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心力衰竭，简称心衰，是由于心脏器质性或功能性异常导致的心室充盈或射血能力受损所引起的复杂临床综合征[1]。随着人口老龄化程度不断加深以及许多患者从急性心脏疾病中存活，慢性心衰的患者数呈现增长态势，尽管过去30年其生存率有了显著提高，但5年病死率仍约为50%[2, 3]。慢性心衰因其高发病率和高病死率，长期以来一直是社会的主要医疗负担[4]。慢性心衰主要表现为射血分数降低的心衰，其药物治疗主要包括血管紧张素转换酶抑制剂或血管紧张素受体脑啡肽酶抑制剂、β受体阻滞剂、盐皮质激素受体拮抗剂、钠-葡萄糖协同转运体2抑制剂组成的四联疗法[5]。患者尤其是长期用药者，由于低血压、电解质紊乱等不良反应的影响，通常用药依从性欠佳。
传统中药在治疗心衰方面有着悠久的历史和独特的理论[6]，具有多靶点且成本较低等优势，如黄芪[7]。黄芪注射液是临床上治疗心衰的常用中药注射剂之一，疗效肯定[8]。大量研究已经证实了黄芪治疗心衰的有效性和安全性[9, 10]。黄芪甲苷是黄芪治疗心衰的主要活性成分[11]。但是，由于黄芪甲苷水溶性差，生物利用度极低，限制了黄芪甲苷药物制剂在临床上的转化[12, 13]。因此，黄芪甲苷可作为先导化合物，进行结构优化，既保持其原有的活性，又能增强其水溶性，以便增加生物利用度，充分发挥黄芪甲苷治疗心衰的作用。本研究主要从合成的系列水溶性黄芪甲苷衍生物中，筛选具有抗心衰效用的化合物，并初步探讨其对心肌重塑和心肌纤维化的改善作用，以期为临床提供抗心衰的候选新药。
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雄性C57BL/6小鼠150只，7~8周龄，体重为18~22 g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，合格证编号：20170012004976。动物实验严格遵守动物护理伦理指南进行操作，已通过海军军医大学动物实验伦理委员会批准。饲养环境为无特定病原体（SPF）环境，温度为（25±2 ）℃，每日光照12 h，昼夜循环，自由摄取标准饲料和饮用水。
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水溶性黄芪甲苷结构改造衍生物包括HHQ、HHQ12CS和HHQ18TC，HHQ进一步结构改造得到HHQ16和HHQ19，均由上海医药工业研究院孙青䶮教授提供。卡托普利、羧甲基纤维素钠（CMC-Na）、异氟烷均购自国药集团。内源性过氧化物酶封闭液、DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒、苏木素染色液购自碧云天公司。Masson复合染色试剂盒购自博谷德生物工程公司。Trizol试剂、逆转录试剂盒、SYBR Green Master Mix荧光定量试剂盒购自日本Takara公司。Target Retrieval Solution购自丹麦Dako公司。COL1、COL3抗体、TGF-β1抗体购自英国Abcam公司。αSMA抗体购自中国博奥森生物技术公司。
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呼吸机（意大利UgoBasile公司）；麻醉剂（中国惠德万邦公司）；二维及M型超声（意大利EsaoteMyLab公司）；诊断仪及探头（意大利One/Touch公司）；光学显微镜（德国Leica公司）；病理切片机（中国辅光精密仪器公司）；包埋机（中国BIOBASE博科公司）；组织摊片机（中国湖北孝感安立信公司）；高通量组织研磨仪（中国上海必横生物公司）；PCR扩增仪（德国Eppendorf公司）；Stepone Plus实时荧光定量PCR仪（美国AB applied biosystems公司）。
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通过2.5%异氟烷麻醉小鼠，气管插管接入呼吸机保持麻醉状态。开胸暴露心脏，在左心耳下缘约1 mm处用线缝扎冠状动脉，缝合后，待小鼠恢复自主呼吸，饲养3~4周，通过心超检测慢性心衰模型，从中筛选慢性心衰造模成功的小鼠（EF<50%）。
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首先对黄芪甲苷衍生物进行药效筛选。将LAD结扎造模成功后的小鼠随机分为模型组、卡托普利组、系列黄芪甲苷衍生物（HHQ、HHQ12CS、HHQ18TC）组、假手术组，共6组。造模后4周使用0.5%CMC-Na溶液配制黄芪甲苷衍生物，并按照小鼠每10 g体重0.1 ml进行灌胃给药，黄芪甲苷衍生物组分别给予10 mg/kg的HHQ、HHQ12CS、HHQ18TC，假手术组和模型组分别给予同等剂量的0.5%CMC-Na溶液，卡托普利组给予8.6 mg/kg卡托普利混悬液，每日给药1次，连续28 d。HHQ衍生物药效筛选分组同上，即造模成功的小鼠随机分为模型组、HHQ组、HHQ16组和HHQ19组、假手术组，一共5组。假手术组和模型组处理同上，HHQ衍生物组分别用10 mg/kg的HHQ、HHQ16、HHQ19灌胃，每日给药1次，连续28 d。
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通过吸入2.5%异氟烷气体麻醉小鼠，在检测过程中提供1.0%~1.5%浓度的异氟烷以维持麻醉状态。通过二维及M型超声诊断仪检测小鼠的心功能，筛选造模后的成功模型（EF<50%）以及评价给药后小鼠的心功能。主要检测指标有左室射血分数（LVEF）、左室短轴缩短率（LVFS）等参数。分别于给药18、28 d对各组小鼠进行心脏超声检测。
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对小鼠进行心脏超声检测之后称重，然后取心脏称重。计算心脏重量和体重的比值，即心体比（mg/g）。心脏标本用10%福尔马林固定24 h后，将心脏取出，排列整齐，拍照，观察心脏的大小和形态。取小鼠心脏组织于4%多聚甲醛中固定24 h后，常规石蜡包埋切片处理。用HE染色和Masson染色观察心脏大体形态及胶原形成。
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提取心肌组织总RNA，逆转录成cDNA，实时定量PCR体系包括：SYBR 10 μl，引物（上游引物和下游引物）1 μl，cDNA 3 μl，以及DEPC水7 μl，引物合成序列见表1。
表 1 引物合成序列
名称 上游引物 下游引物 COL1A1 TAAGGGTCCCCAATGGTGAGA GGGTCCCTCGACTCCTACAT COL3A1 ACGTAGATGAATTGGGATGCAG GGGTTGGGGCAGTCTAGTG αSMA GGACGTACAACTGGTATTGTGC TCGGCAGTAGTCACGAAGGA TGF-β1 GAGCCCGAAGCGGACTACTA TGGTTTTCTCATAGATGGCGTTG Gapdh GTATGACTCCACTCACGGCAAA GGTCTCGCTCCTGGAAGATG -
心脏组织于4%多聚甲醛组织固定液中固定。梯度乙醇脱水后将组织浸入热石蜡中，将浸好的石蜡放入包埋机中包埋。将组织进行横切后去石蜡，使用Target Retrieval Solution进行抗原修复操作。用内源性过氧化物酶封闭液消除内源性过氧化物酶的干扰。用1%牛血清白蛋白封闭，使用相应的特异性抗体进行染色，根据种属关系选择对应二抗染色。为了可视化染色，使用DAB显色，并用苏木素进行复染。
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实验处理及统计图表的绘制利用GraphPad Prism软件完成。实验结果均采用均数±标准误（mean ± SEM）的方式呈现。两组样本之间的比较采用两独立样本t检验（t-test）；两组以上两两之间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）或双因素重复方差分析（two-way ANOVA）。以P<0.05为差异有统计学意义。
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LVEF和LVFS是评价心衰的重要指标，心衰时LVEF和LVFS下降。如图1所示，阳性对照药卡托普利给药后增加18 d和28 d的LVEF和LVFS，以18 d最为显著，LVEF增长百分比为56%；黄芪甲苷衍生物HHQ、HHQ12CS、HHQ18TC均增加LVEF和LVFS，且呈时间依赖性，增强效果在3种药物之间无显著差异。以HHQ为例，LVEF增长百分比在18 d为61%，28 d为71%，优于同期的卡托普利。结合3种药物的合成难易性、稳定性、水溶性和药动学参数（数据在此不展示），HHQ可以作为进一步优化的候选化合物。
图 1 系列黄芪甲苷衍生物对慢性心衰小鼠心功能的影响（n=5~9）
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对上述筛选出来的HHQ药物进一步衍生化，使其具有更好的合成路线、稳定性、水溶性和药动学参数（数据不展示）。进一步以HHQ为对照，对其衍生物HHQ16和HHQ19进行药效评估。如图2所示，给药28 d，HHQ衍生物均能使得心衰小鼠的LVEF%和LVFS%升高，其中，HHQ16升高LVEF%的百分比为104%，HHQ19升高LVEF%的百分比为171%（图2A、图2B）；而HHQ升高LVEF%的百分比为99%。但HHQ19显著增加心率（HR）（图2C），而HR增加会导致心肌耗氧量增加，增加死亡率[14]。因此，3种HHQ衍生物均能提升心衰小鼠的心功能，综合上述因素，选择HHQ16为最优候选化合物。
图 2 HHQ衍生物对慢性心衰小鼠心功能的影响（n=7~10）
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进一步观察候选化合物HHQ16对心肌重塑的影响，初步探索其作用机制。如图3所示，与假手术组比较，模型组心脏显著变大，形态不规则，心体比显著升高（图3B）；HHQ16给药28 d后，心脏显著变小，心体比显著下降（图3A、图3B）。HE染色（图3C）表明，假手术组小鼠心肌细胞结构正常，模型组可见部分心肌细胞呈现区域性不规则，心肌细胞变大。HHQ16给药28 d后，形态变规则，心肌细胞肥大显著改善。
图 3 黄芪甲苷衍生物HHQ16对心脏大小及形态的影响
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进一步观察HHQ16对心肌纤维化的影响。首先通过Masson染色，观察胶原沉积。如图4所示，假手术组的心肌组织无胶原沉积。模型组的心肌组织胶原沉积增多；而HHQ16组给药28 d，心肌胶原沉积显著减少。COL1、COL3、αSMA和TGF-β1是评估心肌纤维化的重要指标[15]。免疫组织化学染色结果显示（图5），与假手术组比较，模型组COL1、COL3、αSMA蛋白表达水平显著升高，经HHQ治疗后，这些蛋白表达水平显著降低。基因水平也展示了相似的改变（图6），与假手术组比较，模型组COL1、COL3、αSMA和TGF-β1 mRNA表达水平显著升高，而HHQ16能显著降低这些纤维化指标的mRNA表达水平。以上结果表明，HHQ16可以改善心衰造成的心肌纤维化。
图 4 心肌组织Masson染色（×40）
图 5 心肌组织免疫组织化学染色（×400）
图 6 HHQ16对心衰小鼠心肌纤维化相关指标mRNA水平的影响
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心衰已经成为严重威胁人类健康的全球性公共卫生问题。越来越多的研究表明，由于“多靶点效应”，中药治疗心衰具有独特的优势，中药活性成分为新药开发提供了有价值的候选化合物。黄芪甲苷是治疗慢性心衰的中成药黄芪注射液的主要有效成分。然而，黄芪甲苷结构复杂，水溶性差，生物利用度低，化学合成困难，限制了该药物的临床转化。本研究涉及的水溶性黄芪甲苷衍生物均可显著改善心功能，最终根据化合物合成难易、药物稳定性、水溶性以及初步药动学比较，确定HHHQ16为最优候选药物。HHQ16具有抗心衰作用，对左冠状动脉前降支结扎模型诱导的慢性心衰小鼠有明确的治疗效果。
心肌重塑是由一系列复杂的分子和细胞机制导致的心肌结构、功能和表型的变化，包括心肌细胞肥大及心肌纤维化（心肌基质重构）等改变，以及在此基础上形成的心脏扩大、心脏质量增加。目前的研究认为，心肌重塑是心衰发生、发展的分子细胞学基础，是心衰恶化的主要机制之一。相关研究表明黄芪甲苷具有抗氧化、增强免疫力、增强心肌收缩力、减轻心肌纤维化和心肌重塑等作用[16-20]。通过对心衰小鼠表型观察，发现经过LAD手术后，模型组的心脏显著变大，心肌细胞变大，结构不规则，通过HHQ16治疗28 d后，心脏显著变小，心肌细胞接近正常，形态变规则。表明HHQ16能够改善心衰小鼠心肌重塑。
心肌纤维化被认为是心衰的基本病理变化，也是心肌重塑的分子基础[21]。心肌纤维化是当心肌因缺血、炎性反应、衰老等原因受损时，局部的心肌细胞凋亡，心肌成纤维细胞增殖，胶原纤维为主的细胞外基质增多，从而产生的一种病理变化。其主要特征是胶原蛋白合成和降解之间的平衡紊乱，导致心脏的深层结构和功能异常，造成收缩和舒张功能的严重损害，最终体现为心衰[22, 23]。心肌纤维化与心衰患者的疾病严重程度密切相关，但纤维化过程尚未成为心衰的直接治疗靶标。实验和临床证据均表明，心肌纤维化的改变可能是可逆的[22]，开发预防和逆转心肌纤维化的药物对于减轻心肌重塑和延缓心衰的发展至关重要。
胶原蛋白是细胞外基质的重要组分，其中COL1约占心脏胶原总量的85％，参与组成具有抗张强度的粗纤维，COL3约占11％，可组装成细纤维，以保持基质网的弹性[24]。在以心肌纤维化为特征的心脏疾病中，不管其病因如何，TGF-β1通常是导致纤维化的最后的、共同的中介物之一。TGF-β1是最重要的促纤维化生长因子之一，通过调节前胶原蛋白基因的表达，促进合成细胞外基质，促使心肌纤维化[25]。在肌成纤维细胞中，αSMA被组装成应力纤维，进一步导致细胞外基质蛋白过度沉积，减弱组织顺应性并加速心衰，肌成纤维细胞的分化是心肌纤维化反应的标志，其中，α-SMA的表达是此种分化的重要特征[26]。在本研究中，用Masson染色检测了小鼠的胶原，LAD手术可使小鼠胶原明显增多，而HHQ16给药治疗后能有效减少胶原沉积。通过免疫组化染色和qPCR检测了小鼠心肌纤维化相关指标，发现HHQ16可下调COL1、COL3以及αSMA蛋白水平的表达，并且下调COL1、COL3、αSMA和TGF-β1 mRNA水平的表达，从而改善LAD手术引起的心肌纤维化，改善心衰程度。
综上所述，本研究从黄芪甲苷衍生物对心衰小鼠的保护作用入手，筛选出改造后黄芪甲苷衍生物最优的候选化合物HHQ16，通过对心肌重塑和心肌纤维化相关指标的检测，初步研究了其在心衰治疗中的作用机制，为HHQ16治疗心衰的药物研发提供科学依据。
Efficacy and mechanism of astragaloside Ⅳ derivatives on chronic heart failure in mice
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摘要:
目的 对黄芪甲苷系列衍生物治疗慢性心力衰竭的药效学进行评价，筛选候选化合物，初步探讨候选化合物黄芪甲苷衍生物HHQ16抗心衰的作用机制。 方法 采用左冠状动脉前降支结扎四周诱导C57BL/6小鼠慢性心衰模型，将小鼠分为假手术组、模型组、阳性对照卡托普利组、系列黄芪甲苷衍生物组，共4组。小鼠灌胃给药4周，超声心动检测心功能，筛选出治疗心衰的最优黄芪甲苷衍生物HHQ16。进一步对HHQ16进行初步机制研究，通过大体形态学观察心脏的大小变化；HE染色观察心脏的病理变化；Masson染色观察心肌胶原沉积；免疫组化染色检测心肌纤维化指标Ⅰ型胶原（COL1）、III型胶原（COL3）、α平滑肌肌动蛋白（αSMA）蛋白水平变化；qPCR技术测定心肌纤维化指标COL1、COL3、αSMA和转化生长因子β1（TGF-β1）mRNA水平的变化。 结果 黄芪甲苷衍生物均能显著增加左室射血分数（LVEF）和左室短轴缩短率（LVFS），改善心功能，以HHQ16为最优化合物。与模型组相比，HHQ16组心脏体积显著减小，心肌肥大减轻，心肌组织胶原沉积显著下降，心肌纤维化指标COL1、COL3、αSMA和TGF-β1 mRNA水平以及COL1、COL3、αSMA蛋白水平显著降低。 结论 HHQ16是治疗小鼠心衰的最优黄芪甲苷衍生物，它通过改善心肌重塑，抑制心肌肥大和心肌纤维化，改善心功能。 Abstract:Objective To evaluate the pharmacodynamics of astragaloside Ⅳ derivatives for chronic heart failure, screen the candidate compounds and preliminarily explore the mechanism of the candidate compound HHQ16 against heart failure. Methods Chronic heart failure was induced by left anterior descending artery ligation in C57BL/6 mice for 4 weeks, and the mice were divided into 4 groups, including sham group, model group, positive control captopril group, and astragaloside Ⅳ derivatives group. After continuous intragastric administration for four weeks, the cardiac function was detected by echocardiography, and the optimal astragaloside Ⅳ derivative HHQ16 was selected for the treatment of heart failure. The preliminary mechanism for HHQ16 was further explored. The size of heart was observed by gross morphology; pathological changes were observed by HE staining; collagen deposition in the myocardium was observed by Masson staining; protein levels of myocardial fibrosis indexes COL1, COL3, and αSMA were detected by immunohistochemical staining, and mRNA levels of myocardial fibrosis indexes COL1, COL3, αSMA, and TGF-β1 were determined by qPCR technique. Results All astragaloside Ⅳ derivatives significantly improved cardiac function with increasing LVEF and LVFS, of which HHQ16 was the optimal compound. Compared with the model group, the heart volume of HHQ16 group was significantly reduced; myocardial hypertrophy was reduced; collagen deposition in myocardial tissues was reduced; and myocardial fibrosis indexes, COL1, COL3, αSMA and TGF-β1 mRNA levels, as well as the protein levels of COL1, COL3 and αSMA were significantly reduced. Conclusion HHQ16 is an optimal astragaloside Ⅳ derivatives for the treatment of chronic heart failure in mice, which could improve cardiac function by improving myocardial remodeling, and inhibit myocardial hypertrophy and myocardial fibrosis. -
苦参碱（Matrine）是传统中药苦参的主要活性成分[1]，是从苦参根中提取的生物碱类化合物，属于喹诺里西啶类生物碱，其化学结构见图1。苦参碱具有广泛的药理活性，包括抗肿瘤、抗病毒、抗纤维化、抗糖尿病、抗心衰、抗血小板和抗动脉粥样硬化等[2-4]。苦参碱存在着生物利用度低、化学稳定性差、生物毒性较高等一系列问题[5-6]。人们通过对苦参碱D环C-13、C-14和C-15位点的修饰，以及使D环的放开或融合等方法[7-9]，获得了一系列活性更高、毒性更低的苦参碱衍生物，如硫代苦参碱[10]、13-羟基乙胺苦参碱[11]、13-酰胺基取代苦参碱[12]等。目前，对于苦参碱衍生物的研究多聚焦于抗肿瘤的活性，充分了解并探索其抗炎活性及机制，有助于人们开发苦参碱衍生物在炎症性疾病中的应用。本文将就苦参碱及衍生物的抗炎作用及其机制进行综述，为药物研发及临床应用提供理论支持。
1. 苦参碱及衍生物在各系统疾病中抗炎作用的研究
炎症是一种高度受控的过程，它被多种信号通路调控以维持机体的稳态[13]。苦参碱及其衍生物可能通过调节多种细胞信号通路或分子靶标在多系统炎症性疾病中发挥治疗作用（图2）。
1.1 神经系统
苦参碱可以通过抑制髓鞘少突胶质细胞糖蛋白MOG35-55诱导的自身免疫性脑脊髓灰质炎（EAE）小鼠中枢神经中Wnt 家族成员 3A（Wnt3a）和β-连环蛋白（β-catenin）活化，激活糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β），降低Wnt3a/β-catenin通路中的两个靶基因G1/S-特异性周期蛋白-D1（cyclin-D1）和Axis抑制蛋白2（Axin2）的表达，促进少突胶质细胞（OL）的成熟和髓鞘修复功能，从而改善多发性硬化症（MS）动物模型的神经功能缺损[14]。苦参碱也可以通过抑制Ⅰ型星形胶质细胞的增殖与浸润，有效减轻中枢神经系统炎症促进神经再生，显著改善EAE 的临床评分[15]。
在阿尔茨海默病（AD）小鼠模型中，科研人员发现苦参碱可以降低海马组织中小胶质细胞的活性氧（ROS）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和IL-6水平，显著改善AD模型小鼠的学习和记忆功能[16]。
在脊髓损伤（SCI）的体外实验中，有研究发现苦参碱能够上调miR-9的表达来抑制c-Jun氨基末端激酶（JNK）和核因子κB（NF-κB）通路，并抑制IL-1β、IL-6和TNF-α的释放，保护大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC 12）免受脂多糖（LPS）诱导的炎症损伤[17]。
此外，苦参碱还能够通过增加视神经中神经丝蛋白（NFs）的表达，降低Iba1细胞（巨噬细胞/小胶质细胞）数量，上调B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）/BCL2相关X蛋白（Bax）的比率，从而减少炎性浸润、脱髓鞘和视网膜神经节细胞凋亡[18]。
1.2 呼吸系统
有研究表明，苦参碱可以通过抑制急性肺损伤模型中单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、IL-6和IL-8的表达，改善造模小鼠的肺组织损伤程度[19]。
在卵清蛋白（OVA）诱导的过敏性哮喘小鼠模型中，人们发现苦参碱可以通过抑制嗜酸性粒细胞趋化因子和Th2细胞因子的产生，显著降低哮喘小鼠的嗜酸性粒细胞浸润、减轻气道高反应性和气道炎症[20]。在过敏性哮喘小鼠模型和TNF-α诱导的人气管上皮细胞实验中，苦参碱可以减少IL-4、IL-6、IL-13和粘附分子的表达，抑制模型小鼠上皮细胞中的细胞因子信号传导抑制因子3 （SOCS3）表达，改善OVA诱导引发的气道高反应性、炎症细胞浸润、杯状细胞分化和黏液产生， 减少气管上皮细胞中促炎细胞因子的产生， 达到缓解哮喘症状的效果[21]。
1.3 消化系统
苦参碱可以抑制过氧化物酶增殖物激活受体-α（PPAR-α）信号通路，增加肠道巴氏杆菌的丰度，降低甘氏幽门螺杆菌的丰度[22]。在葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的溃疡性结肠炎小鼠模型中，苦参碱可以显著抑制炎性细胞因子水平，改善肠道屏障的完整性。
苦参碱衍生物能通过抑制MCP-1的产生和活性，减少炎症性Gr1hi单核细胞在肝脏中的浸润，从而明显减轻四氯化碳（CCl4）诱导的急性肝损伤和肝纤维化[23]。
1.4 风湿免疫系统
在胶原诱导的关节炎（CIA）小鼠模型中，人们观察到苦参碱衍生物MASM通过丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和NF-κB通路抑制炎症介质表达，诱导成纤维样滑膜细胞（RA-FLS）的凋亡来减轻CIA小鼠的关节炎严重程度，降低了CIA小鼠的炎症和关节破坏程度[24]。
1.5 循环系统
动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病，与炎症反应以及血管平滑肌细胞不受控制的增殖和过度凋亡有关。研究发现，苦参碱通过抑制NF-κB通路，降低氧化低密度脂蛋白（oxLDL）诱导的动脉粥样硬化模型中人主动脉血管平滑肌细胞的增殖和凋亡，表现出抗炎作用[25]。
在缺氧性肺动脉高压（HPAH）模型中，炎性细胞因子可浸润肺动脉血管，使肺动脉平滑肌细胞异常增殖，导致肺血管重构。人们发现苦参碱可降低大鼠α平滑肌肌动蛋白和肺动脉介质中增殖细胞核抗原（PCNA）的表达，降低TNF-α和IL-1β水平，将细胞周期延缓在S期，并降低p50、p65、PCNA、Bcl-2的表达，逆转缺氧诱导的肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）增殖和凋亡的失衡，降低大鼠右心室收缩压和平均肺动脉压，改善缺氧诱导的肺血管重塑（PVR）[26]。
1.6 其他
苦参碱可以提高小鼠调节性T细胞（Treg）细胞比例，降低CD4+/CD8+比例，减轻移植心脏的炎性细胞浸润，延长心脏移植小鼠的存活时间。更重要的是，苦参碱可以下调NF-κB通路，上调ERK 1/2信号通路，抑制小鼠树突状细胞（DCs）成熟，减少同种异体心脏的氧化损伤和凋亡[27]。
研究发现，在特应性皮炎（AD）小鼠模型和TNF-α/IFN-γ处理的人表皮角质形成细胞（HaCaT）模型中，苦参碱可以减少T淋巴细胞和肥大细胞浸润，抑制CD4+ T细胞分化，调节Th1/Th2炎症反应，抑制Hsp90/NF-κB信号轴来抑制TNF-α/IFN-γ处理的HaCaT细胞炎性因子分泌，从而减轻AD的症状[28]。
无乳链球菌是牛乳腺炎的主要致病菌，在其诱导的乳腺炎体外模型中，可导致牛乳腺上皮细胞 （BMEC）细胞凋亡，研究发现，苦参碱可以抑制NF-κB和MAPK信号通路，显著下调IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等促炎细胞因子的产生并预防BMEC细胞损伤[29]。
在金黄色葡萄球菌脂磷壁酸（LTA）诱导的小鼠子宫内膜炎模型中，苦参碱可以抑制Toll样受体2（TLR2）的表达及其下游NF-κB的活化，降低TNF-α和IL-1β的表达，发挥对子宫内膜细胞的保护作用[30]。在临床试验中，应用苦参碱治疗慢性盆腔炎，苦参碱组患者的血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平显著低于对照组，苦参碱组疗效明显优于对照组[31]。
2. 苦参碱及衍生物的抗炎作用机制
2.1 对炎症细胞的调节作用
在肽聚糖、脂蛋白等因子的刺激作用下，巨噬细胞发生极化并表现出两种主要表型M1和M2。其中，M1型巨噬细胞产生炎性细胞因子，M2型巨噬细胞则参与炎症的消退和修复[3]。研究表明，苦参碱可以抑制M1巨噬细胞侵袭与浸润，促进M1型巨噬细胞向M2型转化，降低M1/M2的比例，发挥抗炎作用[32]。
中性粒细胞是炎症反应的重要调节剂，它能够表达和产生多种细胞因子参与炎症过程，如IL-1β、IL-6和IL-17等。这些细胞因子在疾病的炎症反应中发挥重要作用。有研究表明，在香烟烟雾暴露诱导的肺炎小鼠模型中，苦参碱能够显著降低其支气管肺泡灌洗液 （BALF） 中嗜中性粒细胞数量，减轻肺部炎症和损伤。进一步研究发现， 苦参碱不是参与抑制中性粒细胞相关的细胞因子及趋化因子， 而是通过诱导中性粒细胞凋亡来起到调节炎症反应的作用[33]。 此外， 苦参碱也可以通过抑制细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、 血管细胞粘附分子-1（VCAM-1）来减少中性粒细胞与病变组织的黏附改善炎症反应[34]。
2.2 炎症相关信号通路的影响
苦参碱及衍生物可以抑制包括NF-κB、JAK2/STAT3、MKK/p38 MAPK信号通路在内的多种炎症信号通路的激活，从而减少炎症因子的分泌，起到抗炎的效果，这也是苦参碱及衍生物发挥抗炎作用的最主要机制。其对各通路的影响汇总并阐述如下（图3）。
2.2.1 一氧化氮信号通路
一氧化氮（NO）是人体内重要的调节分子，诱导型一氧化氮合酶（iNOS）是产生NO的上游调节因子。多种炎症刺激可触发iNOS产生NO，并引发炎症反应。有研究表明，在LPS刺激的RAW 264.7细胞中，氧化苦参碱可以显著抑制iNOS的过表达，从而减少NO水平[35]。
2.2.2 NF-κB信号通路
NF-κB通路在许多生物过程的调节中起着至关重要的作用，是一种典型的促炎症信号通路，与炎症因子TNF和IL的分泌密切相关[27]。苦参碱可以通过刺激上调钙敏感受体的表达，来抑制NF-κB信号通路的激活，从而保护肠脏器并恢复肠屏障的完整性[36]。
氧化苦参碱能够抑制NF-κB和MAPKs信号通路，显著减轻LPS诱导的乳腺损伤[37]；苦参碱可以上调miRNA-9的表达，通过抑制JNK和NF-κB通路，从而改善LPS诱导的PC 12细胞炎症损伤，减轻小鼠脊髓损伤的继发性损伤[17]。苦参碱通过NF-κB通路减弱HAVSMCs中的异常生物反应，减少oxLDL诱导的血管平滑肌细胞异常增殖和过度凋亡，表现出抗炎作用[25]。苦参碱衍生物MASM可显著减轻LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞和RAW264.7细胞中NF-κB通路的激活，减少了TNF-α、IL-6和NO/iNOS的释放[38]。苦参碱也可以通过抑制NF-κB和MAPK途径的活化，抑制LPS刺激的人肺上皮A549细胞中环氧合酶-2（COX-2）和ICAM-1的转录和表达[19]。
2.2.3 JAK2/STAT3信号通路
JAK2/STAT3通路的异常激活与一些炎性疾病的进展密切相关，包括关节炎、肝炎、肾炎和溃疡性结肠炎等。苦参碱可阻断JAK2/STAT3信号通路，抑制DSS诱导的肠上皮细胞促炎因子水平、髓过氧化物酶（MPO）活性、NO产生和细胞凋亡[39]。苦参碱能够抑制脓毒症诱导的沉默信息调节因子1（SIRT-1）下调和NF-κB p65亚基和p53的去乙酰化，减少肺中M1型巨噬细胞的浸润数量，增加M2型巨噬细胞浸润，减轻脓毒症诱导的肺损伤 [32]。
2.2.4 MKK/p38 MAPK信号传导途径
P38 MAPK信号通路在许多细胞类型中诱导炎症反应。p38 MAPK的激活依赖于其上游激酶MKK3和MKK6的磷酸化。研究发现ox-LDL暴露后显著促进MKK3、MKK6和p38的磷酸化，激活p38 MAPK炎症信号通路。而苦参碱能够通过抑制MKKs/p38 MAPK信号通路来减轻ox-LDL诱导的炎症，减少ox-LDL诱导的THP-1细胞ROS产生，发挥抗炎作用[3]。苦参碱能够抑制无乳链球菌诱导的BMEC细胞NF-κB、IκBα、p38和ERK磷酸化水平升高，抑制IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA，减少无乳链球菌感染引起的BMEC损伤[29]。
2.2.5 Toll样受体通路
TLR4位于多种促炎细胞表面，是炎症反应中的主要受体。LPS激活免疫细胞中的TLR4启动信号级联，触发NF-κB通路的激活，从而导致后续一系列细胞因子和炎症介质的产生。研究发现，氧化苦参碱可以通过抑制TLR4的表达而减少NF-κB的活化，下调TLR4/NF-κB通路，抑制LPS刺激诱导的炎症反应[35]。炎症介质高迁移率族蛋白1（HMGB 1）是一种非组蛋白DNA结合蛋白，具有多种生物学效应，在炎症过程中，HMGB1可以通过结合TLR4，从而激活NF-κB信号通路，促进促炎细胞因子的转录。自身免疫性脑脊髓炎的发生发展便与这一通路的激活密切相关，有研究发现，苦参碱可抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信号传导，减少炎症因子的产生，抑制炎性细胞浸润，从而减轻脑脊髓炎模型小鼠的炎性损伤[40]。
2.2.6 热休克蛋白通路
热休克蛋白60（HSP 60）于细胞外释放结合TLR4，可以刺激神经元细胞加重炎症反应。苦参碱可以通过抑制HSP60/TLR4/MyD88信号传导通路，抑制LPS诱导的小胶质细胞活化，发挥神经保护和抗炎作用[41]。苦参碱可以抑制炎性细胞因子-胸腺活化调节趋化因子TARC/CCL17和IL-6分泌，改善AD小鼠的炎症反应；苦参碱还可以通过抑制 Hsp90/NF-κB 信号轴来调节 Th1/Th2 炎症反应，从而缓解特应性皮炎[28]。
3. 总结与展望
苦参碱是从传统中药中提取出来的一种天然成分，具有相当大的药用价值。目前在炎症相关疾病中研究较为深入的苦参碱类生物碱主要包括苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱3种。三者之中，苦参碱在多系统多器官的炎症性疾病中都有广泛研究；氧化苦参碱在支气管哮喘[42]、溃疡性结肠炎[43]的动物模型中表现出了一定的治疗效果；槐果碱则主要在类风湿性关节炎[44]、脓毒症[45]的动物模型中表现出了疗效。考虑到成药性，苦参碱的药理活性低、体内药效维持时间短，其临床应用局限很大，仅能偶尔作为辅助药物使用。因此，研究人员对苦参碱进行了结构修饰，提高了其药理活性，改善了其药代动力学特点，苦参碱衍生物在动物实验中表现出了明确的有效性和安全性。例如，苦参碱衍生物MASM已被证实在小鼠关节炎[24]和脓毒症等模型[38]中表现出较好的治疗效果。在实际临床工作中，对于严重感染引发的急危重症脓毒症，患者的致残致死率极高，给临床工作带来极大困难，如果联合应用安全有效的苦参碱衍生物可能会取得很好的疗效，苦参碱衍生物的临床应用前景值得期待。
与此同时，目前对于苦参碱及其衍生物在抗炎机制研究还不够深入，目前大部分研究还是集中在其抑制炎症相关通路（如NO、NF-κB、MAPK等）以及减少炎症因子分泌（IL-1β、IL-6、TNF-α等）的探讨上，缺乏对其特异性靶点的探索。此外，目前合成苦参碱衍生物通常需要经过多步合成反应，制备工艺还相对复杂，且有些合成产物的稳定性差，易被氧化或降解，距离产业化和临床应用还有较长的一段路要走。综上所述，苦参碱及其衍生物在炎症相关疾病中的应用是一个富有前景的研究方向，仍有许多极富价值的课题有待科研人员去探索和解决。
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图 1 系列黄芪甲苷衍生物对慢性心衰小鼠心功能的影响（n=5~9）
A.左室射血分数（LVEF，%）；B.左室短轴缩短率（LVFS，%）*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001, 与0 d比较。
图 2 HHQ衍生物对慢性心衰小鼠心功能的影响（n=7~10）
A.左室射血分数（LVEF，%）；B.左室短轴缩短率（LVFS，%）；C.心率（HR）**P<0.01，***P<0.001，与0 d比较。
图 6 HHQ16对心衰小鼠心肌纤维化相关指标mRNA水平的影响
A.COL1；B.COL3；C.αSMA；D.TGF-β1*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与模型组比较。
表 1 引物合成序列
名称 上游引物 下游引物 COL1A1 TAAGGGTCCCCAATGGTGAGA GGGTCCCTCGACTCCTACAT COL3A1 ACGTAGATGAATTGGGATGCAG GGGTTGGGGCAGTCTAGTG αSMA GGACGTACAACTGGTATTGTGC TCGGCAGTAGTCACGAAGGA TGF-β1 GAGCCCGAAGCGGACTACTA TGGTTTTCTCATAGATGGCGTTG Gapdh GTATGACTCCACTCACGGCAAA GGTCTCGCTCCTGGAAGATG 
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