花椒生物碱富集纯化工艺优化及其成分分析

杨贺英; 罗彩萍; 彭婷; 梁文仪; 沈颂章; 苏娟

doi:10.12206/j.issn.2097-2024.202404066

花椒生物碱富集纯化工艺优化及其成分分析

doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202404066

杨贺英^1,,
罗彩萍²,
彭婷²,
梁文仪²,
沈颂章²,
苏娟^{1, 2, ,}

1.
上海大学医学院, 上海 200444
2.
海军军医大学军事药学国家级实验教学示范中心, 上海 200433

基金项目: 国家自然科学基金（82304813）；大学生创新能力培养项目（FH2023095）

详细信息

作者简介:
杨贺英，硕士研究生，研究方向：中药活性成分，Email: yhy991231_zd@163.com

通讯作者: 苏　娟，博士，副教授，硕士生导师，研究方向：中药活性成分，Email: juansu_2008@126.com

Optimization of purification process and component analysis of alkaloids from Zanthoxylum bungeanum Maxim

1.
School of Medicine, Shanghai University, Shanghai 200444, China
2.
National Demonstration Center for Experimental Military Pharmacy Education, Naval Medical University, Shanghai 200433, China

摘要: 目的优化大孔树脂富集纯化花椒生物碱的工艺条件，并进行成分分析。方法单因素实验与正交试验相结合，以羟基-α-山椒素（HAS）、羟基-β-山椒素（HBS）含量为指标，确定最佳工艺参数。利用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS^E）技术定性分析生物碱类化学成分。结果最佳条件为选用三菱HP-20型大孔树脂，上样液浓度为0.2 g生药/ml，生药量与树脂体积比为1 g∶2.5 ml，树脂柱径高比为1∶7，以每小时4倍柱体积（BV）的速率动态吸附，静置1 h；20%乙醇2 BV除杂；80%乙醇5 BV洗脱。HAS、HBS的含量分别为4.71%、1.02%，共鉴定出20种生物碱。结论该方法稳定可行，得到高纯度多种类的花椒生物碱，可用于花椒生物碱的富集纯化。
- 花椒 /
- 生物碱 /
- 大孔树脂 /
- 正交设计 /
- 超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱
Abstract: Objective To optimize the process conditions and analyze the components of alkaloids from Zanthoxylum bungeanum Maxim（Z. bungeanum）using macroporous resin. Methods Combining single factor tests and orthogonal tests, the content of hydroxy-α-sanshool（HAS）and hydroxy-β-sanshool（HBS）were considered as indexes to determine the best process parameters. Ultra-performance liquid chromatography-quadrupole tandem time-of-flight mass spectrometry（UPLC-Q-TOF-MS^E）was used to identify the structures of alkaloids. Results The optimal conditions were Mitsubishi HP-20 macroporous resin, the loading solution concentration was 0.2 g crude drug/ml, the ratio of crude drug to resin volume was 1 g∶2.5 ml, the diameter/height ratio of resin column was 1∶7, the dynamic adsorption flow rate was 4 times of bed volume（BV）per hour, and the adsorption time was 1 h. Impurities were removed by using 2 BV of 20% ethanol, 5 BV of 80% ethanol was used to elution, and the content of HAS and HBS was 4.71% and 1.02%, respectively. A total of 20 alkaloids were identified from Z. bungeanum. Conclusion This method was stable and feasible, obtaining high purity and various kinds of alkaloids, which could be used for the enrichment and purification of alkaloids from Z. bungeanum.
- Zanthoxylum bungeanum Maxim /
- alkaloids /
- macroporous resin /
- orthogonal design /
- UPLC-Q-TOF-MS^E
骨质疏松症和阿尔茨海默病均为退行性疾病，越来越多的研究表明它们的发病机制具有关联^[1]。骨质疏松症往往伴随着认知缺陷，Aβ沉积是阿尔茨海默病的典型症状，而阿尔兹海默病小鼠（APPswe/PS1dE9）的骨组织中也会出现Aβ沉积，并出现骨密度降低，骨强度减弱等骨质疏松症状^[2]。另有研究表明，氧化应激会导致 Aβ沉积，这种氧化损伤状态可被抗氧化剂改善^[3]。因此， Aβ沉积偶联氧化损伤可视为阿尔茨海默病及骨质疏松症的共同发病机制。巴戟天丸收载于明代《古今医统大全》，由君药巴戟天，臣药远志、石菖蒲、茯苓、人参以及地骨皮、茯神组成^[4]。前期课题组研究已证实，巴戟天丸组方可以从体内外水平上改善D-半乳糖（D-gal）引发的骨丢失，但巴戟天丸组方治疗Aβ沉积所致的骨丢失及具体作用机制有待进一步阐明^{[4, 5]}。因此，本研究拟以Aβ1-42寡聚体损伤成骨细胞模型，对巴戟天丸组方的抗氧化能力及对骨形成干预作用进行探究，并通过网络药理学方法对潜在的作用机制进行预测。

1.   材料和方法

1.1   材料

1.1.1   巴戟天丸水提物的制备

取质量比为5∶10∶10∶10∶10∶10∶3的巴戟天、茯苓、茯神、地骨皮、远志、石菖蒲、人参粉末，混合均匀。按照料液比1∶10加入去离子水，浸泡1 h后，加热煎煮，回流提取2次，每次1 h，所得药液过滤，合并两次的滤液。将收集到的滤液减压浓缩成浓度为2.6 g（生药量）/ml的巴戟天丸水提物母液。-20°C保存备用。

1.1.2   成骨细胞

新生 24 h Wistar 大鼠（上海西普尔-必凯实验动物有限公司）；胎牛血清（以色列BI）；MTT（上海碧云天）；BCIP/NBT 碱性磷酸酯酶显色试剂盒（上海碧云天）、ALP、CAT、SOD、GSH 、MDA 试剂盒（南京建成）；PBS（天津灏洋）；DMSO（上海博光）；α-MEM 培养基（上海富衡）； BMP2、RUNX-2、OPG、GAPDH抗体（美国Abcam）。

1.2   实验方法

1.2.1   细胞培养

采用二次消化法从新生 24 h Wistar 大鼠的颅盖骨中分离得到原代成骨细胞，将成骨细胞培养于 α-MEM 培养基中（10% 胎牛血清），置于 37 ℃、5% CO₂恒温培养箱中培养，取第 3～5 代成骨细胞进行后续实验。

1.2.2   细胞增殖情况测定

将成骨细胞以 2×10⁴个/孔接种于无菌 96 孔板中，孵育过夜。空白组和模型组更换新的完全培养基，阳性药组加入含N-乙酰半胱氨酸（NAC）的完全培养液（1 mmol/L）, 给药组分别加入含不同浓度的巴戟天丸组方完全培养液（0.008、0.04、0.2、1、5 μg/ml），4 h 后模型组和给药组给予Aβ1-42寡聚体进行损伤，使完全培养基中Aβ1-42寡聚体浓度达到 20 mmol/L。培养 48 h 后，采用 MTT 法测定细胞增殖水平。

1.2.3   成骨细胞 ALP 活性检测及染色

ALP 活性检测：按照“1.4.2”项的方法进行给药，培养 48 h 后，取上清液，根据说明书进行 ALP 活性测定。将成骨细胞以 1×10⁵ 个/孔接种于无菌6孔板中，孵育过夜，细胞完全贴壁后，空白组和模型组更换新的完全培养基，阳性药组加入含NAC的完全培养液（1 mmol/L）, 给药组分别加入含不同浓度的巴戟天丸组方完全培养基（0.2、1、5 μg/ml），4 h 后模型组和给药组给予Aβ1-42寡聚体进行损伤，使培养基中Aβ1-42寡聚体浓度达到20 mmol/L。培养 48 h 后进行染色，室温下避光孵育 48 h，洗去工作液后置于显微镜下拍照。

1.2.4   成骨细胞CAT、SOD、GSH 、MDA活性检测

将成骨细胞以2×10⁴个/孔和5×10⁴ 个/孔分别接种于接种于无菌96孔和24孔板中，孵育过夜，细胞完全贴壁后，空白组和模型组更换新的完全培养基，阳性药组加入含NAC的完全培养液（1 mmol/L）, 给药组分别加入含不同浓度的巴戟天丸组方完全培养液（0.2、1、5 μg/ml），4 h 后模型组、阳性药组和给药组给予Aβ1-42寡聚体进行损伤，使培养基中Aβ1-42寡聚体浓度达到20 mmol/L。培养 48 h 后根据说明书进行检测。

1.2.5   Western Blot实验

将细胞以 2×10⁵ 个/孔接种于 6 孔板中，孵育过夜，细胞完全贴壁后，阳性药组加入含NAC的完全培养液（1 mmol/L）, 给药组分别加入含不同浓度的巴戟天丸组方完全培养基（0.2、1、5 μg/ml），4 h 后模型组和给药组加入Aβ1-42寡聚体，使完全培养基中Aβ1-42寡聚体浓度达到20 mmol/L。48 h 后，吸去培养基，PBS 洗涤 3 次。于冰上对细胞进行裂解提取总蛋白，采用 BCA 试剂盒测定蛋白浓度。蛋白变性后，经 SDS-PAGE 凝胶电泳后转移至 PVDF 膜进行转膜，室温封闭1 h后，加入相应的一抗，4 ℃过夜，1×TBST洗涤 3 次，加二抗于室温孵育 50 min，1×TBST洗涤 3 次，采用 ECL 化学发光试剂盒检测。

1.3   统计学分析

使用 SPSS Staistics 24 统计分析软件进行统计学分析。计量数据均采用（$\bar{x} $±s）表示，选用单因素方差分析（One-Way ANOVA）进行组间变量的比较分析。使用 Graphpad prism 9.0 软件进行统计及绘图。以P<0.05 为差异有显著性意义。

1.4   网络药理学研究

1.4.1   巴戟天丸组方活性成分筛选

通过TCMSP（http://tcmsow.com/tcmsp.php）和ETCM数据库（http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php），查找巴戟天、地骨皮、茯苓、人参、石菖蒲和远志6味中药的成分。在TCMSP数据库中，选择药物口服利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18的成分，在ETCM数据库中根据DrugLikeness Grading评分，选择评分为Moderate和Good的成分^[6]。

1.4.2   构建巴戟天丸组方成分靶点图

通过Uniprot（http://www.uniprot.org/）数据库，将靶点映射成基因，利用Cytoscape 3.6.0软件绘制成分靶点图。

1.4.3   阿尔兹海默病和骨质疏松症靶点构建

通过Disgenet数据库（http://www.disgenet.org/）和Genecards数据库（https://www.genecards.org/）查找阿尔兹海默病和骨质疏松症相关的疾病靶点，绘制PPI蛋白相互作用网络图，整合两大数据库中的靶点基因，去除重复的靶点。利用Venny2.1，将阿尔兹海默病和骨质疏松症相关的疾病靶点图进行交集分析。

1.4.4   阿尔兹海默病、骨质疏松症与巴戟天丸组方共同靶点构建

利用Venny2.1，将阿尔兹海默病、骨质疏松症与巴戟天丸组方相关靶点进行交集分析。将药物疾病交集靶点上传到String数据库进行分析，绘制PPI蛋白相互作用网络图。

1.4.5   GO基因富集分析和KEGG代谢通路分析

采用Metascape数据库，对关键靶点进行GO基因富集分析（http://geneontology.org/）和KEGG代谢通路分析（http://www.genome.jp/kegg/），分析巴戟天丸中的主要分子生物过程和信号通路。

2.   结果

2.1   巴戟天丸组方促进 Aβ损伤成骨细胞骨形成

Aβ1-42寡聚体可显著抑制成骨细胞的增殖；巴戟天丸组方在 0.04、0.2、1、5 μg/ml浓度下均能够显著提高成骨细胞的增殖水平（图1A）。Aβ1-42寡聚体会显著抑制成骨细胞中骨形成相关蛋白BMP2、RUNX-2、OPG的表达；给予巴戟天丸组方干预后，BMP2、RUNX-2、OPG的表达显著提高，提示巴戟天丸组方可显著促进Aβ1-42寡聚体损伤成骨细胞的骨形成（图1B）。与空白组相比，Aβ1-42寡聚体可以显著降低成骨细胞的 ALP 活性，而巴戟天丸组方显著逆转了 Aβ 损伤成骨细胞的 ALP 活性，促进成骨细胞的分化（图1C、D）。

图 1 巴戟天丸组方对Aβ1-42寡聚体损伤成骨细胞增殖、骨形成相关蛋白以及ALP活性的影响（n=6）

^*P<0.05，^**P<0.01与模型组比较，^##P<0.01与空白组比较。

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2.2   巴戟天丸组方改善Aβ损伤成骨细胞氧化应激

如图2 所示，Aβ1-42寡聚体显著降低了成骨细胞CAT（图2A）、SOD（图2B）、GSH（图2D）的活性，提高MDA的活性（图2C），导致成骨细胞的氧化损伤，而巴戟天丸组方低、中、高剂量均可以显著改善Aβ1-42寡聚体导致的氧化损伤。

图 2 巴戟天丸组方对Aβ1-42寡聚体损伤成骨细胞抗氧化能力的影响（n=4）

^*P<0.05，^**P<0.01与模型组比较，^#P<0.05，^##P<0.01与空白组比较。

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2.3   网络药理学研究

2.3.1   巴戟天丸组方活性成分筛选

根据条件筛选后，其中，巴戟天成分为20种，地骨皮成分为12种，茯苓成分为10种，人参成分为18种，石菖蒲成分为10种，远志成分为5种，茯神成分0种，共计成分75种。

2.3.2   构建巴戟天丸组方成分靶点图

通过TCMSP和ETCM数据库查找满足筛选条件的化学成分对应的靶点，得到151个预测靶点。删除重复靶点后，通过Uniprot数据库映射成基因ID，剔除重复靶点后，得到143个基因symbol（图3）。

图 3 巴戟天丸组方成分靶点图

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2.3.3   阿尔兹海默病和骨质疏松症靶点构建

通过Disgenet数据库和Genecards数据库查找得到阿尔兹海默病相关疾病靶点10 362个，骨质疏松症相关疾病靶点4 582个，并将所得靶点进行蛋白相互作用网络分析（图4A、B）。将阿尔兹海默病和骨质疏松症相关的疾病靶点图进行交集分析，得到共有靶点2 674个（图4C）。

图 4 阿尔兹海默病、骨质疏松症靶点图

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2.3.4   阿尔兹海默病、骨质疏松症与巴戟天丸组方共同靶点构建

将2 674个疾病交集靶点基因和143个药物成分靶点基因再次进行交集分析，得到共有靶点95个（图5A），将95个药物疾病交集靶点上传到String数据库进行分析，绘制PPI蛋白相互作用网络图。将单独节点去除后，图中共有94个节点，871条边，意味着它们间有特殊的关联，即蛋白质共同贡献一个共同的功能，每个靶点的平均节点度为18.3，说明交集靶点间关系密切而且存在很强的相互作用关系（图5B）。

图 5 阿尔兹海默病、骨质疏松症与巴戟天丸组方共同靶点图

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2.3.5   GO基因富集分析和KEGG代谢通路分析

GO富集分析包括生物过程（BP）、分子功能（MF）及细胞组分（CC），将每个结果前 10 的条目可视化为条形图（图6A）。巴戟天丸活性物质参与的BP主要包括对脂多糖的反应、对氧含量的反应、细胞凋亡信号途径、活性氧代谢过程。MF主要包括G蛋白偶合胺受体的活性、神经递质受体的活性、氧化还原酶活性、参与凋亡信号通路的半胱氨酸型内肽酶活性、泛素类蛋白连接酶结合。CC主要包括膜筏、突触膜的整体组成部分、浆膜筏等。 KEGG 通路富集分析中主要涉及与阿尔兹海默症、骨质疏松症相关的通路有AGE-RAGE信号通路、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路以及神经活性配体与受体的相互作用通路等（图6B）。

图 6 巴戟天丸GO基因富集分析和KEGG代谢通路分析

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3.   讨论

骨骼重塑是一个重要的生理过程，其主要包括两个阶段，成骨细胞主导的骨形成和破骨细胞主导的骨吸收^[7]。其中，成骨细胞的增殖能力反映骨形成的强弱，其分泌的 ALP 是分化阶段的关键酶，可促进骨组织矿化^[8]。本研究中，各剂量巴戟天丸均可显著改善Aβ损伤成骨细胞的增殖抑制，且0.2 μg/ml效果最好，5 μg/ml的效果优于0.04 μg/ml，故选择0.2 μg/ml、1 μg/ml、5 μg/ml作为巴戟天丸给药剂量进行后续实验，并发现其可显著提高Aβ损伤成骨细胞的ALP活性和骨形成相关蛋白 BMP2、RUNX-2、OPG的表达，促进骨形成。GSH是细胞抗氧化系统的一个重要成员，高水平的GSH对于清除过多的活性氧（ROS）和解毒异物是不可缺少的^[9]。MDA是细胞中多不饱和脂肪酸过氧化的最终产物之一，自由基的增加会导致MDA的过度生产，加剧氧化损伤^[10]。SOD和CAT是重要的酶类抗氧化剂，二者活性的降低会导致氧化损伤^[11,12]。本实验中巴戟天丸组方可逆转Aβ损伤成骨细胞GSH、SOD、CAT活性的降低， MDA活性的升高，结果所表现的剂量依赖与增殖实验相吻合，表明巴戟天丸组方可作为抗氧化剂改善成骨细胞的氧化损伤。后采用网络药理学方法进一步探究巴戟天丸干预Aβ损伤成骨细胞的作用机制，结果显示，巴戟天丸促进Aβ损伤状态下成骨细胞骨形成的作用可能与AGE-RAGE、PI3K-Akt及MAPK等信号通路有关。其中，AGE-RAGE信号通路的激活会扰乱细胞的氧化还原平衡并调节各种细胞死亡途径 ^[13]。作为AGE-RAGE信号通路的下游， PI3K-Akt信号通路的激活会增强细胞的抗氧化能力，保护细胞免受氧化应激^[14]。此外，MAPK通路的激活同样可以减轻氧化应激状态^[15]，故网络药理学研究结果同样提示巴戟天丸组方可通过缓解氧化损伤发挥干预Aβ沉积损伤成骨细胞的作用。

图 1 供试品溶液的HPLC图

1.羟基-α-山椒素；2.羟基-β-山椒素

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图 2 三菱HP-20型大孔树脂动态吸附泄漏曲线

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图 3 不同上样条件对HAS、HBS总得率的影响

A.上样液浓度；B树脂柱径高比；C吸附流速^*P<0.05,^**P<0.01，与白色组比较。

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图 4 正离子模式下花椒生物碱BPI图

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表 1 除杂、洗脱条件正交试验因素水平表

条件	水平	因素
条件	水平	A因素溶剂	B因素体积（BV）	C因素流速（BV/h）
除杂	1	蒸馏水	1	2
	2	10%乙醇	2	3
	3	20%乙醇	3	5
洗脱	1	55%乙醇	3	2
	2	70%乙醇	5	3
	3	80%乙醇	8	5

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表 2 不同类型树脂对HAS、HBS总得率的影响（n=3）

树脂类型	HAS、HBS 总浓度（mg/ml）	HAS、HBS 总含量（%）	$ \bar{X} $±SD（%）
APS-17	2.42	4.06	4.06±2.17
NKA-9	2.08	3.50	3.50±1.76
宝恩HP-20	3.68	6.19	6.19±1.09
AB-8	3.58	6.02	6.02±1.28
HPD-400	3.59	6.03	6.03±0.98
三菱HP-20	4.10	6.89	6.89±0.62

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表 3 除杂条件L₉（3³）正交设计及结果

编号	因素			总得率（%）
编号	除杂溶剂（A）	除杂体积（B）	除杂流速（C）	总得率（%）
1	1	1	1	7.87
2	1	2	2	9.09
3	1	3	3	9.31
4	2	1	2	10.33
5	2	2	3	10.42
6	2	3	1	10.67
7	3	1	3	11.82
8	3	2	1	10.73
9	3	3	2	11.66
k1	8.75	10.06	9.71	−
k2	10.44	10.07	10.34	−
k3	11.37	10.48	10.52	−
R	2.62	0.64	0.81	−

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表 4 洗脱条件L₉（3³）正交设计及结果

编号	因素			总得率（%）
编号	洗脱溶剂（A）	洗脱体积（B）	洗脱流速（C）	总得率（%）
1	1	1	1	2.55
2	1	2	2	5.38
3	1	3	3	7.15
4	2	1	2	5.75
5	2	2	3	8.11
6	2	3	1	9.57
7	3	1	3	9.20
8	3	2	1	8.28
9	3	3	2	6.36
k1	5.03	5.83	6.80	−
k2	7.81	7.26	5.83	−
k3	7.95	7.69	8.15	−
R	2.92	1.86	2.32	−

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表 5 最佳工艺验证结果

编号	得膏率（%）	富集前总含量（%）	富集后总含量（%）	富集后总含量RSD（%）
1	6.88	0.82	5.73	0.87
2	6.91	0.81	5.72	0.87
3	6.95	0.82	5.64	0.87

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表 6 正离子模式下花椒生物碱类成分碎片离子及鉴定结果

峰号	保留时间（t/min）	化合物	分子式	离子模式	理论值（m/z）	实测值（m/z）	误差（ppm）	碎片离子（m/z）	参考文献
1	4.716	木兰花碱	C₂₀H₂₄NO₄⁺	[M]⁺	342.170 5	342.169 0	−4.38	342.169 0[M]⁺, 297.110 6[M-C₂H₇N]⁺, 282.088 2[M-C₂H₇N-CH₃]⁺, 265.085 2[C₁₇H₁₃O₃]⁺, 222.065 3[C₁₅H₁₀O₂]⁺, 191.084 6[C₁₅H₁₁]⁺, 194.071 4[C₁₄H₁₀O]⁺, 165.069 3[C₁₃H₉]⁺	[17]
2	5.483	ZP-amide D	C₁₆H₂₇NO₄	[M+Na]⁺	320.183 8	320.182 5	−4.06	321.186 4[M+H+Na]⁺, 320.182 5[M+Na]⁺	[18]
3	5.877	ZP-amide E	C₁₆H₂₇NO₄	[M+Na]⁺	320.183 8	320.182 5	−4.06	320.182 5[M+Na]⁺	[18]
4	6.043	ZP-amide A	C₁₆H₂₅NO₄	[M+Na]⁺	318.168 1	318.168 5	1.26	613.338 5[2M+Na]⁺, 319.169 2[M+H+Na]⁺, 318.168 5[M+Na]⁺, 296.183 8[M+H]⁺, 278.175 6[M-OH]⁺	[18-19]
5	6.724	ZP-amide B	C₁₆H₂₅NO₄	[M+Na]⁺	318.168 1	318.168 5	1.26	613.338 5[2M+Na]⁺, 319.169 2[M+H+Na]⁺, 318.168 5[M+Na^]+, 296.183 8[M+H]⁺, 278.175 6[M-OH]⁺	[18-19]
6	6.793	ZP-amide C	C₁₆H₂₇NO₄	[M+Na]⁺	320.183 8	320.182 5	−4.06	321.186 4[M+H+Na]⁺, 320.182 5[M+Na]⁺	[18, 20]
7	7.222	ZP-amide L	C₁₆H₂₇NO₄	[M+Na]⁺	320.183 8	320.182 5	−4.06	321.186 4[M+H+Na]⁺, 320.182 5[M+Na]⁺	[18]
8	7.902	ZP-amide K	C₁₆H₂₇NO₄	[M+Na]⁺	320.183 8	320.182 5	−4.06	321.186 4[M+H+Na]⁺, 320.182 5[M+Na]⁺	[18]
9	12.427	ZP-amide N	C₁₈H₃₁NO₄	[M+Na]⁺	348.215 1	348.213 0	−6.03	349.217 7[M+H+Na]⁺, 348.213 0[M+Na]⁺	[18]
10	16.168	茵芋碱	C₁₄H₁₃NO₄	[M+H]⁺	260.092 3	260.092 3	0.00	229.037 0[M-2CH₃]⁺, 227.056 6[C₁₃H₉NO₃]+, 202.046 8[C₁₁H₈NO₃]⁺, 199.062 5[C₁₂H₉NO₂], 184.037 9[C₁₁H₆NO₂]⁺, 156.043 4[C₁₀H₆NO]⁺, 77.037 7[C₆H₅]⁺	[21]
11	22.312	羟基-ε-山椒素	C₁₆H₂₅NO₂	[M+Na]⁺	286.178 3	286.178 3	0.00	302.171 4[M+K]⁺, 286.178 3[M+Na]⁺, 246.184 4[M-OH]⁺	[22]
12^*	22.701	羟基-α− 山椒素	C₁₆H₂₅NO₂	[M+Na]⁺	286.178 3	286.178 3	0.00	287.179 5[M+H+Na]⁺, 286.178 3[M+Na]⁺, 246.184 4[M-OH]⁺	[23]
13^*	23.113	羟基-β− 山椒素	C₁₆H₂₅NO₂	[M+Na]⁺	286.178 3	286.178 3	0.00	287.179 5[M+H+Na]⁺, 286.178 3[M+Na]⁺, 246.187 5[M-OH]⁺	[23]
14	23.605	Zanthoamides A	C₁₈H₂₇NO₄	[M-OH]⁺	304.191 3	304.191 3	0.00	345.184 4[M+H+Na]⁺, 344.181 6[M+Na]⁺	[24]
15	26.156	羟基-γ−山椒素	C₁₈H₂₇NO₂	[M+Na]⁺	312.193 9	312.193 5	−1.28	601.398 7[2M+Na]⁺, 313.164 8[M+H+Na]⁺, 312.193 5[M+Na]⁺, 272.200 9[M-OH]⁺	[22]
16	26.379	羟基-γ− 异山椒素	C₁₈H₂₇NO₂	[M+Na]⁺	312.193 9	312.193 5	−1.28	601.398 7[2M+Na]⁺, 313.164 8[M+H+Na]⁺, 312.193 5[M+Na]⁺, 272.200 9[M-OH]⁺	[22]
17	26.786	bungeanool	C₁₈H₂₉NO₂	[M-OH]⁺	274.217 1	274.216 5	−2.19	565.363 6[2M-OH]⁺, 314.210 3[M+Na]⁺	[15]
18	26.957	isobungeanool	C₁₈H₂₉NO₂	[M-OH]⁺	274.217 1	274.216 5	−2.19	565.363 6[2M-OH]⁺, 314.210 3[M+Na]⁺	[15]
19	27.586	α−山椒素	C₁₆H₂₅NO	[M+H]⁺	248.201 4	248.201 2	−0.81	286.178 3[M+K]⁺	[23]
20	29.068	四氢花椒素	C₁₈H₃₃NO₂	[M+H]⁺	296.259 0	296.257 7	−4.39	318.237 8[M+Na]⁺, 279.137 4[M+H-OH]⁺	[25]
^*：为与对照品比对的化合物。

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图(4) / 表(6)

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1. 材料和方法
1.1 材料
1.2 实验方法
1.3 统计学分析
1.4 网络药理学研究
2. 结果
2.1 巴戟天丸组方促进 Aβ损伤成骨细胞骨形成
2.2 巴戟天丸组方改善Aβ损伤成骨细胞氧化应激
2.3 网络药理学研究
3. 讨论

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花椒为芸香科植物红花椒Zanthoxylum bungeanum Maxim.或青花椒Zanthoxylum schinifolium Sieb.et Zucc.的干燥成熟果皮，味辛，性温，具有温中止痛、杀虫止痒的功效，主治脘腹冷痛、呕吐泄泻、虫积腹痛^[1]。生物碱是花椒的主要特征性成分，组成丰富、结构多样，具有抗炎、镇痛、抗菌、抗氧化、降脂和抗肿瘤等多种药理活性^[2-8]。其中，不饱和脂肪酰胺类生物碱如羟基-α-山椒素（HAS）、羟基-β-山椒素（HBS）已经被证实能够调节脂质代谢，对非酒精性脂肪肝病等代谢性疾病的预防具有潜在效果^[9]。然而，对花椒生物碱的制备、富集纯化工艺优化的研究较少。花椒生物碱高效提取与纯化是其后续活性评价和产品开发的基础，有利于花椒药用价值的深度开发，因此优化花椒生物碱的富集纯化工艺具有重要意义。

大孔吸附树脂法是最常用的富集纯化手段，具有选择性好、吸附能力强、富集效果好、环保绿色等优点，在中药材、中药制剂方面应用广泛^[10-11]。因此，本实验以HAS、HBS的得率为指标，筛选适宜纯化花椒生物碱的大孔树脂类型，采用单因素实验和正交试验确定树脂的最佳吸附、除杂、洗脱条件，建立大孔树脂富集纯化花椒生物碱的最佳工艺。采用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS^E）技术鉴定成分，以期为花椒生物碱的物质基础研究和进一步的综合开发利用提供科学依据。

1. 材料

1.1. 样品

花椒药材（批号：20220705-2，购于陕西省渭南韩城市），经海军军医大学张成中副教授鉴定为芸香科花椒属红花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxim）的干燥果皮。

1.2. 仪器与试剂

1260型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；Acquity I-CLASSTM UPLC 超高效液相色谱系统、Xevo G2-XS 四级杆串联飞行时间质谱（美国沃特世科技有限公司）；R-100型旋转蒸发仪（瑞士步琦有限公司）；DZF-6050型真空干燥箱（巩义市予华仪器有限责任公司）；XS205DU电子分析天平（梅特勒托利多科技公司）。

HAS对照品（纯度≥98%，批号：P2834270，源叶）；HBS对照品（纯度≥98%，批号：P2832664，诗丹德）；95%乙醇（分析纯，上海泰坦科技股份有限公司）；甲酸、甲醇、乙腈（色谱纯，赛默飞世尔科技公司）；APS-17型、NKA-9型、HP-20型、AB-8型大孔吸附树脂（沧州宝恩吸附材料科技有限公司）；HPD-400型大孔吸附树脂（上海一飞生物科技有限公司）；HP-20型大孔吸附树脂（日本三菱化学株式会社）。

2. 方法

2.1. 花椒中生物碱成分含量测定方法的建立

2.1.1. 溶液的配制

称取50 g花椒于圆底烧瓶中，加入500 ml的50%乙醇，95℃水浴加热，回流提取1 h，共提取3次。过滤后合并滤液，45℃减压浓缩至无醇味，过滤，加水分散至250 ml，即得上样液。

取216 ml上样液，上样于直径为2.7 cm、高度为18.9 cm的三菱HP-20型大孔树脂柱，动态吸附30 min，静置1 h后，取216 ml 20%乙醇除杂24 min；540 ml 80%乙醇洗脱1 h。收集洗脱液，45℃减压浓缩并干燥，即得提取物粉末。

对照品溶液：精密称定HAS、HBS对照品适量，加50%乙醇定容，分别制成0.61 mg/ml、0.11 mg/ml的对照品溶液。

供试品溶液：精密称定适量提取物粉末，加50%乙醇定容后，0.45 μm微孔滤膜过滤，即为供试品溶液。

2.1.2. 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus-C₁₈柱（2.1 mm×100 mm, 1.8 μm）；流速：0.3 ml/min；检测波长：270 nm；柱温：30℃；进样量：5 μl。流动相：乙腈（A）-0.1%三乙胺（B）；洗脱梯度：0~18 min，10%→35%A；18~30 min，35%→50%A；30~36 min，50%→90%A，36~39 min，90%A，39~40 min，90%→10%A。

2.1.3. 线性关系

取HAS对照品溶液、HBS对照品溶液0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 ml置于5个5 ml容量瓶中，50%乙醇定容至刻度，摇匀后得到系列梯度浓度的标准工作溶液，0.45 μm微孔滤膜过滤，在“2.1.2”项下色谱条件下进样。

2.1.4. 精密度

取“2.1.1”项下对照品溶液2.0 ml置于5 ml容量瓶中，50%乙醇定容至刻度，混匀后0.45 μm微孔滤膜过滤，连续进样6次。

2.1.5. 稳定性

取“2.1.1”项下的供试品溶液，于0、1、2、4、8、24 h分别进样。

2.1.6. 重复性

按照“2.1.1”项方法平行制备供试品溶液 6 份，在“2.1.2”项下色谱条件进样测定。

2.1.7. 加样回收率

精密称取已知HAS、HBS含量的花椒生物碱粉末适量, 共取9份，分别准确加入HAS、HBS对照品适量，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，进样分析并计算加样回收率。

2.2. 大孔树脂纯化富集工艺优化

2.2.1. 树脂类型

95%乙醇浸泡树脂24 h，充分溶胀后湿法装柱，95%乙醇淋至洗脱液澄清透明，水洗至洗脱液无醇味，备用。取预处理后的不同类型的大孔树脂，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液并进样，计算HAS、HBS的总得率。

2.2.2. 上样量

湿法装柱，取“2.1.1”项下制备的上样液450 ml，以2 BV/h上样，流出液每30 ml收集1份。按“2.1.2”项下色谱条件进样，以累计上样体积（V/ml）为横坐标（X），以HAS、HBS的总泄漏率（%）为纵坐标（Y），绘制泄漏曲线。

2.2.3. 单因素实验考察上样条件

除变量外固定其他工艺条件（树脂类型、上样量与树脂体积比、除杂溶剂、除杂体积、除杂流速、洗脱溶剂、洗脱体积及洗脱流速分别为三菱HP-20型、1 g∶2.5 ml、10%乙醇，2 BV、5 BV/h、70%乙醇、5 BV及5 BV/h）不变的情况下，分别考察上样液浓度（0.1、0.2、0.4 g生药/ml）、树脂柱径高比（1∶5、1∶7、1∶9）及吸附流速（1、2、4 BV/h）对花椒生物碱中HAS、HBS总得率的影响。

2.2.4. 正交试验考察除杂、洗脱条件

在单因素实验的基础上，采用L9（3³）正交试验进一步分析除杂条件（除杂溶剂、体积、流速）、洗脱条件（洗脱溶剂、体积、流速）对花椒生物碱中HAS、HBS总得率的影响（表1），总结最佳工艺并进行验证。统计分析使用SPSS 26.0 软件。

表 1 除杂、洗脱条件正交试验因素水平表

条件	水平	因素
条件	水平	A因素溶剂	B因素体积（BV）	C因素流速（BV/h）
除杂	1	蒸馏水	1	2
	2	10%乙醇	2	3
	3	20%乙醇	3	5
洗脱	1	55%乙醇	3	2
	2	70%乙醇	5	3
	3	80%乙醇	8	5

2.3. 花椒生物碱的化学成分分析

2.3.1. 样品制备

精密称定“2.2.4”项下以最佳工艺制备的花椒生物碱粉末5.0 mg，50%甲醇定容至25 ml，0.45 μm微孔滤膜过滤备用。

2.3.2. 色谱条件

色谱柱：Waters ACQUITY HSS T₃柱（2.1×100 mm, 1.7 μm）；检测波长：270 nm；流速：0.3 ml/min；柱温：30℃；进样量：3 μl。流动相：乙腈（A）-0.1%甲酸水（B），洗脱梯度：0~18 min，10%→35%A；18~24 min，35%→46%A；24~30 min，46%→90%A；30~32 min，90%A；32~33 min，90%~10%A；33~36 min，10%A。

2.3.3. 质谱条件

电喷雾离子源（ESI），正离子模式扫描。离子源温度120℃，雾化气流速为800 L/h，毛细管电压为3.0 kV。锥孔电压40 V，补偿电压80 V。低能量扫描电压6 eV，高能量扫描电压30~60 eV；喷雾器压力为6.5×10⁵ Pa，气帘气体积流量为50 L/h，扫描范围m/z为50~1500。亮氨酸-脑啡肽（m/z∶ 554.261 5 [M-H]⁻）和（m/z∶ 556.277 1[M+H]⁺）作为外标进行质量实时校正，体积流量设为5 μl/min。

MassLynx V4.1工作站使用MS^E模式采集质谱数据。

4. 讨论

实验前期，考察了酸提碱沉法与乙醇回流提取法，经比较发现两方法制备得到的花椒生物碱中HAS、HBS含量差别不显著。但以酸性溶液浸提生物碱时，耗时长、水溶性杂质较多，而且酸性溶液可能会使部分生物碱吸收氢离子导致质子化从而发生重排反应，破坏分子结构，综合考虑下本实验选择乙醇回流提取法。

HAS、HBS是花椒的代表性酰胺类生物碱，具有降脂、抗氧化、麻醉、神经营养等多种活性，受到研究者的广泛关注^[15-16]。本实验确立的工艺能够有效富集花椒生物碱，显著提高HAS、HBS含量，为后续HAS、HBS单体化合物的制备提供了基础。实验过程中尝试通过优化除杂条件、分段收集乙醇洗脱液等方法分离黄酮与生物碱类成分，但UPLC-Q-TOF-MS^E得到的BPI图中，8~11 min仍存在着部分响应较高的黄酮类物质无法完全分离，后续还需要探索其他有效的方法进一步去除黄酮类成分。

本实验在单因素实验基础上采用正交设计考察了花椒生物碱的最佳纯化工艺，利用UPLC-Q-TOF-MS^E对生物碱成分进行分析鉴定，使用HPLC对制备得到的花椒生物碱中的HAS、HBS进行含量测定。本纯化工艺简单可行、稳定有效，可为花椒生物碱的综合开发利用及工业化生产提供科学依据，对提升花椒的综合经济价值具有深远意义。

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花椒生物碱富集纯化工艺优化及其成分分析

doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202404066

作者简介: 杨贺英，硕士研究生，研究方向：中药活性成分，Email: yhy991231_zd@163.com

通讯作者: 苏 娟，博士，副教授，硕士生导师，研究方向：中药活性成分，Email: juansu_2008@126.com

Optimization of purification process and component analysis of alkaloids from Zanthoxylum bungeanum Maxim

1. 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 巴戟天丸水提物的制备

1.1.2 成骨细胞

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养

1.2.2 细胞增殖情况测定

1.2.3 成骨细胞 ALP 活性检测及染色

1.2.4 成骨细胞CAT、SOD、GSH 、MDA活性检测

1.2.5 Western Blot实验

1.3 统计学分析

1.4 网络药理学研究

1.4.1 巴戟天丸组方活性成分筛选

1.4.2 构建巴戟天丸组方成分靶点图

1.4.3 阿尔兹海默病和骨质疏松症靶点构建

1.4.4 阿尔兹海默病、骨质疏松症与巴戟天丸组方共同靶点构建

1.4.5 GO基因富集分析和KEGG代谢通路分析

2. 结果

2.1 巴戟天丸组方促进 Aβ损伤成骨细胞骨形成

2.2 巴戟天丸组方改善Aβ损伤成骨细胞氧化应激

2.3 网络药理学研究

2.3.1 巴戟天丸组方活性成分筛选

2.3.2 构建巴戟天丸组方成分靶点图

2.3.3 阿尔兹海默病和骨质疏松症靶点构建

2.3.4 阿尔兹海默病、骨质疏松症与巴戟天丸组方共同靶点构建

2.3.5 GO基因富集分析和KEGG代谢通路分析

3. 讨论

计量

出版历程

花椒生物碱富集纯化工艺优化及其成分分析

doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202404066

1. 上海大学医学院, 上海 200444 2. 海军军医大学军事药学国家级实验教学示范中心, 上海 200433

作者简介: 杨贺英，硕士研究生，研究方向：中药活性成分，Email: yhy991231_zd@163.com

通讯作者: 苏 娟，博士，副教授，硕士生导师，研究方向：中药活性成分，Email: juansu_2008@126.com

English Abstract

Optimization of purification process and component analysis of alkaloids from Zanthoxylum bungeanum Maxim

1. School of Medicine, Shanghai University, Shanghai 200444, China 2. National Demonstration Center for Experimental Military Pharmacy Education, Naval Medical University, Shanghai 200433, China

全文HTML

1.1. 样品

1.2. 仪器与试剂

2.1. 花椒中生物碱成分含量测定方法的建立

2.1.1. 溶液的配制

2.1.2. 色谱条件

2.1.3. 线性关系

2.1.4. 精密度

2.1.5. 稳定性

2.1.6. 重复性

2.1.7. 加样回收率

2.2. 大孔树脂纯化富集工艺优化

2.2.1. 树脂类型

2.2.2. 上样量

2.2.3. 单因素实验考察上样条件

2.2.4. 正交试验考察除杂、洗脱条件

2.3. 花椒生物碱的化学成分分析

2.3.1. 样品制备

2.3.2. 色谱条件

2.3.3. 质谱条件

3.1. HPLC图与方法学实验结果

3.1.1. 花椒生物碱的HPLC图

3.1.2. 线性关系考察结果

3.1.3. 精密度实验结果

3.1.4. 稳定性实验结果

3.1.5. 重复性实验结果

3.1.6. 加样回收率实验结果

3.2. 大孔树脂纯化富集工艺

3.2.1. 树脂类型的确定

3.2.2. 上样量的确定

3.2.3. 上样条件的确定

3.2.4. 除杂、洗脱条件的确定

3.2.5. 花椒生物碱富集纯化最佳工艺及验证

3.3. 生物碱类化合物的鉴定

目录

全文HTML

1.1. 样品

作者简介:
杨贺英，硕士研究生，研究方向：中药活性成分，Email: yhy991231_zd@163.com

通讯作者: 苏　娟，博士，副教授，硕士生导师，研究方向：中药活性成分，Email: juansu_2008@126.com

1. 上海大学医学院, 上海 200444

2. 海军军医大学军事药学国家级实验教学示范中心, 上海 200433

作者简介:
杨贺英，硕士研究生，研究方向：中药活性成分，Email: yhy991231_zd@163.com

通讯作者: 苏　娟，博士，副教授，硕士生导师，研究方向：中药活性成分，Email: juansu_2008@126.com

1. School of Medicine, Shanghai University, Shanghai 200444, China

2. National Demonstration Center for Experimental Military Pharmacy Education, Naval Medical University, Shanghai 200433, China