化剂对照药[13-14]，但相较之下，Trolox可通过清除自由基产生抗氧化机制，且具有剂量依赖性[15]，而维生素C稳定性较Trolox差，所以该方法选择了该药作为阳性对照。内皮型一氧化氮合酶（eNOS）诱导产生NO是NO产生的重要途径[16]，L-NAME作为eNOS抑制剂，选择其作为对照药可以更加直观地评价药物对细胞产生NO的抑制能力。
3.2 结果分析
参考2015版药典生物测定方法，该试验通过测定生脉注射液的抗炎和抗氧化能力，初步建立了生脉注射液的生物效应质量控制方法，该方法不仅能满足方法学要求，而且可以克服现行质量控制方法的局限性，还可以有效的评价中药复方制剂在治疗过程中产生的效应强度，实现“质-量-效”的有效结合[17]。
4. 展望
中药复方是一个组分复杂，不仅化学成分复杂，未知组分众多，而且其可能通过不同成分的配伍产生作用机制，即其药理机制不是单一化学成分能够阐明的，因此，仅对中药复方的化学成分进行评价难以对其成分及作用进行全面阐述。生物效应质量控制方法能对中药复方的整体组分药效进行把控，从药理活性方面评价中药复方质量，弥补现有质控方法的不足。在生物效应质控方法建立过程中，应注意以下问题：①质控方法应根据药效及药理机制研究选择合适的生物效应指标，充分反映该药的药理活性特征；②选择的对照药应具有足够的专属性、关联性和可测性，能够充分准确地反映药物的生物效应[18-20]。参考已有的生物质量控制研究[11，21]并对生脉注射液可能的药理活性进行筛选，对此进行考察。重点考察其方法学验证，结果显示该方法可行性高，方法学符合生物效应评价要求，可以反映生脉注射液的整体生物效应。但抗炎活性的测定实验要求较高的实验操作，且该方法对中药复方的整体生物活性进行测定，并未对可能产生药理活性的化学组分和含量进行探究和测定，可能产生药理活性的化学成分及作用机制尚不明确，值得后续的探讨。
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表 1 药材信息
药材名称 批号 药材来源 夏枯草 180207 上海康桥药业有限公司 生地黄 180302 上海同济堂药业有限公司 莪术 180306 上海虹桥中药饮片有限公司 麸炒白术 2018031001 上海上药华宇药业有限公司 麸炒苍术 180407 上海虹桥中药饮片有限公司 牡蛎 2017102006 上海上药华宇药业有限公司 煅牡蛎 180301 上海同济堂药业有限公司 
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表 2 夏枯草消瘤合剂中化学成分的正离子模式鉴别结果
序号 相对时间（min） 化合物 分子式 M+H 实验值（m/z） 理论值（m/z） 误差（×10–6） 来源 1 19.174 7-羟基异喹啉 C9H7NO [M+H]+ 146.060 8 146.052 8 –0.72 地黄. 2 24.032 Verrucarol C15H22O4 [M+H]+ 267.159 1 267.151 8 0.06 莪术 3 28.388 白术内酯Ⅱ C15H20O2 [M+H]+ 233.153 3 233.146 3 1.49 白术. 41) 30.653 芦丁 C27H30O16 [M+H]+ 611.160 8 611.153 4 –0.27 夏枯草 51) 30.703 槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷 C21H20O12 [M+H]+ 465.102 9 465.095 5 –0.25 夏枯草 61) 33.713 伞形酮 C9 H6 O3 [M+H]+ 163.038 7 163.031 7 1.54 夏枯草 7 38.337 白术内酯Ⅲ C15H20O3 [M+H]+ 249.148 2 249.141 2 2.05 白术 81) 41.969 十四烷基柠檬酸 C20H36O7 [M+H]+ 389.252 9 389.246 1 1.31 白术 注：1)表示正负模式下测得
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表 3 夏枯草消瘤合剂中化学成分的负离子模式鉴别结果
序号 相对时间（min） 化合物 分子式 M+H 实验值（m/z） 理论值（m/z） 误差（×10–6） 来源 91) 1.999 精氨酸 C6H14N4O2 (M-H)– 173.104 3 173.111 7 0.56 地黄 101) 2.109 葡萄糖酸 C6H12O7 (M-H)– 195.051 1 195.058 3 –0.23 夏枯草 11 2.789 苹果酸 C4H6O5 (M-H)– 133.014 3 133.021 5 –0.61 夏枯草 12 2.842 柠檬酸 C7H12O6 (M-H)– 191.019 5 191.027 0 1.04 夏枯草 13 3.305 二氢梓醇 C15H24O10 (M+CHO2)– 409.134 8 409.136 9 0.88 地黄 141) 4.441 梓醇 C15H22O10 (M+CHO2)– 407.118 8 407.121 2 2.01 地黄 15 4.724 尿嘧啶核苷 C9H12N2O6 (M-H)– 243.062 2 243.069 5 0.43 地黄 16 5.869 络氨酸 C9H11NO3 (M-H)– 180.066 4 180.073 9 1.28 地黄 17 9.186 鸟苷 C10H13N5O5 (M-H)– 282.084 1 282.091 7 1.12 地黄 181) 12.586 地黄苷D C27H42O20 (M+CHO2)– 731.225 6 731.226 9 –0.57 地黄 191) 14.46 丁香酸 C9H10O5 (M-H)– 197.045 3 197.052 8 1.48 地黄 20 14.562 益母草苷 C15H24O9 (M+Cl)– 383.111 1 383.642 0.88 地黄 21 18.189 原儿茶酸 C7H6O3 (M-H)– 137.024 5 137.031 7 –0.75 夏枯草 22 19.253 2, 3-二氢 -7-甲氧基-4 -甲基 -1H-1,
5 -苯并二氮卓 -2-酮C11H12N2O2 (M-H)– 203.082 5 203.089 9 0.52 苍术 23 21.839 地黄苦苷 C16H26O8 (M-H)– 345.155 3 345.162 8 0.41 地黄 24 22.327 咖啡酸 C9H8O4 (M-H)– 179.035 1 180.049 5 –0.9 白术 251) 27.255 异迷迭香酸苷 C24H26O13 (M-H)– 521.130 8 521.137 3 –1.42 夏枯草 42) 28.487 芦丁 C27H30O16 (M-H)– 609.146 1 609.153 4 0.08 夏枯草 52) 28.61 槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷 C21H20O12 (M-H)– 463.088 1 463.095 5 0.26 夏枯草 261) 30.296 迷迭香酸 C18H16O8 (M-H)– 359.077 2 359.084 5 0.18 夏枯草 271) 38.237 异地黄苷 C31H40O15 (M-H)– 651.229 1 651.236 7 0.59 地黄 281) 52.394 表莪术酮 C15H28O2 (M-H)– 239.201 4 239.208 9 1.07 莪术 291) 52.687 肉豆蔻酸 C14H28O2 (M-H)– 227.201 7 227.208 9 –0.12 夏枯草 301) 52.748 熊果酸 C30H48O3 (M-H)– 455.353 455.306 3 0.17 夏枯草 311) 53.606 亚油酸 C18H32O2 (M-H)– 279.232 8 279.240 2 0.55 夏枯草 321) 53.911 软脂酸 C16H32O2 (M-H)– 255.233 4 255.240 2 –1.71 夏枯草 33 54.095 油酸 C18H34O2 (M-H)– 281.249 0 281.255 9 –1.43 夏枯草 341) 54.92 硬脂酸 C18H36O2 (M-H)- 283.264 5 283.271 5 –0.93 苍术 35 33.114 6-0-E阿魏酰基筋骨草醇 C25H32O12 (M-H)– 523.181 7 523.189 4 0.73 地黄 36 51.355 麝香草酚 C10H14O (M-H)– 149.097 1 149.104 5 0.28 夏枯草 37 54.305 11-十八烯酸- C18H34O2 (M-H)– 281.248 6 282.225 9 0.09 夏枯草 注：1)表示负模式下碎片电压160V和260V测得；2)表示正负模式下测得。
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