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透明质酸(hyaluronic acid, HA)又名玻璃酸。首次在1934年由Meyer和Palmer自牛眼玻璃体内提取分离[1]。HA同样广泛存在于人体中，包括人眼的玻璃体、脐带和皮肤等组织(表1)，是细胞外基质的组成部分[2]。HA化学名称为(1,4)-O-β-D葡萄糖醛酸-(1,3)-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D葡萄糖，是一种高分子直链聚糖，由交替的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和葡糖醛酸(GlcA)双糖单位反复交替而形成的一种聚合物[3]，其分子量的差别很大，分子式为(C14H20NO11Na)n，双糖单位的分子量为401.3（图1）。由于其直链的链轴L单糖之间氢键的作用，HA分子在空间呈刚性的螺旋柱型，其半径为200 nm。HA呈强亲水性，在水溶液中，HA亲和的水分约为其本身重量的1000倍。除了亲水性外，HA溶液还有着独特的流体力学性质，其水溶液是一种非牛顿型流体，因此，有着良好的黏弹性和应变性[4]。目前HA广泛应用于生物材料、药物靶向制剂、美容以及腹部手术后预防粘连等[5]。
表 1 人体不同组织中透明质酸的含量
组织或体液 HA浓度（μg/ml） 眼玻璃体 140～340 脐带 4100 关节滑液 1400～3600 真皮 200～500 表皮 100 胸淋巴液 0.2～50 尿液 0.1～0.3 血清 0.01～0.1 
图 1 透明质酸结构式
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HA作为一种酸性黏多糖，广泛分布于人体各种组织的细胞间质中，具有维持细胞渗透压稳定，使相邻细胞黏合等重要生理功能[6]。另外，HA还能调节细胞的黏附和运动功能，调控细胞分化和增殖，维持组织的生物力学性能正常[7]。HA在眼科手术中具有广泛应用，主要是由于其具有黏性、假塑性、弹性、黏合性和涂布性等特性，这些特性使其具有黏弹性衬垫、组织内分离、黏性阻塞、黏性止血、黏弹性缓冲以及弹性固定等重要功能[8]。
干眼病是一种常见的眼科综合症，主要由眼腺细胞功能紊乱等原因所致，包括各类结膜炎等。HA富含亲水基团，能够与水分子结合，起亲水及润滑作用，因此可以在一定程度上缓解干眼症状。《干眼临床诊疗专家共识（2013）》指出[9]，“干眼症治疗目的：轻度干眼症患者是缓解眼部症状，严重干眼患者是保护视功能”。透明质酸钠滴眼液可以冲洗并稀释眼表面炎性介质，降低泪液渗透压，促进眼表上皮的愈合，以及促进眼表纤维连结蛋白分泌和沉积，从而在眼表上皮损伤愈合中起重要作用。俞惠玲[10]对106例干眼症患者的研究发现，单独使用0.3%透明质酸钠滴眼液，对干眼症有效率达81.8%；透明质酸钠滴眼液加普拉洛芬滴眼液联合使用有效率高达92.3%。
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HA常用于化妆品保湿成分，包括HA保湿锁水霜以及保湿补水面膜等。人体内50%HA存在于皮肤真皮内，为胶原纤维和弹性蛋白的分布提供空间架构。三者共同形成皮肤的支架，维持皮肤组织稳定，保持皮肤弹性。若有一者缺失，可加速皮肤衰老和皱纹的形成[11]。HA作为组成人体结缔组织和滑液的成分之一，因其生物相容性较高，是目前全球用量最大的皮肤填充物之一，常用于眼周眉间纹、鱼尾纹、抬头纹等治疗[12-14]。薛紫涵等人通过对23例轻中度面部松弛患者，进行面部韧带处注射HA 0.2 ml，23例患者未出现红肿、疼痛、瘀青和过敏反应，也未发生硬块结节、填充物移位、血管栓塞、皮肤坏死等不良反应。注射后，所有人均有不同程度的眼角和颧下松弛的改善，并有提升法令纹、口角上扬、下颌缘更清晰以及面部更加紧致等效果。随访表明，注射效果约持续3～6个月，若欲维持效果则需半年后再次注射[15]。HA能够调控胶原的合成，降低炎性介质的生成，抑制创面毛细血管的渗出和纤维蛋白原的沉积，抑制成纤维细胞合成胶原纤维，从而抑制手术瘢痕形成[16-18]。Patel采用无针注射交联HA，治疗了两例痤疮疤痕患者，间隔4周后，再重复给药一次，能有效减轻病人的疤痕程度，无不良反应[19]。
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HA是关节滑液的重要成分，作为润滑剂给骨骼末端提供保护[20]。在最初合成时，HA主要由2×105～2×106 Da之间的高分子量HA聚合物组成[21]。在骨关节炎和类风湿性关节炎，HA分子量变小，滑液黏稠度降低，使得HA黏弹性下降，从而导致关节面的磨损增加[20]。关节腔内注射高分子量HA能有效的缓解骨关节炎和类风湿性关节炎患者的疼痛，起到一定的治疗作用[22]。HA除了润滑作用外，还能降低巨噬细胞的吞噬作用，改善炎症反应[23]。苑树岩等给35例膝关节炎患者的关节腔内注射2.5 ml 透明质酸钠，给药后患者疼痛减轻，关节滑液中IL-6β含量下降[24]。Seung发现交联HA凝胶支架易与人牙髓干细胞和模拟肽混合，混合溶液便于注射。注射给小鼠后，交联HA迅速在注射部位形成水凝胶支架，并可安全无刺激的在小鼠体内保留8周以上。牙髓干细胞在水凝胶中至少可存活8周，模拟肽可诱导牙髓干细胞向成骨细胞分化，交联HA凝胶支架作为生物材料，可以用于骨骼组织工程[25]。
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HA用于外科手术后防止组织黏连，能有效的降低黏连的发生率和减轻黏连的严重程度[26]。HA防止术后组织黏连的机理是：①HA凝胶具有高分子纤维网状结构，涂布于组织表面，能起到阻隔作用，在腹膜修复时，形成一种短暂的保护屏障；②抑制术后出血和渗出，减少能形成永久性黏连骨架的血块数量，避免组织接触面的纤维蛋白沉着；③HA抑制中性粒白细胞迁移和吞噬作用，降低炎性反应[27]；④HA与间质细胞和成纤维细胞膜表面高亲和力的HA受体蛋白相互作用，提高这些细胞的迁移及趋化能力，从而促进了体内修复过程；⑤HA凝胶覆盖于创伤浆膜表面，在一定时间内不被降解代谢，使早期的创面组织修复能持续有效的进行，直至在创面形成一连续的间皮细胞覆盖层，完成组织修复。
蔡同凯等[28]采用大鼠盲肠和腹壁双侧损伤模型，以Nair黏连5级分类法判断腹腔黏连程度，发现术后30 d，透明质酸钠凝胶组SD大鼠腹腔黏连明显低于模型组，透明质酸钠凝胶组极限荷载比和刚度比与假手术组和模型组无统计学差异。医用透明质酸钠凝胶能有效降低黏连程度，并且不影响创面的恢复。Zhang等采用大鼠两次子宫损伤模型，研究了医用透明质酸钠和氧化再生纤维素预防大鼠腹膜黏连的疗效，发现医用透明质酸钠和氧化再生纤维素均能有效的降低黏连损伤的程度[27]。固体医用膜在使用时，难以被准确固定在创伤部位，在组织愈合后，还需要再次手术取出医用膜[29]。液体形式的HA，不仅便于操作，易于覆盖在创伤部位，而且其在体内保留的时间与伤口愈合周期一致。
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近年来，HA作为药物载体，与其他药物反应形成化合物，发挥缓释作用和靶向作用，使其结合的药物能够定时或定向地被释放[30-32]。HA作为纳米材料，可以与抗肿瘤药物形成靶向制剂，治疗盆腔肿瘤。Lee发现透明质酸纳米粒易于被CD44受体阳性患者的结肠癌HCT116细胞内吞吸收[33]，HA与紫杉醇共轭形成的纳米复合物，体外对HCT116细胞显示出更强的细胞毒作用[34]。Bajaj将紫杉醇用HA胶体包裹，延长了紫杉醇在裸鼠体内的存留时间，并有效减少人卵巢癌SKOV-3肿瘤的生长和转移[35]。Xiao等采用透明质酸-十八烷基胺结构的脂质载体，装载紫杉醇，其装载率被提高到72%。在裸鼠体内，装载紫杉醇的透明质酸-十八烷基胺载体在肝脏和脾脏的分布减少，而在肿瘤组织的分布增加[36]。Choi将伊立替康封装在HA纳米粒中，在裸鼠体内能有效抑制人结肠癌CT29肿瘤的生长，同时能降低伊立替康的不良反应。利用荧光技术可以观察结肠癌CT26肿瘤的转移[37]。Zhang等利用环丙沙星和万古霉素与HA偶联制备为抗生素缓释颗粒，能在一周内有效抑制绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌[38]。
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人体内HA主要由HA分解酶（Hyals）分解，其中最主要的酶是Hyal-1和Hyal-2。Hyal-2将HA降解成低分子量HA，Hyal-1将HA降解成低分子寡聚体。高分子量HA仅β1、4键暴露，降解缓慢，当HA分子量低于30万时，HA聚集能力降低，降解速度呈指数倍增加[39]。有报道[40]HA能被降解为多糖，为葡萄球菌和链球菌等提供营养。Zhang等[41]研究表明，在富含HA的培养基中，化脓性链球菌的M1蛋白、胶原样表面蛋白和糖酵解酶甘油醛-3-磷酸脱氢酶等几种致病因子上调。但是也有报道[42-43]，HA能抑制SA等细菌的生长，1 mg/ml浓度时就能达到最大抑制作用，但是没有杀菌作用。高浓度高分子量HA体外抑制SA和大肠埃希菌的生长，并且体内体外均不影响抗生素的药效[28]。Jae采用小鼠盲肠结扎穿刺法，构建小鼠腹腔脓肿模型，通过腹腔注射高分子量HA（20 mg/kg），能有效的降低腹腔菌载量，降低炎症因子水平，提高小鼠的存活率[44]。
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内源性低分子量HA可以促进血管生成，增加肿瘤细胞的供血，促进肿瘤细胞的生长[45-47]；另外，内源性低分子量HA也可以促进肿瘤细胞表面CD44的分泌，从而促进肿瘤细胞的转移[48]。通过抑制透明质酸合成酶3（HAS3），降低低分子量HA的产生，可使前列腺肿瘤血管生成减少70%～80%，肿瘤生长速度降低[49]。透明质酸合成酶2（HAS2）过表达，高分子量HA合成增加，组织中高分子量HA浓度升高，反而体现出抑制肿瘤细胞的生长[50]。也有文献报道，内源性的HA能促进肿瘤细胞增殖和扩散[51-53]。外源性HA根据分子量不同，应用也不同[32，54]（表2）。外源性高分子量HA进入人体后会促进HAS2高表达，加速内源性高分子量HA合成，使机体高分子量HA浓度增加，从而抑制肿瘤的生长和扩散[55]。Aikaterini用外源性高分子量HA显著抑制 HT1080细胞的迁移，当加入HA分解酶水解高分子量HA后，HT1080 细胞运动性显著增加[56]。高分子量HA钠凝胶能够抑制结肠癌细胞的转移[57]。除了和抗肿瘤药物合用，外源性寡聚体HA单用还可以与CD44 受体结合，增强肿瘤细胞的凋亡[58]，与HA介导的运动受体结合，降低肿瘤细胞的转移[59]。
表 2 不同相对分子质量外源性透明质酸的应用
用途 分子量(Da) 作用 骨关节注射液 >5×106 对受损部位润滑和机械保护作用； 眼科手术黏弹剂 >3×106 撑起前房，减少术后炎症的发生 滴眼液 （1～1.5）×106 增加滞留时间；润滑和保护作用 术后防黏连 >1×106 形成隔离层，抑制炎症反应 化妆品 （0.5～2）×106 保湿 抗肿瘤药载体 （5～7.5）×105 与肿瘤CD44靶点特异性结合 对创伤修复 <5×105 促进巨噬细胞的吞噬作用；促进血管形成 抗肿瘤作用 800～3200 特异性结合CD44受体和RHAMM受体 -
HA的结构与功能决定了其可用于生物材料、药物靶向制剂、美容以及腹部手术后预防黏连等，但是随着HA可能促进肿瘤细胞的生长和转移以及促进细菌的生长等疑问的出现，使得临床使用HA变得慎之又慎。
本文对HA的临床应用和HA对肿瘤以及细菌作用机制进行综述，对临床安全使用HA特别是将HA用于腹盆腔肿瘤患者的术后防黏连具有一定的指导意义，但其相关作用机制还需要进一步研究。
Research progress on action mechanism and clinical application of hyaluronic acid
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摘要: 透明质酸广泛存在于人体中，是细胞外基质的重要成分，具有独特的流体力学性质、良好的黏弹性和应变性。目前透明质酸被广泛用于生物材料、药物靶向制剂、美容以及腹部手术后预防黏连等。随着透明质酸应用范围的扩展及新型医用材料的不断涌现，近年来对透明质酸的研究日益增加。本文对透明质酸的临床应用及其作用机制进行综述，以期为透明质酸产品的进一步研发和安全应用提供参考。Abstract: Hyaluronic acid is widely present in the human body. It is an important component of extracellular matrix. It has unique hydrodynamic properties, good viscoelasticity and strain properties. At present, hyaluronic acid has been widely used in biomaterials, targeted-drug preparations, cosmetics and prevention of adhesion after abdominal surgery. With the expansion of the application scope of hyaluronic acid and the continuous emergence of new medical materials, the research on hyaluronic acid has been increasing in recent years. This paper reviews the clinical application of hyaluronic acid and its mechanism, in order to provide reference for the further development and safe application of hyaluronic acid products.
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乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是一类能够通过代谢碳水化合物并发酵产生终产物乳酸的细菌统称，属于厚壁菌门、乳酸杆菌目。作为一种革兰氏阳性、兼性厌氧菌，LAB无芽孢，基因组GC含量低[1]。根据细胞形态分类包括乳球菌属、链球菌属、片球菌属、明串珠菌属、双歧杆菌属和乳杆菌属等[2]。多种类型的乳酸菌一直被应用于传统的食品发酵领域，由于其在人类食品营养领域表现出长期的安全性，被美国食品和药品管理局（FDA）认为是安全的（GRAS），并成为一种公认的食品级微生物[3-4]。乳酸菌在乳制品、饮料、肉类、蔬菜以及发酵食品的生产中发挥着重要的作用，在赋予风味的同时，乳酸菌普遍能够通过产酸来保存食物，一些菌株还可以通过产生细菌素来增强抑菌能力。机体经过口服或其它途径摄入的乳酸菌，往往能够定植于宿主的肠道中并改善肠道菌群平衡发挥益生性，因此，世界卫生组织将其定义为益生菌，即适量摄入时能够对健康产生益处的活的微生物。人体存在着数以万亿计的微生物，它们受到机体遗传、环境、饮食和生活方式等多种因素影响，由这些菌群构成的微生态系统与人体健康和某些疾病的发生发展有着密切的关系。随着下一代测序技术的出现，揭示出人体内庞大而多样的微生物类群，共生菌群与机体相关疾病的关系被逐渐阐明[5]。胃肠道中存在数量庞大的微生物群落，当群落平衡受到破坏时，会导致感染性疾病、免疫失调和代谢失衡的发生[6]。在肠道微生物菌群中一些乳酸菌的功能被逐渐发现，它们可以在消化道内存活并发挥多种功效，包括治疗腹泻、刺激免疫系统、改善纤维消化、抗肿瘤和降低胆固醇等，作为机体的益生菌，对乳酸菌的研究引起了人们的广泛关注。
基于乳酸菌的安全性、益生性以及胃肠道存活能力，为乳酸菌成为一种高生物技术潜力工程菌提供了良好的应用基础；同时得益于基因工程技术的发展，重组乳酸菌可以跨越物种屏障，生产各种重组蛋白和代谢产物，在乳制品发酵、氨基酸生产、生物药物递送以及黏膜疫苗载体中应用广泛[4, 7]。蛋白类的生物活性物质或药物以口服途径给药最为方便快捷，但通常面临胃肠道中蛋白水解和降解变性的问题，因此，亟需开发出一种药物递送系统可以用于口服给药。食品级乳酸菌属于非致病性微生物，适合作为口服或者黏膜治疗药物的递送载体，部分菌种可以在胃肠道恶劣的环境中存活下来。开发乳酸菌作为重组蛋白药物递送系统的载体，一般采用基因工程技术改造乳酸菌，通过口服或黏膜给予乳酸菌的方式，利用黏膜递送系统促使药物吸收进入机体，达到预防或治疗疾病的目的，该药物递送系统为蛋白药物应用提供了一种替代给药方式[8]。与其他相对成熟的细菌或酵母蛋白表达系统相比，乳酸菌综合了这些蛋白表达系统的优势，无包涵体及内毒素产生，外源蛋白可胞内、外表达或表面展示，多种类型表达载体可供选择，同时具有部分独有的特性如益生性、安全性等，但是由于胃肠道系统对乳酸菌生存的限制以及乳酸菌活体微生物的特殊性，乳酸菌作为药物递送系统也面临着诸多挑战。
1. 乳酸菌载药系统的安全性和有效性
乳酸菌作为非致病性革兰氏阳性菌，通常被认为对人体健康是安全的。不同于大肠杆菌表达系统，乳酸菌作为工程菌用于外源蛋白表达的过程中不会产生内毒素，避免了对机体造成损伤的可能性[9]。同时通过口服等途径摄入乳酸菌来进行蛋白药物递送，无需经过复杂的产物分离纯化步骤，定植存活于肠道中的乳酸菌可以持续进行表达，在人体中发挥特定的功效。与传统生物药物需注射给药途径相比，乳酸菌载药系统给药途径便捷，给药频次减少，机体依从性相对较好，因此，食品级乳酸菌成为绝佳的生物药物递送载体。作为人体天然的肠道宿主菌，部分乳酸菌能够定植于肠道直接和肠黏膜接触，利用基因工程的方法使重组乳酸菌表达外源蛋白，乳酸菌可直接将药物通过黏膜吸收到机体，开发出的此类生物活性分子可用于黏膜免疫或黏膜药物递送。人体黏膜约400 m2，涵盖了胃肠道、呼吸道和泌尿生殖系统，给药面积大，黏膜药物递送载体通过口服、鼻腔、阴道等途径比注射给药途径更加方便[10]。
为寻求更加安全、有效、易于管理的工程菌，转基因微生物的深入研究使得乳酸菌的遗传和分子性状被阐明，部分乳酸乳球菌和乳酸杆菌因其固有的佐剂和免疫调节能力而被开发应用，另外一些乳杆菌属因其具有抵抗低pH的能力，并可附着于肠道上皮细胞而被用于口服疫苗的开发[11]。乳酸球菌作为乳酸菌中的一种，具备生长速度快、易于操作、自身抗原性弱、不引起机体强烈免疫应答的特点，被认为是非侵入性和非致病性的种属，同时，由于其自身分泌蛋白和胞外蛋白酶产生较少，极大程度降低了对外源蛋白的干扰程度，保留外源蛋白的完整性和功能性，在多种疾病模型中作为功能性蛋白递送载体具有显著的优势[12]。乳酸球菌中的亚种MG1363已经完成了基因组的测序工作，证明乳酸球菌作为乳酸菌中最具特征性的菌种，同大肠杆菌和枯草芽孢杆菌一样可以成为分泌外源蛋白的最佳工程菌[13]。基于这些特点，乳酸菌受到了全球研究者的高度关注，其自身的安全性和低风险性更易于在疾病的治疗中得到接受，有望成为一种有前途的细胞工厂。
2. 重组乳酸菌在消化系统中的保护策略
由于机体胃肠道的恶劣环境，口服重组乳酸菌后表达的肽类及蛋白类药物往往不能发挥显著的生物学功效，很难在疾病治疗中发挥作用。该问题的主要原因在于乳酸菌经过胃肠道后存活率显著下降，药物表达量不足。多种因素限制乳酸菌的存活，包括胃的酸性pH值、消化酶、胆汁盐的存在等[14]。在一项研究乳酸菌在人体胃肠道药动学的实验中表明，分别口服给予植物乳杆菌NCIMB8826、发酵乳杆菌KLD和乳酸球菌MG1363，4 h后收集回肠液进行分析，发现回肠中活菌的存活率分别为7%、0.5%和1.0%，连续口服7天后，植物乳杆菌NCIMB 8826的存活率为(25±29)%，没有菌株在体内定植[15]。在体内和体外模拟胃转运过程测试乳球菌N7的存活率，在体外模拟的胃肠道环境（含有0.5%胆汁盐、pH值为2.5的GM17琼脂板中）时，N7菌株只显示出中等的存活率，在口服给予小鼠后活菌只能在24~48 h的粪便中监测到，只有通过每天给药的方式才能保证活菌株N7持续存在于肠道中，这一研究表明胃肠道环境可能会严重降低乳球菌的活性[16]。传统的蛋白药物保护方式如水凝胶、微球、脂质系统和纳米颗粒等口服递送系统也很难抵抗胃肠道环境，极易导致蛋白质变性和降解，较难用于乳酸菌的保护[17]。
乳酸菌通常必须在胃部的酸性环境中存活下来，并以活菌状态到达小肠定植才能发挥治疗功效。通过现有的技术筛选获得能够抵抗胃肠道系统的菌株作为蛋白药物递送载体，可以有效减少给药频次和剂量，从而达到提高治疗效果的目的，这成为开发乳酸菌应用的一个方向。基于qPCR技术通过对16S rRNA的研究，已经证实部分乳酸菌可以在人体表面和体内进行很好的定植，迄今为止已经在消化道内检测到超过20种乳酸菌，口腔和阴道中乳酸菌的比例达到了最高，表明相比于胃肠道系统，在开放环境中人体更容易获得乳酸菌。从人体或动物的肠道中分离获得的乳酸菌与其他种属的乳酸菌相比有着更强的黏附能力，例如B.longum和Bcateroides thetaiotaiotaomicron[18]。另一方面，设计合适的益生菌制剂用于延长保存期限、保持益生菌进入体内后的活力、抵抗胃液环境。利用藻酸盐通过喷雾干燥包封活的益生菌，作为一种高效实用技术，干燥细粉末颗粒状态的益生菌产品在冷藏8周后，仍表现出稳定的活性状态，暴露于酸性条件时藻酸提供了隔离保护作用，在局部起到pH缓冲的作用，该技术为益生菌在食品和医药行业的商业化应用提供了一种可行的方案[19]。采用藻酸盐和甘露醇共封装产叶酸的乳酸乳球菌，胶囊化的乳酸菌与普通乳酸菌相比在模拟胃液和肠液的环境中存活率得到明显提升，产生了几乎与游离细胞相当的叶酸，混合包埋方法为乳酸乳球菌提供了很好的保护作用[20]。此类包封包埋方法对于许多pH敏感的乳酸菌有着很好的保护效果，提供了一种提高乳酸菌胃肠道存活能力的方法。
3. 重组乳酸菌的蛋白表达系统
乳酸菌作为基因工程中常见宿主菌，重组蛋白的表达多利用质粒载体工具来实现，依赖于外源基因克隆至表达载体并转导进入乳酸菌中。根据功能性外源蛋白表达的目的，一般包括三种表达策略：细胞质表达（CE）、细胞表面展示（SD）和细胞外分泌（ES）。不同的表达策略使乳酸菌可以在机体特定环境中发挥对应功效，用于黏膜免疫或治疗性药物的开发[21]。最早被开发出来的pWV01和pSH71质粒复制系统，具有宿主范围广、生物兼容度高的特点，目前基于这些质粒已经衍生出了多种功能性质粒[22]。质粒上克隆的基因DNA片段通常不含有本身的信号肽，选择乳酸乳球菌大量分泌蛋白LcoB的信号肽（Usp45或称为SPLcoB），信号肽的引入使得乳酸菌具备高效分泌异源蛋白的功能[23]。根据启动子的不同，乳酸菌表达异源蛋白分为组成型表达和诱导型表达[24]。组成型表达通常无需诱导剂即可完成高产异源蛋白的目的，启动子一方面发挥控制表达开关的作用，另一方面其强度也会影响蛋白的表达量。虽然采用组成型启动子能够直接启动目的蛋白表达，但是蛋白在胞内的持续累积会导致其在胞质中发生降解，甚至对宿主造成毒害作用。在用于药物递送系统时，组成型表达不受外界因素调控，因此其在机体内部高强度持续表达也可能存在安全问题。采用诱导型表达系统可以避免蛋白过量表达对宿主本身及机体的毒副作用，同时也能在特定条件下诱导蛋白的表达。多种类型的诱导型启动子构成了不同的诱导表达系统，通过添加诱导物、抑制物或改变培养条件的环境因素（如pH值、温度或离子浓度等）来控制外源蛋白的表达。诱导型表达系统中有常见的NICE系统，乳链菌肽（Nisin）激活启动子PnisA控制基因的表达，主要是由Nisin激活膜定位传感器蛋白（NisK）后，使其磷酸化以激活胞质反应调节剂NisR，进而激活启动子控制转录，诱导水平与添加乳链菌肽的量呈正相关[25]。PZn-ZitR表达系统和更加强效的Zirex调控表达系统，可以通过无毒的Zn2+来进行严格的蛋白表达调控，在乳酸乳球菌中引入了链球菌启动子PczcD及其调节蛋白SczA的编码基因，与PnisA启动子耦合形成了双启动子控制下独立调节不同基因表达的系统[26]。应力诱导可控表达（SICE）系统，基于乳酸菌groESL操纵子无需添加外源诱导物，在热休克（42 ℃）、高盐（NaCl 2.5%）、低pH（4.5）或胆汁盐（15ng/ml）暴露条件下可表达蛋白，SICE系统在两种小鼠模型中分别成功表达了IL-10和HPV-16 E7抗原，证明了这种受应力调控的乳酸菌蛋白表达系统具有广阔的临床应用前景[27]。
4. 重组乳酸菌在疾病治疗中的应用
合成生物学方法已经使得传统乳酸菌通过基因改造技术展现出多种功能，将尖端的基因修饰技术与新颖的设计理念相结合，重组乳酸菌在疾病治疗领域展现出强大的应用价值。工程化乳酸菌的出现也成为了细胞介导生物疗法的一部分，在多种疾病领域中成为一种全新的治疗手段。重组乳酸菌在进入机体后利用与黏膜系统的相互作用，可以递送各种细胞因子、酶、抗体等，与传统的药物递送系统相比，这种可受调控的生物递送系统更加的安全可靠。通过模拟蛋白类生物活性物质给药的方式，重组乳酸球菌NZ9000携带肿瘤抑制肽KiSS1的基因，KiSS1肽作为一种肿瘤细胞的抑制因子，乳酸菌功能性的表达该肽在体外发挥了显著的肿瘤抑制作用[28]。治疗性多肽药物的成功表达使重组乳酸菌有了广阔的应用前景，在糖尿病治疗领域多种生物活性肽能够发挥显著的降血糖作用，将胰高血糖素样蛋白-1受体激动剂Exendin-4的基因构建到PNZ8048载体并导入乳酸菌，异源表达重组Exendin-4的乳酸菌在体外显著增强了胰岛细胞的胰岛素分泌功能，促进了胰岛细胞的增殖和葡萄糖依赖性胰岛素分泌，同时激活了相关的信号通路，证实了这种异源表达的多肽同样具有生物活性[29]。机体内的肠道、阴道菌群基于黏膜免疫发挥对疾病的长期免疫作用已被证实，乳酸菌作为菌群中常见的一类微生物，利用其这一特性在乳酸菌表面锚定抗原制备活菌疫苗，成为了更为安全、高效的一种策略[30]。相比较于传统的减毒活疫苗，乳酸菌的非致病性和非侵入性更适合被设计成为新一代黏膜活疫苗，全球范围内许多研究都在致力于开发这一新型的黏膜活疫苗，针对HPV 16、E2、E6、E7等抗原的多种重组乳酸菌黏膜疫苗均已进入临床前和临床试验[31]。口服、皮下、滴鼻、阴道等多种途径的给药方式让乳酸菌疫苗在不同疾病治疗中有了更多的应用，与传统的抗原表达系统相比，操作简单、应用安全、成本更低[32]。
5. 总结
重组乳酸菌在疾病治疗领域已经得到了广泛的研究应用，作为减毒病原菌运载工具的有力替代品，基因工程工具的开发也推动了乳酸菌药物递送系统的长足发展。现阶段大多数的研究还限于体外或动物模型来评估重组乳酸菌的功能，尚缺乏一些临床的实验论证。另外，乳酸菌作为一种活体微生物，在未来的临床应用中应更多关注于其生物安全性，包括抗生素耐药性、免疫不良反应、遗传稳定性等问题，这就对菌种及生物技术手段的选择提出了更高的要求，活载体乳酸菌的安全性成为了不可忽视的一个环节。口服、黏膜、皮下多种给药途径决定了乳酸菌设计的不同策略，提高菌种应用效率、确定接种最佳剂量、优化菌种选择、设计合适表达系统等问题也是未来重组乳酸菌研究的关键点。
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表 1 人体不同组织中透明质酸的含量
组织或体液 HA浓度（μg/ml） 眼玻璃体 140～340 脐带 4100 关节滑液 1400～3600 真皮 200～500 表皮 100 胸淋巴液 0.2～50 尿液 0.1～0.3 血清 0.01～0.1 
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表 2 不同相对分子质量外源性透明质酸的应用
用途 分子量(Da) 作用 骨关节注射液 >5×106 对受损部位润滑和机械保护作用； 眼科手术黏弹剂 >3×106 撑起前房，减少术后炎症的发生 滴眼液 （1～1.5）×106 增加滞留时间；润滑和保护作用 术后防黏连 >1×106 形成隔离层，抑制炎症反应 化妆品 （0.5～2）×106 保湿 抗肿瘤药载体 （5～7.5）×105 与肿瘤CD44靶点特异性结合 对创伤修复 <5×105 促进巨噬细胞的吞噬作用；促进血管形成 抗肿瘤作用 800～3200 特异性结合CD44受体和RHAMM受体
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