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对萼猕猴桃Actinidia valvata Dunn是猕猴桃科猕猴桃属中型落叶藤本植物，分布于安徽、浙江、江西等地[1]。其根和根茎作猫人参入药，具有清热解毒、消肿的功效[2]，临床常用于治疗肺癌、肝癌及消化道肿瘤[3]。随着猫人参药材的需求量不断增加，在生产过程中，有大量的枝叶未得到有效利用，造成了自然资源的浪费。从中药资源开发利用的角度出发，课题组前期首次对非传统药用部位对萼猕猴桃叶进行了大量研究，发现对萼猕猴桃叶中含有较多的黄酮类成分，具有较强的抗心肌缺血作用和抗氧化活性[4-7]。其中对萼猕猴桃苷E是课题组首次从对萼猕猴桃叶中发现的新黄酮苷类化合物，在叶中含量高，药理活性显著，具有很好的开发前景。作为一个新化合物，如何得到高纯度的对萼猕猴桃苷E并对其进行开发利用，成为一项亟待解决的问题。因此，本文以对萼猕猴桃苷E为研究对象，对其提取分离纯化工艺进行优化，以此获得高纯度的对萼猕猴桃苷E，为后续对萼猕猴桃苷E的药代动力学研究及药理活性研究奠定物质基础。
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Agilent 1200型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司）；2500Y多功能粉碎机（永康市铂欧五金制品有限公司）；BT25S十万分之一电子天平（德国塞利多斯公司）；SYG-A2-6电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）；SHZ-Ⅲ型循环水真空泵（上海亚荣生化仪器厂）；RE-52AA型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；DHG-9123A型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；IS-RDV1恒温振荡器（苏州捷美电子有限公司）。
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对萼猕猴桃苷E（纯度≥98%，自制）；无水乙醇、乙酸乙酯、甲醇为分析纯试剂（上海泰坦科技股份有限公司）；甲酸（上海麦克林生化科技股份有限公司）、乙腈（德国Merck公司）、甲醇（上海泰坦科技股份有限公司）为色谱纯试剂；娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）；D101型、AB-8型、DM130型、HPD100型、NKA-9型大孔吸附树脂（北京瑞达恒辉科技发展有限公司）；柱层析硅胶（100~200目、200~300目，青岛海洋化工有限公司）；ODS填料（日本YMC公司）。
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对萼猕猴桃叶样品为2008年5月采自浙江省衢州市常山县，经海军军医大学辛海量教授鉴定为猕猴桃科猕猴桃属植物对萼猕猴桃Actinidia valvata Dunn的叶。样品于60 ℃烘箱烘干，粉碎过三号筛，得对萼猕猴桃叶粉末，置干燥器中密封保存。
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色谱柱：Agilent TC-C18（4.6 mm×250 mm, 5 µm）；流动相：0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）（梯度洗脱：0~35 min, 10%~40% B）；流速：1 ml/min；柱温：26 ℃；检测波长：265 nm；进样量：10 µl。对照品及样品色谱图见图1。
图 1 对萼猕猴桃苷E对照品（A）和对萼猕猴桃叶提取液（B）HPLC图
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精密称取对萼猕猴桃苷E对照品15.77 mg，置于10 ml容量瓶中，加色谱纯甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得浓度为1.577 mg/ml的对萼猕猴桃苷E对照品溶液，过0.45 µm微孔滤膜，备用。
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精密称取对萼猕猴桃叶粉末2 g，置于250 ml圆底烧瓶中，加入55%乙醇50 ml，95 ℃回流提取1 h，过滤后滤液定容至50 ml，摇匀，经0.45 µm微孔滤膜过滤，备用。
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（1）线性关系考察
精密吸取对萼猕猴桃苷E对照品溶液0.15、0.3、0.6、1.2、2.4、5.0 ml，分别置于5 ml容量瓶中，色谱纯甲醇溶解定容，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定。以对萼猕猴桃苷E浓度（mg/ml）为横坐标（c），其峰面积（mAU*s）为纵坐标（A），绘制标准曲线。回归方程为A =
11127 c+31.985，R2=0.9998 ，表明对萼猕猴桃苷E在0.047~1.577 mg/ml范围内与其峰面积线性关系良好。（2）精密度试验
精密吸取同一浓度的对萼猕猴桃苷E对照品溶液连续进样6次，记录其峰面积，相对标准偏差（RSD）为1.29%，表明仪器精密度良好。
（3）稳定性试验
精密称取对萼猕猴桃叶粉末2 g，按“2.1.3”项下方法进行制备，分别于室温0、4、8、12、16、24 h进样测定，记录峰面积，RSD为0.21%，表明供试品溶液在室温条件下24 h内稳定性良好。
（4）重复性试验
称取对萼猕猴桃叶粉末6份，每份2 g，按“2.1.3”项下方法进行制备，进样测定并记录峰面积，RSD为1.07%，表明该方法重复性良好。
（5）加样回收率试验
精密称取已知对萼猕猴桃苷E含量的对萼猕猴桃叶粉末9份，每份1 g，分别加入相当于本底量80%、100%、120%的已知浓度的对萼猕猴桃苷E对照品溶液，按“2.1.3”项下方法进行制备，进样分析并计算加样回收率。对萼猕猴桃苷E的平均加样回收率为101.16%，RSD为1.95%，表明该方法准确可靠。
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以对萼猕猴桃苷E的含量为指标，单因素考察乙醇浓度、料液比、提取时间、提取温度对对萼猕猴桃苷E含量的影响，并通过四因素三水平L9（34）正交试验优选对萼猕猴桃苷E的最佳提取工艺。
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（1）乙醇浓度考察
精密称取6份对萼猕猴桃叶粉末，每份5 g，按料液比1∶10分别加入45%、55%、65%、75%、85%、95%乙醇，90 ℃回流提取1 h，滤液定容至50 ml，测定对萼猕猴桃苷E含量。结果表明，对萼猕猴桃苷E的含量随乙醇浓度的增加呈现先升高后降低的趋势，当乙醇浓度为65%时对萼猕猴桃苷E含量最大（图2A）。
图 2 单因素对对萼猕猴桃苷E含量的影响
（2）料液比考察
精密称取6份对萼猕猴桃叶粉末，每份5 g，分别按料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35加入65%乙醇，90 ℃回流提取1 h，滤液定容至相应体积。结果表明，料液比过大时，对萼猕猴桃苷E含量下降，其在料液比为1:25时含量最大（图2B）。
（3）提取时间考察
精密称取6份对萼猕猴桃叶粉末，每份5 g，按料液比1:25加入65%乙醇，90 ℃回流提取1次，提取时间分别为0.5、1、1.5、2、2.5、3 h，滤液定容至125 ml。结果表明，对萼猕猴桃苷E含量在提取时间为1 h时最大（图2C）。
（4）提取温度考察
精密称取6份对萼猕猴桃叶粉末，每份5 g，按料液比1:25加入65%乙醇，分别于50、60、70、80、90、100 ℃回流提取1 h，滤液定容至125 ml。结果表明，对萼猕猴桃苷E含量随着提取温度的升高而不断增加，温度升高到90 ℃时，对萼猕猴桃苷E含量骤然提升，当提取温度为100 ℃时其含量最大（图2D）。
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根据单因素实验考察结果，确定影响对萼猕猴桃苷E提取率的因素为乙醇浓度（A）、料液比（B）、提取时间（C）、提取温度（D）4个因素，每个因素选取3个水平，设计L9（34）正交表进行正交试验，优化对萼猕猴桃苷E的提取工艺。重复试验正交结果及直观分析见表1，方差分析见表2，结果表明，影响对萼猕猴桃苷E含量的主次因素为提取温度>乙醇浓度>料液比>提取时间，其中提取温度和乙醇浓度有显著性差异（P < 0.05）。综合考虑，确定对萼猕猴桃苷E的最佳提取工艺为A1B2C2D2，即以对萼猕猴桃叶粉末25倍量的55%乙醇，95 ℃回流提取1 h。
表 1 L9（34）正交试验结果及直观分析（n = 3）
编号 A（%） B（w/V） C（t/h） D（T/ ℃） 对萼猕猴桃苷E含量（mg/g） 1 2 3 1 55（1） 1∶20（1） 0.5（1） 90（1） 7.94 7.98 7.87 2 55（1） 1∶25（2） 1（2） 95（2） 7.99 7.98 8.09 3 55（1） 1∶30（3） 1.5（3） 100（3） 7.89 7.85 7.98 4 65（2） 1∶20（1） 1（2） 100（3） 7.87 7.81 7.77 5 65（2） 1∶25（2） 1.5（3） 90（1） 7.85 7.99 7.97 6 65（2） 1∶30（3） 0.5（1） 95（2） 7.91 7.93 8.05 7 75（3） 1∶20（1） 1.5（3） 95（2） 7.91 7.91 7.81 8 75（3） 1∶25（2） 0.5（1） 100（3） 7.84 7.75 7.81 9 75（3） 1∶30（3） 1（2） 90（1） 7.88 7.97 7.87 K1 71.57 70.87 71.08 71.32 K2 71.15 71.27 71.23 71.58 K3 70.75 71.33 71.16 70.57 k1 7.95 7.87 7.90 7.92 k2 7.91 7.92 7.91 7.95 k3 7.86 7.93 7.91 7.84 R 0.09（2） 0.05（3） 0.02（4） 0.11（1） 表 2 对萼猕猴桃叶提取工艺方差分析
方差来源 离均差平方和 自由度 均方 F值 P值 A 0.037 2 0.019 4.989 0.019* B 0.014 2 0.007 1.856 0.185 C 0.001 2 0.001 0.167 0.847 D 0.061 2 0.031 8.161 0.003** 误差 0.067 18 0.004 合计 0.181 26 注：f1=2，f2=18，F0.05（2, 18）=3.55；*P<0.05，**P<0.01. -
根据优选出的提取方法制备3份对萼猕猴桃叶提取液，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，所测对萼猕猴桃叶中对萼猕猴桃苷E的提取率为99.32%，得率为0.80%，RSD均小于1%，表明所选工艺稳定，可用于对萼猕猴桃叶中对萼猕猴桃苷E的提取。
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（1）大孔树脂预处理
取5种型号的大孔树脂D101、AB-8、DM130、HPD100、NKA-9适量，置于250 ml锥形瓶内，倒入高于树脂层3 cm的95%乙醇，置摇床振摇12 h，继续用95%乙醇洗涤，直至洗涤液不浑浊。然后加入蒸馏水至摇床振摇清洗，直至无醇味。
（2）大孔树脂型号的筛选
精密称取已处理的上述树脂各0.5 g，置于50 ml具塞锥形瓶中，分别加入最佳提取工艺制备的对萼猕猴桃叶浓缩提取液10 ml，盖紧瓶塞，置于恒温振荡器中振摇12 h（150 r/min），达到饱和吸附后过滤，收集未吸附溶液，测定未吸附液中对萼猕猴桃苷E的含量，计算各树脂的吸附率。将上述静态吸附过的树脂用吸水纸吸干溶液，各用10 ml 75%乙醇溶液解吸附，相同条件下振摇，收集解吸附液，测定溶液中对萼猕猴桃苷E的含量，计算各树脂的解吸附率。结果见表3，综合吸附和解吸附性能考虑，最终根据权重大小选择D101型大孔树脂进行后续实验。
表 3 不同型号大孔树脂对对萼猕猴桃苷E静态吸附和解吸附的测定结果
树脂型号 吸附率（%） 解吸率（%） 权重（%） D101 91.54 96.67 88.49 AB-8 88.71 98.01 86.94 DM130 62.10 89.80 55.76 HPD100 87.82 97.25 85.41 NKA-9 87.15 97.64 85.09 （3）上样液浓度考察
称取5份已处理的D101大孔树脂20 g，湿法装柱，分别加入浓度为0.07、0.16、0.24、0.33、0.55 mg/ml的对萼猕猴桃叶提取液5 ml，完全吸附后加3 BV水除杂，3 BV 95%乙醇洗脱，收集洗脱液，测定洗脱液中对萼猕猴桃苷E的量。结果表明，对萼猕猴桃苷E的转移率随上样液浓度的增加而升高（图3A），当上样液浓度大于0.55 mg/ml时，其流动性变差，不予考虑，因此选择0.55 mg/ml作为合适的上样液浓度。
图 3 D101型大孔树脂纯化对萼猕猴桃叶提取液工艺考察结果
（4）吸附流速考察
称取3份已处理的D101大孔树脂20 g，湿法装柱，量取浓度为0.55 mg/ml的上样液5 ml，分别以0.5、1、2 ml/min的流速上柱吸附，完全吸附后加3 BV水除杂，3 BV 95%乙醇洗脱，收集洗脱液，测定对萼猕猴桃苷E的量。结果表明，吸附流速增大，对萼猕猴桃苷E的转移率下降（图3B），故选择0.5 ml/min作为合适的吸附流速。
（5）最大上样体积考察
称取已处理的D101大孔树脂20 g（1 BV=30 ml），湿法装柱，制备一定体积的浓度为0.55 mg/ml的上样液，吸附流速为0.5 ml/min，收集流出液（每15 ml收集1管），根据泄露曲线确定最大上样量。结果表明，当上样体积大于12 BV时，流出液中检测到对萼猕猴桃苷E，且泄露量逐渐增大（图3C），因此确定上样量为12 BV。
（6）梯度洗脱曲线考察
称取已处理的D101大孔树脂20 g，湿法装柱，量取浓度为0.55 mg/ml的上样液12 BV，吸附流速为0.5 ml/min，完全吸附后，加水和10%、30%、50%、70%、95%乙醇各4 BV依次洗脱，收集各段洗脱液，每1 BV为1份。结果显示，水和10%乙醇洗脱液中有极少量的对萼猕猴桃苷E，其主要集中在30%和50%乙醇洗脱液中（图3D），故选择水和10%乙醇除杂，50%乙醇洗脱。
（7）除杂溶剂用量考察
称取已处理的D101大孔树脂20 g，湿法装柱，量取浓度为0.55 mg/ml的上样液12 BV，以0.5 ml/min的流速上样吸附，加水和10%乙醇除杂，均冲洗10 BV，按柱体积收集各段除杂液，将其烘干称重。结果表明，水和10%乙醇除杂液烘干质量均在第5 BV后无明显变化（图3E），因此除杂体积均控制在5 BV。
（8）洗脱溶剂用量考察
称取已处理的D101大孔树脂20 g，湿法装柱，量取浓度为0.55 mg/ml的上样液12 BV，吸附流速为0.5 ml/min，依次加水和10%乙醇各5 BV除杂，50%乙醇洗脱10 BV，收集洗脱液，测定洗脱液中对萼猕猴桃苷E的量。结果表明，7 BV后洗脱液中对萼猕猴桃苷E的量基本可以忽略（图3F），因此选择50%乙醇洗脱液的用量为7 BV。
（9）D101型大孔树脂柱纯化对萼猕猴桃苷E工艺验证
称取已处理的D101型大孔树脂20 g，湿法装柱，量取浓度为0.55 mg/ml的上样液12 BV，以0.5 ml/min的流速进行动态吸附，完全吸附后，依次加水和10%乙醇各5 BV除杂，50%乙醇7 BV洗脱，除杂和洗脱流速均为2 ml/min，收集洗脱液，测定对萼猕猴桃苷E的含量，计算该步骤中对萼猕猴桃苷E的转移率，并将洗脱液浓缩干燥至恒重，备用。结果表明，在大孔树脂纯化步骤中，对萼猕猴桃叶中对萼猕猴桃苷E的转移率为91.36%。该纯化工艺稳定可行，可用于对萼猕猴桃叶提取液的纯化。
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（1）硅胶柱装填
称取200~300目硅胶适量，用初始比例的洗脱液充分溶胀后湿法装柱，尽可能地排出柱子中的气泡，待其沉降后加入洗脱液充分冲洗压实，直至硅胶层界面不再下降。收集D101型大孔树脂50%乙醇洗脱部分所得的干燥样品，适量甲醇溶解后与100~200目硅胶按质量比1∶1~1∶1.5于50 ℃水浴锅上充分混匀蒸干，干法上样后在其表面加一层空白硅胶，以不同比例的洗脱液洗脱，收集各段洗脱液，测定对萼猕猴桃苷E的含量。
（2）不同洗脱系统的考察
①二氯甲烷-甲醇洗脱系统的考察：采用湿法装柱干法上样的方式进行硅胶柱色谱，依次用二氯甲烷-甲醇15∶1、10∶1、8∶1、5∶1、3∶1、1∶1、1∶5、0∶1洗脱，每个梯度洗脱5 BV，收集各段洗脱液，测定对萼猕猴桃苷E的含量。结果表明，对萼猕猴桃苷E主要集中在10∶1和8∶1洗脱部位（图4A），可选择二氯甲烷-甲醇8∶1洗脱5 BV进行硅胶柱色谱。
图 4 硅胶柱色谱不同洗脱系统考察结果
②乙酸乙酯-乙醇洗脱系统的考察：依次用乙酸乙酯-乙醇20∶1、15∶1、10∶1、8∶1、5∶1、3∶1、1∶1、1∶5、0∶1洗脱，其余步骤同上。结果显示，对萼猕猴桃苷E在10∶1条件下基本已完全洗脱（图4B），因此可选择乙酸乙酯-乙醇洗脱系统10∶1洗脱5 BV。
在硅胶柱色谱实验中，使用上述两种洗脱体系所得对萼猕猴桃苷E的转移率分别为82.09%、83.21%，两者相差不大，考虑到洗脱溶剂的毒性安全性问题，选择乙酸乙酯-乙醇系统作为硅胶柱色谱步骤的洗脱体系。
（3）硅胶柱纯化对萼猕猴桃苷E工艺验证
硅胶柱色谱采用湿法装柱干法上样的方式进行操作，上样后以乙酸乙酯-乙醇10∶1洗脱5 BV，收集洗脱液，测定洗脱液中对萼猕猴桃苷E的含量，得该步骤对萼猕猴桃苷E的转移率为83.52%。
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将浸泡在甲醇中的ODS填料倒入色谱柱中，待其沉降完全后以初始洗脱比例30%甲醇溶液置换柱子中的纯甲醇溶液。将硅胶柱色谱所得的洗脱液浓缩干燥后用少量甲醇溶解过滤膜后进行湿法上样，待样品完全吸附后，依次用30%、40%、50%甲醇各洗脱2 BV，分段收集50%甲醇洗脱部分，通过液相色谱结果进行合并，合并液再次以相同条件进行ODS柱色谱，最终得到较纯的对萼猕猴桃苷E单体化合物（图5），该步骤中对萼猕猴桃苷E的转移率为70.37%，其纯度为99.9%，表明该方法分离纯化效果较好。
图 5 ODS柱色谱所得对萼猕猴桃苷E的HPLC图
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按照优选的对萼猕猴桃苷E提取分离纯化方法对其工艺进行验证。称取对萼猕猴桃叶粉末25 g，以25倍量55%乙醇95 ℃回流提取1 h，滤液减压浓缩。将已处理的D101型大孔树脂进行湿法装柱，量取浓度为0.55 mg/ml的上样液12 BV，吸附流速为0.5 ml/min，依次加水和10%乙醇各5 BV除杂，50%乙醇7 BV洗脱，洗脱液浓缩干燥。硅胶柱采用湿法装柱干法上样的方式进行柱色谱，上样后以乙酸乙酯-乙醇10:1洗脱5 BV，收集并浓缩干燥洗脱液。ODS柱经上样后依次用30%、40%、50%甲醇各洗脱2 BV，分段收集50%甲醇洗脱部分，较纯部分合并后再次以相同条件进行ODS柱色谱，最终得到黄色粉末状物质，HPLC进样检测，与对照品比对后确定该物质为对萼猕猴桃苷E。该提取分离纯化工艺所得对萼猕猴桃苷E的转移率为53.70%，得率为0.35%，纯度为99.9%，表明该方法稳定可行，可用于对萼猕猴桃叶中对萼猕猴桃苷E的提取分离纯化。
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中药的提取方法包括热回流提取、水煎煮提取、超声辅助提取等方法[8]，在前期提取方法及提取试剂的考察中，我们使用了水及不同浓度的乙醇考察提取溶剂对对萼猕猴桃叶中对萼猕猴桃苷E提取率的影响，结果表明，乙醇浓度在60%左右时其提取率最大。此外，通过对超声提取法、热回流提取法及渗漉法三种提取方法的比较，发现热回流提取法具有时间较短、节省溶剂、提取率较大的优势，因此在本实验中选用乙醇回流提取法进行单因素考察和正交试验。
在回流提取实验的单因素考察中，除了乙醇浓度、料液比、提取时间和提取温度外，提取次数也是一个重要的考察因素。本实验发现，第2次回流提取所得的提取液中对萼猕猴桃苷E含量极低，基本可以忽略，因此在实验中确定提取次数为1次。
大孔吸附树脂柱色谱是分离纯化黄酮类化合物常用的方法之一[9]，其吸附与解吸附性能对化合物的转移率有很大影响。本实验中，我们对D101型大孔树脂进行静态吸附与解吸附动力学考察，分别在不同时间点吸取未吸附液及解吸附液，测定对萼猕猴桃苷E的含量。结果显示，D101型大孔树脂属于慢速吸附型树脂，在上样时，应尽量降低流速，增加样品与树脂的接触时间，其解吸附能力较强，洗脱时可加大流速。
葡聚糖凝胶柱和ODS柱常作为化合物精制纯化的关键一步。前者主要是依据分子筛原理，由于化合物的分子量不同，在凝胶柱中受到的阻滞作用也不同，导致分子量大的化合物先被洗脱下来[10]；后者是根据化合物极性的不同进行分离的，由于反相柱中固定相极性小于流动相极性，致使极性较大的化合物先从柱中流出。在硅胶柱色谱后，我们发现对萼猕猴桃叶洗脱液中主要成分为两个黄酮苷类化合物，两者结构式仅有一个乙酰基之差，使用葡聚糖凝胶柱始终无法完全分离。其中对萼猕猴桃苷E的极性与另一黄酮类化合物相比极性较小，通过高效液相色谱可以将两个化合物分离，且分离度较好。因此，选用ODS反相柱进行纯化，最终得到对萼猕猴桃苷E单体化合物。
本实验从中药资源非药用部位的开发利用角度出发，对对萼猕猴桃叶进行研究，首次设计出一条稳定可行、重复性好的提取分离纯化工艺从对萼猕猴桃叶中分离得到对萼猕猴桃苷E，整个工艺操作简易，提取效率高，所得对萼猕猴桃苷E纯度为99.9%。作为一个新化合物，其药物开发过程有很长的路要走，本实验所做的提取分离纯化工艺研究为对萼猕猴桃苷E进一步的药代动力学研究、安全性药理研究等内容的实施奠定了物质基础。
Study on the extraction, separation and purification process of actinoside E
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摘要:
目的 优选对萼猕猴桃苷E的提取分离纯化工艺。 方法 以对萼猕猴桃苷E的含量为指标，采用单因素考察结合正交试验确定对萼猕猴桃苷E的最佳提取工艺；通过优化大孔吸附树脂柱、硅胶柱和ODS柱的色谱条件，对提取物进行分离纯化。 结果 对萼猕猴桃苷E的最佳提取工艺为：以25倍量的55%乙醇95 ℃加热回流1 h。优化的分离纯化工艺为：D101型大孔树脂柱以50%乙醇洗脱7 BV；硅胶柱以乙酸乙酯-乙醇10∶1洗脱5 BV；ODS柱重复纯化50%甲醇洗脱部分，最终得到对萼猕猴桃苷E单体化合物。整个工艺对萼猕猴桃苷E的转移率为53.70%，得率为0.35%，纯度达99.9%。 结论 该工艺稳定可行，可为对萼猕猴桃苷E的开发利用提供物质基础。 Abstract:Objective To optimize the extraction, separation and purification process of actinoside E. Methods Single factor experiment combined with orthogonal test was used to determine the optimal extraction process of actinoside E using its content as an index. The extracts were separated and purified by optimizing the chromatographic conditions of macroporous resin, silica gel and ODS column. Results 25 times amount of 55% ethanol with heating reflux at 95 ℃ for one hour were used as the optimal extraction process of actinoside E. The optimum separation and purification process was as follows: D101 macroporous resin column was eluted with 7 BV of 50% ethanol, silica gel column was eluted with 5 BV of ethyl acetate-ethanol（10∶1）and 50% methanol eluted fraction was purified repeatedly by ODS column to obtain actinoside E. The transfer rate of actinoside E in the whole process was 53.70%, the yield was 0.35%, and the purity was 99.9%. Conclusion The process is stable and viable, which can provide material foundation for the development and utilization of actinoside E. -
Key words:
- actinoside E /
- extraction /
- separation and purification /
- chromatography
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肿瘤恶病质是肿瘤患者较为常见且复杂的并发症，主要表现为厌食、严重的体力和体重下降、虚弱、贫血、水肿等症状。患者机体出现糖、脂、蛋白质代谢的异常反应变化，进行性的骨骼肌量减少，从而引起功能性障碍，对肿瘤患者的心理健康、社会功能产生极大的负面影响，严重影响肿瘤患者的生活质量[1-2]。研究表明50%~80%的肿瘤患者会发生不同程度的恶病质，影响患者放化疗的进行和生活质量，甚至超过20%患者死于恶病质[3]。目前，针对肿瘤恶病质的标准治疗方案主要是在营养支持基础上加用孕激素类药物，如醋酸甲羟孕酮。由于恶病质期单纯营养支持疗效欠佳[4]，且孕激素类药物存在一些药物不良反应，因此，仍需更多治疗手段解决肿瘤恶病质带来的一系列临床医学问题。
相关研究显示，中药由于多成分、多靶点的作用，能对肿瘤恶病质进行整体干预，起到较好的疗效。中医药在改善恶病质患者体重、体力情况、食欲等方面可能有一定疗效[5]，其中以参苓白术散为代表的益气健脾法在临床实践中取得了较好的疗效，得到专家共同的推荐，被用于减少肿瘤患者化疗和术后的不良反应，恢复胃肠道功能，提高生活质量[6]，但其具体作用机制仍不明确[7]。参苓白术散首载于《太平惠民和剂局方》，由人参、茯苓、白术、白扁豆、山药、甘草、莲子、砂仁、薏苡仁、桔梗10味中药组成，方中以人参、白术、茯苓为君药，人参补益脏器，白术健脾燥湿，茯苓既善健脾补虚，又兼利水渗湿，三者共达益气健脾之效；另加山药补脾养胃，薏苡仁健脾渗湿，白扁豆补脾化湿，莲子补脾止泻，共为臣药，加强健脾益气、渗湿止泻之功。砂仁为佐，醒脾和胃，行气化滞，桔梗和甘草为佐使，桔梗以宣肺利气，通调水道，引气上升，甘草则健脾和中，调和诸药。诸药合用，共奏健脾益气、和胃渗湿之效。脾胃健运，湿滞得化，水谷精微生化恢复，使患者衰弱的机体可以逐步好转。因此，本研究借助网络药理学对参苓白术散治疗肿瘤恶病质的有效成分及靶点进行预测，探讨其作用机制。
1. 资料与方法
1.1 参苓白术散处方活性成分的筛选和靶点预测
检索中药系统药理学数据库和分析平台[8]（TCMSP；https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）获取人参、茯苓、白术、山药、白扁豆、薏苡仁、砂仁、桔梗、甘草9味中药的化学成分，根据口服利用度（OB）≥30%且类药性（DL）≥ 0.18进行活性成分初步筛选，以获得活性化合物及其作用的蛋白质靶点。检索BATMAN-TCM数据库（http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）[9]，设置Score cutoff ≥20，P≤0.05，获取莲子的化学成分和靶点信息。筛选结束后，统一在Uniprot蛋白质数据库（https://www.uniprot.org）将化合物作用的蛋白质靶点进行规范。
1.2 肿瘤恶病质相关靶点检索
以“Cancer cachexia”为关键词，在OMIM（https://omim.org/）、Genecards（https://www.genecards.org/）、Disgenet（https://www.disgenet.org/）三个基因数据库寻找肿瘤恶病质的潜在靶点（检索时间为2021年8月27日），在DRUGBANK数据库（https://go.drugbank.com/）中检索改善肿瘤恶病质临床一线用药作用靶点进行补充[10]。合并检索的4个数据库靶点后，删除重复值，并使用Uniprot蛋白质数据库进行规范。然后将肿瘤恶病质相关靶点与参苓白术散处方活性成分潜在作用靶点导入Venny 2.1.0，筛选出共同靶点，生成韦恩图。
1.3 参苓白术散与肿瘤恶病质“药物-活性成分-靶点”网络的构建
通过Cytoscape3.7.2软件来构建“药物-活性成分-靶点”网络，其中用节点表示成分或靶点，用边表示两者之间的关系；采用Cytoscape3.7.2软件内置的Network Analyzer分析工具分析网络特征参数，包括连接度、介度及紧密度等，研究参苓白术散中较为重要的成分和靶点及它们之间的关系。
1.4 参苓白术散成分-肿瘤恶病质靶点PPI网络构建
为进一步研究参苓白术散治疗肿瘤恶病质靶点蛋白在系统水平的作用，将筛选出来的共同靶点导入STRINGv11数据库[11]（https://string-db.org），选择物种为“Homo sapiens”，使用默认设置，以获得PPI网络关系，通过CytoScape3.7.2软件制作PPI网络图，并使用Network Analyzer分析工具进行网络拓扑属性分析。
1.5 靶点GO功能富集和KEGG通路富集
采用整合多个权威数据库的Metascape平台（http://metascape.org/gp/index.html）[12]，将筛选后的靶点导入Metascape 平台进行GO及KEGG分析，保存结果并通过R软件进行可视化。
1.6 分子对接
通过pubchem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库下载“药物-活性成分-治疗靶点”网络图中度值排前10的化学成分结构（.sdf），PDB(http://www.rcsb.org/)数据库下载PPI中度值排前10的靶点的结构。用Discovery Studio软件分别对靶点结构进行去除结晶水、加氢等处理，将其进行对接，以libdockscore值作为对接程度的评判标准。
2. 结果
2.1 参苓白术散活性成分及靶点获取
从TCMSP数据库初步获取参苓白术散中人参、茯苓、白术、山药、白扁豆、薏苡仁、砂仁、桔梗、甘草成分949个，通过ADME参数筛选后获得179种活性成分，从BATMAN-TCM数据库筛选获取莲子17种活性成分。将靶点预测结果合并重复值，共获得544个靶点。
2.2 肿瘤恶病质相关靶点和参苓白术散潜在治疗靶点
检索Genecards、OMIM、Disgenet、DRUGBANK数据库，获得肿瘤恶病质相关靶点个数分别为1 792、499、110、9，筛选并去重后得到2 281个靶点。药物与疾病靶点交集得到181个共有靶点（图1），作为参苓白术散治疗肿瘤恶病质的潜在靶点。
2.3 “药物-活性成分-靶点”网络构建
运用CytoScape 3.7.2构建参苓白术散的“药物-活性成分-靶点”网络图，见图2。图中共有336个节点（10个中药节点，145个活性成分节点，181个潜在靶点节点），1 385条边。通过Cytoscape 3.7.2内置的Network Analyzer功能分析参苓白术散治疗肿瘤恶病质的网络拓扑学参数，筛选网络中关键节点，排前10的活性成分节点拓扑参数见表1，排前10的靶点节点拓扑参数见表2。
图 2 参苓白术散中“药物-活性成分-治疗靶点”网络注：三角形为中药，圆形为药物的活性成分，不同颜色为不同药物的，菱形为靶点，每个节点面积和颜色透明度代表度值，面积越大、颜色越深表明该节点越重要。表 1 参苓白术散排名前10的活性成分拓扑参数编号 Mol ID 活性成分 连接度 介度 紧密度 来源 GC1 MOL000098 quercetin 81 0.271 114 0.436 767 甘草 K1 MOL000422 kaempferol 58 0.053 66 0.389 082 人参、甘草 LZ2 MOL000663 pyrolignous acid 55 0.274 946 0.394 582 莲子 S2 MOL000449 stigmasterol 40 0.031 101 0.381 115 人参、砂仁、山药、薏苡仁 JG1 MOL000006 luteolin 37 0.058 771 0.380 25 桔梗 B1 MOL000358 beta-sitosterol 34 0.039 925 0.391 813 人参、砂仁 GC5 MOL000392 formononetin 19 0.009 376 0.374 302 甘草 GC14 MOL003896 7-methoxy-2-methyl isoflavone 19 0.010 022 0.378 531 甘草 GC7 MOL000497 licochalcone a 17 0.013 409 0.375 14 甘草 JG2 MOL001689 acacetin 16 0.015 687 0.359 828 桔梗 表 2 “药物-活性成分-治疗靶点”网络排名前10治疗靶点拓扑参数分析靶点 连接度 介度 紧密度 PTGS2 111 0.155 87 0.448 461 ESR1 82 0.063 534 0.355 249 HSP90AA1 76 0.054 254 0.406 061 AR 74 0.133 102 0.453 315 PPARG 69 0.028 901 0.389 988 NOS2 69 0.014 526 0.350 785 SCN5A 61 0.140 382 0.442 536 GSK3B 57 0.006 328 0.319 962 CHEK1 47 0.004 578 0.311 628 MAPK14 47 0.003 912 0.309 898 2.4 蛋白相互作用网络（PPI）的构建
将在STRING构建的蛋白互作网络导入Cytoscape 3.7.2进行可视化，见图3。图中42个治疗靶点存在362条相互作用。对网络中的节点进行拓扑分析得出节点的平均度中心性（degree centrality，DC）为36.143 7，平均中介中心性（betweenness centrality，BC）为0.000 57，平均紧密中心性（closeness centrality，CC）为0.507 1，其中以上3个参数都大于平均值的节点有30个，其排名前10的参数详见表3。
表 3 PPI排名前10治疗靶点拓扑参数分析靶点 连接度 介度 紧密度 AKT1 128 0.086 792 0.765 957 TP53 105 0.035 549 0.674 157 TNF 102 0.022 326 0.671 642 IL-6 100 0.020 958 0.669 145 MAPK3 98 0.017 936 0.664 207 CASP3 98 0.024 522 0.661 765 JUN 96 0.017 324 0.654 545 CTNNB1 93 0.033 266 0.654 545 HIF1A 93 0.031 81 0.640 569 EGFR 92 0.019 349 0.652 174 2.5 靶点功能与通路富集分析
应用Metascape数据平台对参苓白术散治疗肿瘤恶病质的相关靶点进行信号通路分析，选择富集计数和-lgP 排名前20的与肿瘤恶病质相关结果，借助R语言将其进行可视化，结果见图4A。共同靶点主要参与的生物学过程，包括对有机环状化合物的细胞反应、对脂多糖的反应、对无机物质的反应、对生长因子的反应、凋亡信号通路、蛋白质磷酸化的正调控等；细胞的组成主要包括轴突、膜筏细胞质核周区；分子功能方面涉及蛋白质结构域特异性结合、RNA特异性聚合酶IIDNA-结合转录因子结合、氧化还原酶活性、激酶结合、磷酸酶结合、蛋白激酶活性等。
KEGG富集显示，参与的相关通路主要有癌症的途径、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、癌症中的蛋白多糖、HIF-1信号通路、多巴胺能突触、5-羟色胺能突触、癌症中的转录失调、雌激素信号通路等，结果见图4B。
2.6 分子对接验证
运用Discovery Studio软件对靶点和化学成分进行分子对接，进一步说明靶点与化合物之间的结合性，其结合度越高，得分越高，对接结果见图5，图中横坐标代表靶蛋白，纵轴为参苓白术散活性成分，图中颜色越紫代表结合能越低，颜色越黄代表结合能越高，每个靶点均有活性成分与其对接，最低libdockscore>79。木蜡酸、豆甾醇、β谷甾醇与靶点对接值较高，ATK1、TP53、MAPK3、CASP3、JUN、EGFR等靶点与活性成分均有较高的对接值，选择部分活性成分绘制对接模式图见图6，可见活性成分与靶点之间形成氢键，结合稳定。
3. 讨论
肿瘤相关恶病质会使患者虚弱，难以接受进一步的治疗，且几乎没有有效的治疗方法[13]。恶病质不仅发生在癌症晚期，许多早期癌症也可能发生恶病质。恶病质降低了患者机体对药物、射线等抗肿瘤治疗反应的敏感性与耐受性，直接影响肿瘤治疗效果，且会增加并发症，缩短癌症患者的生存期[14]。恶病质的特征是全身炎症和多器官消耗紊乱，伴随着体重减轻，特别是脂肪组织和骨骼肌的质量减少[15-16]。目前尚不清楚恶病质的发病机制，多认为是由于厌食症、全身系统性炎症、能量代谢异常和信号通路等相互作用造成的[17-19]。中医药辅助治疗不仅可以针对肿瘤进行治疗，同时可改善晚期恶性肿瘤患者体倦乏力、食少纳呆等脾虚现象，以及放、化疗引起的胃肠道不适等不良反应。郭东霖等[20]对中药汤剂治疗肿瘤恶病质疗效进行meta分析，结果显示，中药汤剂对肿瘤恶病质的治疗有一定的疗效，且不良反应较小。
以益气健脾为治法的参苓白术散联合放、化疗治疗肺癌、胃癌、结直肠癌，不仅能提高对肿瘤的治疗效果，还能增强机体免疫力，改善化疗后的毒副作用，提高患者生活质量[21-24]。本研究通过网络药理学初步筛选出参苓白术散治疗肿瘤恶病质的主要活性成分为槲皮素、山奈酚、木蜡酸、豆甾醇、木犀草素、β谷甾醇等。相关研究表明，槲皮素可能通过影响脂肪的消化吸收、甘油磷脂代谢、SCAP-SREBP2-LDLr信号通路等改善脂质代谢[25]，同时可以直接或间接作用于脂多糖，抑制脂多糖诱导产生TNF-α，进而抑制机体炎症[26]。山柰酚可增强脂肪分解并减少高级脂肪酸及受损葡萄糖的摄取、糖原合成、AMPK活性以及葡萄糖转运蛋白4的表达[27]，可下调炎症通路蛋白的表达[28]。豆甾醇通过下调NF-κB P65的表达来抑制促炎介质(TNF-α，IL-6，IL-1β等)的表达，增加抗炎细胞因子(IL-10)的表达[29]。木犀草素能借助AMP活化蛋白激酶1信号传导，降低THP-1细胞衍生的巨噬细胞中总胆固醇水平，同时抑制巨噬细胞趋化因子和炎性细胞因子表达[30]。研究表明，槲皮素、山奈酚、豆甾醇三种成分作为抗癌候选药，可通过调节多种生物途径，以诱导和促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤血管新生、防止肿瘤细胞增殖的方式抑制肿瘤的发展[31-34]。
KEGG通路富集分析发现，参苓白术散治疗肿瘤恶病质作用的通路可分为3个方面。一是抑制炎症，改善食欲。肿瘤生长增加了血浆色氨酸浓度，大脑中色氨酸浓度增加可引起下丘脑腹内侧核5-羟色胺能神经元活性增强，从而增强下丘脑厌食神经元的活性[35]。IL-1β、TNF-α、IL-6等细胞因子在厌食症发病过程中起到重要作用，促进了厌食症的发生和发展。参苓白术散可能通过作用于血清学突触、多巴胺能突触、HIF-1信号通路、雌激素信号等通路，抑制炎症因子产生，降低5-羟色胺能神经元活性，从而促进食欲。二是作用于代谢相关通路，纠正肿瘤恶病质机体能量恶性消耗、代谢紊乱的状态。如糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、脂肪细胞脂解调节、PPAR信号通路等与脂肪代谢有关的通路。糖化应激通过AGEs与RAGE结合，诱导炎症和氧化应激，研究表明，AGE-RAGE可介导高胆固醇血症引起的动脉粥样硬化等多种病变，并且sRAGE水平与HDL呈正相关[36]。PPAR通路中，PPAR家族调控参与细胞增殖、分化以及炎症和免疫相关蛋白的表达，同时也是参与调控脂肪细胞分化和葡萄糖稳态的关键细胞因子[37]。推测参苓白术散通过这些通路修复肿瘤恶病质所致的高甘油三酯和低胆固醇症等。HIF-1 信号通路是治疗肿瘤具有潜在价值的通路，抑制PIK3/Akt-HIF-1α途径能够显著减少多种细胞的糖酵解[38]，而糖酵解正是恶性肿瘤细胞获取能量的主要方式，也是造成糖代谢紊乱的原因。HIF-1α蛋白升高诱导瘦素信号通路，从而增强白色脂肪组织储存的脂肪分解[39]。三是直接作用于肿瘤相关的通路（癌症中的通路、癌症中的蛋白多糖、Wnt信号通路），抑制肿瘤活性。刘羽茜等[40]通过网络药理学研究发现，参苓白术散作用涉及到肺癌的多种信号通路，其通过调节相关信号通路从而抑制炎症因子的活化，缓解机体过激的免疫反应，发挥对肺癌的治疗作用。田婷婷等[41]运用网络药理学探索参苓白术散治疗结直肠癌作用机制，发现其可能通过调节炎性反应、优化肠道菌群结构发挥治疗作用。参苓白术散基础方四君子汤治疗恶病质的作用[42]与本研究中参苓白术散调节代谢和抑制肿瘤的作用基本一致，参苓白术散在四君子汤基础上添加的药物，增加了抗击炎症和增强食欲的作用。
研究结果表明，参苓白术散同一活性成分可调控不同靶点，而同一靶点可干预不同的生物学过程及信号通路。分子对接结果显示，排名前10的活性成分和靶点之间存在较好的结合活性，具有良好的相互作用，体现了参苓白术散多通路、多靶点联合作用的特点，为参苓白术散临床运用提供了科学依据，也为挖掘参苓白术散潜在作用机制提供新方向。本研究主要是以生物信息学与海量数据计算的结果为基础，后续将在此基础上进一步进行动物或细胞实验验证，进而明晰参苓白术散的主要调控靶点。
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表 1 L9（34）正交试验结果及直观分析（n = 3）
编号 A（%） B（w/V） C（t/h） D（T/ ℃） 对萼猕猴桃苷E含量（mg/g） 1 2 3 1 55（1） 1∶20（1） 0.5（1） 90（1） 7.94 7.98 7.87 2 55（1） 1∶25（2） 1（2） 95（2） 7.99 7.98 8.09 3 55（1） 1∶30（3） 1.5（3） 100（3） 7.89 7.85 7.98 4 65（2） 1∶20（1） 1（2） 100（3） 7.87 7.81 7.77 5 65（2） 1∶25（2） 1.5（3） 90（1） 7.85 7.99 7.97 6 65（2） 1∶30（3） 0.5（1） 95（2） 7.91 7.93 8.05 7 75（3） 1∶20（1） 1.5（3） 95（2） 7.91 7.91 7.81 8 75（3） 1∶25（2） 0.5（1） 100（3） 7.84 7.75 7.81 9 75（3） 1∶30（3） 1（2） 90（1） 7.88 7.97 7.87 K1 71.57 70.87 71.08 71.32 K2 71.15 71.27 71.23 71.58 K3 70.75 71.33 71.16 70.57 k1 7.95 7.87 7.90 7.92 k2 7.91 7.92 7.91 7.95 k3 7.86 7.93 7.91 7.84 R 0.09（2） 0.05（3） 0.02（4） 0.11（1） 
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表 2 对萼猕猴桃叶提取工艺方差分析
方差来源 离均差平方和 自由度 均方 F值 P值 A 0.037 2 0.019 4.989 0.019* B 0.014 2 0.007 1.856 0.185 C 0.001 2 0.001 0.167 0.847 D 0.061 2 0.031 8.161 0.003** 误差 0.067 18 0.004 合计 0.181 26 注：f1=2，f2=18，F0.05（2, 18）=3.55；*P<0.05，**P<0.01.
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表 3 不同型号大孔树脂对对萼猕猴桃苷E静态吸附和解吸附的测定结果
树脂型号 吸附率（%） 解吸率（%） 权重（%） D101 91.54 96.67 88.49 AB-8 88.71 98.01 86.94 DM130 62.10 89.80 55.76 HPD100 87.82 97.25 85.41 NKA-9 87.15 97.64 85.09
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[1] 中国植物志编委. 中国植物志[M]. 北京: 科学出版社, 1984: 218. [2] 国家中医药管理局《中华本草》编委会. 中华本草-1[M]. 上海: 上海科学技术出版社, 1999: 548-549. [3] 陈豪, 潘坤官, 何丽君. 抗癌中药猫人参研究概况[J]. 海峡药学, 2011, 23(12):9-11. doi: 10.3969/j.issn.1006-3765.2011.12.004 [4] 石垚, 贾敏, 张婷婷, 等. 不同生长时段对萼猕猴桃叶中黄酮类成分的含量分析[J]. 国际药学研究杂志, 2018, 45(10):795-798. [5] XIN H L, WU Y C, SU Y H, et al. Novel flavonoids from the leaves of Actinidia valvata Dunn: structural elucidation and antioxidant activity[J]. Planta Med, 2011, 77(1):70-73. doi: 10.1055/s-0030-1250113 [6] 辛海量. 抗心肌缺血的对萼猕猴桃叶组合物: CN201510213371.2[P]. 2018-08-21. [7] 辛海量, 凌昌全, 曲丽萍, 等. 对萼猕猴桃苷E、F在制备抗心肌缺血药物中的应用: CN201110271050. X[P]. 2013-02-06. [8] 李伟. 黄酮类化合物提取方法概述[J]. 农产品加工, 2023(14):75-78. [9] 陈丛瑾. 大孔吸附树脂分离纯化黄酮类化合物的研究进展[J]. 化学与生物工程, 2010, 27(11):1-4. doi: 10.3969/j.issn.1672-5425.2010.11.001 [10] 梁耀光, 吕巧莉. 葡聚糖凝胶Sephadex LH-20分离苷类的研究进展[J]. 广东化工, 2013, 40(13): 101, 93. -
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