Study on bacterial endotoxin limit value and the detection methodological investigation for the active pharmaceutical ingredient of pentetic acid
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摘要:
目的 探索建立喷替酸原料药的细菌内毒素限值及检查方法，并进行方法学考察。 方法 用3批喷替酸建立细菌内毒素测定方法，并进行干扰试验研究。以市售碱性调节剂溶解样品至4 mg/ml及以下浓度，用细菌内毒素检查用水进行稀释；选用灵敏度为0.125 EU/ml及以上的鲎试剂，用市售的镁离子缓冲液复溶；用凝胶法进行内毒素检查 。 结果 喷替酸原料药的细菌内毒素限值确定为<0.125 EU/mg。 结论 建立的细菌内毒素检查方法可用于喷替酸原料药中细菌内毒素的控制。 Abstract:Objective To explore and establish the bacterial endotoxin limit value and testing method of the active pharmaceutical ingredient （API） of pentetic acid, and conduct methodological investigation. Methods Three batches of pentetic acid were used to establish the method for the determination of bacterial endotoxin, and interference test was conducted simultaneously. The sample was dissolved with commercially available alkaline regulator to a concentration of 4 mg/ml or lower, and then diluted with water for bacterial endotoxin test. Limulus reagent with sensitivity of 0.125 EU/ml or higher was selected and redissolved with commercially available magnesium ion buffer solution. And the endotoxin test was performed by gel method. Results The endotoxin limit of API of pentetic acid was determined as: less than 0.125 EU/mg. Conclusion The method established could be used for the control of bacterial endotoxin in API of pentetic acid. -
Key words:
- pentetic acid /
- endotoxin limit /
- methodological investigation
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表 1 鲎试剂灵敏度复核
鲎试剂批号 标示灵敏度（λc，EU/ml） 内毒素浓度（EU/ml） 实测λC
（EU/ml）0. 25 0. 125 0.06 0.03 阴性对照 2211211 0. 125 ++++ ++++ − − − − − − − − − − 0.125 21030312 0. 125 ++++ ++−+ − − − − − − − − − − 0.150 
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表 2 喷替酸细菌内毒素检测干扰预试验一（鲎试剂批号：2211211，λ=0.125 EU/ml）
供试品批号 A（供试品稀释液） B（供试品稀释液+内毒素） NC（W） PC（E2λ） S2 S1 S0.5 S0.25 S2E2λ S1E2λ S0.5E2λ S0.25E2λ 220501 − − − − − − − − − − − − +− +− − − ++ 220502 − − − − − − − − − − − − −+ +− 220503 − − − − − − − − − − − − −+ −+ 注：S2表示供试品浓度为2 mg/ml稀释液，下标表示溶液浓度；E2λ表示内毒素的浓度为2倍λ浓度（0.25 EU/ml）；W为细菌内毒素检查用水。
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表 3 喷替酸细菌内毒素检测干扰预试验二（鲎试剂批号：2211211，λ=0.125 EU/ml）
供试品批号 A（供试品稀释液） B（供试品稀释液+内毒素） NC（W） PC（E2λ） S2 S1 S0.5 S0.25 S2E2λ S1E2λ S0.5E2λ S0.25E2λ 220501 − − − − − − − − +− ++ ++ ++ − − ++ 220502 − − − − − − − − ++ ++ ++ ++ 220503 − − − − − − − − ++ ++ ++ ++
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表 4 喷替酸细菌内毒素检测干扰预试验三（鲎试剂批号：21030312，λ=0.125 EU/ml）
供试品批号 A（供试品稀释液） B（供试品稀释液+内毒素） NC（W） PC（E2λ） S2 S1 S0.5 S0.25 S2E2λ S1E2λ S0.5E2λ S0.25E2λ 220501 − − − − − − − − − − ++ ++ ++ − − ++ 220502 − − − − − − − − − − ++ ++ ++ 220503 − − − − − − − − − − ++ ++ ++
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表 5 喷替酸细菌内毒素检测干扰试验
鲎试剂批号 溶液名称 内毒素浓度（EU/ml） A NC λc，Et 0.25 0.125 0.06 0.03 2211211 BET水 ++ ++ − − − − − − − − λc=0.125 A0001 ++++ ++++ − − − − − − − − − − − − Et=0.125 A0002 ++++ ++++ − − − − − − − − − − − − Et=0.125 A0003 ++++ ++++ − − − − − − − − − − − − Et=0.125 21030312 BET水 ++ +− − − − − − − − − λc=0.18 A0001 ++++ − − −+ − − − − − − − − − − − − Et=0.21 A0002 ++++ − − − − − − − − − − − − − − − − Et=0.25 A0003 ++++ − − − − − − − − − − − − − − − − Et=0.25 注：λc=log−1（∑Xs/2）、Et= log−1（∑Xt/4）。其中：Xs为BET水的反应终点浓度的对数值；Xt为干扰试验溶液（即3批供试品）的反应终点浓度的对数值[6]；A0001、A0002、A0003分别为用供试品批号为220501、220502、220503配制而成的溶液。
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表 6 喷替酸细菌内毒素检查
鲎试剂批号 供试品批号 B A PC NC 2211211 220501 ++ − − ++ − − 220502 ++ − − ++ − − 220503 ++ − − ++ − − 21030312 220501 ++ − − ++ − − 220502 ++ − − ++ − − 220503 ++ − − ++ − − 注：A为1 mg/ml喷替酸溶液；B为1 mg/ml喷替酸溶液含有2λ浓度细菌内毒素；PC为含有2λ浓度细菌内毒素的阳性对照。
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[1] BUCKINGHAM J, MACDONALD F. Anonymous Pentetic Acid. In the Dictionary of Organic Compounds[M]. Sixth Edition. Florida: CRC Press, 1996: 1188. [2] U. S. Food and Drug Administration. NDA 21-751 Pentetate zinc trisodium injection [EB/OL]. (2004-08-11)[2023-07-25]. https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2004/021751lbl.pdf. [3] 药品标准查询数据库. Pentetic Acid[DB/OL].(2008-11-01)[2023-07-25]. https://www.drugfuture.com/Pharmacopoeia/usp 32/pub/data/v32270/usp32nf27s0_m62300.html. [4] 药品标准查询数据库. Pentetic Acid[DB/OL].(2024-01-06)[2024-02-12]. https://www.drugfuture.com/Pharmacopoeia/USP 2024/download.aspx?filename=Pentetic%20Acid. [5] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典(四部)2020年版[S]. 北京: 中国医药科技出版社, 2020: 178-181, 516-520. [6] 沈娟, 芦佳月, 罗晓茹, 等. 高浓度维生素B6注射液细菌内毒素检查方法学验证[J]. 药学实践杂志, 2020, 38(1): 67-70.
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