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冻伤是由寒冷、潮湿或大风引起的，会导致周围组织的损伤、丧失和残疾，尤其是手、脚、鼻子、脸颊和耳朵[1]。冻伤可引起微血管收缩，红细胞聚集，小动脉口径减小，硬度增大，毛细血管通透性升高，从而增加血液黏度，增大血流阻力，引起局部组织血流量减少，最终导致微循环障碍，使组织细胞由于缺血缺氧而坏死[2-3]，临床早期主要通过血管阻塞症状和软组织缺血边界来判断冻伤程度[4-5]。因此，课题组着手研发一种由肌醇烟酸酯（IN）和肝素钠组成的冻伤膏，直接涂在易冻伤的四肢上，用于预防和治疗冻伤，降低冻伤程度。该冻疮膏对早期冻伤、皲裂、湿疹及软组织损伤均有很好的治疗效果[6]。其中，IN是一种外周血管扩张剂，温和持久，能选择性扩张病变部位及冷刺激敏感部位的血管，具有溶栓抗凝、缓解血管痉挛、改善小血管循环、降低毛细血管脆性的作用[7]。此外，它还具有止痒、止痛、消肿的作用。在此处方中，肌醇烟酸酯还可缓解长期使用肝素钠引起的局部血肿血栓和皮肤过敏，有效减少全身凝血功能障碍的副作用。
分析药物在体内血药浓度随时间变化的动态过程，是传统药动学的研究方法。然而，对于经皮给药，药物入血浓度往往很低，难以定量。故本研究采用活体分时采样法，直接在大鼠皮肤上涂药，在不同时间点测定皮肤组织匀浆中的药物浓度。目前，已有研究对人或大鼠血浆中肌醇烟酸酯进行药代动力学研究[8-9]，但是，没有可用于定量分析大鼠皮肤组织匀浆样品中肌醇烟酸酯的含量。因此，本研究旨在建立一种快速、灵敏、重现性好、经济简便的HPLC法，定量分析大鼠皮肤中肌醇烟酸酯，用于大鼠经皮给药肝素钠肌醇烟酸酯乳膏后肌醇烟酸酯的药动学研究。
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W501型高效液相色谱仪（Waters）；KQ3200型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率150 W，频率40 kHz）；FLUKO MODE组织匀浆器（上海弗鲁克流体机械制造有限公司）；XW-80A微型旋涡混合器（上海沪西分析仪器厂有限公司）；离心机（ABBOTT LABORATORIES Germany）；剃须刀（上海飞科电器有限公司）；AUW120D型电子分析天平（SHIMADZU公司）。
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肌醇烟酸酯（天津中瑞药业有限公司，纯度：99.5%）；甲苯咪唑对照品（中国食品药品检定研究院；纯度：99.9%）；肝素钠肌醇烟酸酯乳膏（北部战区总医院药剂科自制，批号：
20150108 ）；盐酸（分析纯，天津市凯信化学工业有限公司）；乙腈（色谱纯，Sigma公司）；甲醇（色谱纯，Sigma公司）；四氢呋喃（色谱纯，Sigma公司）；水为纯化水；其他试剂均为分析纯。 -
SD清洁级雄性大鼠（体重230~250 g）：由辽宁长生生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK（辽）2010-0001。
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Kromasil ODS C18 色谱柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；流动相为甲醇-水-四氢呋喃（35∶55∶10，V/V/V）；检测波长为262 nm；流速1.0 ml/min；柱温25 ℃；进样量20 μl。
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精密称取肌醇烟酸酯对照品12.5 mg（现用现配），置于10 ml量瓶中，加入适量0.5 mol/L盐酸水溶液，超声溶解，0.5 mol/L盐酸水稀释至刻度，即得浓度为1 250 μg/ml的对照品储备液。精密量取对照品储备液适量，置于10 ml量瓶中，分别用0.5 mol/L盐酸水稀释成系列溶液，即得到浓度为5.00、10.00、20.00、50.00、100.00、200.00和400.00 μg/ml的系列对照品溶液。同法配制浓度分别为10.00、50.00、300.00 μg/ml的低、中、高对照品溶液。
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精密吸取低、中、高对照品溶液各50 μl，分别加入到1 ml空白皮肤匀浆液中，分别得到浓度为0.50、2.50和15.00 μg/ml的质控样品（QC）。
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取甲苯咪唑对照品适量，精密称定，加2%盐酸甲醇溶液超声溶解并定量稀释制成浓度为12 μg/ml的内标溶液。
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根据非临床药动学研究技术指导原则及《中国药典》生物样品定量分析方法验证指导原则的有关要求[10-11]，对定量研究方法进行方法学验证。
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取72只健康SD大鼠，雄性，体重（230～250）g，于实验条件下饲养5 d（22±2） ℃，相对湿度（50±10）%。试验开始前1 d，用电动理发器对腹部皮肤进行脱毛（4 cm×4 cm，不要损伤皮肤），禁食不禁水。其中6只大鼠作为空白组，涂抹空白乳膏基质。其余大鼠将临床3倍用量的肝素钠肌醇烟酸酯乳膏均匀涂抹于腹部脱毛处皮肤，剂量为0.2 g/只，于给药后0.25、0.5、l、2、3、4、6、8、10、12、24 h各时间点分别取6只大鼠，给药皮肤表面用生理盐水反复擦拭，以棉签擦干，剥离剪取固定面积的皮肤，去除附着的肌肉，备用。皮肤样品的处理：精密称取皮肤样品0.07 g，加入1 ml 甲醇-0.5mol/L盐酸（50:50，V/V），组织匀浆机研磨后超声处理20 min，离心10 min（转速为10 000 r/min），取300 μl上清液，加入50 μl内标溶液，再加入1 ml乙腈，涡旋混匀1 min，离心10 min（转速为10 000 r/min），取上清液，空气流吹干，加200 μl流动相涡旋1 min复溶，离心5 min（转速为10 000 r/min），取上清液，20 μl进样。
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采用DAS 2.0药动学软件处理，以统计矩方法计算药动学参数。
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取涂抹空白乳膏基质的大鼠皮肤和给药后大鼠皮肤经处理后，分别进样20 μl，记录色谱图，考察是否有内源性物质干扰肌醇烟酸酯的测定。结果见图1。由实验结果可知，在此色谱条件下，皮肤中内源性物质和空白乳膏基质不干扰肌醇烟酸酯和内标的定量测定。
图 1 专属性HPLC图谱
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精密吸取系列对照品溶液各50 μl，分别加入到1 ml空白皮肤匀浆液中，分别得到待测物浓度为0.25、0.50、1.00，2.50，5.00，10.00和20.00 μg/ml的系列溶液，按“2.4”项下操作后进样分析，记录峰面积，以肌醇烟酸酯的浓度（X）为横坐标，以肌醇烟酸酯（A）与内标物（B）的峰面积比值（Y）为纵坐标，进行线性回归计算，得回归方程为Y=0.172X+0.002（r=0.999 9），线性范围0.25~20.00 μg/ml，定量下限为0.25 μg/ml（S/N≥10）。
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取低、中、高不同浓度的QC样品及定量下限，按“2.4”项下方法操作。每个浓度配制6份样品，配制3个分析批，连续测定3 d。计算定量下限和QC样品的日间和日内的准确度RE%和精密度RSD%，见表1，该方法的精密度和准确度均符合生物样品分析要求。
表 1 肌醇烟酸酯在皮肤样品中的精密度和准确度（n=6）
质量浓度
（ρB/μg·ml−1）日内精密度 日间精密度 实测浓度
（ρB/μg·ml−1）RSD
（%）RE
（%）实测浓度
（ρB/μg·ml−1）RSD
（%）RE
（%）0.25 0.24±0.020 8.20 −3.44 0.24±0.025 10.38 −3.18 0.5 0.50±0.042 8.53 −0.87 0.51±0.039 7.65 1.61 2.5 2.37±0.068 2.85 −5.25 2.33±0.12 5.15 −7.00 15 14.67±0.66 4.49 −2.22 13.99±0.85 6.07 −6.73 -
取低、中、高不同浓度的QC样品，按“2.4”项下方法操作，记录峰面积（A1）。另外，将1 ml空白皮肤匀浆液按“2.4”项下方法操作，提取后，加入3种不同浓度的QC样品各50 μl，空气流吹干，加200 μl流动相涡旋1 min复溶，离心（10 000 r/min，5 min），取上清液，20 μl进样，记录峰面积（A2）。将两者相比，即得QC样品的提取回收率。结果见表2。肌醇烟酸酯的平均提取回收率为96.18%，甲苯咪唑的平均提取回收率为90.65%，RSD均<15%，表明该提取方法具有较好的稳定性和重现性。
表 2 样品提取回收率考察结果（n=6）
成分 质量浓度
（ρB/μg·ml−1）回收率（ % ） mean±SD RSD（ % ） 肌醇烟酸酯 0.5 94.26±4.11 4.36 2.5 96.76±5.02 5.19 15 97.52±2.20 2.26 甲苯咪唑 1.70 90.65±3.17 4.35 -
取低、高不同浓度的QC样品，按照“2.4”项下皮肤样品的处理方法操作，分别考察低、高2个浓度的QC样品在室温下放置12 h、−4 ℃放置12 h、反复冻融3次（−20 ℃）和冷冻贮存2周（−80 ℃）的稳定性。数据结果见表3。结果表明，各生物样品在上述条件下稳定性均良好。
表 3 肌醇烟酸酯在不同贮存条件下的稳定性（n=3）
稳定性条件 质量浓度
（ρB/μg·ml−1）实测值
（ρB/μg·ml−1）RSD
（%）室温下放置12 h 0.5 0.47±0.037 7.94 15 14.56±0.63 4.36 −4 ℃乙腈中放置12 h 0.5 0.46±0.034 7.40 15 16.71±0.50 3.03 −20 ℃反复冻融3次 0.5 0.50±0.019 3.75 15 16.73±0.16 0.96 −80 ℃冷冻贮存2周 0.5 0.47±0.038 8.24 15 13.21±0.75 5.69 -
采用DAS 2.0软件，以非房室模型分析待测物的药动学数据。皮肤中药物浓度数据以（mean±SD）表示，绘制了平均药物浓度时间曲线，各时间点含药浓度的计算分别伴随行标曲及QC。将给药后不同时间血药浓度和时间数据用DAS 2.0药动学软件处理，以统计矩方法计算药动学参数。详见图2和表4。
图 2 单次经皮给药后大鼠皮肤中肌醇烟酸酯药物浓度-时间曲线图（mean±SD, n=6）
表 4 大鼠经皮给药后肌醇烟酸酯的主要药动学参数（mean±SD, n=6）
统计矩参数 单位 肌醇烟酸酯参数值 t1/2 h 4.555±2.054 Tmax h 6±0 Cmax mg/L 16.929±2.153 AUC0-t mg·h /L 150.665±16.568 AUC0-∞ mg·h /L 161.074±23.917 MRT（0−t） h 9.044±0.618 MRT（0−∞） h 10.444±1.91 CLz/F L/（h·kg） 0.19±0.03 Vz/F L/（h·kg） 1.19±0.437 -
本实验采用在体给药分时取样法，在不同时间点取皮制备成匀浆测定皮肤中药物浓度。该方法线性关系良好、所测匀浆样品的精密度、准确度等方法学均符合生物样品定量分析要求，其专属性强、灵敏度高、简便、快速高效，可以用于大鼠皮肤中IN的含量测定，对IN在体皮肤浓度测定以及相关药理研究有一定的参考价值。由上述结果可知，IN能迅速渗透进入皮肤，并能长时间蓄积在皮肤局部，有利于IN在病变部位长时间发挥药效。HPLC分析方法快速、准确、回收率高、重现性好，可成功的用于测定GJR中IN在皮肤中的含量，表明在体给药分时取样法能较好地反映药物在大鼠体内的经皮代谢过程，适用于临床前外用药物的皮肤药动学筛选与评价，为临床用药方案的确定提供参考。
Skin pharmacokinetics of inositol nicotinate in heparin sodium inositol nicotinate cream
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摘要:
目的 建立HPLC法测定大鼠皮肤中肌醇烟酸酯（IN）的浓度，并研究肝素钠肌醇烟酸酯乳膏在大鼠经皮给药后IN的药动学特征。 方法 采用HPLC法建立简便快速的测定给药后不同时间点大鼠皮肤中IN浓度的分析方法，并用建立的方法开展肝素钠肌醇烟酸酯乳膏在大鼠经皮给药后IN的药动学研究，采用DAS软件拟合药物动力学参数。 结果 该分析方法在0.25 ~ 20 μg/ml浓度范围内线性良好，定量限为0.25 μg/ml，平均加样回收率为96.18%。肝素钠肌醇烟酸酯乳膏皮肤给药后IN的药动学参数t1/2 为（4.555±2.054） h、Tmax为（6±0） h、Cmax为（16.929±2.153） mg/L、AUC0−t为（150.665±16.568） mg·h /L、AUC0−∞为（161.074±23.917） mg·h /L、MRT（0−t）为（9.044±0.618） h、MRT（0−∞）为（10.444±1.91） h、CLz/F 为（0.19±0.03） L/（h·kg）、Vz/F 为（1.190±0.437） L/（h·kg）。 结论 IN能迅速渗透进入皮肤，并能够长时间蓄积在皮肤局部，有利于IN在病变部位长时间发挥药效。该方法简便、快速、专属性强、重复性好，可应用于大鼠腹部皮肤给药后IN的药动学研究。 -
关键词:
- 肝素钠肌醇烟酸酯乳膏 /
- 皮肤药动学 /
- 肌醇烟酸酯
Abstract:Objective To establish an HPLC method to determine the concentration of inositol nicotinate（IN） in rat skin, and study the pharmacokinetic characteristics of IN after transdermal administration of heparin sodium inositol nicotinate cream in rats. Methods HPLC method was used to establish a simple and rapid analytical method for the determination of IN concentration in the skin of rats at different time points after administration. The established method was used to study the pharmacokinetics of IN after transdermal administration of heparin sodium inositol nicotinate cream in rats, and the pharmacokinetic parameters were fitted with DAS software. Results The linearity of the analytical method was good in the concentration range of 0.25-20 μg/ml, the quantitative limit was 0.25 μg/ml, and the average recovery rate was 96.18%. The pharmacokinetic parameters of IN after transdermal administration of heparin sodium inositol nicotinate cream in rats were as follows: t1/2 was （4.555±2.054） h, Tmax was （6±0）h, Cmax was （16.929±2.153）mg/L, AUC0−t was （150.665±16.568） mg·h /L ,AUC0−∞ was （161.074±23.917） mg·h /L, MRT（0−t） was （9.044±0.618）h, MRT（0−∞） was （10.444±1.91） h, CLz/F was （0.19±0.03） L/（h·kg）, and Vz/F was （1.19±0.437） L/（h·kg）. Conclusion IN could quickly penetrate the skin and accumulate in the skin for a long time, which was beneficial to the pharmacological action of drugs on the lesion site for a long time. The method is simple, rapid, specific and reproducible, which could be successfully applied to the pharmacokinetic study of IN after transdermal administration in rats. -
近年来，随着肿瘤、器官移植和获得性免疫缺陷综合征(AIDS)等导致的免疫功能低下人群的增加，侵袭性真菌感染（IFIs）的发病率和病死率逐年上升[1-2]。念珠菌、隐球菌和曲霉菌是IFIs最主要的致病菌，并且造成的病死率超过90%[3]。在念珠菌属中，白念珠菌（Candida. albicans）是院内血液感染最常见的致病菌原体，其在重症监护病房（ICU）患者中致病率超过17%，病死率高达40%[4-5]。临床上治疗IFIs的抗真菌药物主要包括：多烯类（两性霉素B）、核酸类（5-氟胞嘧啶）、唑类（氟康唑）和棘白菌素类（卡泊芬净）药物（图1）[6-7]。然而，由于临床上出现抗真菌药物严重的耐药性和毒副作用，IFIs的治疗效果相当有限。因此，迫切需要研发全新机制的抗真菌药物。
组蛋白乙酰化修饰（包括组蛋白乙酰化和去乙酰化）是表观遗传学研究的重要组成部分。组蛋白去乙酰化酶（HDACs）将组蛋白和其他蛋白上的赖氨酸末端乙酰基去除，对染色体重塑和基因的表达起着重要作用[8-9]。目前HDAC抑制剂主要集中于抗肿瘤研究方向，且已有多个上市药物应用于肿瘤的治疗。据研究报道，真菌中的HDACs，如烟曲霉[10]、白念珠菌[11-12]、酿酒酵母[13]和新生隐球菌的HDACs[14-15]参与了毒力相关的过程和形态变化。因此，抑制真菌HDACs可能是治疗IFIs的有效策略。
联合药物治疗是提高临床一线药物疗效并克服真菌耐药性的有效策略之一。真菌的耐药性涉及转录调节，其中染色体重塑和组蛋白修饰起主要作用。HDACs调节的组蛋白修饰在应激信号通路中起着至关重要的作用，这可能与真菌对各种环境（包括药物）的应激反应有关[16]。此外，已有研究报道，HDAC抑制剂与唑类药物联用具有协同增效作用[17-18]。例如，HDAC抑制剂MGCD290与氟康唑联用具有协同抗多种临床真菌分离株的作用[19]。
基于此，本研究首先对8个市售的HDAC抑制剂（图2）进行体外协同抗真菌活性测试，筛选结果显示化合物Rocilinostat与氟康唑联用具有优秀的体外协同抗耐药白念珠菌活性。后续考察其与不同唑类药物联用时对不同念珠菌属的体外协同抗真菌活性，以及对正常细胞的毒性作用，以期为抗真菌药物的研发提供依据。
1. 材料和方法
1.1 实验试剂与菌株
临床分离的6株唑类耐药白念珠菌（编号：9893，10061，10060，9173，4108和0304103），2株唑类耐药热带念珠菌（编号：5008，10086），1株光滑念珠菌（编号：9073）和1株耳道念珠菌（编号：0029）由海军军医大学附属长征医院提供。菌株活化首先从−80 ℃中挑取菌株冻存液至YEPD液体培养基活化24 h,然后取10 μl菌悬液至1 ml YEPD中，并在30 ℃、200 r/min下培养16 h后待用。HUVEC细胞来源于中国科学院上海细胞库，并在新鲜配置的DMEM完全培养基中培养。
YEPD液体培养基：取10 g酵母浸膏、20 g葡萄糖、20 g蛋白胨溶解于1 000 ml三蒸水中，经高压蒸汽灭菌（121 ℃, 15 min）后，保存于4 ℃条件下备用。RPMI 1640培养基：取10 g RPMI 1640（Gibco）粉末、34.5 g吗啡啉丙磺酸、2 g NaHCO3、2.7 g NaOH溶解于1 000 ml三蒸水中，经0.22 μm的微孔滤膜过滤与灭菌后，置于4 ℃条件下保存和备用。DMEM完全培养基：按照89% DMEM基础培养基+10%胎牛血清+1%的双抗比例混匀制得，混匀后置于4 ℃条件下保存和备用。PBS缓冲液：10 × PBS 100 ml溶解于900 ml三蒸水中，经高压蒸汽灭菌（121 ℃, 15 min）后，置于4 ℃条件下保存和备用。
1.2 仪器
THZ-92A气浴恒温振荡器（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）、MJ-150-I霉菌培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）、LW100T生物显微镜（北京测维光电技术有限公司）、HDC-15K高速离心机（上海泰坦科技股份有限公司）、C170二氧化碳培养箱（BINDER GmbH）、infinite M200多功能酶标仪（Tecan Austria GmbH）、高压蒸汽灭菌锅、无菌洁净工作台。
1.3 棋盘式微量液基稀释法
本实验参照美国临床和实验室标准协会（CLSI）公布的M27-A3方案中微量液基稀释法进行。首先，收集活化好的真菌细胞，PBS洗3次后用RPMI 1640培养基制成浓度为1×103 CFU/ml的菌悬液。按照每孔100 μl接种菌悬液至无菌96孔板中，1～9列加入倍半稀释的HDAC抑制剂，A～F行加入倍半稀释的氟康唑，其中G行只加氟康唑，第10列只加化合物，第11列为不加药的阴性对照组，后将96孔板置于35 °C条件下孵育48 h。测定每孔在630 nm处的吸光度A，依据公式：抑制率（%）=（A阳性对照孔−A化合物孔）/（A阳性对照孔−A阴性对照孔）× 100%，计算各孔对应的抑制率。如果某一孔和其左边孔对应的抑制率均大于80%，则该孔对应的化合物和FLC浓度分别作为FIC化合物和FIC氟康唑，利用协同指数公式：FICI =（FIC化合物./MIC80 化合物）+（FIC氟康唑/MIC80 氟康唑），计算各化合物对应的FICI。
1.4 时间-生长曲线实验
收集活化好的白念珠菌0304103稀释在RPMI 1640培养液中，保持菌浓度为1×105 CFU/ml。取5 ml稀释的菌悬液和不同浓度的待测药物加入50 ml的离心管中, DMSO组作为空白对照组和32 μg/ml FLC作为阳性对照。随后将50 ml的离心管置于30 °C条件下振荡培养（200 r/min），在多个时间点吸取不同药物组的真菌混悬液（100 μl）于96孔板上，测量A630值并使用GraphPad Prism 7作图。
1.5 真菌细胞总HDAC酶活性测试实验
收集指数生长期的白念珠菌0304103细胞（湿重为100 mg），然后用3 mg snailase、12 μl 2-巯基乙醇和3 ml snailase反应缓冲液等新鲜配置的真菌裂解液来处理它们，以制备真菌原生质体。真菌原生质体分散在PBS（20 ml）中以获得混悬液，然后往96孔板每孔中加入100 μl的混悬液和不同浓度的化合物Rocilinostat，并在35 °C下培育12 h。接着往每个孔中加入30 μmol/L的HDAC底物，于37°C下孵育6 h。随后添加100 μl HDAC酶促终止溶液并在37°C下孵育2 h。最后，在每个孔中取出100 μl培养物添加到黑板中，用Ex=360 nm，Em=460 nm来监测荧光强度并记录下来用于计算HDAC酶的抑制率。
2. 结果
2.1 化合物Rocilinostat与氟康唑联用具有协同抗真菌活性
表1列出了HDAC抑制剂单独使用或与氟康唑联合使用的体外抗真菌活性筛选结果。MIC80为抑制80%真菌细胞生长的最低药物浓度。实验结果表明，8个HDAC抑制剂单独使用对耐药白念珠菌均无直接的抗真菌活性（MIC80>64 μg/ml）；而化合物Rocilinostat（FICI=0.039）和伏立诺他（FICI=0.125）与FLC联用时均表现出良好的协同抗真菌活性。其中，化合物Rocilinostat的协同活性最佳，值得进一步研究。
表 1 单用HDAC抑制剂或者与氟康唑联用对白念珠菌0304103的体外抗真菌活性(μg/ml)抑制剂 抑制剂 氟康唑 FICI 单用 联用 单用 联用 伏立诺他 >64 4 >64 4 0.125 Rocilinostat >64 2 >64 0.5 0.039 T3516 >64 64 >64 64 2 T6016 >64 64 >64 64 2 T6421 >64 32 >64 32 1 T2157 >64 32 >64 32 1 T1726 >64 64 >64 64 2 T3358 >64 32 >64 64 1.5 注: FICI值≤ 0.5表示协同，FICI值> 4表示拮抗；0.5<FICI<4表示不相关。 2.2 Rocilinostat与氟康唑或伏立康唑联用对多种白念珠菌的抗真菌活性
为进一步考察Rocilinostat是否具广谱的抗真菌作用，挑选9株临床分离的念珠菌属菌株进行协同抗真菌活性测试。如表2所示，Rocilinostat与FLC联合使用时，对两株耐FLC的白念珠菌（C. albicans 9173，FICI=0.094; C. albicans 4108, FICI=0.5）和对FLC敏感的光滑念珠菌（C. glabrata 9073）表现出协同增效作用，而对热带念珠菌（C. tropicis）和耳道念珠菌（C. auris）没有协同抗真菌活性。当Rocilinostat与伏立康唑（VRC）联用时，对耐VRC的白念珠菌（C. albicans 10060, FICI=0.033）表现出优异的协同抗真菌活性 (表3)。
表 2 Rocilinostat与氟康唑单用或联用对多种念珠菌菌株的体外抗真菌活性[MIC80 (μg/ml)]菌株 单用 联用 FICI Rocilinostat 氟康唑 Rocilinostat 氟康唑 9893 >64 >64 64 64 2 10061 >64 >64 64 64 2 10060 >64 >64 64 64 2 9173 >64 >64 4 2 0.094 4108 >64 >64 32 32 0.5 10186 >64 >64 64 64 2 5008 >64 >64 64 8 1.125 9073 32 4 32 8 0.375 0029 64 32 >64 32 1 表 3 Rocilinostat与伏立康唑单用或联用对白念珠菌菌株的体外抗真菌活性[MIC80 (μg/ml)]菌株 单用 联用 FICI Rocilinostat 伏立康唑 Rocilinostat 伏立康唑 0304103 >64 >64 32 2 0.531 10061 >64 >64 32 0.125 0.502 10060 >64 >64 2 0.125 0.033 2.3 Rocilinostat与氟康唑联用有效抑制真菌的生长
为进一步考察化合物Rocilinostat的协同抗真菌活性，我们又开展了时间-生长曲线实验。从图3结果可以看出，高浓度的氟康唑或Rocilinostat单独使用对真菌生长无抑制作用，而Rocilinostat与不同浓度的氟康唑联用能够有效抑制真菌的生长，且呈浓度依赖趋势 (图3中抑制剂为Rocilinostat)。
2.4 Rocilinostat对真菌细胞的选择性作用
采用HUVEC（人脐静脉内皮细胞）对化合物Rocilinostat进行细胞毒性的评价。结果如表4显示，化合物Rocilinostat对正常细胞表现出低毒性，IC50值为52.17 μmol/L (22.60 μg/ml)，相当于其发挥协同抗耐药真菌（C. albicans 0304103）活性MIC80值的44倍，表明Rocilinostat对真菌细胞具有较强的选择性作用。此外，我们还测试了化合物Rocilinostat对真菌总HDAC酶的抑制活性，结果表明，Rocilinostat对真菌HDAC酶抑制活性（IC50=0.41 μmol/L）优于泛HDAC抑制剂伏立诺他（IC50=1.03 μmol/L）。
表 4 Rocilinostat对正常细胞的毒性和真菌总HDAC酶活性IC50 (μmol/L)化合物 HUVEC 白念珠菌（总HDAC酶） Rocilinostat 52.17 0.41 伏立诺他 — 1.03 注: “—”表示没有测试。 3. 讨论
本研究从市售的8个HDAC抑制剂中筛选出协同活性最佳的化合物Rocilinostat。进一步研究发现Rocilinostat与氟康唑联用对白念珠菌和光滑念珠菌具有协同增效作用。此外，化合物Rocilinostat与伏立康唑联用对临床分离的耐药白念珠菌株同样具有优秀的抗真菌活性。更值得关注的是，化合物Rocilinostat对正常细胞表现出低毒性，其对真菌细胞具有很好的选择性。因此，HDAC抑制剂Rocilinostat可以作为一种低毒、有效的唑类抗真菌药物增效剂，为抗真菌药物的发展提供了新的研究基础。
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图 1 专属性HPLC图谱
A. 空白皮肤（涂抹空白基质乳膏）溶液；B. 空白皮肤溶液+肌醇烟酸酯+甲苯咪唑对照品溶液； C.含药皮肤样品溶液（涂抹6 h后）；1. 肌醇烟酸酯；2. 甲苯咪唑
表 1 肌醇烟酸酯在皮肤样品中的精密度和准确度（n=6）
质量浓度
（ρB/μg·ml−1）日内精密度 日间精密度 实测浓度
（ρB/μg·ml−1）RSD
（%）RE
（%）实测浓度
（ρB/μg·ml−1）RSD
（%）RE
（%）0.25 0.24±0.020 8.20 −3.44 0.24±0.025 10.38 −3.18 0.5 0.50±0.042 8.53 −0.87 0.51±0.039 7.65 1.61 2.5 2.37±0.068 2.85 −5.25 2.33±0.12 5.15 −7.00 15 14.67±0.66 4.49 −2.22 13.99±0.85 6.07 −6.73 
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表 2 样品提取回收率考察结果（n=6）
成分 质量浓度
（ρB/μg·ml−1）回收率（ % ） mean±SD RSD（ % ） 肌醇烟酸酯 0.5 94.26±4.11 4.36 2.5 96.76±5.02 5.19 15 97.52±2.20 2.26 甲苯咪唑 1.70 90.65±3.17 4.35
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表 3 肌醇烟酸酯在不同贮存条件下的稳定性（n=3）
稳定性条件 质量浓度
（ρB/μg·ml−1）实测值
（ρB/μg·ml−1）RSD
（%）室温下放置12 h 0.5 0.47±0.037 7.94 15 14.56±0.63 4.36 −4 ℃乙腈中放置12 h 0.5 0.46±0.034 7.40 15 16.71±0.50 3.03 −20 ℃反复冻融3次 0.5 0.50±0.019 3.75 15 16.73±0.16 0.96 −80 ℃冷冻贮存2周 0.5 0.47±0.038 8.24 15 13.21±0.75 5.69
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表 4 大鼠经皮给药后肌醇烟酸酯的主要药动学参数（mean±SD, n=6）
统计矩参数 单位 肌醇烟酸酯参数值 t1/2 h 4.555±2.054 Tmax h 6±0 Cmax mg/L 16.929±2.153 AUC0-t mg·h /L 150.665±16.568 AUC0-∞ mg·h /L 161.074±23.917 MRT（0−t） h 9.044±0.618 MRT（0−∞） h 10.444±1.91 CLz/F L/（h·kg） 0.19±0.03 Vz/F L/（h·kg） 1.19±0.437
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