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紫杉醇（PTX）是从裸子植物红豆杉树皮分离得到的天然次生代谢产物，属于微管蛋白抑制剂，在临床上广泛用于卵巢癌、非小细胞肺癌和乳腺癌的治疗[1]。传统的PTX注射液因添加了聚氧乙烯蓖麻油而导致过敏反应，并加重PTX的外周神经毒性，还影响药物分子向组织间扩散，影响抗肿瘤效应，且滴注时间过长[2]。前药设计在提高药物生物利用度，增加药物稳定性，减小毒副作用，延长药物作用时间等方面具有很大的优势[3]。其中，长链饱和脂肪酸如肉豆蔻酸（MA）[4]、棕榈酸（PA）[5]和硬脂酸（SA）[6]等常用于药物成酯前药修饰。例如，治疗类风湿性关节炎的上市药物地塞米松棕榈酸酯注射液，就是通过饱和脂肪酸棕榈酸与地塞米松成酯反应形成地塞米松棕榈酸酯前药，继而制备成纳米前药，极大地增加了制剂的稳定性与成药性[6]。
脂质体作为载体递送脂溶性药物近年来受到广泛关注，这为PTX脂质体制剂的研发提供了重要依据。据此，我们对PTX的C2′羟基进行酯化修饰形成脂溶性较强的PTX肉豆蔻酸酯（PTX-MA）、PTX棕榈酸酯（PTX-PA）和PTX硬脂酸酯（PTX-SA）等前药分子，然后将其分别制备成PTX-MA脂质体（PTX-MA-L）、PTX-PA脂质体（PTX-PA-L）和PTX-SA脂质体（PTX-SA-L），不仅可以解决PTX成药性差的问题，也可以提高载药量、增加药物稳定性、改善药代动力学和药效学[7-10]。
该研究以卡马西平为内标，成功建立了小鼠血浆中PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA含量的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）测定方法，在此基础上比较考察了其脂质体PTX-MA-L、PTX-PA-L和PTX-SA-L在小鼠体内的药代动力学特性，从而为PTX脂肪酸酯前药的纳米制剂研发提供科学依据。
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Vanquish™ 超高相液相色谱仪（美国Thermo scientific公司）；TSQ Altis™ 三重四级杆质谱仪（美国Thermo scientific公司）；台式高速冷冻离心机（上海伟进生物科技有限公司）。
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紫杉醇（纯度≥98%）购自江苏红豆杉生物医药科技股份有限公司；紫杉醇肉豆蔻酸酯（PTX-MA，纯度≥98%）及其脂质体（PTX-MA-L）、紫杉醇棕榈酸酯（PTX-PA，纯度≥98%）及其脂质体（PTX-PA-L）、紫杉醇硬脂酸酯（PTX-SA，纯度≥98%）及其脂质体（PTX-SA-L）均为海军军医大学药学系药剂学教研室自制；甲酸、超纯水、甲醇和乙腈购自赛默飞世尔（中国）有限公司，均为色谱纯；卡马西平购自上海源叶生物科技有限公司。
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ICR小鼠[雌性，（18±2） g，购自浙江维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号：SCXK（浙）2020-0002]。
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色谱柱：Eclipse Plus C8色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；流动相：0.2%甲酸水溶液（A）-甲醇（B）梯度洗脱；梯度洗脱程序：20% B~ 60% B（0~0.3 min），60% B~ 98% B（0.3~ 3.9 min），98% B~ 60% B（3.9~ 4.8 min），60% B~ 20% B（4.8~ 5.2 min），20% B（5.2~ 7.0 min）；流速：0.3 ml/min；进样量：10 µl；柱温：30 ℃。
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电喷雾离子源（ESI）采用正离子采集模式。离子源参数：电喷雾电压：3.5 kV（+）；离子传输管温度：325 ℃；雾化温度：275 ℃；鞘气压力：35 Arb；辅气压力：5 Arb；毛细管压力：1.5 mTorr。定量分析离子分别为：m/z
1086.7 →518.3（PTX-MA），m/z1114.5 →546.3（PTX-PA），m/z1142.7 →574.4（PTX-SA），m/z 237.1→194.0（卡马西平，内标）。 -
分别精密称取10.00 mg 3种对照品（PTX-MA、PTX-PA、PTX-SA）置于10 ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成1.00 mg/ml的对照品储备液。吸取一定量的对照品储备液，用甲醇稀释成一系列浓度的工作溶液，置于4 ℃冰箱保存备用。
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精密称取10.00 mg卡马西平，用乙腈溶解并定容，配制成1.00 mg/ml的内标储备液。吸取一定量的内标储备液，用乙腈稀释成30.00 ng/ml工作溶液，置于4℃冰箱保存备用。
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精密量取100 μl小鼠血浆样品液于1.5 ml离心管中，加入300 µl内标溶液，涡旋混合1 min后，13 000 r/min离心10 min，吸取上清液，置于新的EP管中，于40 ℃下真空离心挥干溶剂。精密量取200 µl乙腈复溶样品，过0.22 μm尼龙滤膜，即制得小鼠血浆样品溶液。
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精密量取100 µl空白血浆，用300 µl乙腈代替300 µl内标液，按“2.3”项下方法处理后，再按“2.1”项下方法测定，记录空白血浆色谱图；精密量取100 µl空白血浆，按“2.3”项下操作处理后，再按“2.1”项下方法测定，记录含内标的血浆样品色谱图；精密量取含适量PTX-MA、PTX-PA、PTX-SA的空白血浆样品各100 µl，用300 µl乙腈代替300 µl内标液，按“2.3”项下方法处理后，再按“2.1”项下方法测定，记录含PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA的血浆样品色谱图。结果见图1，内标、PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA的色谱峰附近无明显内源性杂质峰干扰，其保留时间分别为2.41、4.37、4.84和5.28 min，表明血浆中内源性物质不干扰PTX-MA、PTX-PA、PTX-SA和内标的测定。
图 1 空白血浆及内标、PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA的血浆样品液的UPLC-MS/MS色谱图
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精密量取95 µl小鼠空白血浆，加入5 µl紫杉醇脂肪酸酯对照样品（PTX-MA或PTX-PA或PTX-SA）工作溶液配制成5.00、25.00、50.00、100.00、300.00和500.00 ng/ml的PTX-MA或PTX-PA或PTX-SA系列浓度对照样品小鼠血浆液，按“2.3”项下操作处理后，再按“2.1”项下进样测定。以PTX-MA或PTX-PA或PTX-SA对照样品浓度为横坐标（X），样品峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标（Y）进行线性回归分析，求得各自回归方程，结果见表1。
表 1 PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA的标准曲线参数
对照样品 回归方程 r 线性范围（ng/ml） PTX-MA Y=0.186 2 X−1.984 0.995 8 5.00~500.00 PTX-PA Y=0.668 5 X−12.977 0.998 4 5.00~500.00 PTX-SA Y=0.402 1 X−7.171 0.998 8 5.00~500.00 -
取空白小鼠血浆，分别配制含PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA浓度为10.00、250.00和375.00 ng/ml的低、中、高3个浓度的小鼠血浆样品溶液，置于−80 ℃低温冰箱保存。按“2.3”项下方法处理后，再按“2.1”项下方法进样分析测定。每个浓度5份，每天连续进样3次，连续3 d。根据测得PTX-MA、PTX-PA、PTX-SA和内标的峰面积，计算PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA的实测浓度，考察PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA低、中、高浓度在小鼠血浆中的日内及日间的准确度和精密度。如表2结果显示，PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA在低、中、高3个浓度的日内和日间的精密度RSD均<8.4%，准确度均>95%，表明仪器精密度良好。
表 2 PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA样本的精密度（n = 5）
对照样品 理论浓度（ng/ml） 日内精密度 日间精密度 实测浓度（ng/ml） 回收率（%） RSD（%） 实测浓度（ng/ml） 回收率（%） RSD（%） PTX-MA 10.00 9.93±0.83 99.36±8.32 8.38 10.37±0.61 103.67±6.06 5.84 250.00 242.29±10.93 96.84±4.51 4.51 247.42±5.30 98.97±2.12 2.14 375.00 371.31±6.30 99.02±1.68 1.70 373.37±6.20 99.57±1.65 1.66 PTX-PA 10.00 9.83±0.50 98.28±5.00 5.09 10.25±0.55 102.53±5.52 5.38 250.00 248.42±6.81 99.37±2.72 2.74 246.93±5.74 98.77±2.29 2.32 375.00 373.79±8.70 99.68±2.32 2.33 371.59±4.12 99.09±1.10 1.11 PTX-SA 10.00 9.59±0.51 95.90±5.08 5.30 10.33±0.67 103.27±6.72 6.50 250.00 248.81±7.89 99.53±3.16 3.17 245.92±5.04 98.37±2.01 2.05 375.00 374.36±8.81 99.83±2.35 2.35 371.26±2.43 99.00±0.65 0.65 -
取空白小鼠血浆，分别配制低、中、高3个浓度（10.00、250.00和375.00 ng/ml）的血浆样品（PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA）液各3份，分别于室温放置12 h、−20 ℃冻存5 d后复融或−20 ℃反复冻融3次，按“2.3”项下方法处理样本，再按“2.1”项下方法进样分析测定。结果显示，在上述考察条件下，PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA的低、中、高3个实测浓度的RSD均<10%，表明PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA的小鼠血浆样品在室温放置12 h、−20 ℃冻存5 d及−20 ℃反复冻融3次条件下稳定性良好。
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取空白小鼠血浆，分别配制低、中、高3个浓度（10.00、250.00和375.00 ng/ml）的血浆样品（PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA）液各3份，按“2.3”项下方法处理样本，再按“2.1”项下方法进样分析测定，计算所得浓度为A。另取空白血浆，按“2.3”项下方法处理样本后，再加入PTX-MA或PTX-PA或PTX-SA工作液形成终浓度分别为10.00、250.00和375.00 ng/ml的3种不同浓度的标准溶液，按“2.1”项下方法进样分析测定，计算所得浓度为B。用甲醇配制含内标（30 ng/ml）的低、中、高3个浓度（10.00、250.00 和375.00 ng/ml）的PTX-MA或PTX-PA或PTX-SA的样品溶液，按“2.1”项下方法进样分析测定，计算所得浓度为C。提取回收率为（A/B）×100%，基质效应为（B/C）×100%。结果见表3，PTX-MA、PTX-PA或PTX-SA的平均提取回收率和基质效应的RSD均<10%，符合测定要求。
表 3 小鼠血浆中PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA的提取回收率和基质效应（n = 3）
对照样品 理论浓度（ng/ml） 回收率（%） RSD（%）a 基质效应（%） RSD（%）b PTX-MA 10.00 79.82±6.60 8.28 95.36±6.55 6.87 250.00 88.35±2.84 3.22 96.28±3.59 3.73 375.00 92.08±2.46 2.67 98.86±1.46 1.48 PTX-PA 10.00 73.34±7.24 9.88 94.28±1.96 2.08 250.00 83.58±2.24 2.68 98.46±1.86 1.89 375.00 89.47±1.51 1.68 98.88±0.68 0.69 PTX-SA 10.00 61.90±4.11 6.63 95.90±5.08 5.30 250.00 77.26±2.88 3.73 98.78±2.22 2.25 375.00 84.43±1.21 1.44 99.08±1.01 1.02 注：a：回收率的相对标准偏差；b:基质效应的相对标准偏差。 -
雌性ICR小鼠90只，于实验前12 h禁食不禁水， 标记称重后分为PTX-MA-L、PTX-PA-L、PTX-SA-L 3组。以紫杉醇等摩尔剂量15.00 mg/kg小鼠尾静脉给药，分别于给药后2 min、30 min、1 h、2 h、4 h、6 h、12 h、1 d、3 d、14 d，小鼠眼眶静脉丛取血0.3 ml（每个时间点各取3只小鼠），置于装有肝素钠的离心管中，以10 000 r/min离心3 min后，上清液置于−80 ℃冰箱保存待测。上述血浆样品液按“2.3”项下方法处理后按“2.1”项下方法进样测定。所得数据用DSA2.0软件进行处理，以三房室模型计算得到药代动力学参数，结果见表4。
表 4 小鼠尾静脉注射3种紫杉醇脂肪酸酯前药脂质体药代动力学参数（n = 3）
关键参数 单位 PTX-MA-L PTX-PA-L PTX-SA-L Cmax ng/L 226 436.10±4 932.89 289 171.80±5 311.62 333 508.00±3 464.10 AUC0-14 d ng·h/L 502 384.75±3 464.10 776 973.44±5 196.15 1 668 984.05±6 350.85 AUC0-∞ ng·h/L 503 800.86±8 082.90 777 835.54±6 429.10 1 669 696.54±5 773.50 t1/2 h 14.78±2.00 44.49±3.51 69.32±2.15 V L/kg 45.68±1.00 62.57±1.53 68.58±3.10 CL L·kg/h 29.06±2.52 24.94±2.08 13.74±2.52 -
该研究以卡马西平为内标，建立了小鼠血浆中3种紫杉醇脂肪酸酯前药含量的UPLC-MS/MS测定方法。其中，内标、PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA色谱峰保留时间分别为2.41、4.37、4.84和5.28 min，均达到基线分离。相比前期研究中血浆PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA含量的传统HPLC测定方法存在分离度差、灵敏度低的缺陷而无法满足检测要求，该方法具有选择性更好、分离范围更广、分离能力更强、灵敏度及重现性更高等优点，并成功应用于3种紫杉醇脂肪酸酯前药脂质体（PTX-MA-L、PTX-PA-L和PTX-SA-L）的小鼠体内药代动力学参数的测定。
该研究采用乙腈直接沉淀血浆蛋白的方式，短时间内可检测小鼠血浆中3种紫杉醇脂肪酸酯，体现了方法的便捷性和可控性。另外，通过优化流动相组成以及比例，使得内源性杂质与药物样品具有较好的分离效果。特别是在流动相中加入甲酸，不仅可以改善峰形，也可促进样品离子化，提高质子化检测能力，从而提高该方法的检测灵敏度。
总之，该研究建立的UPLC-MS/MS测定方法专属性强、操作简便、灵敏度和精密度高、重现性和稳定性好， 可用于定量测定小鼠体内血浆中3种紫杉醇脂肪酸酯前药含量。小鼠体内药代动力学研究结果显示， 3种紫杉醇脂肪酸酯脂质体PTX-MA-L、PTX-PA-L和PTX-SA-L在小鼠体内的t1/2分别为14.78、44.49和69.32 h，清除率（CL）分别为29.06、24.94和13.74 L·kg/h，提示随着脂肪酸碳链长度的增加，紫杉醇脂肪酸酯在小鼠体内的t1/2大幅延长、CL则显著降低，表明紫杉醇经不同链长饱和脂肪酸酯化修饰可明显改变其体内药动学特性，其中，紫杉醇棕榈酸酯脂质体（PTX-PA）具有适宜的药动学参数，值得下一步深入开发研究。
Determination and pharmacokinetics investigation of prodrugs of paclitaxel fatty acid esters in mouse plasma by UPLC-MS/MS
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摘要:
目的 建立小鼠血浆中紫杉醇肉豆蔻酸酯（PTX-MA）、紫杉醇棕榈酸酯（PTX-PA）和紫杉醇硬脂酸酯（PTX-SA）等3种紫杉醇脂肪酸酯的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）测定方法，并初步考察其脂质体的小鼠体内药代动力学特性。 方法 采用Eclipse Plus C8色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm），0.2%甲酸水溶液（A）和甲醇（B）的不同比例混合液为流动相，梯度洗脱，三重四极杆串联质谱多重反应监检测（MRM），流速：0.3 ml/min，柱温：30℃，进样量：10 μl。 结果 PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA在5.0~500.0 ng/ml范围内均呈良好的线性关系（r >0.995 0），日内和日间精密度、稳定性、提取回收率和基质效应试验结果的RSD均小于10%；3种紫杉醇脂肪酸酯脂质体PTX-MA-L、PTX-PA-L和PTX-SA-L在小鼠体内的半衰期（t1/2）分别为14.78、44.49和69.32 h，清除率（CL）分别为29.06、24.94和13.74 L·kg/h。 结论 该方法专属性高、灵敏、操作简便、稳定性好，可用于小鼠血浆中紫杉醇脂肪酸酯的含量测定。小鼠体内药代动力学研究结果表明，随脂肪酸碳链增加，紫杉醇脂肪酸酯在小鼠体内t1/2呈大幅延长，清除率则显著降低，提示紫杉醇经不同链长饱和脂肪酸酯化修饰可改变其体内药代动力学特性，从而为紫杉醇脂肪酸酯前药的纳米制剂研发提供科学依据。 -
关键词:
- 紫杉醇 /
- 脂肪酸酯 /
- 前药 /
- 高效液相色谱-串联质谱法 /
- 药动学
Abstract:Objective To establish an UPLC-MS/MS method for determinating content of three paclitaxel fatty acid esters such as paclitaxel myristate （PTX-MA）, paclitaxel palmitate （PTX-PA） and paclitaxel myristate （PTX-SA） in mouse plasma, and preliminarily investigate the pharmacokinetic characteristics of their liposomes in mice. Methods Eclipse Plus C8 chromatography column （2.1 mm×50 mm, 1.8 μm） was used with different proportions of 0.2% formic acid aqueous solution （A） and methanol （B） mixture as mobile phase for gradient elution at a flow rate of 0.3 ml/min. The collum temperature was 30℃. The sample injection volume was 10 μl. The triple quadrupole mass series spectrometer was used as multi-reaction monitoring （MRM）. Results PTX-MA, PTX-PA and PTX-SA all exhibited a good linear relationship in the range of 5.0~500.0 ng/ml （r> 0.9950 ）. Their RSD of precision, stability, extraction recovery rate and matrix effect test results was all less than 10%. The half-lives （t1/2） for liposomes of three paclitaxel fatty acid esters PTX-MA-L、PTX-PA-L and PTX-SA-L in mice were 14.78 h, 44.49 h and 69.32 h individually, and their clearance rates （CL） were 29.06 L·kg/h, 24.94 L·kg/h and 13.74 L·kg/h, respectively.Conclusion This method had high specificity, sensitivity, easy operation and good stability, which could be used for the determination of paclitaxel fatty acid esters in mouse plasma. The results of pharmacokinetic studies in mice showed that t1/2 for paclitaxel fatty acid esters were significantly prolonged, and the clearance rate were significantly reduced with the length of fatty acid carbon chains increasement, which indicated that esterification of paclitaxel with different chain length saturated fatty acids could obviously alter its in vivo pharmacokinetic properties, which provided scientific basis for the research and development of nano formulations of paclitaxel fatty acid ester prodrug. -
Key words:
- Paclitaxel /
- Fatty acid esters /
- Prodrug /
- UPLC-MS/MS /
- Pharmacokinetics
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海绵是具有代表性的海洋生物，其共附生微生物也是近年来研究的热点。在海洋高盐、高压、低温、寡营养的生存环境下，海绵共附生微生物能够产生结构新颖、生物活性良好的次级代谢产物。其中海绵共附生真菌是海绵化学多样性的重要来源[1]。
曲霉属 (Aspergillus sp)真菌分布广泛而且研究丰富。海洋曲霉属真菌的次级代谢产物主要包括聚酮类[2]、生物碱类[3]、肽类[4]、萜类[5]等化合物，具有抗肿瘤[6]、抗菌[7]、抗病毒[4]等生物活性。本课题的土曲霉(Aspergillus terreus)是从我国南海西沙永兴岛海域的棕色扁海绵Phakellia fusca中分离得到的，属于散囊菌目(Eurotiales)发菌科(Tri-chocomaceaez)的一种真菌，在海洋动植物和陆地植物中均有分布。该菌的次级代谢产物具有多样性，包括生物碱类化合物[8]、丁烯酸内酯类化合物[9]、萜类化合物[10]、环肽类化合物[11]等。本文采用硅胶柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱、高效液相色谱等多种分离方法从土曲霉Aspergillus terreus中共分离得到8个单体化合物。通过理化常数测定、波谱数据分析等方法确定了化合物的结构。化合物1～8的结构见图1。
1. 材料和方法
1.1 样品
菌株来源于棕色扁海绵Phakellia fusca，由上海交通大学海洋药物研究中心鉴定为Aspergillus terreus，菌株保存在上海交通大学医学院附属仁济医院药学部海洋药物研究中心（菌株编号152805）。
1.2 仪器与试剂
Agilent 600核磁共振波谱仪（美国 Agilent 公司）；Waters高效液相色谱仪（美国Waters公司）；XBridge C18半制备型液相色谱柱（10 mm×250 mm，5 μm）；快速制备色谱仪（法国Interchim公司）；OSB-2100旋转蒸发仪（日本EYELA 公司）；振荡培养箱（上海知楚）。薄层硅胶、200~300目柱色谱用硅胶（青岛海洋化工厂）；Sephadex LH-20凝胶（瑞典GE Healthcare公司）；色谱纯试剂（天津康科德科技有限公司）；其他分析纯有机试剂（上海化学试剂公司）；氘代试剂（剑桥同位素实验室）。
1.3 发酵与萃取
取Aspergillus terreus单菌落接种到装有100 ml PDB培养液的250 ml三角瓶中，28 ℃，220 r/min震荡培养3 d，以该发酵液10%的接种量接到装有500 ml的真菌2号培养液（甘露醇20 g，麦芽糖20 g，CaCO3 15 g，葡萄糖10 g，谷氨酸钠10 g，酵母提取物3 g，玉米浆1 g，KH2PO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，海盐30 g，蒸馏水1 L）的1 L三角瓶中，28 ℃，220 r/min震荡培养10 d，获得菌株的发酵物。收集发酵液24 L，用等体积的乙酸乙酯萃取3次，浓缩后得到乙酸乙酯相浸膏9.3 g。
1.4 提取分离
乙酸乙酯相浸膏首先经Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离，以二氯甲烷-甲醇（体积比为1∶1）作为溶剂进行洗脱，得到组分Fr.1～Fr.4。组分Fr.2经硅胶柱色谱（石油醚：丙酮 = 100∶1～0∶100）分离得到组分Fr.2-1～Fr.2-9。组分Fr.2-5经反相中压柱色谱分离得到8个亚组分，其中Fr.2-5d经重结晶得到化合物3 (2.5 mg)。组分Fr.2-6经LH-20凝胶柱色谱和反相半制备HPLC（38%乙腈-水）分离得到化合物1 (3.5 mg, tR = 21.0 min)。化合物2 (3.5 mg, tR = 13.0 min)由组分Fr.2-7经反相半制备HPLC，以33%乙腈-水为流动相等梯度洗脱得到。组分Fr.2-8以乙腈-水 (体积比10∶90～100∶0)为流动相，经反相中压柱色谱和反相半制备HPLC（20%乙腈-水）分离得到化合物4 (2.0 mg, tR=30.0 min)、 化合物5 (4.0 mg, tR=28.0 min)和化合物6 (9.0 mg, tR=14.0 min)。Fr.3经过硅胶柱色谱分离得到7个组分，其中Fr.3-3经反相半制备HPLC进一步纯化得到化合物7 (1.7 mg, tR=12.0 min)。组分Fr.3-4以20%～100%的乙腈-水为流动相，经反相中压柱色谱和反相半制备HPLC（15%乙腈-水）分离得到化合物8 (18.0 mg, tR = 8.0 min)。
2. 结构鉴定
化合物1为黄色粉末(甲醇)，硫酸/香草醛显色为黄色，ESIMS给出的分子离子峰[M＋H]＋m/z 466.15。1H NMR (600 MHz, CDCl3)中，δH 12.23 (1H, s)为氨基质子信号；一组邻位二取代的苯环质子信号δH 8.82 (1H, dd, J=8.5, 0.8 Hz, H-3), 7.89 (1H, dd, J=7.9, 1.3 Hz, H-6), 7.60 (1H, td, J=8.5, 1.3 Hz, H-4), 7.22 (1H, m, H-5)，芳香质子信号δH 9.21 (1H, brs, H-9), 8.70 (1H, d, J=4.5 Hz, H-1′), 8.25 (1H, dt, J=8.0, 2.2 Hz, H-3′), 7.36 (1H, dd, J=8.0, 4.5 Hz, H-2′)，提示3-取代吡啶环的存在；1个芳香质子信号δH 7.27 (1H, s, H-10′)；4个甲氧基质子信号δH 3.97 (3H, s, 4″-OCH3), 3.91 (3H, s, 3″-OCH3), 3.90 (3H, s, 5″-OCH3), 3.82 (3H, s, 7″-OCH3)。13C NMR (150 MHz, CDCl3)共显示24个碳信号，结合DEPT谱，推断δC 168.2, 167.2, 164.0为羰基碳信号；17个芳香碳信号；δC 61.3, 61.3, 56.5, 52.7为4个甲氧基碳信号。碳信号归属为：δC 168.2 (C-7)、167.2 (C-7′′)、164.0 (C-7′)、152.6 (C-4′)、151.5 (C-5′′)、149.3 (C-2′)、148.8 (C-3′′)、146.9 (C-4′′)、140.4 (C-2)、135.2 (C-6′)、133.6 (C-4)、130.3 (C-1′)、127.9 (C-6)、125.8 (C-2′′)、123.8 (C-5)、123.6 (C-5′)、121.8 (C-3)、120.4 (C-1′′)、119.0 (C-1)、108.8 (C-6′′)、61.3 (3″-OCH3)、61.3 (4″-OCH3)、56.5 (5″-OCH3)、52.7 (7″-OCH3)。该化合物核磁数据与参考文献[11]对照基本一致，确定化合物为methyl-3,4,5-trimethoxy-2-(2-(nicotinamido)benzamido) benzoate。
化合物2为黄色粉末(甲醇)，ESIMS给出的分子离子峰[M＋H]＋m/z 457.14。1H NMR (600 MHz, DMSO-d6)中，δH 12.19 (1H, s, 3-NH), 11.10 (1H, s, 1′′-NH), 8.52 (1H, d, J = 8.1 Hz, 1′-NH)为氨基质子信号；1个芳香质子单峰信号δH 9.29 (1H, s, H-7)；一组邻位二取代的苯环质子信号δH 8.44 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-7′′), 7.92 (1H, dd, J = 7.9, 1.5 Hz, H-4′′), 7.63 (1H, td, J = 7.9, 1.5 Hz, H-6′′), 7.20 (1H, td, J = 7.6, 1.5 Hz, H-5′′)；2个相邻的连接杂原子的次甲基质子信号δH 4.55 (1H, dd, J = 8.1, 2.9 Hz, H-2′), 4.41 (1H, m, H-4′)；3个甲基质子信号δH 3.70 (3H, s, H-9′′), 3.52 (3H, s, H-9), 1.19 (3H, d, J = 6.4 Hz, H-5′)。13C NMR (150 MHz, DMSO-d6)共显示20个碳信号，结合DEPT谱，推断δC 168.8, 167.3, 162.7, 159.5, 150.1为羰基碳信号；10个芳香碳信号；δC 65.9, 59.8为2个连杂原子的次甲基碳信号；δC 52.4, 28.6, 20.5为3个甲基碳信号，结合氢谱信号，确定有一个甲氧基和一个氮甲基。碳信号归属为：δC 168.8 (C-3′)、167.3 (C-8″)、162.7 (C-10)、159.5 (C-4)、151.2 (C-8a)、150.1 (C-2)、146.3 (C-7)、139.3 (C-2′′)、138.2 (C-6)、134.2 (C-6′′)、130.7 (C-4′′)、127.2 (C-4a)、123.4 (C-5′′)、120.7 (C-7′′)、117.1 (C-3′′)、65.9 (C-4′)、59.8 (C-2′)、52.4 (C-9″)、28.6 (C-9)、20.5 (C-5′)。该化合物的比旋光值为
$[\alpha]_{\rm{D}}^{20} $ +98 (c 0.1, MeOH)。该核磁数据与参考文献[12]对照基本一致，确定该化合物为terrelumamide A。化合物3为白色结晶(甲醇)，ESIMS给出的分子离子峰[M＋H]＋m/z 323.13。1H-NMR (600 MHz, CDCl3)中，δH 7.2-7.5 (10H, m, H-3′-H-7′, H-3′′-H-7′′)为10个芳香质子信号，提示存在2个单取代苯基；2个亚甲基质子信号δH 4.20 (2H, brs, H-1′′), 3.94 (2H, brs, H-1′)；1个甲氧基质子信号δH 3.92 (3H, s, 2-OCH3)。13C-NMR (150 MHz, CDCl3)共显示19个碳信号，结合DEPT谱推断δC 158.2为羰基碳信号；12个芳香碳信号；δC 34.0, 30.4为2个亚甲基碳信号，提示结构中存在两个苄基基团；δC 61.8为甲基碳信号；δC 144.2, 140.6, 129.4为3个烯碳信号。碳信号归属为：δC 158.2 (C-5), 144.2 (C-6), 140.6 (C-2), 136.5 (C-2′′), 135.6 (C-1′), 129.6 (C-3′, 7′), 129.4 (C-3, 3′′, 7′′), 128.6 (C-4′, 6′), 127.8 (C-4′′, 6′′), 126.9 (C-5′, 5′′), 61.8 (2-OCH3), 34.0 (C-1′′), 30.4 (C-1′)。该化合物核磁数据与参考文献[13]对照基本一致，确定化合物为emeheterone。
化合物4为黄色粉末(甲醇)，硫酸/香草醛显色为紫色，ESIMS给出的分子离子峰[M＋H]＋m/z 240.12。1H NMR (600 MHz, CD3OD)中，给出1个芳香质子信号δH 6.13 (1H, d, J = 0.7 Hz, H-5)；3个次甲基氢信号δH 6.07 (1H, d, J = 3.0 Hz, H-8), 3.89 (1H, dt, J = 10.5, 3.0 Hz, H-9), 1.90 (1H, m, H-11)；1个亚甲基质子信号δH 1.58 (1H, ddd, J = 12.2, 10.5, 4.6 Hz, H-10), 1.36 (1H, ddd, J = 12.2, 10.5, 3.0 Hz, H-10)；3个甲基质子信号δH 2.28 (3H, s, H-7), 0.99 (3H, d, J = 6.7 Hz, H-13), 0.96 (3H, d, J = 6.7 Hz, H-12)。13C NMR (150 MHz, CD3OD)共显示12个碳信号，结合DEPT谱推断δC 155.0为羰基碳信号；4个芳香碳信号；δC 115.8, 70.5, 25.2为3个次甲基脂肪碳信号，结合对应的氢信号提示结构中存在1个缩醛碳信号和一个连氧次甲基碳信号；δC 40.4为亚甲基碳信号；δC 24.0, 21.8, 18.8为3个甲基碳信号。碳谱信号归属为：δC 157.9 (C-4)、155.0 (C-2)、143.5 (C-6)、132.7 (C-3)、115.8 (C-8)、95.0 (C-5)、70.5 (C-9)、40.4 (C-10)、25.2 (C-11)、24.0 (C-12)、21.8 (C-13)、18.8 (C-7)。该化合物的ECD曲线显示在217 nm处有负的Cotton 效应(Δε −5.86)，其核磁和ECD数据与参考文献[14]对照基本一致，最终确定该化合物为(8R, 9S)-dihydroisoflavipucine。
化合物5为黄色结晶(甲醇)，硫酸/香草醛显色为紫色，ESIMS给出的分子离子峰[M＋H]＋m/z 240.12。1H NMR (600 MHz, CD3OD)中，给出1个芳香质子信号δH 6.13 (1H, d, J = 0.7 Hz, H-5)；3个次甲基氢信号δH 6.06 (1H, d, J = 3.0 Hz, H-8), 3.90 (1H, dt, J = 10.5, 3.0 Hz, H-9), 1.90 (1H, m, H-11)；1组亚甲基质子信号δH 1.56 (1H, ddd, J = 12.3, 10.5, 4.6 Hz, H-10), 1.36 (1H, ddd, J = 12.3, 10.5, 3.0 Hz, H-10)；3个甲基质子信号δH 2.28 (3H, s, H-7), 0.99 (3H, d, J = 6.6 Hz, H-13), 0.95 (3H, d, J = 6.6 Hz, H-12)。13C NMR (150 MHz, CD3OD)共显示12个碳信号，结合DEPT谱推断δC 155.0为羰基碳信号；4个芳香碳信号；δC 115.8, 70.5, 25.2为3个次甲基碳信号，结合对应的氢信号提示结构中存在1个次甲二氧基碳信号和一个连氧次甲基碳信号；δC 40.5为亚甲基碳信号；δC 24.0, 21.8, 18.8为3个甲基碳信号。碳信号归属为：δC 157.8 (C-4)、155.0 (C-2)、143.4 (C-6)、132.8 (C-3)、115.8 (C-8)、95.1 (C-5)、70.5 (C-9)、40.5 (C-10)、25.2 (C-11)、24.0 (C-12)、21.8 (C-13)、18.8 (C-7)。该化合物的核磁数据与化合物4对比基本一致，ECD曲线显示在217 nm处有正的Cotton 效应(Δε +25.34)，提示为化合物4的差向异构体。将此化合物的核磁和ECD数据与参考文献[14]对照基本一致，最终确定化合物为(8S, 9S)-dihydroisoflavipucine。
化合物6为黄色粉末(甲醇)，硫酸/香草醛溶液无明显显色，ESIMS给出的分子离子峰[M+H]＋m/z 245.12。1H NMR (600 MHz, CDCl3)中，给出1组单取代的苯环芳香质子信号δH 7.32 (2H, t, J = 7.5 Hz, H-5′), 7.26 (1H, t, J = 7.5 Hz, H-4′), 7.20 (2H, d, J = 7.5 Hz, H-6′)；2个次甲基氢信号δH 4.25 (1H, dd, J=10.5, 2.9 Hz, H-9), 4.04 (1H, t, J = 7.8 Hz, H-6)；4组亚甲基质子信号δH 3.65-3.50 (2H, m, H-3); 3.65-3.50 (1H, m, H-10), 2.76 (1H, dd, J=14.5, 10.5 Hz, H-10); 2.30 (1H, m, H-5), 1.88 (1H,m, H-5); 1.98 (2H, m, H-4)。13C NMR (150 MHz, CDCl3)共显示14个碳信号，结合DEPT谱推断δC 169.6, 165.3为酰胺羰基碳信号；6个芳香碳信号；δC 59.3, 56.4为2个连氮次甲基碳信号；δC 45.6, 37.0, 28.5, 22.7为4个亚甲基碳信号，提示结构中存在苯丙氨酸和脯氨酸片段。碳信号归属为：δC 169.6 (C-7)、165.3 (C-1)、136.1 (C-1′)、129.4 (C-2′)、129.4 (C-6′)、129.3 (C-3′)、129.3 (C-5′)、127.7 (C-4′)、59.3 (C-6)、56.4 (C-9)、45.6 (C-3)、37.0 (C-10)、28.5 (C-5)、22.7 (C-4)。该化合物的比旋光值为
$[\alpha]_{\rm{D}}^{20} $ -47 (c 0.1, MeOH)，将核磁数据与参考文献[15]对照基本一致，最终确定化合物为cyclo(S-Pro-S-Phe)。化合物7为浅黄色粉末(甲醇)，硫酸/香草醛显色不明显，ESIMS给出的分子离子峰[M＋H]＋m/z 284.13。1H NMR (600 MHz, DMSO-d6)中给出2个氨基质子信号δH 10.83 (1H, s, H-1′), 7.71 (1H, s, H-8)；1组邻二取代的苯环芳香质子信号δH 7.54 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5′), 7.30 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-8′), 7.03 (1H, t, J = 7.3 Hz, H-7′), 6.94 (1H, t, J = 7.3 Hz, H-6′)；1个芳香质子单峰信号δH 7.16 (1H, s, H-2′)；2个次甲基氢信号δH 4.28 (1H, t, J = 5.0 Hz, H-9), 4.04 (1H, t, J = 8.5 Hz, H-6)；4组亚甲基质子信号δH 3.36 (1H, m, H-3), 3.23 (1H, m, H-10), 3.21(1H, m, H-3), 3.05 (1H, m, H-10), 1.95 (1H, m, H-5), 1.66 (1H, m, H-4), 1.59 (1H, m, H-4), 1.36 (1H, m, H-5)。13C NMR (150 MHz, DMSO-d6)共显示16个碳信号，结合DEPT谱推断δC 169.0, 165.5为酰胺羰基碳信号；8个芳香碳信号；δC 58.4, 55.2为2个连氮次甲基碳信号；δC 44.6, 27.7, 25.8, 21.8为4个亚甲基碳信号。碳信号归属为：δC 169.0 (C-7)、165.5 (C-1)、136.0 (C-9′)、127.3 (C-4′)、124.4 (C-2′)、120.8 (C-7′)、118.6 (C-5′)、118.2 (C-6′)、111.2 (C-8′)、109.3 (C-3′)、58.4 (C-6)、55.2 (C-9)、44.6 (C-3)、27.7 (C-5)、25.8 (C-10)、21.8 (C-4)。将核磁数据与化合物6对比，化合物7中吲哚基取代了化合物6中的苯基。该化合物的比旋光值为
$[\alpha]_{\rm{D}}^{20} $ -90 (c 0.1, MeOH)，将该核磁数据与参考文献[16]对照基本一致，最终确定化合物为brevianamide F。化合物8为棕黄色油状(甲醇)，ESIMS给出的分子离子峰[M＋Na]＋m/z 177.06。1H NMR (600 MHz, DMSO-d6)中，给出3个烯氢信号δH 6.72 (1H, m, H-7), 6.37 (1H, d, J = 15.8 Hz, H-6), 6.00 (1H, s, H-2)，其中一对为反式烯氢；2个羟基信号δH 5.80 (1H, s, 5-OH), 5.68 (1H, s, 4-OH)；2个连氧次甲基质子信号δH 4.50 (1H, m, H-4), 3.89 (1H, m, H-5)；1个甲基质子信号δH 1.88 (3H, d, J = 6.3 Hz, H-8)。13C NMR (150 MHz, DMSO-d6)共显示8个碳信号，结合DEPT谱，推断δC 203.7为酮羰基碳信号；4个双键碳信号；δC 80.8, 76.4为2个连氧次甲基碳信号；δC 19.1为甲基碳信号。碳信号归属为：δC 203.7 (C-1)、168.5 (C-3)、139.4 (C-7)、125.5 (C-6)、124.8 (C-2)、80.8 (C-5)、76.4 (C-4)、19.1 (C-8)。该化合物的比旋光值为
$[\alpha]_{\rm{D}}^{20} $ +78 (c 0.1, MeOH)，将该化合物核磁数据与参考文献[17]对照基本一致，确定化合物为terrein。3. 活性测试
对分离得到的化合物进行α-葡萄糖苷酶抑制活性的测试。采用PBS缓冲液为反应体系，利用α-葡萄糖苷酶，以4-硝基苯基-α-D吡喃葡萄糖苷（PNPG）为特异性底物，以阿卡波糖作为阳性药，分别设立空白对照组、α-葡萄糖苷酶空白组和PNPG空白组，评价化合物的α-葡萄糖苷酶的抑制活性。结果表明，化合物3具有较强的α-葡萄糖苷酶的抑制活性，IC50值为14.28 µmol/L。其他化合物没有明显的α-葡萄糖苷酶的抑制活性。另外，还对化合物的抗氧化活性进行测试。采用DPPH的方法，以抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸作为阳性药对分离得到的化合物进行了体外抗氧化活性测试。结果显示这些化合物抗氧化活性不明显。
4. 讨论
本研究从棕色扁海绵共附生真菌土曲霉中分离得到了8个化合物，其中化合物3、4、5、7为首次从该菌中分离得到，丰富了土曲霉次级代谢产物的多样性，为进一步探索该属真菌的化学成分和生源途径提供了理论依据。
根据文献报道，化合物2可以提高胰岛素的敏感性[13]，化合物4和5测试了多个肿瘤细胞系，均显示细胞毒活性不明显[15]，化合物6对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、黄体微球菌、白色念珠菌和隐球菌等具有很好的抗菌活性[16]，化合物7对PaCa-2胰腺细胞的抗癌活性和抗菌活性都不明显[17]，化合物8能够抑制雄激素依赖性前列腺癌细胞LNCaP-CR的血管生成素分泌，能够抑制人脐静脉内皮细胞的血管形成[18]。为了更好的探究该真菌代谢产物的活性，对分离得到的化合物进行了α-葡萄糖苷酶抑制活性和抗氧化活性测试。其中化合物3显示了较强的α-葡萄糖苷酶的抑制活性，IC50值为14.28 µmol/L，其α-葡萄糖苷酶抑制活性的机制有待于进一步研究。
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图 1 空白血浆及内标、PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA的血浆样品液的UPLC-MS/MS色谱图
A.空白血浆；B.内标；C. PTX-MA；D. PTX-PA；E. PTX-SA
表 1 PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA的标准曲线参数
对照样品 回归方程 r 线性范围（ng/ml） PTX-MA Y=0.186 2 X−1.984 0.995 8 5.00~500.00 PTX-PA Y=0.668 5 X−12.977 0.998 4 5.00~500.00 PTX-SA Y=0.402 1 X−7.171 0.998 8 5.00~500.00 
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表 2 PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA样本的精密度（n = 5）
对照样品 理论浓度（ng/ml） 日内精密度 日间精密度 实测浓度（ng/ml） 回收率（%） RSD（%） 实测浓度（ng/ml） 回收率（%） RSD（%） PTX-MA 10.00 9.93±0.83 99.36±8.32 8.38 10.37±0.61 103.67±6.06 5.84 250.00 242.29±10.93 96.84±4.51 4.51 247.42±5.30 98.97±2.12 2.14 375.00 371.31±6.30 99.02±1.68 1.70 373.37±6.20 99.57±1.65 1.66 PTX-PA 10.00 9.83±0.50 98.28±5.00 5.09 10.25±0.55 102.53±5.52 5.38 250.00 248.42±6.81 99.37±2.72 2.74 246.93±5.74 98.77±2.29 2.32 375.00 373.79±8.70 99.68±2.32 2.33 371.59±4.12 99.09±1.10 1.11 PTX-SA 10.00 9.59±0.51 95.90±5.08 5.30 10.33±0.67 103.27±6.72 6.50 250.00 248.81±7.89 99.53±3.16 3.17 245.92±5.04 98.37±2.01 2.05 375.00 374.36±8.81 99.83±2.35 2.35 371.26±2.43 99.00±0.65 0.65
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表 3 小鼠血浆中PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA的提取回收率和基质效应（n = 3）
对照样品 理论浓度（ng/ml） 回收率（%） RSD（%）a 基质效应（%） RSD（%）b PTX-MA 10.00 79.82±6.60 8.28 95.36±6.55 6.87 250.00 88.35±2.84 3.22 96.28±3.59 3.73 375.00 92.08±2.46 2.67 98.86±1.46 1.48 PTX-PA 10.00 73.34±7.24 9.88 94.28±1.96 2.08 250.00 83.58±2.24 2.68 98.46±1.86 1.89 375.00 89.47±1.51 1.68 98.88±0.68 0.69 PTX-SA 10.00 61.90±4.11 6.63 95.90±5.08 5.30 250.00 77.26±2.88 3.73 98.78±2.22 2.25 375.00 84.43±1.21 1.44 99.08±1.01 1.02 注：a：回收率的相对标准偏差；b:基质效应的相对标准偏差。
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表 4 小鼠尾静脉注射3种紫杉醇脂肪酸酯前药脂质体药代动力学参数（n = 3）
关键参数 单位 PTX-MA-L PTX-PA-L PTX-SA-L Cmax ng/L 226 436.10±4 932.89 289 171.80±5 311.62 333 508.00±3 464.10 AUC0-14 d ng·h/L 502 384.75±3 464.10 776 973.44±5 196.15 1 668 984.05±6 350.85 AUC0-∞ ng·h/L 503 800.86±8 082.90 777 835.54±6 429.10 1 669 696.54±5 773.50 t1/2 h 14.78±2.00 44.49±3.51 69.32±2.15 V L/kg 45.68±1.00 62.57±1.53 68.58±3.10 CL L·kg/h 29.06±2.52 24.94±2.08 13.74±2.52
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[1] VYAS D M, KADOW J F. Paclitaxel: a unique tubulin interacting anticancer agent[J]. Prog Med Chem, 1995, 32:289-337. [2] ADAMS J D, FLORA K P, GOLDSPIEL B R, et al. Taxol: a history of pharmaceutical development and current pharmaceutical concerns[J]. J Natl Cancer Inst Monogr, 1993, 15:141-147. [3] ABET V, FILACE F, RECIO J, et al. Prodrug approach: An overview of recent cases[J]. Eur J Med Chem, 2017, 127:810-827. doi: 10.1016/j.ejmech.2016.10.061 [4] MIKHALIN A A, EVDOKIMOV N M, FROLOVA L V, et al. Lipophilic prodrug conjugates allow facile and rapid synthesis of high-loading capacity liposomes without the need for post-assembly purification[J]. J Liposome Res, 2015, 25(3):232-260. doi: 10.3109/08982104.2014.992022 [5] HARADA H, YAMASHITA U, KURIHARA H, et al. Antitumor activity of palmitic acid found as a selective cytotoxic substance in a marine red alga[J]. Anticancer Res, 2002, 22(5):2587-2590. [6] LORSCHEIDER M, TSAPIS N, UR-REHMAN M, et al. Dexamethasone palmitate nanoparticles: an efficient treatment for rheumatoid arthritis[J]. J Control Release, 2019, 296:179-189. doi: 10.1016/j.jconrel.2019.01.015 [7] MENG Z, LV Q, LU J, et al. Prodrug strategies for paclitaxel[J]. Int J Mol Sci, 2016, 17(5):796-819. doi: 10.3390/ijms17050796 [8] CHEN K J, PLAUNT A J, LEIFER F G, et al. Recent advances in prodrug-based nanoparticle therapeutics[J]. Eur J Pharm Biopharm, 2021, 165:219-243. doi: 10.1016/j.ejpb.2021.04.025 [9] FANG J Y, AL-SUWAYEH S A. Nanoparticles as delivery carriers for anticancer prodrugs[J]. Expert Opin Drug Del, 2012, 9(6):657-669. doi: 10.1517/17425247.2012.679927 [10] 程丹, 余侬, 许幼发, 等. 紫杉醇棕榈酸酯脂质体的制备及初步药效学和安全性评价[J]. 中国药学杂志, 2018, 53(8):614-619. doi: 10.11669/cpj.2018.08.010 -
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