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脑卒中是当前国内首位致死致残疾病，其中缺血性脑卒中占所有卒中的70%[1]，严重危害人民身体健康。缺血性脑卒中发生后尽可能快的实现缺血半暗带再灌注是治疗的关键[2]，但再灌注会使缺血半暗带区域形成强烈的免疫激活和炎症损伤[3]，可能导致缺血性脑卒中急性损伤期的二次伤害并在远期预后上增加功能恢复难度[4]。日本学者研究显示，血管内治疗后仅有约1/7的患者有较好的90天预后[5]，在我国接受再灌注治疗的患者仍有约1/3会留有终身残疾[6]，因此对脑卒中后神经保护药物的研究显得越来越重要[7]。大量研究表明，神经保护药可通过多种途径抑制致病级联反应达到急性期治疗效果，如尼莫地平、依达拉奉等[8]；也可以在长期治疗和功能恢复中发挥重要作用，包括一些“老药”新用，如右美托咪定、半胱氨酰白三烯受体拮抗剂等[9]，特别是一些活血化瘀功效中药组方及成分，如灯盏生脉胶囊、白果内酯等的研究都取得了一定的进展[10]。课题组前期研究发现：中药红花（Carthami Flos）中的黄酮类化合物菸花苷能够通过促进自噬、抗氧化等对CIRI动物发挥急性期治疗效果[11, 12]，同时菸花苷长期给药可改善CIRI大鼠生存状态[13]，但到目前为止，菸花苷发挥长期保护作用的机制尚不明确。作为延续性工作，本实验重点研究了菸花苷长期给药对CIRI大鼠神经功能的影响，并运用转录组测序等方法对其作用机制进行了初步探索，旨在为将菸花苷应用于促进CIRI大鼠神经功能恢复提供更多实验支撑，也为从传统活血化瘀中药中开发神经保护药物提供借鉴。
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成年雄性Wistar大鼠，体重240±10 g，购自上海市计划生育科学研究所实验动物经营部，许可证号为SCXK（沪）2018-0006。大鼠购入后于学校药学系SPF级动物房内饲养，自由食水，人工照明模拟昼夜变化。实验操作严格遵守动物福利和伦理原则。
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菸花苷注射液和菸花苷空白对照制剂由苏中药业集团股份有限公司生产加工（批号：20200331），菸花苷含量10 mg/ml。Caspase-1多克隆抗体（22915-1-AP）、GSDMD多克隆抗体（20770-1-AP）、NLRP3单克隆抗体（68102-1-Ig）、ASC多克隆抗体（10500-1-AP）均购于武汉三鹰生物科技有限公司，重组Anti-Caspase-11抗体（EPR18628）购于Abcam公司，IL-18多克隆抗体（AF5207）购于碧云天生物科技有限公司。
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直钳、齿镊、线剪等手术器材（上海医疗器械有限公司）；MCAO线栓（250 ～ 280 g，北京西浓科技有限公司）；平衡木装置（江苏赛昂斯生物科技有限公司）；Morris水迷宫泳池及站台（上海玉研科学仪器有限公司）；高速冷冻离心机（3H16RI，湖南赫西仪器装备有限公司）；扫膜仪（Tanon-
5200 ，上海天能科技有限公司）。 -
大鼠饲养至体重270±15 g，采用随机数字表法将大鼠随机分为3组:其中模型组（M）和菸花苷组（Y）大鼠进行CIRI模型的建立，而假手术组（S）大鼠则无脑部损伤。造模后1 h，菸花苷组腹腔注射菸花苷注射液1 ml/kg[14]，模型组与假手术组腹腔注射菸花苷注射液空白对照制剂1 ml/kg，造模后常规饲养并在固定时间给药，第1周1次/日，1周后1次/2日持续至实验周期结束。
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采用MCAO/R法进行模型制备，参考文献并进行一定改进[15]，具体方法如下：术前4 h禁食水，用1%戊巴比妥钠（4 ml/kg，生理盐水配制）腹腔注射麻醉。手术部位常规备皮消毒，仰卧位，将大鼠四肢与前牙用皮筋固定于手术台板。沿颈部正中线作2 cm纵行切口，从气管偏右侧（大鼠的左侧）沿肌纤维走行向下分离，至颜色深红且明显搏动的左颈总动脉，沿该血管向上至颈总动脉分叉，近气管侧为颈外动脉，另一侧即为线栓需要进入的颈内动脉。在距分叉1.5 cm处结扎左颈总动脉近心端，用动脉夹锁闭颈内动脉及颈外动脉近心端。用眼科剪在颈总动脉近心端距分叉口1 cm处剪一斜行小口，将线栓插入左颈总动脉，用缝合线略微固定于颈总动脉，撤掉颈内动脉近心端动脉夹，将线栓缓慢深入颈内动脉直至明显阻力时停止深入（18 ～ 20 mm），撤掉颈外动脉近心端动脉夹并将固定线栓的缝合线牢固打结，逐层缝合结缔组织和皮肤。术后将大鼠放于保温垫上保持其体温至苏醒放入笼中，术后1 h根据分组腹腔注射给药，待大鼠完全苏醒后观察大鼠右前肢无法完全伸展，且大鼠行走时向右侧倾倒或前进时向右侧转圈，此即标志造模成功。术后2 h使用初次剂量1/3的1%戊巴比妥钠进行二次麻醉，将线栓向外抽出1.5 cm形成大脑缺血再灌注损伤。假手术组仅分离血管，不插入线栓。
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在第2、4、8周进行3轮悬尾偏转实验[16]。将大鼠尾中段处固定在距地面垂直高度30 cm的实验架上，分别记录大鼠头部及躯干向左、右两侧偏转的次数，偏离中轴线10°以上计为偏转1次，每轮实验记录10次。正常大鼠会随机向左侧或者右侧进行偏转并试图攀爬，而CIRI大鼠由于一侧肢体的偏瘫及肌力减弱，向另一侧进行偏转的几率会大大提高。
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在第2、4、8周进行3轮平衡木实验[17]。取长2 m、宽2.5 cm、距地面高度50 cm的木条为平衡木，一端为大鼠躲避处放置黑色方盒，另一端为大鼠起步处。每轮实验测试前每只大鼠训练3次，每次间隔2小时；训练完毕后观察大鼠从起步处经过平衡木进入躲避处的过程，记录大鼠通过平衡木的情况并按以下标准进行打分。
平衡木评分标准 得分 通过平衡木，无踩空、跌倒 0分 通过平衡木，踩空、跌倒机会小于50% 1分 通过平衡木，踩空、跌倒机会大于50% 2分 通过平衡木，对侧后肢出现拖行 3分 不能通过平衡木，但能保持平衡不摔落 4分 不能在平衡木上保持平衡，伴有摔落 5分 -
由同一名操作人员在第2、4、8周进行3轮水迷宫实验[18]。本实验使用直径1.8 m的圆形水池，水温25±2 ℃，站台为高0.4 m、直径12 cm的圆形板，水深约0.43 m，即水位高度超过站台平面约3 cm，并在池壁四个方位上方1 m高处悬挂显著的远距离视觉参照物。每轮前5天站台放于池中固定位置，大鼠入水后找寻并记忆站台位置，第6天撤掉站台进行空间探索实验测试大鼠的空间记忆能力，记录大鼠在90 s内穿过之前站台位置的次数。
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8周后脱颈处死大鼠，断头取脑，吸除表面水分后将脑组织冷冻硬化，切除嗅球、脑干、小脑等部位，将大脑切成厚度均等的6片，放入2% TTC染液37 ℃水浴染色10 min，4%多聚甲醛溶液固定5 min后拍照，白色或缺如则计为梗死萎缩区，正常组织显示为红色部分。利用ImageJ软件进行图像处理，按公式计算梗死萎缩区体积百分比=[（患侧梗死体积+萎缩体积）/健侧半脑体积]×100%，其中萎缩体积=健侧半脑体积−患侧半脑体积。
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造模8周后，提取总RNA，在RNA总量超过1 μg的基础上，以浓度超过35 ng/μl的标准，进行库的建立，并确保OD 260/280≥1.8，OD 260/230≥1.0。分离所需的mRNA后加入碎片缓冲液，使mRNA随机分裂为300bp的小片段。反转录合成cDNA，利用PCR技术扩增15 cycles，2%琼脂糖胶回收目的条带并进行精确定量，借助cBot系统通过大规模分子簇的方式达到荧光信号检测强度，IlluminaNovaseq6000平台测序，读长控制在2×150 bp。对所得数据库数据进行筛选过滤，基因差异表达分析。
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采用Western-blot法检测各组大鼠脑组织缺血半暗带中Caspase-1、Caspase-11、GSDMD-N、NLRP3、ASC、IL-18蛋白表达。参考相关文献取缺血半暗带区域作为样品[19]，取适量样品加入RIPA裂解液进行研磨裂解，12 000 r/min、4 ℃离心取上清液，BCA法定量蛋白浓度，浓度均一化后进行蛋白变性作为待测样品。经电泳、转膜、漂洗、封闭、漂洗，一抗（Caspase-1，1∶10 000、Caspase-11,1∶4 000、GSDMD,1∶800、NLRP3,1∶800、ASC,1∶10 000、IL-18，1∶1 000、GAPDH，1∶15 000）4 ℃孵育16 h，漂洗后二抗（1∶15 000）25 ℃孵育1 h，再次漂洗后加入ECL发光液，在凝胶成像分析系统中成像。
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取大鼠脑组织10 mg加入适量PBS溶液，研磨后低温离心取上清液，按照ELISA试剂盒说明书配置梯度浓度标准品溶液，按顺序滴加样品及各反应液，显色反应终止后，使用酶标仪测定450 nm处OD值，根据标准曲线计算各样品IL-1β、IL-18浓度。
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应用ImageJ软件对脑组织TTC切片的照片、Western-blot图片进行图像处理，统计学分析及数据处理使用GraphPad Prism 8.0.1进行。实验数据采用（
$\bar {\mathrm{X}} $ ±SE）表示，大鼠神经行为学数据使用双因素方差分析，TTC切片及Western-blot数据应用单因素方差分析方法， P<0.05表示差异有统计学意义。 -
在第2、4、 8周对大鼠的神经功能进行多角度评价，其中悬尾偏转实验中模型组大鼠的对侧偏转率明显高于菸花苷组（P<0.000 1）（图1A）；平衡木实验中模型组大鼠的评分始终高于菸花苷组（P<0.05）（图1B）；水迷宫实验中模型组大鼠90 s时间内穿台次数明显少于菸花苷组（P<0.05）（图1C）。以上实验显示菸花苷长期给药能够一定程度上改善CIRI大鼠的偏瘫及肌力减弱情况，提高肢体平衡性、空间学习和记忆能力。
图 1 造模后第2、4、8周大鼠神经功能评价
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TTC染色显示模型组大鼠脑组织明显变小且左侧萎缩缺如体积超60%（P<0.01）；菸花苷组大鼠脑梗死萎缩体积同模型组相比减少约25%（P<0.01）（图2A、2B、2C）。提示CIRI长期发展会导致大鼠脑组织梗死萎缩，菸花苷长期给药能减轻大鼠脑组织梗死萎缩状况。
图 2 造模8周后大鼠脑组织外观
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以总表达量为基础，利用TPM进行数据分析，以 |log2fc|>1， p adjust<0.05为显著差异标准，统计分析组间的差异基因（DEGs）。模型组对假手术组DEGs
2816 个，其中上调1900个，下调916个；菸花苷组对模型组DEGs 1 546个，其中上调343个，下调1 203个；具有反转效应的DEGs 1 416个，其中上调290个，下调1 126个（图3A、3B）。
图 3 转录组测序组间DEGs
分析1 416个反转效应DEGs，基因数在前20位的GO功能注释条目与生物学过程（BP）和细胞组成（CC）相关的基因较多，主要参与生物调节、细胞过程、细胞组分（图3C）。通过KEGG功能富集分析，发现1 416个DEGs主要富集在NOD样受体信号通路、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、Toll样受体信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路等通路中（图3D），其中NOD样受体信号通路是显著性最高的信号通路，参与细胞炎症、细胞死亡过程的重要通路之一。
如表1所示， NOD样受体信号通路中GSDMD、IL-18、NLRP3等基因富集度较高，而这些基因在细胞焦亡过程均有参与，结合图3A中所标注的焦亡相关基因表达情况，推测脑缺血再灌注损伤可能与细胞焦亡有关，且菸花苷可能对细胞焦亡过程产生一定的抑制作用。
表 1 菸花苷治疗CIRI大鼠KEGG筛选的通路和富集基因
通路名称 通路显著性（P值） 富集基因 NOD样受体信号通路 6.05×10−7 NF-κB、IL-18、Caspase8
NLRP3、GSDMD、Caspase4肿瘤坏死因子受体信号通路 1.12×10−6 NF-κB、p38、Bcl3、TNFR1、
TNFR2、Ccl2、、Caspase8Toll样受体信号通路 3.66×10−6 NF-κB、p38、Caspase8
TLR3、TLR4、TLR7丝裂原活化蛋白激酶信号通路 5.73×10−6 NF-κB 、P38、TNFR、IL-1R -
根据转录组数据结果，采用Western-blot方法检测脑缺血半暗带中Caspase-1、Caspase-11、GSDMD-N、NLRP3、ASC、IL-18蛋白的表达情况（ASC的基因型为PYCARD，Caspase-11与Caspase-4同源）。结果显示模型组表达水平显著高于假手术组（P<0.01），菸花苷组显著低于模型组（P<0.05）（图4）。提示菸花苷长期给药能够降低CIRI大鼠细胞焦亡相关蛋白的表达量。
图 4 大鼠脑组织焦亡相关蛋白表达情况
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利用ELISA法对炎症因子IL-1β、IL-18进行了测定，结果显示模型组IL-1β、IL-18释放量相较于假手术组明显增加（P<0.001），菸花苷组IL-1β、IL-18释放量比模型组明显降低（P<0.05）。表明菸花苷能够抑制因CIRI导致的脑组织炎症因子IL-1β、IL-18释放量升高。
图 5 大鼠脑组织炎症因子IL-1β、IL-18释放量
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目前神经保护药物的实验研究更多集中于缺血性脑卒中的急性损伤期治疗，对缺血性脑卒中长期治疗和慢性恢复的研究相对较少[20]。本实验以菸花苷对CIRI大鼠的长期治疗和功能恢复研究为重点，对CIRI大鼠神经运动能力及脑组织外观形态进行了观察分析，结果表明，菸花苷能显著改善CIRI大鼠的神经运动功能，提高长期治疗和功能恢复效果，明显减少脑梗死萎缩体积，抑制脑缺血后梗死区域进一步扩大并改善梗死区域坏死萎缩的状况。
缺血性脑卒中涉及到细胞凋亡、铁死亡和细胞焦亡等多种病理机制[21]，其中细胞焦亡是一种依赖半胱天冬酶（caspase）的炎症性细胞死亡形式，在缺血性脑卒中神经损伤中扮演了重要角色[22]。细胞焦亡过程中GSDMD蛋白被活化caspase剪切为具有活性的GSDMD-N， GSDMD-N聚合并在细胞膜上形成孔道导致细胞膜破裂伴随细胞内IL-1β、IL-18等炎症因子释放增加[23]，进一步促进炎症反应的发生和神经细胞的死亡。有研究表明，通过抑制细胞焦亡可以有效促进CIRI后的神经功能恢复[24, 25]。本实验首次将菸花苷促进缺血性脑卒中的长期恢复与其抑制细胞焦亡联系起来，利用转录组测序及蛋白免疫印记等方法对细胞焦亡相关基因和蛋白的表达水平进行了测定，数据显示菸花苷能够降低NOD样受体信号通路中细胞焦亡关键基因的表达量并使焦亡相关蛋白的表达水平以及炎症因子的释放量明显下降，表明菸花苷能够抑制细胞焦亡及其引起的炎症反应。
综上，菸花苷能减轻大鼠脑缺血再灌注损伤，显著促进CIRI大鼠的长期功能恢复，该作用可能与抑制大鼠脑组织细胞焦亡有关。随着对菸花苷治疗缺血性脑卒中研究的不断深入，其对缺血性脑卒中缺血再灌注损伤的长期保护作用及机制将被进一步阐释。
Effects of long-term administration of nicotiflorin on neurological function in rats with cerebral ischemia-reperfusion injury
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摘要:
目的 探讨菸花苷长期给药对脑缺血再灌注损伤（CIRI）大鼠神经功能恢复的促进作用。 方法 建立CIRI模型，梗阻1 h后腹腔注射给药，持续给药8周，并在第2、4、8周进行悬尾偏转实验、平衡木实验及水迷宫实验，8周后TTC染色观察大脑梗死萎缩体积，用转录组测序筛选差异基因（DEGs）并分析富集通路，采用Western-blot法和ELISA法对细胞焦亡相关蛋白及炎症因子IL-1β和IL-18进行了测定。 结果 菸花苷长期给药能显著降低CIRI大鼠的对侧偏转率和平衡木实验评分，提高水迷宫实验中的穿台次数（P<0.05），减小脑梗死萎缩体积（P<0.01），对大鼠神经功能的恢复有明显促进作用。转录组测序发现，菸花苷组大鼠脑组织中细胞焦亡相关信号通路中的基因表达显著下调（P<0.05）， Western-blot和ELISA实验显示，菸花苷降低了caspase-1、GSDMD-N等焦亡相关蛋白的表达水平，同时，炎症因子IL-1β、IL-18的释放量明显降低（P<0.05），表明菸花苷能够抑制细胞焦亡这一炎性过程。 结论 菸花苷对CIRI大鼠神经功能恢复具有长期促进作用，该作用可能与菸花苷能够抑制细胞焦亡有关。 Abstract:Objective To explore the promoting effect of long-term administration of nicotiflorin on the recovery of neurological function in rats with cerebral ischemia-reperfusion injury （CIRI）. Methods The CIRI model was established and nicotiflorin was injected intraperitoneally after 1 hour of obstruction for 8 weeks. Tail suspension deflection experiment, balance beam experiment and water maze test were performed in the 2nd, 4th and 8th weeks. After 8 weeks, TTC staining was used to observe the volume of infarct atrophy, transcriptome sequencing was employed to screen differential expressed genes （DEGs） and highly enriched pathways were analyzed, Western-bloting and ELISA were used to assess proteins expression related to the pyroptosis pathway and inflammatory cytokines IL-1β and IL-18. Results By long-term administration of nicotiflorin, the contralateral deflection rate were significantly reduced and beam experiment score of CIRI rats was balanced, the number of crossing the platform in water maze test was increased （P<0.05）, the volume of cerebral infarction atrophy was decreased （P<0.01）, which significantly promoted the recovery of neurological function in rats. Transcriptome sequencing found that the expression of genes in the pyroptosis-related signaling pathways in the brain tissue of rats in the nicotiflorin group was significantly down-regulated （P<0.05）. Western-blot and ELISA experiments showed that nicotiflorin reduced the expression levels of caspase-1 and GSDMD-N and other pyroptosis-related proteins, and at the same time, the release of inflammatory factors IL-1β and IL-18 was significantly reduced （P<0.05）, indicating that nicotiflorin could inhibit the inflammatory process of pyroptosis. Conclusion Nicotiflorin exhibited a significant long-term promotion effect on the recovery of neurological function in CIRI rats, which potentially attributed to its ability to inhibit pyroptosis. -
脑卒中是当前国内首位致死致残疾病，其中缺血性脑卒中占所有卒中的70%[1]，严重危害人民身体健康。缺血性脑卒中发生后尽可能快的实现缺血半暗带再灌注是治疗的关键[2]，但再灌注会使缺血半暗带区域形成强烈的免疫激活和炎症损伤[3]，可能导致缺血性脑卒中急性损伤期的二次伤害并在远期预后上增加功能恢复难度[4]。日本学者研究显示，血管内治疗后仅有约1/7的患者有较好的90天预后[5]，在我国接受再灌注治疗的患者仍有约1/3会留有终身残疾[6]，因此对脑卒中后神经保护药物的研究显得越来越重要[7]。大量研究表明，神经保护药可通过多种途径抑制致病级联反应达到急性期治疗效果，如尼莫地平、依达拉奉等[8]；也可以在长期治疗和功能恢复中发挥重要作用，包括一些“老药”新用，如右美托咪定、半胱氨酰白三烯受体拮抗剂等[9]，特别是一些活血化瘀功效中药组方及成分，如灯盏生脉胶囊、白果内酯等的研究都取得了一定的进展[10]。课题组前期研究发现：中药红花（Carthami Flos）中的黄酮类化合物菸花苷能够通过促进自噬、抗氧化等对CIRI动物发挥急性期治疗效果[11, 12]，同时菸花苷长期给药可改善CIRI大鼠生存状态[13]，但到目前为止，菸花苷发挥长期保护作用的机制尚不明确。作为延续性工作，本实验重点研究了菸花苷长期给药对CIRI大鼠神经功能的影响，并运用转录组测序等方法对其作用机制进行了初步探索，旨在为将菸花苷应用于促进CIRI大鼠神经功能恢复提供更多实验支撑，也为从传统活血化瘀中药中开发神经保护药物提供借鉴。
1. 材料
1.1 实验动物
成年雄性Wistar大鼠，体重240±10 g，购自上海市计划生育科学研究所实验动物经营部，许可证号为SCXK（沪）2018-0006。大鼠购入后于学校药学系SPF级动物房内饲养，自由食水，人工照明模拟昼夜变化。实验操作严格遵守动物福利和伦理原则。
1.2 药品和试剂
菸花苷注射液和菸花苷空白对照制剂由苏中药业集团股份有限公司生产加工（批号：20200331），菸花苷含量10 mg/ml。Caspase-1多克隆抗体（22915-1-AP）、GSDMD多克隆抗体（20770-1-AP）、NLRP3单克隆抗体（68102-1-Ig）、ASC多克隆抗体（10500-1-AP）均购于武汉三鹰生物科技有限公司，重组Anti-Caspase-11抗体（EPR18628）购于Abcam公司，IL-18多克隆抗体（AF5207）购于碧云天生物科技有限公司。
1.3 仪器设备
直钳、齿镊、线剪等手术器材（上海医疗器械有限公司）；MCAO线栓（250 ～ 280 g，北京西浓科技有限公司）；平衡木装置（江苏赛昂斯生物科技有限公司）；Morris水迷宫泳池及站台（上海玉研科学仪器有限公司）；高速冷冻离心机（3H16RI，湖南赫西仪器装备有限公司）；扫膜仪（Tanon-
5200 ，上海天能科技有限公司）。2. 方法
2.1 分组及给药
大鼠饲养至体重270±15 g，采用随机数字表法将大鼠随机分为3组:其中模型组（M）和菸花苷组（Y）大鼠进行CIRI模型的建立，而假手术组（S）大鼠则无脑部损伤。造模后1 h，菸花苷组腹腔注射菸花苷注射液1 ml/kg[14]，模型组与假手术组腹腔注射菸花苷注射液空白对照制剂1 ml/kg，造模后常规饲养并在固定时间给药，第1周1次/日，1周后1次/2日持续至实验周期结束。
2.2 造模方法
采用MCAO/R法进行模型制备，参考文献并进行一定改进[15]，具体方法如下：术前4 h禁食水，用1%戊巴比妥钠（4 ml/kg，生理盐水配制）腹腔注射麻醉。手术部位常规备皮消毒，仰卧位，将大鼠四肢与前牙用皮筋固定于手术台板。沿颈部正中线作2 cm纵行切口，从气管偏右侧（大鼠的左侧）沿肌纤维走行向下分离，至颜色深红且明显搏动的左颈总动脉，沿该血管向上至颈总动脉分叉，近气管侧为颈外动脉，另一侧即为线栓需要进入的颈内动脉。在距分叉1.5 cm处结扎左颈总动脉近心端，用动脉夹锁闭颈内动脉及颈外动脉近心端。用眼科剪在颈总动脉近心端距分叉口1 cm处剪一斜行小口，将线栓插入左颈总动脉，用缝合线略微固定于颈总动脉，撤掉颈内动脉近心端动脉夹，将线栓缓慢深入颈内动脉直至明显阻力时停止深入（18 ～ 20 mm），撤掉颈外动脉近心端动脉夹并将固定线栓的缝合线牢固打结，逐层缝合结缔组织和皮肤。术后将大鼠放于保温垫上保持其体温至苏醒放入笼中，术后1 h根据分组腹腔注射给药，待大鼠完全苏醒后观察大鼠右前肢无法完全伸展，且大鼠行走时向右侧倾倒或前进时向右侧转圈，此即标志造模成功。术后2 h使用初次剂量1/3的1%戊巴比妥钠进行二次麻醉，将线栓向外抽出1.5 cm形成大脑缺血再灌注损伤。假手术组仅分离血管，不插入线栓。
2.3 悬尾偏转实验
在第2、4、8周进行3轮悬尾偏转实验[16]。将大鼠尾中段处固定在距地面垂直高度30 cm的实验架上，分别记录大鼠头部及躯干向左、右两侧偏转的次数，偏离中轴线10°以上计为偏转1次，每轮实验记录10次。正常大鼠会随机向左侧或者右侧进行偏转并试图攀爬，而CIRI大鼠由于一侧肢体的偏瘫及肌力减弱，向另一侧进行偏转的几率会大大提高。
2.4 平衡木实验
在第2、4、8周进行3轮平衡木实验[17]。取长2 m、宽2.5 cm、距地面高度50 cm的木条为平衡木，一端为大鼠躲避处放置黑色方盒，另一端为大鼠起步处。每轮实验测试前每只大鼠训练3次，每次间隔2小时；训练完毕后观察大鼠从起步处经过平衡木进入躲避处的过程，记录大鼠通过平衡木的情况并按以下标准进行打分。
平衡木评分标准 得分 通过平衡木，无踩空、跌倒 0分 通过平衡木，踩空、跌倒机会小于50% 1分 通过平衡木，踩空、跌倒机会大于50% 2分 通过平衡木，对侧后肢出现拖行 3分 不能通过平衡木，但能保持平衡不摔落 4分 不能在平衡木上保持平衡，伴有摔落 5分 2.5 水迷宫实验
由同一名操作人员在第2、4、8周进行3轮水迷宫实验[18]。本实验使用直径1.8 m的圆形水池，水温25±2 ℃，站台为高0.4 m、直径12 cm的圆形板，水深约0.43 m，即水位高度超过站台平面约3 cm，并在池壁四个方位上方1 m高处悬挂显著的远距离视觉参照物。每轮前5天站台放于池中固定位置，大鼠入水后找寻并记忆站台位置，第6天撤掉站台进行空间探索实验测试大鼠的空间记忆能力，记录大鼠在90 s内穿过之前站台位置的次数。
2.6 脑形态及TTC染色
8周后脱颈处死大鼠，断头取脑，吸除表面水分后将脑组织冷冻硬化，切除嗅球、脑干、小脑等部位，将大脑切成厚度均等的6片，放入2% TTC染液37 ℃水浴染色10 min，4%多聚甲醛溶液固定5 min后拍照，白色或缺如则计为梗死萎缩区，正常组织显示为红色部分。利用ImageJ软件进行图像处理，按公式计算梗死萎缩区体积百分比=[（患侧梗死体积+萎缩体积）/健侧半脑体积]×100%，其中萎缩体积=健侧半脑体积−患侧半脑体积。
2.7 转录组测序
造模8周后，提取总RNA，在RNA总量超过1 μg的基础上，以浓度超过35 ng/μl的标准，进行库的建立，并确保OD 260/280≥1.8，OD 260/230≥1.0。分离所需的mRNA后加入碎片缓冲液，使mRNA随机分裂为300bp的小片段。反转录合成cDNA，利用PCR技术扩增15 cycles，2%琼脂糖胶回收目的条带并进行精确定量，借助cBot系统通过大规模分子簇的方式达到荧光信号检测强度，IlluminaNovaseq6000平台测序，读长控制在2×150 bp。对所得数据库数据进行筛选过滤，基因差异表达分析。
2.8 蛋白印迹法测定
采用Western-blot法检测各组大鼠脑组织缺血半暗带中Caspase-1、Caspase-11、GSDMD-N、NLRP3、ASC、IL-18蛋白表达。参考相关文献取缺血半暗带区域作为样品[19]，取适量样品加入RIPA裂解液进行研磨裂解，12 000 r/min、4 ℃离心取上清液，BCA法定量蛋白浓度，浓度均一化后进行蛋白变性作为待测样品。经电泳、转膜、漂洗、封闭、漂洗，一抗（Caspase-1，1∶10 000、Caspase-11,1∶4 000、GSDMD,1∶800、NLRP3,1∶800、ASC,1∶10 000、IL-18，1∶1 000、GAPDH，1∶15 000）4 ℃孵育16 h，漂洗后二抗（1∶15 000）25 ℃孵育1 h，再次漂洗后加入ECL发光液，在凝胶成像分析系统中成像。
2.9 炎症因子测定
取大鼠脑组织10 mg加入适量PBS溶液，研磨后低温离心取上清液，按照ELISA试剂盒说明书配置梯度浓度标准品溶液，按顺序滴加样品及各反应液，显色反应终止后，使用酶标仪测定450 nm处OD值，根据标准曲线计算各样品IL-1β、IL-18浓度。
2.10 统计学处理
应用ImageJ软件对脑组织TTC切片的照片、Western-blot图片进行图像处理，统计学分析及数据处理使用GraphPad Prism 8.0.1进行。实验数据采用（
$\bar {\mathrm{X}} $ ±SE）表示，大鼠神经行为学数据使用双因素方差分析，TTC切片及Western-blot数据应用单因素方差分析方法， P<0.05表示差异有统计学意义。3. 结果
3.1 菸花苷对CIRI大鼠神经功能的影响
在第2、4、 8周对大鼠的神经功能进行多角度评价，其中悬尾偏转实验中模型组大鼠的对侧偏转率明显高于菸花苷组（P<0.000 1）（图1A）；平衡木实验中模型组大鼠的评分始终高于菸花苷组（P<0.05）（图1B）；水迷宫实验中模型组大鼠90 s时间内穿台次数明显少于菸花苷组（P<0.05）（图1C）。以上实验显示菸花苷长期给药能够一定程度上改善CIRI大鼠的偏瘫及肌力减弱情况，提高肢体平衡性、空间学习和记忆能力。
图 1 造模后第2、4、8周大鼠神经功能评价A.大鼠悬尾垂吊实验中大鼠对侧偏转率；B.大鼠在平衡木实验中评分；C.大鼠水迷宫实验中90 s内通过原站台位置的次数n=10；**P<0.01，**P<0.01，****P<0.000 1，与假手术组比较；#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，####P<0.000 1，与模型组比较。3.2 菸花苷对CIRI大鼠脑梗死萎缩体积的影响
TTC染色显示模型组大鼠脑组织明显变小且左侧萎缩缺如体积超60%（P<0.01）；菸花苷组大鼠脑梗死萎缩体积同模型组相比减少约25%（P<0.01）（图2A、2B、2C）。提示CIRI长期发展会导致大鼠脑组织梗死萎缩，菸花苷长期给药能减轻大鼠脑组织梗死萎缩状况。
图 2 造模8周后大鼠脑组织外观A.大鼠完整脑组织外观形态图；B.大鼠大脑切片TTC染色图；C.大鼠脑组织梗死体积n=6；****P<0.000 1，与假手术组比较；##P<0.01，与模型组比较。3.3 转录组测序结果
以总表达量为基础，利用TPM进行数据分析，以 |log2fc|>1， p adjust<0.05为显著差异标准，统计分析组间的差异基因（DEGs）。模型组对假手术组DEGs
2816 个，其中上调1900个，下调916个；菸花苷组对模型组DEGs 1 546个，其中上调343个，下调1 203个；具有反转效应的DEGs 1 416个，其中上调290个，下调1 126个（图3A、3B）。分析1 416个反转效应DEGs，基因数在前20位的GO功能注释条目与生物学过程（BP）和细胞组成（CC）相关的基因较多，主要参与生物调节、细胞过程、细胞组分（图3C）。通过KEGG功能富集分析，发现1 416个DEGs主要富集在NOD样受体信号通路、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、Toll样受体信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路等通路中（图3D），其中NOD样受体信号通路是显著性最高的信号通路，参与细胞炎症、细胞死亡过程的重要通路之一。
如表1所示， NOD样受体信号通路中GSDMD、IL-18、NLRP3等基因富集度较高，而这些基因在细胞焦亡过程均有参与，结合图3A中所标注的焦亡相关基因表达情况，推测脑缺血再灌注损伤可能与细胞焦亡有关，且菸花苷可能对细胞焦亡过程产生一定的抑制作用。
表 1 菸花苷治疗CIRI大鼠KEGG筛选的通路和富集基因通路名称 通路显著性（P值） 富集基因 NOD样受体信号通路 6.05×10−7 NF-κB、IL-18、Caspase8
NLRP3、GSDMD、Caspase4肿瘤坏死因子受体信号通路 1.12×10−6 NF-κB、p38、Bcl3、TNFR1、
TNFR2、Ccl2、、Caspase8Toll样受体信号通路 3.66×10−6 NF-κB、p38、Caspase8
TLR3、TLR4、TLR7丝裂原活化蛋白激酶信号通路 5.73×10−6 NF-κB 、P38、TNFR、IL-1R 3.4 菸花苷对CIRI大鼠焦亡相关蛋白的影响
根据转录组数据结果，采用Western-blot方法检测脑缺血半暗带中Caspase-1、Caspase-11、GSDMD-N、NLRP3、ASC、IL-18蛋白的表达情况（ASC的基因型为PYCARD，Caspase-11与Caspase-4同源）。结果显示模型组表达水平显著高于假手术组（P<0.01），菸花苷组显著低于模型组（P<0.05）（图4）。提示菸花苷长期给药能够降低CIRI大鼠细胞焦亡相关蛋白的表达量。
图 4 大鼠脑组织焦亡相关蛋白表达情况A.NLRP3、Caspase-1、Caspase-11、GSDMD-N、ASC、IL-18蛋白条带；B.NLRP3 蛋白相对表达量；C.Cas-1 蛋白相对表达量；D.Cas-11 蛋白相对表达量；E.GSDMD-N蛋白相对表达量；F.ASC蛋白相对表达量；G.IL-18蛋白相对表达量n=4； **P<0.01，***P<0.001，****P<0.000 1，与假手术组比较；#P<0.05，##P<0.01，，###P<0.001与模型组比较。3.5 菸花苷对CIRI大鼠IL-1β、IL-18的影响
利用ELISA法对炎症因子IL-1β、IL-18进行了测定，结果显示模型组IL-1β、IL-18释放量相较于假手术组明显增加（P<0.001），菸花苷组IL-1β、IL-18释放量比模型组明显降低（P<0.05）。表明菸花苷能够抑制因CIRI导致的脑组织炎症因子IL-1β、IL-18释放量升高。
图 5 大鼠脑组织炎症因子IL-1β、IL-18释放量A.炎症因子IL-1β的释放量；B.炎症因子IL-18的释放量n=5； ***P<0.001,与假手术组比较；#P<0.05，与模型组比较。4. 讨论
目前神经保护药物的实验研究更多集中于缺血性脑卒中的急性损伤期治疗，对缺血性脑卒中长期治疗和慢性恢复的研究相对较少[20]。本实验以菸花苷对CIRI大鼠的长期治疗和功能恢复研究为重点，对CIRI大鼠神经运动能力及脑组织外观形态进行了观察分析，结果表明，菸花苷能显著改善CIRI大鼠的神经运动功能，提高长期治疗和功能恢复效果，明显减少脑梗死萎缩体积，抑制脑缺血后梗死区域进一步扩大并改善梗死区域坏死萎缩的状况。
缺血性脑卒中涉及到细胞凋亡、铁死亡和细胞焦亡等多种病理机制[21]，其中细胞焦亡是一种依赖半胱天冬酶（caspase）的炎症性细胞死亡形式，在缺血性脑卒中神经损伤中扮演了重要角色[22]。细胞焦亡过程中GSDMD蛋白被活化caspase剪切为具有活性的GSDMD-N， GSDMD-N聚合并在细胞膜上形成孔道导致细胞膜破裂伴随细胞内IL-1β、IL-18等炎症因子释放增加[23]，进一步促进炎症反应的发生和神经细胞的死亡。有研究表明，通过抑制细胞焦亡可以有效促进CIRI后的神经功能恢复[24, 25]。本实验首次将菸花苷促进缺血性脑卒中的长期恢复与其抑制细胞焦亡联系起来，利用转录组测序及蛋白免疫印记等方法对细胞焦亡相关基因和蛋白的表达水平进行了测定，数据显示菸花苷能够降低NOD样受体信号通路中细胞焦亡关键基因的表达量并使焦亡相关蛋白的表达水平以及炎症因子的释放量明显下降，表明菸花苷能够抑制细胞焦亡及其引起的炎症反应。
综上，菸花苷能减轻大鼠脑缺血再灌注损伤，显著促进CIRI大鼠的长期功能恢复，该作用可能与抑制大鼠脑组织细胞焦亡有关。随着对菸花苷治疗缺血性脑卒中研究的不断深入，其对缺血性脑卒中缺血再灌注损伤的长期保护作用及机制将被进一步阐释。
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图 1 造模后第2、4、8周大鼠神经功能评价
A.大鼠悬尾垂吊实验中大鼠对侧偏转率；B.大鼠在平衡木实验中评分；C.大鼠水迷宫实验中90 s内通过原站台位置的次数n=10；**P<0.01，**P<0.01，****P<0.000 1，与假手术组比较；#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，####P<0.000 1，与模型组比较。
图 2 造模8周后大鼠脑组织外观
A.大鼠完整脑组织外观形态图；B.大鼠大脑切片TTC染色图；C.大鼠脑组织梗死体积n=6；****P<0.000 1，与假手术组比较；##P<0.01，与模型组比较。
图 4 大鼠脑组织焦亡相关蛋白表达情况
A.NLRP3、Caspase-1、Caspase-11、GSDMD-N、ASC、IL-18蛋白条带；B.NLRP3 蛋白相对表达量；C.Cas-1 蛋白相对表达量；D.Cas-11 蛋白相对表达量；E.GSDMD-N蛋白相对表达量；F.ASC蛋白相对表达量；G.IL-18蛋白相对表达量n=4； **P<0.01，***P<0.001，****P<0.000 1，与假手术组比较；#P<0.05，##P<0.01，，###P<0.001与模型组比较。
图 5 大鼠脑组织炎症因子IL-1β、IL-18释放量
A.炎症因子IL-1β的释放量；B.炎症因子IL-18的释放量n=5； ***P<0.001,与假手术组比较；#P<0.05，与模型组比较。
平衡木评分标准 得分 通过平衡木，无踩空、跌倒 0分 通过平衡木，踩空、跌倒机会小于50% 1分 通过平衡木，踩空、跌倒机会大于50% 2分 通过平衡木，对侧后肢出现拖行 3分 不能通过平衡木，但能保持平衡不摔落 4分 不能在平衡木上保持平衡，伴有摔落 5分 
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表 1 菸花苷治疗CIRI大鼠KEGG筛选的通路和富集基因
通路名称 通路显著性（P值） 富集基因 NOD样受体信号通路 6.05×10−7 NF-κB、IL-18、Caspase8
NLRP3、GSDMD、Caspase4肿瘤坏死因子受体信号通路 1.12×10−6 NF-κB、p38、Bcl3、TNFR1、
TNFR2、Ccl2、、Caspase8Toll样受体信号通路 3.66×10−6 NF-κB、p38、Caspase8
TLR3、TLR4、TLR7丝裂原活化蛋白激酶信号通路 5.73×10−6 NF-κB 、P38、TNFR、IL-1R
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