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白血病是一类由造血干细胞恶性增殖引起的以出血、贫血、感染、不同程度的肝、脾、淋巴结肿大等为症状的造血系统恶性肿瘤[1]。目前，化疗是白血病治疗的重要手段，但复发率高、预后差、易产生耐药性等情况使得其对白血病的治疗效果大大折扣[2-3]。因此，寻找低毒、高效的治疗药物来提高疗效并降低复发率是治疗白血病的关键[4-5]。中医古籍中无白血病病名，但据其临床特点，应归属于“急劳”“热劳”“髓劳”“血证”“髓枯”“虚劳”等范畴[6]，由正虚邪实导致形成本虚标实之证。中药有可改善症状、减低化疗后毒副反应等特点，在白血病的治疗方面具有独特优势[7]。
定清片是上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院（本院）血液科黄振翘教授、周永明教授在“扶正祛邪”理论指导下，经多年潜心研究，逐步改良而成的一种治疗白血病的有效制剂，由雄黄、黄芩、人工牛黄、栀子、陈皮、冰片等12味药组成[8]。方中诸药配伍，共奏益气养阴、清解邪毒之功，使标本得治、虚实共调。定清片在临床使用中取得了很好的疗效，在临床上定清片联合化疗治疗急性髓系白血病患者的西医疗效总有效率为80.0%，中医证候疗效总有效率为93.34%，缓解率66.7%，高于化疗治疗，还可显著改善患者临床症状，减轻化疗引起的常见毒副反应[9-10]。实验表明，定清片在体外能抑制人白血病HL-60细胞增殖，其作用机制可能与影响细胞周期和诱导细胞凋亡相关[11]，但其具体作用机制尚不明晰，需要进一步研究。
本研究利用网络药理学及分子对接技术，探讨定清片治疗白血病的活性成分和作用靶点，以期阐明其可能的作用机制，为定清片用于白血病的临床治疗提供理论依据。
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本研究通过检索TCMSP数据库（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php），以OB≥30%，DL≥0.18[12] 作为筛选条件选出定清片的有效成分及对应的靶点信息。对于TCMSP数据库没有的中药，通过HERB数据库（http://herb.ac.cn/）筛选成分，在Pubchem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中下载有效成分的2 D结构，并在SwissTargetPrediction数据库（http://www.swisstargetprediction.ch/）中输入有效成分的2 D结构进行检索，以“Probability>0.1”为条件对靶点进行筛选。最后利用UniProt数据库（https://www.uniprot.org/）将筛选到的靶点转换为对应的标准基因名。
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在OMIM（https://www.omim.org/）、DisGeNET （https://www.disgenet.org/）和GeneCards（http://www.genecards.org/）数据库，以关键词“Leukemia”进行检索，获取白血病相关疾病靶点，在Venny2.1在线平台导入药物与疾病靶点，绘制药物-疾病共有靶点韦恩图，获得定清片治疗白血病的潜在靶点。
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将药物、活性成分、疾病靶点导入Cytoscape 3.7.2软件，构建“药物-成分-疾病靶点” 网络图。
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将共有靶点导入 String 数据库（https://cn.string-db.org），种属选择“homo sapiens”，设置置信度为0.4，隐藏游离节点，其他参数保持默认设置，输出后将结果导入Cytoscape软件构建PPI网络，应用MCODE插件，识别密集连接的网络特征，进一步筛选核心靶点群落。
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将物种设置为“homo sapiens”，利用DAVID数据库（https://david-d.ncifcrf.gov/）， 进行基因本体论（GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。富集结果以P<0.05为标准进行筛选，通过微生信在线软件（http://www.Bioinformatics.com.cn/）进行数据可视化处理。
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用RCSB PDB数据库（https://www.rcsb.org/）下载核心靶点的蛋白结构，借助Pymol软件去除蛋白的水分子和小分子配体。通过Pubchem数据库获取成分的3 D结构，运用OpenBabel-3.1.1软件将小分子结构转换为mol 2格式。再通过AutoDock vina软件对小分子配体和蛋白受体进行预处理并进行分子对接，得到靶点蛋白和化合物对接的最低结合能，运用Pymol软件将对接结果进行可视化。
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定清片由12味药组成，通过数据库搜集共获得82个活性成分及439个作用靶点。通过疾病数据库得到白血病相关靶点1 878个，将疾病靶点与活性成分靶点进行交集，绘制韦恩图（图1），得到169个共有靶点。将这169个共有靶点导入Cytoscape中，删除与靶点无交集的孤立成分后绘制“药物-成分-靶点-疾病”网络图（图2），共获得249个节点、712条边。根据网络的拓扑分析，筛选出度值较大的活性成分有槲皮素（97）、桑黄素（78）、山柰酚（75）、木犀草素（61）、川陈皮素（33）、汉黄芩素（20）和柚皮素（17）等，这些度值较大的化合物可能是定清片治疗白血病的潜在活性成分。
图 1 药物-疾病靶点韦恩图
图 2 定清片治疗白血病的药物-成分-靶点网络
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将169个共有靶点导入STRING数据库，将得到的文件导入Cytoscape软件进行可视化处理（图3A），获得PPI网络图。通过分析可知网路中共有162个节点（靶点蛋白）、1 817条边（蛋白相互作用），颜色由深变浅代表度值由大变小。按照度值大小排名靠前的靶点有TP53、AKT1、CASP3、STAT3、TNF、MYC、EGFR、JUN、BCL2等，选取度值最高的靶点绘制核心靶点PPI网络图（图3B），这些可能是定清片治疗白血病的关键靶点。
图 3 定清片治疗白血病共有靶点的PPI网络与核心靶点网络
为进一步探究靶点间的集落关系，对PPI网络开展MCODE子簇分析，得到评分最高的4个基因簇（图4）。其中基因簇1包含31个靶点，2含27个，3含7个，4含8个。评分最高的基因簇1中包含了31个关键靶点，有FOS、IL-2、EGFR、TP53、ICAM1、MAPK3、MAPK14、IFNG、TGFB1、MYC、NFKBIA、HIF1A、CREB1、ESR1、BCL2、TNF、IL-10、AKT1、IL-6、IL-1B、MMP9、CCL2、JUN、CXCL10、PTGS2、IL-4、VCAM1、STAT3、IL-1A、CASP3、CXCL8。
图 4 富集分子复合物检测（MCODE）分析中排名前4位的基因簇
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为聚焦核心靶点的相互作用，对基因簇1中的31个关键靶点进行GO和KEGG通路富集分析，最终得到GO富集条目431条。其中，生物过程（BP）368条，细胞组成（CC）19条，分子功能（MF）44条。通过GO富集分析发现，BP主要包括RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、基因表达的正调控、炎症反应、细胞凋亡过程的负调控等；CC主要包括细胞外间隙、转录因子复合物、大分子复合物等；MF主要包括酶的结合、细胞因子活性、相同蛋白质结合等（图5）。KEGG信号通路有138个条目，相关通路主要有TNF信号通路、IL-17信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、脂质和动脉粥样硬化和癌症信号通路等（图6）。
图 5 定清片作用靶点的GO富集分析
图 6 定清片作用靶点的KEGG通路富集分析
为进一步探究其作用机制，以KEGG分析获得的TNF、IL-17信号通路为重点研究对象，探讨药物、活性成分、核心靶点的关系。通过分析发现，信号通路中包含的核心靶点有7个，分别为AKT1、CASP3、MMP9、TNF、JUN、IL-6、MAPK3。这7个核心靶点与定清片中相关活性成分对应，构建活性成分-关键靶点-通路网络（图7），包括36个节点和75条边。核心靶点对应得到的13个活性成分为:槲皮素、山柰酚、木犀草素、柚皮素、刺槐素、β-谷甾醇、汉黄芩素、吴茱萸次碱、川陈皮素、桑黄素、睾酮、黄芩素、芒柄花素等。这些成分存在于黄连、太子参、黄芩、黄柏等8味药材中，通过调控核心靶点参与了TNF与IL-17信号通路的调节，可能在定清片治疗白血病的过程中发挥重要作用。
图 7 子网络A的药物-成分-靶点-通路图
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采用分子对接技术，选择药物-疾病共有靶点和基因簇1的“药物-成分-靶点-通路”网络图中节点度值最高的核心靶点蛋白，包括TP53、AKT1以及MMP9、CASP3和TNF，与排名靠前的活性成分槲皮素、山柰酚、木犀草素、刺槐素和柚皮素（图8）进行分子对接分析。化合物与靶点的结合能越低，表明其可能有更好的相互作用。从表1的结合能结果可知，定清片中的活性成分与核心靶点蛋白有一定的相互作用，例如槲皮素，与多个靶点的结合能均小于−20.93 kJ/mol，被认为可能有较好的结合性，其中与AKT1的结合能最低（−41.03 kJ/mol），表明其与AKT1的结合能力最强，槲皮素可能与蛋白上的TYR-272、ASN54、GLN79、THR211残基通过氢键等相互作用（图9），其他活性成分均与对应的大分子蛋白上的关键残基存在相互作用，对接可视化结果见图9。这些结果提示，定清片中的多种化合物成分与白血病的相关核心靶点有良好的亲和性。
图 8 定清片主要活性成分的化学结构式
表 1 分子对接结果
活性成分 结合能（kJ / mol） MMP9 TNF TP53 AKT1 CASP3 槲皮素 −24.28 −24.70 −31.40 −41.03 −31.40 刺槐素 −25.96 −27.21 −33.08 −25.96 −29.73 木犀草素 −25.54 −23.86 −30.14 −26.38 −28.47 山柰酚 −25.12 −26.38 −33.91 −27.63 −31.82 柚皮素 −27.63 −26.80 −30.98 −25.96 −30.14 
图 9 分子对接示意图
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定清片是本院黄振翘教授和周永明教授通过多年临床实践拟定的经验方，对白血病的疗效得到了普遍认可。其由12味中药组成，每味药物中又有许多不同的化合物。且其对白血病治疗的作用机制尚未阐明。
白血病的发病机制涉及多种因素，不同的药物治疗针对不同的通路和机制发挥作用[13]。本研究通过网络药理学分析，筛选出可能在定清片防治白血病的作用机制中具有重要作用的5个核心靶点。其中，肿瘤抑制基因TP53是人类癌症中最常见的突变基因之一，也是包括血液系统恶性肿瘤在内的许多恶性肿瘤研究的重要预后指标。其编码产生的p53蛋白与细胞周期的调控、细胞凋亡和衰老等重要的生物学功能息息相关，通过抑制细胞的生长，预防癌症的发展[14-15]。在分子对接实验中，刺槐素与p53蛋白有较好的亲和性。已有研究表明，刺槐素能通过结合RARγ，靶向调控AKT-p53信号通路，诱导癌细胞凋亡[16]；但其是否能直接作用于p53从而调控下游生物学功能尚需实验证实。丝氨酸/苏氨酸激酶1（AKT1）在细胞存活、细胞周期、侵袭和代谢的调节中发挥作用。研究表明，包括白血病在内的多种癌症都伴有AKT信号的失调，在急性白血病中经常发现AKT的持续激活和磷酸化水平的显著升高。AKT1与PI3K、PTEN和mTOR等构成的重要信号通路对维持细胞存活和凋亡之间的平衡具有重要作用[17]，且AKT1会影响来自胸腺的调节性T细胞的增殖能力[18]。研究发现，定清片中的槲皮素与多个核心靶点均有较好的亲和力，其与AKT的相互作用可能最强。已有多项研究表明，槲皮素可用于白血病的治疗，是一种有应用前景的抗肿瘤药物。槲皮素可通过调节CaMKKβ/AMPK/mTOR信号通路诱导HL-60细胞凋亡和自噬[19]，还能克服癌细胞的耐药性[20]。但槲皮素治疗白血病是否与AKT通路有关，有待进一步研究。在药物-靶点网络中显示与白血病靶点密切相关的化合物，如木犀草素、山柰酚和柚皮素等，都可能是定清片治疗白血病的关键化合物。
聚类分析结果显示，定清片治疗白血病的作用机制可能与TNF信号通路和IL-17信号通路有关。TNF参与白血病发生发展的所有过程，包括细胞转化、增殖、血管生成和髓外浸润等，并且在急性髓性白血病患者外周血中，调节性T细胞的增殖依赖于TNF受体通路[21]。而对慢性淋巴细胞白血病（CLL）、免疫功能紊乱和肿瘤细胞生存期延长是病情进展的重要诱因之一。在CLL早期，存在机体Th细胞免疫系统失衡，其中Th2细胞活化、嗜酸性粒细胞聚集，促进慢性炎症的发生，致使IL-17水平升高，最终导致CLL进展，预后欠佳[22]。IL-17诱导炎性细胞因子（如TNF-α和IL-6）和趋化因子（CXCL1、CXCL2）的持续产生，从而促进急性髓性白血病（AML）的发生发展[23]。在B细胞急性淋巴细胞白血病中，Th17细胞分泌的IL-17A水平明显升高，其通过激活Akt 信号通路显著促进细胞的增殖，提高柔红霉素的耐药性[24]。这些研究均表明，TNF信号通路和IL-17信号通路在白血病的发生发展中有重要作用，药物对这些通路发挥调控作用可能是其治疗白血病和改善耐药性的作用机制。
综上所述，本研究基于网络药理学方法，对定清片中的12味药材进行有效成分和作用靶点的筛选，构建了药物成分-疾病-靶点网络图，并通过对关键子网络核心靶点的富集分析，探索其治疗白血病的主要通路。定清片中的主要有效成分如山柰酚、槲皮素、木犀草素、柚皮素、刺槐素等，可能通过与核心靶点TP53、AKT1、MMP9、CASP3和TNF等的相互作用，调控TNF、IL-17等信号通路，从而发挥对白血病的治疗作用。本研究围绕中药复方多种药物成分、多靶点的基本分析策略，验证了“定清片”的有效性和科学性，为其在临床的推广应用提供了一定的理论依据。
Mechanism of effective ingredients of Dingqing tablets in the treatment of leukemia based on network pharmacology and molecular docking technology
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摘要:
目的 探讨定清片治疗白血病的药理作用机制。 方法 检索中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）、本草组鉴平台（HERB），收集定清片的活性成分；利用SwissTargetPrediction数据库预测其作用靶点。利用GeneCards、OMIM和DisGeNET数据库获取疾病靶点，将药物与疾病的共有靶点导入String网站，构建共有靶点蛋白相互作用（PPI）网络，并利用MCODE插件筛选核心子网络。利用DAVID数据库中对评分最高的基因簇1基因进行GO和KEGG富集分析，构建“成分-靶点-通路”网络；利用AutoDock对定清片的活性成分和核心靶点进行分子对接，并对其结果进行可视化分析。 结果 数据库检索共获得定清片活性成分82个及其作用靶点439个，白血病相关靶点1 878个，活性成分和疾病的共有靶点169个。由度值推测定清片中发挥作用的主要活性成分有槲皮素、木犀草素、山柰酚等，而PPI核心网络表明其治疗白血病的关键靶点主要包括TP53、MMP9、TNF、AKT1、CASP3等；子网络的基因富集分析及“成分-靶点-通路”网络图显示定清片可能通过调节TNF、IL-17等信号通路来发挥对白血病的治疗作用。分子对接结果显示活性成分与靶点间有较强的结合活性。 结论 定清片的活性成分可能通过调控TP53、AKT1和CASP3等基因参与TNF、IL-17等信号通路，从而发挥对白血病的治疗作用。 Abstract:Objective To explore the material basis and mechanism of the Chinese medicine Dingqing tablets in the treatment of leukemia. Methods The potential active ingredients of Dingqing tablets were retrieved through TCMSP and HERB Database and the targets of herbs were screened by Swiss TargetPrediction databases. The treatment targets of leukemia were searched from the GeneCards, OMIM and Disgenet databases. The protein-protein interaction network was used to construct the interactive target regulation function of Dingqing tablets and leukemia by STRING software, and the core subnetworks were filtered by the MCODE plug-in. A component-target pathway network was constructed by GO and KEGG enrichment analysis of the highest scoring Gene cluster 1 gene in the DAVID database. Molecular docking of the active components and core targets of Dingqing tablets was performed by AutoDock and the results were visualized. Results A total of 82 active ingredients and 439 targets of action of Dingqing tablets, and 1 878 leukemia-related targets were obtained through database retrieval, in which 169 common targets of active ingredients and diseases were mapped. Based on the degree values, the main active ingredients were determined as quercetin, luteolin, kaempferol, etc. The PPI core network indicated that the key targets for treating leukemia included TP53, MMP9, TNF, AKT1, CASP3, etc. The gene enrichment analysis of sub-networks and the component-target pathway network diagram showed that Dingqing tablets might exert therapeutic effects on leukemia by regulating signaling pathways such as TNF and IL-17. The molecular docking results showed fairly strong binding activity between the active ingredients and the targets. Conclusion The active ingredients of Dingqing tablets may participate in TNF, IL-17, and other signaling pathways by regulating genes such as TP53, AKT1, and CASP3, thereby exerting therapeutic effects on leukemia. -
Key words:
- Dingqing tablets /
- leukemia /
- network pharmacology /
- molecular docking /
- mechanism
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心脑血管疾病是由于血液黏稠、动脉粥样硬化等导致的心脏、脑部乃至整个身体组织层面上的健康障碍[1]。目前对这类疾病的常规治疗方法主要集中在手术干预和药物调理，涉及到血管扩充、减少颅内高压、维持生理功能和针对性治疗等，然而这些方法往往伴随多种不良反应，并且患者的康复预期通常不是很乐观[2-4]。传统医学认为心脑血管疾病属“胸痹”、“心痛”、“中风”范畴[5]。中医药一方面可以改善微循环、保护神经功能，另一方面可以益气活血，改善心脑血管引起的不适症状。
血通胶囊为黄浦区香山中医医院特色院内制剂，处方由水蛭、大黄、何首乌三味药材组成，具有化瘀活血、通络降脂等功效，主治动脉粥样硬化、高脂血症、中风后遗症等疾病，疗效确切，安全性好[6-7]。但血通胶囊在临床应用仍有一定局限性：制剂工艺落后，采用药材原粉直接入药，服用量大，卫生学检查难以合格；制剂稳定性差等。依照2020年国家市场监督管理总局发布的《药品注册管理办法》及2023年国家药品监督管理局发布的《中药注册管理专门规定》的要求，本研究采用了正交试验设计方法来优化提取工艺。同时，针对何首乌与大黄含有的5种蒽醌类化合物，建立了高效液相色谱（HPLC）的定量分析方法，为血通胶囊的质量控制指标提供了一套新的量化检测指标。
1. 仪器与试药
1.1 仪器
LC-20AD岛津高效液相色谱仪、ShimNex C18-AQ色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）（日本岛津公司）；XS105DU分析天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；100SD极脉超声波清洗机（深圳市超洁科技实业有限公司）。
1.2 试药
乙腈（HPLC梯度级，批号：0134240402D，上海星可高纯溶剂有限公司）、无水乙醇（分析纯，批号：20231213）、磷酸（HPLC梯度级，批号：20230807）、盐酸（分析纯，批号：20230331）、三氯甲烷（分析纯，批号：20220901）均购于国药集团化学试剂有限公司；何首乌（批号：2023041002，上海华济药业有限公司，经上海中医药大学附属龙华医院史秀峰主任药师鉴定为蓼科植物何首乌Polygonum multiflorum Thunb.的干燥块根）、大黄（批号：2023021901，上海华济药业有限公司，经上海中医药大学附属龙华医院史秀峰主任药师鉴定为蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatum L.、唐古特大黄 Rheum tanguticum Maxim. ex Balf.或药用大黄 Rheum officinale Baill.的干燥根和根茎）、芦荟大黄素（含量97.5%，批号：110795-202211）、二苯乙烯苷（含量97.9%，批号：10844-202317）、大黄酸（含量95%，批号：110757-202308）、大黄素（含量96.0%，批号：110756-201913）、大黄酚（含量99.8%，批号：110796-202011）、大黄素甲醚（含量98.9%，批号：110758-202218）均购于中国食品药品检定研究院；血通胶囊（批号：240101、240102、240103，上海市黄浦区香山中医医院自制制剂）。
2. 提取工艺优化
2.1 二苯乙烯苷、芦荟大黄素含量测定方法的建立
2.1.1 色谱条件
ShimNex C18-AQ色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～15 min，17%A；15～40 min，17%～80%A；40～50 min，80%A）；检测波长：双波长254 nm（芦荟大黄素）、320 nm（二苯乙烯苷）；流速：1.0 ml/min；进样量：10 μl。
2.1.2 对照品溶液的制备
取二苯乙烯苷、芦荟大黄素对照品适量，精密称定，置于棕色量瓶中，加稀乙醇溶解稀释，定容，摇匀即得429.98 μg/ml芦荟大黄素、323.07 μg/ml二苯乙烯苷混合对照品溶液。
2.1.3 供试品溶液的制备
称取0.4 g干膏粉，置具塞锥形瓶中，加入稀乙醇25 ml，称定重量，加热回流30 min，放冷，称定重量，用稀乙醇补足重量，摇匀，静置，上清液滤过，即得。
2.1.4 专属性实验
按照2.1.1项下色谱条件，分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液和空白溶剂稀乙醇溶液各10 μl进样测定。结果显示，供试品溶液色谱图与对照品溶液色谱图相同的保留时间上有相同的色谱峰，而空白溶剂稀乙醇溶液在同一位置没有检查到色谱峰，表明专属性良好，见图1。
图 1 芦荟大黄素、二苯乙烯苷HPLC图A.空白溶剂稀乙醇溶液；B.芦荟大黄素对照品溶液；C.芦荟大黄素供试品溶液；D.空白溶剂稀乙醇溶液；E.二苯乙烯苷对照品溶液；F.二苯乙烯苷供试品溶液1.芦荟大黄素；2.二苯乙烯苷。2.1.5 标准曲线的制备
取2.1.2项下对照品溶液适量，加稀乙醇按比例稀释，定容至刻度，混匀，使二苯乙烯苷的含量为20.19、40.38、80.77、161.54、323.07 μg/ml，芦荟大黄素的含量为26.87、53.75、107.49、214.99、429.98 μg/ml。按2.1.1项下色谱条件进样10 μl，测定峰面积（Y），以样品浓度（X）进行线性回归，计算回归方程。二苯乙烯苷：Y=42 381 X−15 930，r=0.999 8；芦荟大黄素：Y=15 707 X+9 782.4，r=0.999 8。结果表明，二苯乙烯苷在20.19~323.07 μg/ml、芦荟大黄素在26.87~429.98 μg/ml范围内线性关系良好。
2.1.6 精密度实验
精密吸取混合对照品溶液10 μl，按2.1.1项下色谱条件重复进样5次，按峰面积计算二苯乙烯苷、芦荟大黄素的RSD分别为0.29%、0.17%（n = 5）。表明仪器精密度良好。
2.1.7 稳定性实验
按2.1.3项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液，精密吸取10 μl，按2.1.1项下色谱条件分别在0、2、4、6、8 h各进样1次，记录峰面积，计算得到二苯乙烯苷、芦荟大黄素的RSD分别为0.24%、0.75%（n=5），表明供试品溶液在8 h内稳定。
2.1.8 重复性实验
按2.1.3项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液5份，精密吸取10 μl，按2.1.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算得到二苯乙烯苷、芦荟大黄素的含量分别为6.05、6.60 mg/g；RSD分别为0.14%、0.55%（n=5），表明方法的重复性良好。
2.1.9 加样回收率实验
取已知二苯乙烯苷、芦荟大黄素含量的浸膏粉9份，每份约0.4 g，精密称定，分别加入相当于二苯乙烯苷、芦荟大黄素含量80%、100%、120%的对照品溶液适量，按2.1.3项下制备供试品溶液，并测定含量，计算样品的加样回收率。结果二苯乙烯苷的平均加样回收率为98.57%，RSD为0.98%（n=9）；芦荟大黄素的平均加样回收率为97.55%，RSD为1.10%（n=9）。
2.2 提取工艺考察方案
选择乙醇回流法对何首乌和大黄进行提取。利用正交试验设计手段，本研究以何首乌中的二苯乙烯苷和大黄中的芦荟大黄素含量及其浸膏得率作为评价指标，对乙醇用量（因素A）、乙醇浓度（因素B）、提取时间（因素C）、提取次数（因素D）进行考察，见表1。
表 1 正交试验因素水平表水平 因素A
乙醇用量（倍）因素B
乙醇浓度（%）因素C
提取时间（t/h）因素D
提取次数（次）1 6 60 1 1 2 8 70 1.5 2 3 10 80 2 3 2.3 浸膏得率测定
称取何首乌和大黄饮片各10 g，根据正交试验设计安排表进行实验（表2）。乙醇回流法提取，每组提取后合并提取液，过滤，减压浓缩回收乙醇至稠膏状，放置于真空干燥箱内（设定温度为60℃~75℃，压力控制在0.04~0.08 MPa，持续时间12~24 h）进行烘干处理。烘干完毕的物料经过粉碎成干燥的膏状粉末。然后，通过测量该粉末的质量来计算提取率，并据此得到浸膏的提取效率。
表 2 正交试验分析表试验号 因素
A因素
B因素
C因素
D二苯乙烯
苷含量
（mg/g）芦荟大黄
素含量
（mg/g）浸膏
得率
（%）综合
评分1 1 1 1 1 3.335 5.096 19.4 0.63 2 1 2 2 2 4.996 6.162 25.8 0.85 3 1 3 3 3 5.725 6.549 25.6 0.89 4 2 1 2 3 5.155 5.228 29.5 0.87 5 2 2 3 1 5.128 6.714 20.2 0.80 6 2 3 1 2 2.458 7.114 23.5 0.73 7 3 1 3 2 5.172 5.086 29.4 0.86 8 3 2 1 3 6.064 6.694 28.6 0.96 9 3 3 2 1 3.145 7.427 19.9 0.73 K1 2.375 2.360 2.320 2.158 K2 2.393 2.603 2.438 2.434 K3 2.544 2.348 2.554 2.719 R 0.169 0.255 0.234 0.561 2.4 正交试验结果
依据所得二苯乙烯苷、芦荟大黄素的含量以及浸膏得率，按公式[综合评分=0.3×二苯乙烯苷含量/实验中二苯乙烯苷含量最大值+0.3×芦荟大黄素含量/实验中芦荟大黄素含量最大值+0.4×浸膏得率/实验中浸膏得率最大值]，计算综合评分，见表2、表3。
表 3 综合评分正交试验方差分析表变异来源 离差平方和
（SS）自由度
（df）均方
（MS）F值 P 因素B 0.014 2 0.007 2.333 0.30 因素C 0.009 2 0.004 1.430 0.41 因素D 0.052 2 0.026 8.430 0.11 因素A（含误差） 0.006 2 0.003 由表2、表3可见，各因素对乙醇回流法无显著性影响（P>0.05），根据影响力大小排序为：D>B>C>A。正交试验结果得出最佳提取工艺条件为A3B2C1D3。考虑到节约资源、提高效率的原则，参考评分结果，确定最佳工艺为A3B2C1D3，即加入处方药材质量10倍的70%乙醇，提取3次，每次1 h。
2.5 验证实验
称取正交试验处方量药材3份，按最佳工艺进行验证实验，浸膏得率平均值为28.80%，RSD为0.73%（n=3）；二苯乙烯苷和芦荟大黄素平均含量分别为6.04、6.60 mg/g，RSD分别为0.25%、0.80% （n=3），说明优选的提取工艺稳定、可行。
3. 蒽醌类成分含量测定
3.1 色谱条件
色谱柱：ShimNex C18-AQ柱,4.6 mm×250 mm，5 μm；流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液=85∶15，检测波长：254 nm，流速：1.0 ml/min，进样量：10 μl。
3.2 对照品溶液的制备
精密称取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚适量，置于100 ml量瓶中，加适量甲醇超声、水浴加热使其充分溶解，放置室温后再用甲醇定容至刻度，制成含芦荟大黄素106.67 μg/ml、大黄酸104.41 μg/ml、大黄素207.74 μg/ml、大黄酚210.38 μg/ml和大黄素甲醚191.47 μg/ml的混合对照品溶液，备用。
3.3 供试品溶液的制备
精密称定优化提取工艺后制备的血通胶囊样品（批号：240101）0.45 g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇25 ml，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液5 ml，至烧瓶中，挥去溶剂，加8%的盐酸溶液10 ml，加热回流1 h，放冷，至分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10 ml，合并溶液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3.4 阴性对照溶液的制备
按血通胶囊处方比例称取除大黄、何首乌外的药材适量，按照处方工艺及供试品溶液制备方法，制得阴性对照溶液。
3.5 专属性实验
按照3.1项下色谱条件，分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10 μl进样测定。结果显示，供试品溶液色谱图与对照品溶液色谱图相同的保留时间上有相同的色谱峰，而阴性对照溶液在同一位置没有检查到色谱峰，表明专属性良好，见图2。
3.6 标准曲线的制备
取3.2项下对照品溶液适量，加甲醇稀释，定容至刻度，混匀，使芦荟大黄素的含量为2.73、6.83、17.07、42.67、106.67 μg/ml，大黄酸含量为2.67、6.68、16.70、41.76、104.41 μg/ml，大黄素含量为5.32、13.30、33.24、83.10、207.74 μg/ml，大黄酚含量为5.39、13.46、33.66、84.15、210.38 μg/ml，大黄素甲醚含量为4.90、12.25、30.64、75.59、191.47 μg/ml。按3.1项下色谱条件进样10 μl，测定峰面积（Y），以样品浓度（X）进行线性回归，计算回归方程。芦荟大黄素：Y=51 669 X+13 430，r=0.999 8；大黄酸：Y=42 556 X−62 801，r=0.999 7；大黄素：Y=39 484 X−51 629，r=0.999 8；大黄酚：Y=53 244 X−69 950，r=0.999 9；大黄素甲醚：Y=15 518 X+4 047，r=0.999 8。结果表明，芦荟大黄素在2.73~106.67 μg/ml、大黄酸在2.67~104.41 μg/ml、大黄素在5.32~207.74 μg/ml、大黄酚在5.39~210.38 μg/ml、大黄素甲醚在4.90~191.47 μg/ml范围内线性关系良好。
3.7 精密度实验
精密吸取对照品混合溶液10 μl，按3.1项下色谱条件重复进样5次，按峰面积计算芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的RSD，分别为0.52%、0.20%、0.57%、0.26%和0.84%（n = 5）。表明仪器精密度良好。
3.8 稳定性实验
按3.3项下供试品溶液制备方法制备血通胶囊供试品溶液（批号：240101），精密吸取10 μl，按3.1项下色谱条件分别在0、2、4、6、8 h各进样1次，记录峰面积，计算得到芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的RSD分别为0.38%、0.57%、0.59%、0.60%和0.58%（n=5），表明供试品溶液在8 h内稳定。
3.9 重复性实验
按3.3项下供试品溶液制备方法制备血通胶囊供试品溶液（批号240101）6份，精密吸取10 μl，按3.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算得到芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量分别为0.635、0.677、1.965、2.518、1.070 mg/g；RSD分别为0.96%、0.87%、0.47%、0.89% 和0.72%（n=6），表明方法的重复性良好。
3.10 加样回收率实验
取同一批号已知芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚含量的血通胶囊9份（批号：240101），每份约0.45 g，精密称定，分别加入相对于5种蒽醌类成分含量80%、100%、120%的对照品溶液适量，按3.3项下制备供试品溶液并测定含量，计算样品的加样回收率。结果芦荟大黄素96.85%，RSD为1.62% （n=9）；大黄酸95.76%，RSD为1.48%（n=9）；大黄素95.64%，RSD为1.66%（n=9）；大黄酚93.66%，RSD为1.56%（n=9）；大黄素甲醚94.71%，RSD为1.64%（n = 9）。
3.11 样品含量测定
取3批血通胶囊样品约0.45 g，分别按3.3项下供试品溶液制备方法平行制备9份供试品溶液，按3.1色谱条件测定峰面积，计算含量，结果见表4。
表 4 血通胶囊蒽醌类成分含量测定结果（n = 3）批号 芦荟大黄素 大黄酸 大黄素 大黄酚 大黄素甲醚 含量（mg/g） RSD（%） 含量（mg/g） RSD（%） 含量（mg/g） RSD（%） 含量（mg/g） RSD（%） 含量（mg/g） RSD（%） 240101 0.632 0.133 0.681 0.851 1.968 0.102 2.570 0.354 1.101 0.196 240102 0.637 0.471 0.660 0.313 1.970 0.154 2.580 0.424 1.079 0.352 240103 0.641 0.545 0.681 0.73 1.991 0.253 2.547 0.127 1.076 0.382 4. 讨论
4.1 提取工艺优化
血通胶囊原制剂工艺中，水蛭、大黄、何首乌三味药材均为药材原粉入药，制剂服用量偏大，卫生学检查难以合格，因此，本研究分别对大黄、何首乌二味药材的提取工艺进行了筛选优化。张绵松等[8]研究证实何首乌醇提物体外抗氧和抑菌作用明显强于水提物。李冰韶等[9]研究发现，大黄醇提物中蒽醌类成分含量高于水提物，且降脂效果更强。因此，本研究选择乙醇回流法对何首乌和大黄进行提取，采用正交试验设计法对乙醇用量、浓度、提取时间、次数等因素进行考察。
正交试验结果显示，血通胶囊提取物中二苯乙烯苷含量、芦荟大黄素含量、浸膏得率综合评分最高是实验8，根据直观分析可知，被考察因素对综合评分重要性排序为因素D>因素B>因素C>因素A，确定最优提取工艺为A3B2C1D3，即加10倍乙醇，乙醇浓度70%，提取3次，每次1 h。验证实验结果表明该方法重复性好，提取效率较高。
4.2 蒽醌类成分含量测定
血通胶囊的原始质量控制标准仅有的薄层色谱法定性鉴别，并未设立定量的质量控制标准。本研究根据2020年版发布的《中国药典》所列出的规范[10]，对血通胶囊中5个蒽醌类化合物进行含量测定。检测结果显示，3批血通胶囊蒽醌类成分含量稳定，表明该提取方法制备的血通胶囊稳定可靠。本研究结果为血通胶囊的质量控制及进一步研究奠定基础。
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表 1 分子对接结果
活性成分 结合能（kJ / mol） MMP9 TNF TP53 AKT1 CASP3 槲皮素 −24.28 −24.70 −31.40 −41.03 −31.40 刺槐素 −25.96 −27.21 −33.08 −25.96 −29.73 木犀草素 −25.54 −23.86 −30.14 −26.38 −28.47 山柰酚 −25.12 −26.38 −33.91 −27.63 −31.82 柚皮素 −27.63 −26.80 −30.98 −25.96 −30.14 
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