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手性药物是指药物分子具有手性中心，形成对映异构体，这些对映异构体在生物体内的药理活性、药物代谢及毒性等方面存在显著的差异[1]。有文献[2]对各国药典进行了研究统计，发现欧洲药典对所有手性药物都须明确左旋、右旋手性化合物的有效性；日本药典对大多数手性药物有明确手性构型要求；中国药典未明确要求特定构型的手性药物占比较多，这说明我国手性药物分析和检测仍需完善。二氢吡啶类（DHP）药物是一类常见的钙通道阻滞药，多用于治疗心脑血管疾病。《中华人民共和国药典》（2020年版）收载的DHP类药物中，除硝苯地平外，其他药物母核的C-4位为手性中心；但这些药物中仅左旋氨氯地平被药典收载，药典对其他DHP类药物构型并未作出明确要求。临床上DHP类药物大多以消旋体形式给药，其对映体的药理活性则差别很大。因此对DHP类药物的手性分析及体内过程的探讨，有助于该类药物进一步确认构型要求，降低用药安全隐患。
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目前，手性药物的分析方法主要为高效液相色谱法（HPLC）和毛细管电泳法（CE），这些方法因其分析手性药物具有快速、分离效果好、检测灵敏度高、可选模式多等特点，应用较广，同时也为生物样品中手性药物的分析提供了技术支撑。
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HPLC进行手性拆分的方法主要分为3种，包括手性固定相法（CSP）、手性流动相添加剂法（CMPA）和手性衍生化试剂法（CDR）。CSP是通过物理吸附或者化学键合的方法把手性化合物键合到固定相载体上，具有简单、快速、高效的特点。CMPA是在流动相中添加某种手性试剂，该手性试剂与对映体溶质之间通过氢键、离子键、配位键或者空穴的包含作用等相互作用，形成非对映异构体，然后根据非对映异构体自身的稳定性及其在固定相和流动相之间的分配系数不同，从而实现对映体的拆分[3]。该方法的成本低，无需昂贵的手性柱，且分离效果好。CDR是利用手性衍生化试剂与样品反应形成非对映异构体，然后在非手性柱上进行分离。该方法柱效高、价格便宜，但耗时且操作复杂，对手性试剂的纯度、反应过程中的稳定性等要求较高，目前国内外暂无用于拆分DHP类药物的文献报道。
Kang等[4]采用万古霉素手性固定相分离人血浆中的贝尼地平对映体。流动相为甲醇-乙酸-三乙胺（100∶0.01∶0.000 1），柱温45 ℃，流速1 ml/min。血浆中贝尼地平在碱性条件下用乙醚液液萃取后进样分析，(–)-α-和(+)-α-贝尼地平异构体分别在2.4 min和3.4 min洗脱，浓度在0.05~10.00 ng/ml范围内线性关系良好，检测限均为0.05 ng/ml。
Yu等[5]首次采用多糖衍生物手性固定相Chiralcel OD-RH、Chiralpak IB和Chiralpak IC柱对尼莫地平、西尼地平、尼卡地平、尼索地平、非洛地平和乐卡地平等6种DHP类药物进行对映体分离比较。其中，键合型手性柱溶剂相容性强、色谱分离效率高、重现性好、手性识别能力更广泛，分离效果好于涂布型手性柱。在Chiralpak IC柱上，流动相为正己烷-异丙醇（90∶10）时，尼莫地平、西尼地平、尼卡地平和尼索地平分离度分别为10.25、6.49、2.20和1.71；只有非洛地平和乐卡尼地平未分离，效果远好于Chiralpak IB柱，说明Chiralpak IC柱中氯代苯基产生的偶极作用增大了手性拆分的几率，适合用于DHP类药物的拆分。
Sun等[6]在前人研究的基础上使用Chiralpak IC柱在标准正相洗脱模式、非标准洗脱模式和反相洗脱模式下对17种DHP结构类似物进行了对映体分离，并考察了醇改性剂、添加剂及温度的影响，发现标准正相洗脱模式对DHP对映体分离的整体效果较好，反相洗脱模式可以作为互补，分离正向模式下不能分离的化合物，证明了Chiralpak IC柱在DHP对映体分离中的广泛溶剂通用性，将不同洗脱模式组合可以针对多种类似物达到更好的分离效果。另外结合对映体分离结果和热力学研究发现，氢键、π-π相互作用、偶极-偶极相互作用、改性剂的浓度、极性在对映体分离中起了重要作用，而碱性添加剂的微小变化对对映体分离没有影响。
Deng等[7]制备了一系列壳聚糖2-硫脲衍生物作为手性固定相，通过比较不同对映体的分离结果，发现其对DHP类钙离子拮抗剂表现出独特的手性识别特性。为进一步探究其机制，将壳聚糖衍生物（Thio-1c, 1e）与尼索地平、尼莫地平、西尼地平外消旋体进行了分子对接，发现壳聚糖硫脲衍生物的2-[3-（甲硫基）丙基硫脲]取代基是分离DHP类钙离子拮抗剂的关键因素。
宫丽等[8]在纤维素键合OJ手性柱上对尼群地平的两个对映异构体进行了拆分，选用不同比例的正己烷-无水乙醇作为流动相，通过溶质计量置换保留模型考察了置换剂无水乙醇强度对拆分的影响，并通过改变流动相中三乙胺浓度及柱温，考察对保留与拆分的影响。溶质计量置换保留模型公式为Logk’=LogI-ZLog[D]，式中k’为容量因子，LogI和Z为常数，分别表征对映体分子对固定相亲合势和与固定相接触面积，[D]为流动相中置换剂的浓度，公式含义为溶质的容量因子的对数与流动相中置换剂的浓度对数之间有线性关系。通过改变流动相中无水乙醇浓度可以计算出LogI和Z值，进而便可以通过公式考察手性固定相的拆分能力、流动相体系中置换剂对拆分的影响方式和程度等，确定色谱条件。发现以正己烷-无水乙醇（90∶10）时，在0～0.25 mol/L范围内，拆分效率及各对映体的保留值均随三乙胺浓度的增高而降低；保持柱温在20℃~30℃可以改善和提高拆分效果。
除了以上的CSP外，CMPA也有应用，表1总结了DHP类药物的手性HPLC分析方法。
表 1 DHP类药物的HPLC手性分析方法
药品 方法 固定相 流动相 保留时间（t/min） 分离度 参考文献 马来酸
氨氯地平CMPA Kromasil-Cl8柱 含20 mmol/L SBE-β-CD的10 mmol/L
磷酸盐缓冲液-乙腈（75∶25）28.45，30.38 2.08 [10] 西尼地平 CSP ChiralcelOD-H
手性柱正己烷-正丁醇（92.5∶7.5） — 1.88 [11] 马尼地平 CSP ChiralcelOD-H
手性柱正已烷-异丙醇
（95∶5）— 1.58 [11] 苯磺酸
氨氯地平CMPA Agilent Eclipse XDB-C18 含20 mmol/L SBE-β-CD的10 mmol/L
磷酸二氢钾溶液-甲醇（60∶40）15.050，18.032 2.1 [12] 尼莫地平
尼群地平CSP Co-MOF-74-L-Tyr手性柱 正已烷-异丙醇
（98∶2）— 2.45
2.63[13] 注：“—”表示未提及；CMPA：手性流动相添加剂法；CSP：手性固定相法。 -
CE是近几十年迅速发展并广泛使用的一种微分离技术，以高压电场为驱动力，毛细管为分离通道，根据样品中各组分之间的淌度和分配行为上的差异而实现分离。通常在缓冲液中添加手性识别试剂之后，以毛细管区带电泳（CZE）、胶束电动毛细管电泳（MEKC）和毛细管电色谱（CEC）为主要的几种分离模式来进行分析，实现快速、高效、低耗的手性药物分析。
蔡诚等[9]采用毛细管区带电泳模式，以高磺化环糊精（HS-CD）为手性识别试剂，考察了手性试剂的类型、浓度及缓冲溶液pH值等对分离度的影响，确定了拆分尼卡地平、尼莫地平和尼群地平对映体的最佳条件为：运行缓冲溶液为50 mmol/ml三乙胺磷酸盐溶液（pH 2.5）；温度：25 ℃；电压：15 kV。其中盐酸尼卡地平对映体在HS-γ-CD手性选择剂存在下获得基线分离，尼莫地平和尼群地平对映体分别在HS-β-CD和HS-α-CD手性选择剂存在下获得部分分离（图1）。对其分离机理进行了初步探讨，发现低pH值条件下叔胺类药物与高磺化环糊精之间存在一定的静电引力作用，对手性对映体的拆分起着决定性的作用。
图 1 尼卡地平、尼莫地平和尼群地平的手性对映体拆分电泳图[13]
Van Eeckhaut等[14]采用电动色谱法研究了尼莫地平、尼索地平和尼群地平的分离和同时对映体分离。以胆盐作为手性表面活性剂时可实现这些DHP衍生物的非手性分离，其中尼莫地平和尼索地平对映体能够分开但无法实现基线分离；十二烷基硫酸钠与中性环糊精混合的十二烷基胶束则无法实现对映体分离；而用羧甲基-β-环糊精在pH值为5.0的条件下则可实现尼索地平和尼莫地平的基线对映体分离。条件优化过程显示，缓冲液类型对尼索地平的手性分离影响较大；有机溶剂会降低尼莫地平对映体分离度，而甲醇或乙醇则增加了尼索地平对映体拆分；温度对尼索地平的对映体分辨率影响几乎无影响，而在较低温度下尼莫地平对映体分辨率提高，推测这可能与二者在醇中的溶解度有关，溶解度增加会导致手性识别能力降低。
聂桂珍等[15]采用甲基丙烯酸缩水甘油酯原位聚合物基质，将磺丁基醚-β-环糊精（SBE-β-CD）修饰到毛细管内壁，制备了开管电色谱柱，开管电色谱柱无须烧塞，操作与电泳同样便利。通过固定相和流动相中SBE-β-CD的协同作用，优化手性添加剂浓度、pH值、施加电压、温度及有机调节剂含量等条件，实现了10种DHP类药物对映体较好的拆分。优化的流动相组成为20 mmol/L NaH2PO4（pH 4.0），含4.0 mmol/LSBE-β-CD，乙腈的体积分数为10%~25%，施加电压15~25 kV，温度为15 ℃，电动进样2 kV×5 s，检测波长为236 nm。基于色谱分离数据探讨得知，氢键、静电、位阻和包结等多种作用对上述手性分离均有贡献。
Ma等[16]以组氨酸、2-甲基咪唑和Co2+为原料，功能化NH2-β-环糊精（NH2-β-CD）制备了一种新型的用于手性分离的开管毛细管柱。表征表明，与NH2-β-CD@capillary相比，NH2-β-CD@His-ZIF-67@毛细管包膜柱对手性分子的分辨能力显著提高。NH2-β-CD@His-ZIF-67@毛细管柱实现了氨氯地平的基线分离，分离度1.70。
Ren等[17]以第二代大环内酯类抗生素伽米霉素（Gam）作为CE中对映体分离的新型手性选择剂，系统地研究了影响对映体分离的因素，包括背景电解质（BGE）的组成、Gam的浓度、有机溶剂的种类和比例、外加电压等。在分析物中，氨氯地平对映体的分离度（Rs）高达15.65，据称这是该药在CE研究中报道的Rs最高值（除了使用分子印迹聚合物技术）。
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药动学主要研究机体对药物处置的动态变化，包括药物在机体内的吸收、分布、代谢及排泄过程。药物的代谢与人的年龄、性别、个体差异和遗传因素等有关。在人体的手性环境中，手性药物对映体与生物大分子间相互识别、相互作用的立体选择性导致了他们在吸收、分布、代谢和排泄过程中存在差异，引起一系列药动学参数的不同[18]，包括生物利用度（F）、血药浓度-时间曲线下面积（AUC0~∞）、达峰浓度（cmax）、表观分布容积（Vd）、消除半衰期（t1/2）、血浆蛋白结合率等。
药动学参数差异与其药效学密不可分。手性药动学的研究可以帮助了解药物在体内立体选择性的过程，更好地评价药物的疗效或毒性，便于开发出单一对映体的药物。目前对DHP类药物手性药动学研究比较明确的是氨氯地平，且临床已经出现了采用单一左旋氨氯地平给药来提高高血压的治疗效果，而其他该类药物如非洛地平、西尼地平等，手性药动学研究仍需加强。
立体选择性药动学研究需要体内手性药物分析方法作为支撑。不同的生物样品如血浆、血清、尿液、组织，以及不同的前处理方法，可能存在影响对映体分离检测的干扰；另外由于给药剂量等原因，DHP类药物的血药浓度往往较低，前处理方法的纯化富集能力和对映体色谱分析时的灵敏度需要重点关注。目前对于生物样品，主要的前处理方法为液-液萃取（LLE）、蛋白沉淀法（PPT）和固相萃取法（SPE）等。其中PPT无法实现对分析物的纯化和富集，检测灵敏度也欠佳，而LLE分离富集效果好，目前应用最多。
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氨氯地平作为长效钙通道阻滞药，临床上广泛用于治疗高血压和心绞痛。其中左旋氨氯地平（S-AML）有扩张血管的作用，具备长效、高效且不良反应少的优点；而右旋氨氯地平（R-AML）不仅几乎无效，还易引起面部潮红、肢端水肿、头痛、头昏等不良反应。
Wang等[19]采用液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）测定大鼠血浆中氨氯地平对映异构体。前处理采用LLE，50 μl血浆样品加入400 μl乙酸乙酯涡旋提取，以卡马西平为内标，使用CHIRALCEL OZ-RH柱，乙腈-水（10 mmol/L乙酸铵∶0.5%氨溶液=95∶5）进行分离，血浆中对映体的最低定量限为0.937 5 ng/ml。18只大鼠随机分为3组，分别灌胃R-AML、S-AML和rac-AML（氨氯地平外消旋体），测定相应的血药浓度，并计算对映体间主要动力学参数。大鼠给药rac-AML后，R-AML的cmax和AUC0~∞分别为（53.08±10.42） μg/ml和（751.58±166.20） h·μg/ml，均显著低于S-AML的cmax和AUC0~∞，即（75.29±9.27） μg/ml和（1 083.42±248.54） h·μg/ml，而tmax和t1/2并无统计学差异，表明大鼠体内氨氯地平具有立体选择性处置差异；有研究表明[20]R-AML在大鼠肝细胞中的代谢程度较S-AML大，说明氨氯地平的代谢具有立体选择性，这也是体内S-AML血药浓度更高的原因。将单一对映体给药和消旋体给药对比发现，两者S-AML药动学参数和血浆药物浓度没有统计学上的显著差异，但是给药消旋体后R-AML各项参数却有明显降低，这说明氨氯地平的立体选择性代谢可能存在竞争性，消旋体给药后R-AML的代谢会抑制S-AML。
房晶等[21]研究健康男性人体中氨氯地平对映体的立体选择性药动学，1 ml血浆采用Oasis HLB 96孔固相萃取板进行前处理，以氯氮䓬为内标，在CHIRAL-AGP柱上用10 mmol/L乙酸铵缓冲液-异丙醇（98∶2）进行手性对映体分离，最低定量限达0.10 ng/ml。健康男性口服给药5 mg后，不同时间点S-AML和R-AML的血浆浓度比值为1.29～1.60（P<0.05），S-AML的cmax为（3.19±0.50） ng/ml，较R-AML的（1.99±0.27） ng/ml明显升高（P<0.05），S-AML和R-AML的AUC0~∞分别为（195.48±39.20） h·ng/ml和（140.45±18.00） h·ng/ml，t1/2分别为（38.10±4.75）h和（32.54±6.58）h，差异均具有统计学意义（P<0.05），说明S-AML是健康男性体内的优势对映体。除了氨氯地平在代谢上的立体选择性外，与血浆蛋白的结合率也可能是其手性差异的原因，S-AML相较于R-AML，与人血清白蛋白的结合更强，从而在血浆中浓度更高[22]。
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贺浪冲等[23]通过联用非手性与手性色谱法，研究尼莫地平及其对映体在大鼠体内药动学及组织分布的立体选择性特征。0.2 ml血浆或0.5 ml组织匀浆样品经过碱化后用正己烷-乙酸乙酯（50∶50）LLE，取上清液挥干后用甲醇0.25 ml复溶，进样100 μl进入ODS柱测定尼莫地平总浓度，同时收集该组分再进行LLE，进一步消除干扰后注入Chiralcel OJ柱，以正己烷-无水乙醇（85∶15）为流动相测定尼莫地平对映体比例。非手性与手性色谱的离线联用测定结果显示，血浆及组织匀浆液中尼莫地平对映体线性关系、最低检测限、精密度和准确度均满足分析要求，每种对映异构体的定量下限确定为5 ng/ml。大鼠体内S-（–）-尼莫地平清除较慢，在血液循环中的浓度水平较高；主要效应器官心脏、大脑、小脑中，S-（–）-尼莫地平的浓度高于R-（+）-尼莫地平，在主要消除器官肾脏、脾脏和肝脏中R-（+）-尼莫地平浓度高于中S-（–）-尼莫地平的浓度，说明尼莫地平对映体在大鼠体内药动学及组织分布存在着立体选择性差异。
Isse等[24]使用LC-MS/MS，测定人体血浆中尼莫地平对映异构体含量。前处理的所有操作均在避光条件下进行，以避免分析物的光降解。将300 µl血浆与50 µl硝苯地平（50 ng/ml）混合后，向样品中加入200 µl氢氧化钠（1 mol/L）并涡旋混合，随后向样品中添加4 ml己烷和乙醚（1∶1）并涡旋混合，在室温下以2 000 r/min离心10 min。将有机层转移到洁净的试管中，并通过真空浓缩器进行干燥。残留物用125 µl流动相（甲醇∶水=75∶25）复溶，将40 µl体积的复溶样品注入LC-MS/MS。使用（S, S）-Whelk O1柱，流动相（甲醇∶水=75∶25）进行分离。实验结果显示，该方法灵敏度高、选择性强，可在1.5~75 ng/ml浓度范围内，准确测定尼莫地平对映异构体含量。由于人体肝脏对S-（–）-尼莫地平的代谢能力更强，因此口服给药后，人体血浆中R-（+）-尼莫地平浓度更高。
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依福地平是新一代DHP类药物，旨在抑制T型和L型Ca2+通道，临床上作为外消旋体给药，其R（–）构型被证明在降压中具有较好的肾保护作用。Liu等[25]研究开发并验证了一种可靠的LC-MS/MS方法用于测定人血浆中依福地平对映异构体，并成功用以表征依福地平的立体选择性药动学。0.5 ml血浆样品通过碱化后用正己烷-二氯甲烷-异丙醇（20∶10∶1）LLE，取上清液挥干后用50%水∶乙腈150 μl 复溶，进样20 μl进入CHIRALPAK ID色谱柱上优化手性分离。每种对映异构体的定量下限确定为0.100 ng/ml。该方法成功应用于口服40 mg盐酸依福地平片后健康受试者体内立体选择性药动学研究。依福地平对映体药动学参数cmax、MRT0~t和MRT0~∞的S（+）/R（–）比值分别为1.15、0.92和0.86，表明依福地平对映体在人体内药动学不存在明显立体选择性差异，开发R（–）构型单一对映体药物将使得具有高血压性肾损伤病人获益。
马尼地平属于新型的DPH类长效钙通道拮抗剂，兼有L型和T型钙双通道阻滞作用，临床上作为外消旋体给药，其R构型无降压作用[26]。Adireddy等[27]采用了一种灵敏、选择性的LC-MS/MS分析方法，测定人体血浆中马尼地平的对映体选择性并应用于健康人体的药动学研究。取500 μl血浆样品，采用固相萃取，以100 ng/ml的R-（–）-马尼地平d4和S-（+）-马尼地平d4混合稀释液为内标，甲醇、水进行预处理，碳酸氢铵缓冲液和水洗涤，乙腈洗脱后氮气吹蒸，流动相溶解后取10 μl进样。由2 mmol/L碳酸氢铵和乙腈（15∶85，v/v）组成的等度流动相，在Chiralpack IC-3 C18柱上对R-（–）-马尼地平和S-（+）-马尼地平进行色谱分离，最低定量限达0.05 ng/ml。健康受试者在禁食条件下口服20 mg后，各药动学参数与该药物的公开评估报告基本一致，表明该分析方法的灵敏度足以达到要求。
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手性药物的对映体虽然具有相似的理化性质，但在体内手性环境中具有高度的立体选择性，手性药物的临床疗效是药物体内过程和生物活性立体选择性的综合结果。
目前除氨氯地平已采用单一对映体给药外，其他DHP类药物还是以消旋体给药，其研究主要集中在手性分析及拆分机理上，仅极个别的药物如尼卡地平、尼莫地平等进行了手性药动学研究，发现部分对映体在生物体内药动学及组织分布存在着立体选择性差异；部分药物如非洛地平、西尼地平等的类似研究还需进一步加强。这主要是因为DHP类药物手性分析条件较为复杂，不仅是手性固定相和手性添加剂的选择，添加剂的浓度、pH值、温度及有机调节剂含量等条件的改变都会对拆分结果产生较大影响。特别是应用到体内分析时，需要考虑原有的拆分方法是否能够满足高灵敏的检测，样品处理是否能够消除内源性干扰对手性分离系统的影响，分析周期是否符合大批量样品测定，因此亟待开发出适合生物样品中DHP类药物手性分析的HPLC或CE方法，为揭示药物或候选化合物可能的立体选择性代谢途径，最大限度地发挥药效和降低毒副作用，以及进一步的结构改造及临床用药提供更为合理的建议。
Advances in chiral analysis and stereoselective pharmacokinetics of dihydropyridine calcium antagonists
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摘要: 手性药物与安全有效用药的关系密切，大多数二氢吡啶类药物具有手性碳原子，以消旋体入药，进入体内后产生立体选择性处置特征，可能影响用药的安全有效。该研究围绕该类药物手性拆分及药动学特点，综述了近年来该类药物的手性高效液相色谱法(HPLC)和手性毛细管电泳法(CE)方法选择规律及体内分析应用；列举并比较了该类药物间的立体选择性药动学研究情况，发现该类药物部分具有明显的立体选择性差异，体内药效和毒性也随之不同。Abstract: Chiral drugs are closely related to the safety and effectiveness of drug use. Most dihydropyridine drugs have chiral carbon atoms, which are used as racemes and produce stereoselective disposal characteristics after entering the body, and may affect the safety and effectiveness of drugs. Therefore, based on the chiral resolution and pharmacokinetic characteristics of this class of drugs, the selection rules of chiral HPLC and CE methods and in vivo analysis applications of this class of drugs in recent years were reviewed. The stereoselective pharmacokinetics of this class of drugs were listed and compared. It was found that some of these drugs had obvious differences in stereoselective pharmacokinetics, and the pharmacokinetics and toxicity in vivo were also different.
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Key words:
- Dihydropyridines /
- Chiral resolution /
- HPLC /
- CE /
- Pharmacokinetics
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随着抗菌药物的广泛使用，细菌耐药问题已经成为全球面临的严重公共卫生挑战。近年来，在院内分离菌株中，革兰阴性菌（G−菌）占比远超革兰阳性菌（G+菌)，其中耐药株日益增多[1]，特别是耐碳青霉烯类肠杆菌属（CRE）、多重耐药（MDR）和泛耐药（XDR），甚至全耐药（PDR）菌株的出现（具体定义参考国际专家建议的暂行标准[2-3]），给临床抗感染治疗带来更多困难。并且不同地区抗菌药物应用和耐药菌流行分布有所不同，在2020年全国耐药监测报告中发现，各种耐药菌检出率排名前3位的地区中，北京市、上海市和河南省出现次数较多，如上海市、河南省及北京市是全国耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌（CR-KPN）检出率最高的3个地区[4]。作为上海市北部的区属某二级综合医院（以下简称本院），周边社区老年患者多，2022年起又承担着大量新冠患者救治任务，因此本院抗菌药物的使用量一直居高不下。
本研究收集本院2018年7月至2023年3月细菌的分离检出数据，分析近年来院内耐药菌变化趋势，有助于临床合理选择和使用抗菌药物，也为制定抗菌药物管理策略提供了数据基础。
1. 资料与方法
1.1 菌株来源
收集2018年7月1日至2023年3月31日本院临床分离的菌株，本次入院时间段内同一患者同一标本取第一次送检结果，并剔除重复菌株。采用法国梅里埃公司的vitek2_compact细菌鉴定仪进行菌株鉴定。
1.2 药敏试验
本院主要采用MIC法，K-B法辅助进行药物敏感性试验，检验结果参考美国临床实验室标准协会（CLSI）指南。质控菌株有大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853、粪肠球菌ATCC29212和金黄色葡萄球菌ATCC25923等。
1.3 统计学处理
使用院内检验系统、Excel软件等对每个季度分离菌株的类型和细菌耐药情况等进行统计分析和数据整理。
2. 结果
2.1 病原菌流行情况
菌株标本主要来源于粪便、血液、尿液、分泌物、脓液和呼吸道标本等。其中血液标本阳性率7.97%，呼吸道标本（咽拭子+痰液）阳性率33.04%，粪便标本阳性率4.59%，中段尿标本阳性率30.26%。
2.1.1 病原菌检出率
2018年7月1日至2023年3月31日本院共分离检出细菌病原菌14 844株，其中G+菌4 757株（32.05%）、G−菌10 087株（67.95%），G−菌检出的菌株数是G+菌的2倍多。本院G−菌和G+菌各季度检出率较平稳，分别为68.22%和31.78%。可以看出本院致病病原细菌以G−菌为主，也是需要关注的焦点。
2.1.2 G−菌检出率
G−菌中最为常见的是大肠埃希菌（G−菌中占比30.25%）、肺炎克雷伯菌（G−菌中占比29.04%）、铜绿假单胞菌（G−菌中占比22.59%）和鲍曼不动杆菌（G−菌中占比15.70%），如表1所示。
表 1 临床分离检出G−菌菌株的分布情况菌株 菌株数 构成比（%） 大肠埃希菌 3 051 30.25 肺炎克雷伯菌 2 929 29.04 铜绿假单胞菌 2 279 22.59 鲍曼不动杆菌 1 584 15.70 如图1所示，2018年7月至2023年3月各季度检出G−菌病原菌构成比和具体检出数值基本较为稳定（2022年第2季度本院成为疫情定点医院，标本数量较少，存在一定偶然性）。大肠埃希菌占总检出菌株数的20%左右，呈下降趋势，肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌在15%左右，其中肺炎克雷伯菌检出率呈上升趋势，于2020年第2季度起总体上超过大肠埃希菌检出率位居第一，铜绿假单胞菌检出率略低于肺炎克雷伯菌，近5年来鲍曼不动杆菌检出率上升较为明显，由2018年第3季度的4.96%上升至2023年第1季度的18.75%。
2.2 G−菌的耐药率
2.2.1 肠杆菌科：大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌
本院对检出的肠杆菌科细菌均进行了产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）监测。2022年大肠杆菌和肺炎克雷伯菌ESBLs的检出率为43.23%和19.50%；对碳青霉烯耐药的大肠杆菌（CR-EC）和肺炎克雷伯菌检出率分别为2.92%和58.07%，对亚胺培南的耐药率逐渐趋于平稳（图2）；喹诺酮类耐药大肠杆菌（QNR-EC）检出率为58.91%，头孢曲松耐药肺炎克雷伯菌（CRO-R KP）检出率为62.41%。但头孢唑林对上述两种肠杆菌的耐药率有下降趋势 （图3）。总体上看肺炎克雷伯菌的耐药形势较大肠杆菌更为严峻，对头孢菌素类、喹诺酮类、β-内酰胺酶抑制剂（除阿维巴坦）和呋喃妥因的耐药率均>50%，对氨基糖苷类和复方新诺明耐药率>30%，仅对替加环素和头孢他啶/阿维巴坦较为敏感，具体数据详见表2。
表 2 2022年大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的耐药率（%）检测项目 大肠埃希菌
（n=393）肺炎克雷伯菌
（n=331）ESBL检测 43.23 19.50 氨苄西林 78.64 100.00 氨苄西林/舒巴坦 35.56 66.42 哌拉西林/他唑巴坦 3.21 57.08 头孢唑林 56.95 66.22 头孢呋辛 64.52 55.57 头孢曲松 53.41 62.41 头孢他啶 26.48 60.59 头孢吡肟 16.25 57.85 头孢替坦 4.44 53.33 头孢哌酮/舒巴坦 5.34 56.82 头孢他啶/阿维巴坦 1.32 1.89 氨曲南 32.87 60.00 亚胺培南 2.51 55.76 美罗培南 2.52 55.46 厄他培南 2.92 58.07 庆大霉素 29.43 50.70 妥布霉素 10.06 47.54 阿米卡星 2.17 32.99 替加环素 0.31 4.62 环丙沙星 58.91 60.83 左氧氟沙星 58.88 60.57 复方新诺明 41.07 39.58 呋喃妥因 1.45 50.31 2.2.2 非发酵菌：铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌
2022年碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌（CR-PA）和鲍曼不动杆菌（CR-AB）的检出率为22.02%和74.34%，2020年耐药率上升，现趋于稳定（CR-PA检出率约25%，CR-AB检出率约80%）；多重耐药铜绿假单胞菌（MDR-PA）检出率26.41%，多重耐药鲍曼不动杆菌（MDR-AB）的检出率为74.34%；铜绿假单胞菌对氨基糖苷类、头孢他啶和头孢吡肟敏感性较好，耐药率均<20%，对氟喹诺酮类的耐药率<30%。鲍曼不动杆菌耐药性高，对头孢菌素类、碳青霉烯类和喹诺酮类的耐药率均>70%，对氨基糖苷类的耐药率>60%，仅对替加环素敏感率高，具体数据详见表3。
表 3 2022年铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌的耐药率（%）检测项目 铜绿假单胞菌
（n=269）鲍曼不动杆菌
（n=289）氨苄西林 100.00 100.00 氨苄西林/舒巴坦 98.83 62.17 哌拉西林/他唑巴坦 5.10 70.88 头孢唑林 100.00 100.00 头孢呋辛 − − 头孢曲松 98.83 71.93 头孢他啶 6.44 72.10 头孢吡肟 5.73 72.71 头孢替坦 100.00 100.00 头孢哌酮/舒巴坦 6.49 49.85 头孢他啶/阿维巴坦 4.03 − 氨曲南 19.69 100.00 亚胺培南 22.02 72.10 美罗培南 17.48 74.34 厄他培南 − − 庆大霉素 17.28 67.03 妥布霉素 18.68 66.36 阿米卡星 0 60.83 替加环素 − 3.37 环丙沙星 26.41 73.61 左氧氟沙星 24.13 72.05 复方新诺明 98.83 23.79 呋喃妥因 100.00 100.00 注：“−”表示不适用。 3. 讨论
近5年本院检出数居于前列的是大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、屎肠球菌和表皮葡萄球菌，2022年病原菌的流行分布情况与Chinet报道[5]基本一致。本院各季度细菌分离检出构成比基本稳定，反映出本院收治的患者及病种较为稳定，未出现院内感控问题。但细菌耐药仍较严重，特别是G− 菌CRE（对碳青霉烯类抗生素耐药菌）、MDR和XDR问题。肺炎克雷伯菌耐药形势严峻，总体耐药率要高于Chinet报道[5]。大肠杆菌的耐药率与Chinet报道[5]大体一致。碳青霉烯类一直被称为治疗肠杆菌科多重耐药菌（尤其是ESBLs菌）的“最后一道防线”，但随着抗菌药物的滥用，对其的耐药菌株的检出率呈上升趋势[6]。2022年本院肺炎克雷伯菌对亚胺培南和美罗培南的耐药率远高于2022年Chinet报告中的22.60%和24.20%，在2021年第2季度也开始出现对厄他培南耐药菌株，2023年第1季度对亚胺培南耐药率高达54.82%。
目前提出4种CRE耐药机制：①产碳青霉烯酶（产KPC为主的A类碳青霉烯酶、以锌离子为活性中心的B类金属β-内酰胺酶和D类的OXA-48）；②产AmpC酶或ESBLs合并外膜蛋白的丢失或改变；③结合位点的缺失、数量下降或亲和性降低/药物作用靶点的改变；④外排泵的高表达/细菌外排泵系统的改变。碳青霉烯酶又分为A类、B类和D类[7]。经研究表明，CRE耐药机制主要是产碳青霉烯酶，其中CR-KP最常见，其耐药机制与总体CRE一致并有相关研究[8-11]佐证。另外有研究表明，CR-KP重要的是有AcrAB-TolC外排泵，该泵是由外膜通道TolC、位于内膜的继发性主动转运体AcrB和周质蛋白AcrA三者构成的完整膜蛋白，该主动转运系统可有方向性的运输不同的化合物，使得肺炎克雷伯菌对多种抗菌药物产生耐药[12]。CRE对目前临床上常应用的绝大多数抗菌药物都耐药，给临床治疗带来巨大困难。在应对泛耐药Kpn，有研究[13]提出增加药物敏感试验（CLSI未推荐）的种类，为临床治疗感染提供有效选择。
本院非发酵菌（特别是鲍曼不动杆菌）分离检出率有逐渐上升趋势，临床上分布广泛，耐药形势极为严峻。CR-AB检出率要高于2022年Chinet监测[5]。鲍曼不动杆菌已成为我国医院感染最主要病原菌，在院内广泛存在，且其抵抗力强、定植和污染多，可通过医务工作者的手和污染的医疗器械以及空气等引起院内感染，病死率高[14]。本院鲍曼不动杆菌检出率增长过快，且对大多数抗菌药物的耐药率高于75%。肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌等细菌耐药未能有效改善，以及近年来出现CRE、MDR和XDR问题等，这些情况都需要引起临床警惕。在2020年第1季度本院细菌耐药有小幅度上升情况，可能与疫情爆发，大量使用抗菌药物进行经验治疗有一定相关性。
前7批国家组织药品集中带量采购，已有42种抗菌药物（不包括局部用药）被纳入其中，美罗培南、法罗培南、厄他培南已被纳入第7批集中大量采购中。有专家对于碳青霉烯类纳入集采表示担忧，为此，中华医学会临床药学分会与中华医学会细菌感染与耐药防治分会针对医疗机构在抗菌药物集采执行过程中面临的问题，组织药学、感染、医保、政策及方法学专家共同撰写专家共识[15]。抗菌药物目录管理在药品集采常态化背景下，医疗机构应主动及时开展抗菌药物供应目录遴选和评估工作，确保本医疗机构抗菌药物目录科学合理前提下，开展病原菌耐药情况的分析和研究，有助于提高临床抗感染治疗的针对性和有效性，更能及时发现问题和遏制细菌耐药。
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表 1 DHP类药物的HPLC手性分析方法
药品 方法 固定相 流动相 保留时间（t/min） 分离度 参考文献 马来酸
氨氯地平CMPA Kromasil-Cl8柱 含20 mmol/L SBE-β-CD的10 mmol/L
磷酸盐缓冲液-乙腈（75∶25）28.45，30.38 2.08 [10] 西尼地平 CSP ChiralcelOD-H
手性柱正己烷-正丁醇（92.5∶7.5） — 1.88 [11] 马尼地平 CSP ChiralcelOD-H
手性柱正已烷-异丙醇
（95∶5）— 1.58 [11] 苯磺酸
氨氯地平CMPA Agilent Eclipse XDB-C18 含20 mmol/L SBE-β-CD的10 mmol/L
磷酸二氢钾溶液-甲醇（60∶40）15.050，18.032 2.1 [12] 尼莫地平
尼群地平CSP Co-MOF-74-L-Tyr手性柱 正已烷-异丙醇
（98∶2）— 2.45
2.63[13] 注：“—”表示未提及；CMPA：手性流动相添加剂法；CSP：手性固定相法。 
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