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铁死亡（ferroptosis）是一种铁依赖性，区别于细胞凋亡、细胞坏死和细胞自噬新型细胞程序性死亡方式[1]。细胞中铁过量时，可通过芬顿反应产生羟自由基，这些自由基直接会与细胞膜中多不饱和脂肪酸反应，产生大量脂质活性氧，从而诱导细胞死亡。铁死亡在细胞内受到多种代谢途径调控。其中就包括一个重要的抗氧化系统——谷胱甘肽系统。谷胱甘肽可以在还原态（G-SH）和氧化态（G-S-S-G）之间循环，使其能够参与细胞内的氧化还原生物化学反应。正常情况下，细胞内谷胱甘肽以还原态为主[2]。谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4），分子量约为19 000，由170个氨基酸组成，是含硒GPx家族第4位成员。目前已在哺乳动物中发现GPX1-GPX8等多个GPx家族成员，然而仅有GPX4表现出对于膜脂过氧化氢产物的清除能力，这与GPX4独特的氨基酸序列以及空间结构相关。GPX4能够以谷胱甘肽或其他硫氧化还原蛋白作为电子供体，将氢过氧化物（R-OOH）还原为对应的醇（R-OH），从而限制铁离子依赖的毒性自由基生成，抑制脂质过氧化，使得细胞膜免受氧化损伤，是铁死亡的重要调节蛋白[3]。
近年来，大量研究表明通过抑制GPX4蛋白来诱导细胞发生铁死亡，在克服肿瘤细胞耐药、治疗脂质过氧化相关神经退行性疾病等方面极具前景[4]。本文介绍了GPX4蛋白结构及其功能，并重点综述了目前GPX4小分子抑制剂最新研究进展，为开发基于GXP4蛋白功能抑制的铁死亡诱导剂提供研究基础。
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GPX4是一种由170个氨基酸组成的单体蛋白质，显示出典型的硫氧还蛋白基序，由四个定位在蛋白质表面α螺旋和七条β链组成。GPX4含有在其他GPX硒酶中存在的保守催化活性四分体，由硒代半胱氨酸（Sec46）、谷氨酰胺（Gln81）、色氨酸（Trp136）和天冬酰胺（Asn137）组成，见图1A。Sec46，Gln81和Trp136三个氨基酸残基之间可以发生氢键相互作用和静电相互作用，这种相对牢固的空间排列对GPX4催化活性至关重要[5]。其中，Sec46是催化活性必需的，Sec46突变为半胱氨酸会使GPX4催化活性大幅降低。Sec46催化氧化还原反应是由3个连续反应组成的循环反应，见图1B：第一步，过氧化物与离子化的GPX4反应，产生GPX4硒酸衍生物；第二步，GPX4硒酸衍生物与还原型谷胱甘肽反应，还原型谷胱甘肽通过硫与GPX4的硒共价结合形成GPX4-谷胱甘肽复合物；催化循环最后一步，GPX4-谷胱甘肽复合物通过与另一个还原型谷胱甘肽反应分离为GPX4和一分子氧化型谷胱甘肽[2]。与其他GPx同工酶相比，GPX4表现出3种特性：一是该酶具有广泛的底物，即使是在高度结构化脂质蛋白组装体中，如生物膜和脂蛋白中，GPX4也能够减少复杂的脂质过氧化物；二是GPX4不仅可以将还原型谷胱甘肽作为氢供体，也可以接受蛋白质硫醇和其他还原等价蛋白；三是GPX4除了以单体形式存在以外，在精子细胞中还能以蛋白质聚集体的形式存在，这一特性影响了精子发育过程中线粒体膜的形成[6]。
图 1 GPX4蛋白结构及其功能
GPX4主要功能是利用谷胱甘肽作为辅助因子来降低脂质过氧化，从而保护细胞膜的完整性。GPX4作为一种关键的抗过氧化物酶，可还原膜和脂蛋白中的磷脂氢过氧化物（PLOOH）。GPX4不仅可以利用谷胱甘肽消除毒性PLOOH，还可以通过减少胸腺嘧啶氢过氧化物、胆固醇氢过氧化物和脂肪酸氢过氧化物，保护细胞免受氧化损伤。除了还原氢过氧化物以外，GPX4还具有抑制花生四烯酸脂氧合酶（ALOX）活性的功能[6]。此外，与其他GPx家族成员相比，GPX4另一个独特功能是调节哺乳动物的胚胎发育[2]：在GPX4基因敲除小鼠模型中，小鼠胚胎在妊娠中期就在子宫内死亡，与此相反，GPX1、GPX2或GPX3敲除小鼠不会产生胚胎致死性。
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迄今为止，已报道的GPX4小分子抑制剂大部分都包含与催化晒代半胱氨酸发生共价结合的反应弹头，其中最早发现的抑制剂就是以氯乙酰胺为共价结合弹头的化合物。RSL3（图2，化合物1）是最具有代表性的GPX4小分子抑制剂，最初被Yang[7]等人从47725种化合物中筛选出来，发现其具有抑制RAS突变肿瘤细胞增殖的效果。该团队发现RSL3诱导的细胞死亡与凋亡、坏死和自噬均不同。该研究团队进一步开展研究[8]，通过化学蛋白质组学来筛选鉴定RSL3靶标蛋白，确定了GPX4是其作用的靶蛋白，并发现RSL3氯乙酰胺部分对其活性至关重要，即1.0 μmol/L浓度下，GPX4抑制率为（17.08 ± 0.40）%，更换为其他亲电弹头取代时，会导致活性丧失。Hengrui团队从晶体结构角度进一步阐述了GPX4和RSL3的结合方式，发现RSL3结合位点是半胱氨酸66（Cys66）而不是GPX4的催化活性位点Sec46[9]。
图 2 氯乙酰胺弹头共价抑制剂的化学结构
Michel团队[10]对
303282 种化合物进行了高通量筛选，得到了对RAS突变细胞具有优秀抑制活性的化合物ML162（图2，化合物2）。该化合物同样含有氯乙酰胺基团，与RSL3相比显示出更好抑制率，其在1.0 μmol/L浓度下，GPX4抑制率为（27.0±0.9）%。Chen的团队[11]在ML162和RSL3的基础上，设计得到了一系列新型GPX4共价抑制剂，其中，化合物C18（图2，化合物3）表现出优于RSL3和ML162的GPX4抑制率[1.0 μmol/L浓度下，GPX抑制率为（98.8±1.5）%]，能抑制三阴性乳腺癌细胞生长（IC50=0.012 μmol/L）。Xu的团队[12]以RSL3多环的刚性骨架为切入点，以RSL3为先导化合物，将分子骨架中的哌啶环打开，并基于此继续进行结构优化，设计合成了一系列衍生物（图3）。其中化合物26a（图2，化合物4）表现出优秀的GPX4蛋白抑制活性[1.0 μmol/L浓度下，GPX抑制率为（71.7±1.7）%]，能诱导三阴性乳腺癌细胞死亡（IC50=0.78 μmol/L）。
图 3 化合物26a的设计思路
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目前报道GPX4抑制剂主要是通过氯乙酰胺基团与GPX4进行共价结合来抑制其活性。然而，这些化合物中的氯乙酰胺基团不仅与GPX4的半胱氨酸残基共价结合，还可能与其他氨基酸残基发生结合，从而降低了它们对GPX4的特异性。鉴于此，研究人员正致力于寻找能够更特异性地与GPX4结合的化学结构。Michel[10]团队发现，不含亲电弹头的化合物ML210（图4，化合物5）在1.0 μmol/L浓度下对GPX4的抑制率高达（34.8±0.5）%。Eaton[13]等研究者揭示了ML210的作用机制（图4）：ML210中的硝基异噁唑基团在细胞内转化为氧化腈基团，进而与GPX4中的半胱氨酸残基形成共价结合。同样的机制也在化合物二酰基呋咱（图4，化合物6）中观察到[14]，其结构中的噁二唑基团能在细胞内转化为氧化腈基团，从而抑制GPX4，1.0 μmol/L浓度下抑制率为（34.8±0.5）%。不同于RSL3和ML162这类作用于多种蛋白质的抑制剂，ML210和二酰基呋咱可专一性地作用于GPX4，说明掩蔽腈氧化物是一种高特异性的GPX4靶向结构。
图 4 掩蔽氧化腈共价抑制剂的化学结构及其在细胞的转化过程
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除了直接与GPX4发生共价结合外，某些化合物可通过非直接途径抑制GPX4蛋白。例如Shimada[15]团队从
3169 种化合物中筛选出FIN56（图5，化合物7），该化合物并不具有亲电弹头，但能导致GPX4失活。FIN56会增加细胞内活性氧的含量，但其作用速度明显慢于直接作用于GPX4的抑制剂RSL3。研究表明，经FIN56处理的细胞中GPX4丰度显著下降，但是其转录水平却显著增加，这种现象在RSL3处理的细胞中并未观察到。因此，研究者推测FIN56可能通过促进GPX4的降解来发挥作用，但具体机制尚不明确。另一种由Micheal[16]报道的非共价GPX4抑制剂是FINO2（图5，化合物8），其结构中的过氧键能直接氧化亚铁离子，导致GPX4失活。这些分子的发现为GPX4小分子抑制剂的开发提供了新的视角。
图 5 GPX4间接抑制剂的化学结构
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近年来，随着对铁死亡相关研究的进一步深入，人们发现铁死亡与多种癌症以及神经性疾病等病理过程相关，为治疗这些疾病提供了新的解决策略。在铁死亡的发生过程中，GPX4是关键的调控因子，它能够分解脂质过氧化物，维持脂质双分子层的稳定，反之，抑制GPX4可以诱导细胞发生铁死亡。目前，大多数已报道的GPX4小分子抑制剂为含有氯乙酰胺基团的共价抑制剂，这些化合物由于其强大的亲电性，可以与多种蛋白质结合，从而导致它们与GPX4结合的特异性不高。为解决这一问题，研究者们设计了含掩蔽氧化腈弹头的化合物，这种设计旨在通过减少细胞与高亲电性弹头的接触时间，提高靶向GPX4的特异性。这两类GPX4小分子抑制剂虽然具有较好的蛋白及细胞水平活性，但尚无候选分子进入临床试验。此外，还发现了一些非共价的GPX4小分子抑制剂，这些分子显示出抑制GPX4活性并能诱导细胞发生铁死亡，但其与GPX4具体的作用机制尚不清楚。因此，无论是基于关键调控蛋白GPX4探索高特异性的共价抑制剂，还是揭示GPX4非共价抑制剂的作用机制，都是铁死亡相关研究领域的热点问题，克服这些挑战是未来铁死亡诱导剂进入临床应用的关键一步。
Research progress on small-molecule inhibitors of ferroptosis regulatory protein GPX4
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摘要: 铁死亡（ferroptosis）是2012年新发现的一种非凋亡坏死的细胞死亡方式，其主要特征为脂质活性氧增多以及细胞内亚铁离子累积。谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）是含硒GPx家族第4位成员，是细胞清除脂质过氧化物的重要蛋白，也是铁死亡的重要调节因子。靶向GPX4小分子抑制剂能诱导铁死亡发生，为治疗耐药性癌症和神经退行性疾病提供了新的策略。主要介绍GPX4蛋白的结构和功能，并综述GPX4小分子抑制剂最新前沿进展，为开发基于GXP4抑制的铁死亡诱导剂提供研究基础。Abstract: Ferroptosis, discovered in 2012, is a newly form of non-apoptotic and non-necrotic cell death, which is characterized by an increasement in lipid peroxidation and accumulation of intracellular iron ions. Glutathione peroxidase 4（GPX4）is the fourth member of the selenoprotein GPx family and plays a crucial role in clearing lipid peroxides in cells, making it an important regulator of ferroptosis. Small molecule inhibitors targeting GPX4 can induce ferroptosis, offering a new strategy for treating drug-resistant cancers and neurodegenerative diseases. The protein structure and function of GPX4 were primarily discusseed, and the latest advances in small molecule inhibitors of GPX4 were summarized, which provided a research foundation for developing ferroptosis inducers based on GPX4 inhibition.
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Key words:
- ferroptosis /
- GPX4 /
- small molecule inhibitors /
- glutathione /
- lipid peroxidation
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抗生素的发现是人类健康史的一大进步，但由于抗生素在医疗卫生领域和动物卫生领域的过度使用，导致耐药性的产生，临床效果减弱。伴随着抗生素耐药性的产生，很多人类赖以生存的药物正在迅速失效，治疗手段日益减少，人类的健康和生命受到严重威胁[1]。因此开发新的抗生素和建立新的治疗模式迫在眉睫。
群体感应（QS）是病原菌自发产生某些特定的小分子物质，随着浓度变化，调节自身特定基因的表达，从而改变群体行为的现象。群体感应抑制剂（QSI）作为一种新型抑菌方式，在治疗病原菌感染方面有重要作用，通过不同的方式干扰或阻断病原菌群体感应现象的产生[2]。其作用机制不同于目前抗生素以抑制或杀灭病原菌为目的，而是在不对病原菌生长产生压力的前提下，通过阻断病原菌群体感应通路来减少紫色色素、生物被膜、几丁质酶等毒力因子的产生或表达，达到降低病原菌致病性。由于不影响细菌正常生长，因此避免了细菌的生存选择压力，也就减少严重的耐药性问题[3]。
研究表明，很多中药活性成分具有群体感应抑制作用，如肉桂中的肉桂醛对荧光假单胞菌生物膜形成的抑制作用[4]，药用植物金丝雀花中提取的邻苯三酚及其类似物对群体感应信号分子呋喃硼酸二酯具有拮抗作用[5]，槲皮素和柚皮素能抑制哈维菌BB120和大肠杆菌O157∶H7的生物膜形成[6]。川白芷提取物对铜绿假单胞菌生物膜形成的具有抑制作用[7]，马齿苋、板蓝根等中药提取物能明显地抑制了铜绿假单胞菌的浮游迁移，这些研究为筛选新型抗感染药物提供新的思路，具有非常重要的研究意义和实用价值[8]。
黄酮类化合物因其抗氧化、抗菌和抗癌作用而成为研究的热点[9-11]。淫羊藿E. brevicornum为小檗科（Berbridacese）淫羊藿属植物，其主要有效成分中黄酮类化合物含量最高，如宝藿苷、淫羊藿苷、朝藿定A/B/C等黄酮苷类化合物。淫羊藿具有抗炎，提高人体免疫力，抗氧化等多种药理活性，而且黄酮类成分在抗感染以及抗菌防霉有良好的应用前景[12-13]。但淫羊藿在群体抑制方面的研究目前是鲜有报道。
因此，本实验拟测定淫羊藿提取物及5个主要的黄酮苷类化合物对常见条件病原菌（紫色杆菌CV026和铜绿假单胞菌 PAO1）的群体感应抑制作用，为寻找高效的群体感应抑制剂奠定基础，为淫羊藿的进一步开发应用提供理论依据。
1. 材料和方法
1.1 仪器
超声细胞破碎仪（宁波新芝JY99-IIDN）；低温高速离心机（美国贝克曼Avanti J-26S XP）；高压灭菌锅（日本SANYO MLS-3020）；真空干燥箱（上海一恒科技有限公司DHG-9053A）；酶标仪（瑞士TECAN infinite M200 pro）；旋转蒸发仪（瑞士BUCHI Rotavator R-200）；光学显微镜（日本尼康80i）。
1.2 实验材料
化学试剂乙醇（批号：XW00641751）、二甲基亚砜DMSO（批号：XW00676851，购自国药集团化学试剂有限公司）；本实验中所用的抗生素包括妥布霉素（批号：014241281）、硫酸奈替米星（批号：014138073）、庆大霉素（批号：014321472）、环丙沙星（批号：014252858）、淫羊藿苷（批号：01230870）、宝藿苷（批号：014125028）、朝藿定A（批号：045930800）、朝藿定B（批号：045930801）、朝藿定C（批号：041603427）、对照品水杨酸（批号：013474062）均购自上海泰坦科技股份有限公司；几丁质酶活性检测试剂盒（批号：BC0825，购自北京索莱宝公司）；LB培养基（批号：041417503，购自上海泰坦科技股份有限公司）；淫羊藿（购自湖北十堰丹江口铜架山村毛家坪淫羊藿种植基地，由海军军医大学中药鉴定学教研室张成中副教授鉴定）；紫色杆菌CV026、铜绿假单胞菌 PAO1（购自广东省微生物菌种保藏中心，菌种均于−80℃冰箱冻存）。
1.3 淫羊藿提取物的制备及样品配置
淫羊藿药材50℃烘干，粉碎，过40目筛，保存备用。称取5.0 g淫羊藿粉末，加入100 ml 75% 乙醇，超声破碎30 min，过夜静置，过滤取上清，上清液减压浓缩至浸膏。溶于1% DMSO溶液中，过滤，分装，−20℃保存备用。淫羊藿提取物的质量浓度为 0.5 mg/ml。
将淫羊藿苷、宝藿苷、朝藿定A/B/C、水杨酸分别称取2.00 mg 溶于1 ml DMSO溶液（1%）中，得到浓度为2 000 μg/ml的标准品母液，−20℃保存备用。将抗生素妥布霉素、硫酸奈替米星、庆大霉素、环丙沙星溶于1 ml DMSO溶液（1%）中，得到浓度为100 μg/ml的标准品母液，−20℃保存备用。
1.4 对紫色杆菌CV026和铜绿假单胞菌 PAO1最小抑菌浓度（MIC）的测定
菌株活化后按1%接种量接种于现配LB培养基，37℃，220 r/min震荡培养至OD600nm为0.4～0.6。加入上述制备的样品，采用2倍稀释法梯度稀释，DMSO为阴性对照，在2、4、6、8、10 h分别测定OD620nm值，实验进行3个重复，测定最小抑菌浓度。
1.5 对紫色杆菌CV026紫色色素产生的抑制作用
按1.4实验结果，本实验按200 μg/ml以下浓度进行，制备不同浓度样品（最终浓度分别为25、50、100 μg/ml）的CV026菌液，加入C6-HSL终浓度为5 μmol/L，28℃培养24 h。DMSO为阴性对照。取3 ml培养液，12 000 r/min离心10 min，弃上清液，加入1 ml 酸化乙醇（4%，1 mol/L HCl），充分混匀，离心，取上清液，534 nm处测定吸光值[14]。按下式计算抑制率[15]：
$$ \text{抑制率}=\frac{\text{对照组}\mathrm{O}\mathrm{D}\text{值}-\text{实验组}\mathrm{O}\mathrm{D}\text{值}}{\text{对照组}\mathrm{O}\mathrm{D}\text{值}}\times 100\text{%} $$ 1.6 对铜绿假单胞菌 PAO1生物被膜形成的抑制作用
将铜绿假单胞菌 PAO1培养物稀释至现配LB中，将样品（终浓度100 μg/ml）加入到实验组，并将DMSO作为阴性对照组，水杨酸作为阳性对照。将200 μl样品添加到96孔平板中，在37℃下温育24 h，除去悬浮培养物。利用光学显微镜观察后，用无菌磷酸盐缓冲盐水PBS（pH 7.2）洗涤，保持不破坏底部生物被膜。将200 μl的LB培养基和溶解有样品（终浓度100 μg/ml）或DMSO（阴性对照）或具有抗生素的LB培养基添加到96孔板中。适当摇动，将平板在37℃下再温育24 h。使用酶标仪在620 nm（OD620）处测量光密度[16]。
1.7 几丁质酶抑制活性
将铜绿假单胞菌 PAO1培养物稀释至现配LB中，将样品（终浓度100 μg/ml）加入到实验组，并将DMSO作为阴性对照组，水杨酸作为阳性对照。使用几丁质酶活性检测试剂盒，将1 ml的提取液加入到1 ml培养物中，10 000 r/min，4℃离心20 min，取上清液，分别沸水浴反应 10 min，置于冰上暂存。在540 nm下测定每管的吸光度，对比标准曲线计算几丁质酶活性[17]。
2. 结果与分析
2.1 对紫色杆菌CV026和铜绿假单胞菌 PAO1的MIC测定
根据紫色杆菌CV026和铜绿假单胞菌 PAO1的生长情况，以及测定培养物的OD值，确定淫羊藿提取物及活性成分对紫色杆菌CV026和铜绿假单胞菌 PAO1的最小抑菌浓度如下表1。淫羊藿提取物及五种黄酮苷的MIC都在500 μg/ml。因此，后续实验测定选择200 μg/ml以下的浓度对于紫色杆菌CV026和铜绿假单胞菌PAO1生长均无抑制作用。
表 1 样品对紫色杆菌CV026和铜绿假单胞菌 PAO1最小抑菌浓度样品 MIC（μg/ml） CV026 PAO1 淫羊藿提取物 >2 000 >2 000 宝藿苷I 500 500 淫羊藿苷 500 500 朝藿定A 500 500 朝藿定B 500 500 朝藿定C 500 500 妥布霉素 0.25 0.5 奈替米星 2 1 庆大霉素 1 1 环丙沙星 2 2 2.2 对紫色杆菌CV026紫色色素产生的抑制作用
紫色杆菌群体感应的特殊现象就是产生紫色色素，对6个样品进行浓度梯度实验，样品对于CV026群体感应的抑制作用可以通过检测紫色色素的产生量进行判定。实验结果显示，淫羊藿提取物、淫羊藿苷和朝藿定C对CV026紫色色素的产生有抑制作用，且随着样品浓度升高而增强，淫羊藿苷和朝藿定C浓度达到100 μg/ml时，其抑制率可达到42.9%和31.9%，与阴性对照组（DMSO）相比有显著差异（P<0.05，图1）。结果表明，淫羊藿苷和朝藿定C在不影响CV026生长的情况下，具有良好的群体感应抑制作用。
2.3 对铜绿假单胞菌 PAO1生物被膜形成的抑制作用
生物被膜的产生是导致抗生素耐药的主要原因之一。铜绿假单胞菌能生成高度结构化和致密的生物被膜，多与群体感应有关。本实验利用光学显微镜对细胞爬片上的生物膜进行观察，利用酶标仪对其定量测定，结果如图2所示。淫羊藿苷与朝藿定C（100 μg/ml）均表现出优于阳性对照水杨酸的抑制活性，与阴性对照组（DMSO）相比有显著差异（P<0.05, P<0.01）。
2.4 几丁质酶抑制作用
几丁质酶是真菌和细菌生物被膜中的重要成分，是一种中药的毒力因子，能够帮助病原菌穿透组织侵袭宿主。本实验通过淫羊藿提取物、淫羊藿苷、朝藿定C（100 μg/ml）对铜绿假单胞菌 PAO1培养物进行处理，结果表明淫羊藿提取物、淫羊藿苷、朝藿定C（100 μg/ml）可大大降低几丁质酶活。几丁质酶活分别降低了41％、38％和45％（图3），与阴性对照组比较有显著差异（P<0.05，P<0.01，P<0.001）。
3. 结论与讨论
本实验利用群体感应抑制研究的模式菌株CV026紫色杆菌、PAO1铜绿假单胞菌对淫羊藿提取物及其主要的黄酮苷类成分进行了最小抑菌浓度MIC的测定，发现其在500 μg/ml浓度下不影响病原菌的正常生长，随后，分别对紫色色素、生物被膜、几丁质酶等毒力因子进行测定，发现淫羊藿苷、朝藿定C（100 μg /ml）对紫色杆菌CV026和铜绿假单胞菌 PAO1的群体感应具有抑制作用。
随着常见致病菌的耐药性的增多，通过抑制或沉默致病菌群体感应的方法被认为是解决耐药性的途径之一，本实验中涉及到的作为研究群体感应的模式菌株得到了大量的应用，在此基础上挖掘出大量具有潜力的QSI，例如绿茶中的茶多酚、西柚中的香豆素、百里香中的香芹酚以及白藜芦醇、山奈酚、槲皮素等[9-11,18-19]。淫羊藿中的黄酮苷类成分与上述的潜力QSI有着结构上的相似性，因此我们推测可能是黄酮类的化合物结构与QS系统的信号分子相似，当其处于高浓度时可能会与QS系统中的某些信号分子受体产生竞争性结合，以此抢占活性受体靶标，阻断了QS系统传导，最终导致细菌毒力因子的表达下降。
黄酮苷类成分作为淫羊藿的主要活性成分，尤其是本实验中发现的淫羊藿苷和朝藿定C两个活性单体可以作为抗感染治疗的一种潜在前体，与上述潜力QSI有一定差异性，前者大多是以苷元的形式存在，其水溶性较差，而本文中提到的淫羊藿苷和朝藿定C分别带有二糖和三糖基修饰，其水溶性大大的增强，在进入生物体后，水解生成黄酮苷元发挥抑制作用，可能具有更高的生物利用度。
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