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社区获得性肺炎（community-acquired pneumonia，CAP）是指在医院外罹患的感染性肺实质（含肺泡壁，即广义上的肺间质）炎症，包括具有明确潜伏期的病原体感染而在入院后潜伏期内发病的肺炎[1]。儿童由于自身免疫力差，很容易受到病原菌感染而罹患CAP。其主要病因是由于病原菌的感染引起患者不适，抗感染治疗是CAP患者主要的治疗手段。因此，选择合适的抗感染药物尤其关键。
以往的观点认为，治疗CAP不能联合应用β-内酰胺类和大环内酯类，药理学角度解释为：作为繁殖期杀菌剂的β-内酰胺类主要通过干扰细菌增殖活跃期细胞壁的合成来杀伤细菌。然而大环内酯类作为快速抑菌剂，抑制细菌处于静止状态，影响β-内酰胺类的繁殖期杀菌作用，两者的药理作用机制相互矛盾，因此认为联合应用时临床疗效不佳。但在临床实践中我们发现，两类药物联用时表现出良好的疗效。β-内酰胺类与大环内酯类的联用治疗仍存有争议。虽然已有研究采用Meta分析方法对CAP患者的临床疗效与安全性进行了综合评价，但却没有专门针对易感染儿童CAP的相关Meta分析。笔者通过检索PubMed、CNKI和VIP数据库，搜集使用β-内酰胺类联合大环内酯类药物治疗儿童CAP的RCT研究，按照纳入与排除标准筛选文献、提取相关数据，采用RevMan 5.3软件进行Meta分析，对儿童联合使用β-内酰胺类与大环内酯类药物的安全性与有效性进行探究，以期能够为临床儿童CAP患者选择更好的抗感染方案提供参考。
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本文纳入的均为RCT研究。
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符合国内外CAP诊治指南诊断标准的儿童CAP患者。
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试验组采用β-内酰胺类联合大环内酯类药物治疗，对照组单用β-内酰胺类药物治疗。
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①临床有效率。临床有效率 =（痊愈例数 + 显效例数）/总例数×100%。痊愈为临床症状、体征消失或基本消失，实验室检查指标恢复正常，无需继续使用抗生素治疗；显效为临床症状、体征明显缓解，实验室检查指标恢复正常，无需继续使用抗生素治疗。②发热消退时间。③肺部啰音消失时间。④不良反应发生率。
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①重复发表的文献；②无法提取数据的文献；③研究的对象为成人CAP患者的文献；④非随机对照试验。
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检索PubMed、CNKI、VIP数据库，搜集使用β-内酰胺类联合大环内酯类对照单用β-内酰胺类治疗的非ICU住院CAP患者的RCT，检索时限均从建库截至2020年7月。英文检索词为pneumonias、children、beta lactams、penicillin、cephalosporin antibiotics、cephamycin、cefoxitin、carbapenems、macrolides、randomized controlled trial等。中文检索词为社区获得性肺炎、儿童、小儿、大环内酯、红霉素、罗红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、β-内酰胺、青霉素、氨苄西林、头孢。
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由两人按纳入与排除标准进行文献筛选和资料提取。文献资料提取使用Excel软件。资料提取内容包括：第一作者、发表时间、题目、杂志名称、研究设计类型、样本量、干预措施的具体细节（药物名称、剂量、疗程、用法）、所评价的结局指标情况等。并对纳入的RCT研究进行偏倚风险评估。
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采用RevMan 5.3软件进行统计分析。本研究所评价结局指标数据中，计量资料使用均数差与95%CI，计数资料采用相对危险度（RR）为效应分析统计量，同时给出其95%CI。纳入研究结果间的异质性采用I2=50作为分界定量判断异质性的大小，I2<50%不存在异质性，选择采用固定效应模型进行分析；I2>50%存在异质性，采用随机效应模型进行分析。若各研究结果间存在统计学异质性，明显的临床异质性采用亚组分析或敏感性分析等方法进行处理，Meta分析的检验水准设为α=0.05。
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初检共得到499篇文献，经逐层筛选后，最终纳入13篇文献[2-14]，其中，中文12篇，英文1篇。13个RCT共包括1 788例患者，其中，单用β-内酰胺类组1 101例，β-内酰胺类联合大环内酯类组687例。文献筛选流程及结果见图1。
图 1 文献筛选流程及结果
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纳入文献与纳入研究的基本特征见表1。
表 1 纳入研究的基本特征
研究项目 例数（单药组/联用组） 年龄 干预措施 疗程(t/d) 结局指标 单用β-内酰胺 β-内酰胺联合大环内酯类 朱宏斌2005[2] 39/42 4～14岁 头孢曲松钠针50～80 mg/(kg·d) 头孢曲松50～80 mg/(kg·d)
阿奇霉素5～10 mg/(kg·d)6～9 ① 李秋双2008[3] 39/41 6个月至14岁 头孢曲松钠针80 mg/(kg·d) 头孢曲松钠针80 mg/(kg·d)
阿奇霉素颗粒10 mg/(kg·d)6～9 ①② 罗亚辉2008[4] 46/46 6个月至7岁 头孢曲松钠针50～80 mg/(kg·d) 头孢曲松50～80 mg/(kg·d)
阿奇霉素10 mg/(kg·d)5～7 ①③④ 高永强2008[5] 63/67 3～12岁 头孢曲松钠60～80 mg/(kg·d) 头孢曲松钠60～80 mg/(kg·d)
阿奇霉素10 mg/(kg·d)5～10 ①② 冯光毅2008[6] 45/45 5个月至14岁 头孢噻肟钠50～100 mg/(kg·d) 头孢噻肟50～100 mg/(kg·d)
阿奇霉素10 mg/(kg·d)3～5 ①②③④ 黄芪2011[7] 69/69 3个月至14岁 头孢曲松钠80 mg/(kg·d) 头孢曲松钠80 mg/(kg·d)
阿奇霉素10 mg/(kg·d)5～10 ①② 刘卫东2013[8] 34/34 2～5岁 头孢他啶50～100 mg/(kg·d) 头孢他啶50～100 mg/(kg·d)
阿奇霉素10～15 mg/（kg·d）5～10 ①③④ 陈荣2014[9] 40/40 1～13岁 头孢他啶50～100 mg/(kg·d) 头孢他啶50～100 mg/(kg·d)
阿奇霉素10 mg/(kg·d)7～14 ①④ 范小萍2015[10] 34/34 2～13岁 头孢菌素80 mg/(kg·d) 头孢菌素80 mg/(kg·d)
阿奇霉素8～10 mg/(kg·d)14 ① Ambroggio 2015[11] 570/147 1～18岁 β-内酰胺 β-内酰胺联合大环内酯 14 ①② 夏剑萍2016[12] 54/54 6个月至7岁 头孢曲松钠1.0 g/d 头孢曲松钠1.0 g/d
阿奇霉素5～10 mg/(kg·d)5 ①② 齐艳芳2017[13] 34/34 2～13岁 第三代头孢菌素 第三代头孢菌素
阿奇霉素8～10 mg/(kg·d)7 ①②③ 戚海波2018[14] 34/34 未阐述范围 头孢西丁13.3～26.7 mg/kg，
q6或20～40 mg/kg，q8头孢西丁13.3～26.7 mg/kg，q6或
20～40 mg/kg，q8
阿奇霉素干混悬液10 mg/(kg·d)5 ①③④ 注：①表示治愈率；②表示发热消退时间；③表示肺部啰音消失时间；④表示不良反应发生率。 -
纳入文献的偏倚风险评价结果见表2。
表 2 纳入研究的偏倚风险评价
研究项目 随机方法 分配隐藏 盲法 结果数据完整性 选择性报告 其他偏倚 朱宏斌[2] 随机分组 不清楚 否 完整 不清楚 不清楚 李秋双[3] 随机分组 不清楚 否 完整 不清楚 不清楚 罗亚辉[4] 随机分组 不清楚 否 完整 不清楚 不清楚 高永强[5] 随机分组 不清楚 否 完整 不清楚 不清楚 冯光毅[6] 随机分组 不清楚 否 完整 不清楚 不清楚 黄芪[7] 随机分组 不清楚 否 完整 不清楚 不清楚 刘卫东[8] 随机分组 不清楚 否 完整 不清楚 不清楚 陈荣[9] 随机分组 不清楚 否 完整 不清楚 不清楚 范小萍[10] 随机分组 不清楚 否 完整 不清楚 不清楚 Ambroggio[11] 随机分组 不清楚 不清楚 完整 不存在 存在 夏剑萍[12] 随机分组 不清楚 否 完整 不清楚 不清楚 齐艳芳[13] 随机分组 不清楚 否 完整 不清楚 不清楚 戚海波[14] 随机数字法 不清楚 否 完整 不清楚 不清楚 -
13篇文章[2-14]报道了β-内酰胺类联合大环内酯类的有效事件。采用χ2检验各研究间无显著异质性（P=0.05，I2=43%），采用固定效应模型进行分析，不做分组分析和敏感性分析。Meta分析显示，β-内酰胺类药物与大环内酯类药物联合应用治疗儿童CAP的有效率高于单用β-内酰胺类药物组，与对照组比较，差异有统计学意义(RR=1.11, CI=1.07～1.15, P<0.000 01)，见图2。
图 2 两组临床有效率比较的Meta分析
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5篇文章[4, 6, 8, 13-14]报道了退热至正常体温的时间数据，Meta分析显示，试验组儿童退热至正常的时间小于对照组，试验组的退热效果好于对照组，差异有统计学意义(MD=−1.31, CI=−1.58～−1.05, P<0.000 01)，见图3。
图 3 退热正常时间的森林图
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5篇文献[4, 6, 8-9, 14]包括肺部啰音消失的时间数据，Meta分析显示，试验组比对照组患者肺部啰音消失的时间短，差异有统计学意义(MD=−1.75, CI= −2.13～−1.37, P<0.000 01),见图4。
图 4 肺部啰音消失的时间森林图
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7篇文献[3, 5-7, 11-13]报道了药物的不良反应。采用χ2检验各研究间无统计学异质性（P=0.78，I2=0%），故采用固定效应模型进行分析，无需做分组分析和敏感性分析。试验组与对照组的不良反应主要表现在胃肠道症状、皮疹，且均为轻度不良反应。试验组共451例，35例出现不良反应，不良反应发生率为7.8%；对照组共874例，33例出现不良反应，不良反应发生率为3.8%。两组间在不良反应发生率方面无统计学意义[RR = 1.37，95% CI (0.86，2.18)，P=0.19 > 0.05]。结果见图5。
图 5 两组不良反应发生率比较的Meta分析
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本研究对β-内酰胺类联合大环内酯类与单用β-内酰胺类药物治疗儿童CAP患者的临床疗效及安全性的RCT进行了Meta分析。结果显示：①在临床有效性上，两组间差异有统计学意义，β-内酰胺类联合大环内酯类优于单用β-内酰胺类药物。②试验组降低体温的时间短于对照组；③试验组消除肺部啰音的时间短于对照组；④在临床安全性方面，不良反应的发生率和程度相当，两者差异无统计学意义。
本研究与孙寅田等[15]研究结果一致，但孙寅田等研究的是整个CAP人群，本文研究的是针对儿童CAP群体。由于本研究纳入的文献较少，且质量不高，故本研究存在不少局限性：①部分研究的对照组和试验组包含的样本少，而且一篇国外的文献和其余文献样本量差距很大，可能导致检验效能不足，影响分析结果的可靠性；②纳入的13个RCT中仅有一篇提到随机化方法，其余均没有详细描述，均未对随机方案隐藏的方法进行详细描述，可能存在选择性偏倚和实施偏倚；③仅涉及一篇国外文献，且国内的RCT文章质量不高；④未检索到未发表或其他在研试验，不排除存在发表偏倚的可能性；⑤本文仅对β-内酰胺类与大环内酯类联用和单用β-内酰胺类药物进行用药安全性和有效性探究，未进行药物经济性评价。
综上所述，当前证据显示，在儿童CAP患者中，联用β-内酰胺类与大环内酯类比单用β-内酰胺类临床疗效更优，改善症状和体征优于单用β-内酰胺组，且两者安全性相近。因受纳入研究数量和质量所限，本研究结论尚需进一步开展大样本高质量RCT进行验证。
Meta-analysis on the efficacy and safety of β- lactams combined with macrolides in the treatment of community-acquired pneumonia in children
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摘要:
目的 比较β-内酰胺类联合大环内酯类与单用β-内酰胺类药物治疗儿童社区获得性肺炎（CAP）的有效性与安全性。 方法 检索PubMed、CNKI和VIP数据库，搜集使用β-内酰胺类联合大环内酯类治疗儿童CAP患儿的相关随机对照试验（RCT），检索时限为自建库至2020年7月。按照纳入与排除标准筛选文献、提取所需数据，采用RevMan 5.3软件进行Meta分析。 结果 有13篇文献纳入研究，共1 788例儿童患者。结果显示，试验组联合用药的临床有效率优于对照组[RR=1.11, CI=1.07～1.15, P<0.000 01]，发热消退至正常的时间短于对照组[MD=−1.31, CI=−1.58～−1.05, P<0.000 01]，肺部啰音消失时间短于对照组[RR=−1.75, CI= −2.13～−1.37, P<0.000 01]，不良反应发生率两组无统计学意义（P> 0.05）。 结论 当前证据表明，对于儿童CAP感染患者，β-内酰胺类联合大环内酯类的有效性优于单用β-内酰胺类药物，其不良反应两者无明显差异。因受纳入研究数量和质量所限，本研究结论尚需进一步开展大样本、高质量RCT进行验证。 Abstract:Objective To compare the efficacy and safety of β - lactams alone and the combination of β - lactams with macrolides in the treatment of community-acquired pneumonia(CAP) in children. Methods PubMed, CNKI and VIP databases were searched by computer. RCT on children with CAP treated by β-lactams and macrolides were collected. The retrieval time was from the establishment of the database to July 2020. Literatures were selected and data was extracted according to inclusion and exclusion criteria. The risk of bias was evaluated, RevMan 5.3 software was used for Meta-analysis. Results Thirteen articles with 1788 patients were included in the study. The results showed that the clinical efficacy of the combination therapy in the experimental group was better than that in the control group [RR = 1.11, CI = 1.07–1.15, P < 0.000 01]. The time for fever returning to normal was shorter in the experimental group than that in the control group [MD = −1.31, CI =−1.58– −1.05, P < 0.000 01]. The disappearance time of pulmonary rales was shorter in the experimental group than that in the control group [MD = −1.75, CI = −2.13– −1.37, P < 0.000 01], There was no statistically significant difference in adverse reactions between the two groups (P > 0.05). Conclusion The combination therapy of β - lactams and macrolides is better than β-lactams alone in children with CAP with no significant difference in adverse reactions. Limited by the quantity and quality of the included studies, the conclusions from this study need to be further verified by large samples of high-quality RCT. -
Key words:
- β-lactams /
- macrolides /
- community acquired pneumonia in children /
- Meta-analysis
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中药红花（Carthami Flos）是菊科植物红花（Carthamus tinctorius L.）的干燥花，传统本草学著作《本草纲目》记载，红花具有活血散瘀，通经止痛的功效[1]，其药材和制剂在临床上被广泛用于心脑血管疾病的预防和治疗。现代药理研究表明，其主要药效物质是以羟基红花黄色素A（hydroxysafflower yellow A，HSYA）为代表的查尔酮类化合物和以菸花苷为代表的黄酮醇类化合物，这些化合物均具有良好的心脑血管损伤保护活性[2-3]。红花药材的产量偏低，每平方千米产量仅为18.0～22.5 t[4]，其中特有的HSYA[5]、红花红色素等查尔酮类成分在不同品种间差异较大[6]。由于红花中的查尔酮类成分仅特异性地存在于花冠中[7]，加之体外组织培养再生率低[8]等原因，对其功能基因的研究工作一直进展缓慢。特别是对于HSYA等红花特有的有效成分，其生物合成相关的功能基因尚不完全清楚，合成通路也未被完全解析[9]。因此，用现代分子生物学技术手段以提高药效物质的含量，是提高红花品质，节约土地资源、降低制药成本的一条新途径。
短链脱氢酶/还原酶（short-chain dehydrogenases/reductases，SDR）在植物次生代谢物的生物合成中广泛参与各类碳-氧双键，碳-碳双键以及烯酮键的氧化还原催化反应。根据SDRs基因序列的特征结构，SDRs超家族可以被分为5个亚家族[10-14]。最早发现并且进行鉴定的两类主要短链还原酶命名为classical和extend，classical类的SDRs基因拥有长度约为250个氨基酸残基，被称为Extended类的SDRs基因在碳基末端因其含有多余的约100个氨基酸残基而得名。另外3种类型SDRs基因分别被命名为intermediate、complex和divergent。这些类型的SDRs基因基于其结合辅酶类型和结合催化位点的不同进行命名分类。此外，SDRs存在与传统类型不同的含有“rossmann-fold”保守结构域的氧化还原酶结构[15-18]。
黄酮类化合物起源于莽草酸途径和苯丙素生物合成途径，1个香豆酰辅酶A（coumaroyl CoA）和3个丙二酰辅酶A（malonyl CoA）在查尔酮合酶的作用下生成二氢查尔酮，然后经查尔酮异构酶催化为二氢黄酮，进一步在各类还原酶，聚合酶和糖基转移酶的作用下，生成终端次生代谢产物组合[19-21]。红花中所含的主要有效成分HSYA具有查尔酮式结构，本课题组前期研究认为：HSYA从前体物质到合成，中间存在必不可少的氧化还原过程。短链脱氢还原酶家族广泛参与植物体内次生代谢，这一类还原酶都带有相似的折叠结构以及催化位点，已有研究表明，其对苯丙烷代谢途径起重要作用[22-23]，但有关红花中还原酶基因相关报道较少[24]。故笔者通过对红花转录组数据库、基因表达谱数据库以及代谢组数据库进行分析，筛选在HSYA生物合成途径的关键还原酶基因，并进行功能验证，以期揭示红花次生代谢成分生物合成途径，为定向调控红花的品质提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 植物材料
云南巍山红花品系（ZHH0119），采自海军军医大学药学系温室，经海军军医大学郭美丽教授鉴定为菊科植物红花（Carthamus tinctorius L.）。红花种植条件：温度恒定25 ℃，16 h光照，8 h黑暗。采集相关花与组织后迅速存放于液氮或者−80 ℃冰箱中冷冻。
1.2 RNA提取及cDNA第一链合成
按照Trans ZOL Plant植物总RNA提取试剂盒（北京全式金公司，中国）说明书方法提取红花花冠总RNA，按照Transtart One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix逆转录试剂盒（北京全式金公司，中国）说明书方法进行cDNA第一链的合成。cDNA于−20 ℃保存。
1.3 基因筛选
基于数据库中的基因注释以“黄酮还原酶”和“黄酮类化合物生物合成”作为关键词进行检索，筛选出其中可能与HSYA生物合成相关的还原酶基因，将筛选基因不同花期时间的表达量，将其与红花代谢组数据库中同花期的芦丁（rutin）、山柰酚（kaempferol）、槲皮素（quercetin）、HSYA、柚皮素（naringenin）、山柰酚-3-O-芸香糖苷（kaempferol-3-O-rutinoside）、山柰酚-3-O-葡萄糖苷（kaempferol-3-O-gluciside）、Carthamin、芹菜素（apigenin）、黄芩素（scutellarein）、木犀草素（luteolin）、苯丙氨酸（D-phenylalanine） 12个主要成分的含量[12,25]进行皮尔森相关性分析。
1.4 全长克隆及生物信息学分析
基于红花花冠EST转录组文库，结合第三代测序技术[26-29]红花花冠全长转录组数据库筛选得到目的基因序列。在其5'端、3'端分别设计特异性引物。按照2× Phanta Flash Master Mix（Dye Plus）高保真酶（南京诺唯赞公司，中国）说明书进行PCR扩增，扩增片段经EasyPure Quick Gel Extraction Kit胶回收试剂盒（北京全式金公司，中国）说明书操作回收后，连接于pEASY-Blunt Zero Cloning Kit（北京全式金公司，中国）载体上，转化至大肠杆菌T1感受态细胞（北京全式金公司，中国）后，涂布在LBA平板上，恒温培养37 ℃过夜，挑取阳性单克隆菌落[30-31]，送至上海生工生物有限公司进行菌液测序。
用ExPASyProtParam工具（http://web.expasy.org/compute/）对目的基因的理论等电点（pI），蛋白分子量（MW）和蛋白分子式进行预测。通过Simple Molecule Architecture Research Tool工具（http://smart.embl-heidelberg.de/）对目的基因编码的蛋白质结构功能域进行分析。使用ProtScale（http://us.Expasy.org/cgi-bin/protscale.pl）以及TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）对蛋白质的亲/疏水性和跨膜区域做出预测。使用SignaIP 4.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）预测目的蛋白是否含有信号肽。使用NCBI BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对筛选出的SDRs基因进行BLAST序列比对。通过Neighbor-Joining相邻节点法构建系统发育进化树，自展分析法进行1000次重复[32-34]。使用PBILYON-GRLAND数据库预测构建蛋白质二级结构模型。蛋白三级结构由Protein Homology/analogy Recognition Engine预测。用WOLFPSORT软件（https://wolfpsort.hgc.jp/）进行亚细胞定位预测。
1.5 目的基因表达模式分析
取盛花期新鲜红花根、茎、叶、花冠4个部位的新鲜组织和花期Ⅰ（开花前3 d）、花期Ⅱ（开花当天）、花期Ⅲ（开花后1 d）、花期Ⅳ（开花后3 d）4个花期的新鲜花冠，提取总RNA，合成cDNA第一链后，在靠近5'端处对各个基因设计引物，依据Transtart Top Green qPCR super Mix（北京全式金公司，中国）试剂盒推荐体系，以Ct60s（KJ634810）作为内参标记基因，进行qRT-PCR实验，结果使用2−ΔΔCt的方法进行计算分析[35]。
1.6 植物表达载体构建及红花体内功能初步验证
根据CtSDR3的开放阅读框和植物真核表达载体pMT-39序列信息，设计无缝克隆引物。以红花cDNA做模板，使用高保真酶进行PCR反应。产物经胶回收后依无缝克隆试剂盒说明书与经NcoI酶切线性化的pMT-39载体进行重组连接。重组载体转化大肠杆菌T1感受态细胞，挑取阳性克隆菌株扩大培养后抽提质粒，提取的pMT39-CtSDR3质粒用冷冻法转至农杆菌GV3101中。LBK+Rif平板筛选阳性克隆后，取1ml OD600 = 0.8的菌液经6 000 r/min，离心3 min后用1 ml 5%蔗糖溶液重悬，加入Silwet-L 1μl，用注射器注射于红花花柱，套袋避光[35]。
在pMT-39的35 s启动子区域设计5'端特异性引物，在目的基因CtSDR3中设计3'端引物。取T2代新鲜叶cDNA第一链作为模板，2× Easy Taq PCR Mix（北京全式金，中国）推荐体系进行PCR反应，确定是否存在目的条带。采集CtSDR3阳性植株花冠以及pMT-39空载体对照植株的花冠，按照上述的qRT-PCR反应体系评价CtSDR3基因的过表达水平，使用UPLC-Q-TOF/MS 检测CtSDR3过表达组和空载体对照组的黄酮代谢物含量，选择以HSYA为代表性成分的8个黄酮类化合物作为检测对象。
1.7 原核表达载体构建及蛋白表达
根据CtSDR3的开放阅读框及蛋白表达载体pGEX-6p-1以及pET-28a序列信息，设计同源重组克隆引物[34]。以红花花冠cDNA为模板，使用高保真酶进行PCR反应。PCR产物经胶回收后依无缝克隆试剂盒说明书与经XhoI、BamHI酶切线性化的载体pGEX-6p-1以及pET-28a进行重组连接。重组载体转化大肠杆菌T1感受态细胞，挑取阳性菌株克隆扩大培养后抽提质粒，提取的重组质粒用热激法转至大肠杆菌Rosseta（DE3）（上海唯地生物，中国）中。
在20 ml LBA液体培养基中培养至OD600为0.6左右，分2份10 ml菌液各加入终浓度为0.3 mmol/L的IPTG和生理盐水。恒温培养箱中16 ℃，100 r/min继续培养16 h[35-36]。菌液离心弃上清液，用1×PBS缓冲液洗涤两次后重悬。超声破碎仪中40 kW，工作时间5 s，循环间隔时间25 s，共15个循环进行破碎[16]，裂解完成后取上清与沉淀15 μl，上样检测。
2. 结果
2.1 基因筛选
通过分析，得到contig325、contig483、contig2863共3个与HSYA具有强相关性的基因（r>0.85），见图1。
2.2 全长克隆和生物信息学分析
3个目的基因序列信息经测序验证结果如下：contig325全长共1523 bp，开放阅读框1341bp，编码446个氨基酸；contig483全长1393 bp，开放阅读框792 bp，编码263个氨基酸；contig2863全长序列1527 bp，开放阅读框1023 bp，编码340个氨基酸。PCR产物电泳结果如图2所示。
contig325基因编码446个氨基酸，命名为CtSDR1（GenBank登录号：MW792035）；Contig483基因编码263个氨基酸，命名为CtSDR2（GenBank登录号：MW792036）；Contig2863基因编码339个氨基酸，命名为CtSDR3（GenBank登录号：MW792037）。系统进化树表明CtSDR1与蓟Cirsium japonicum (QQH14901.1)同源性最高；CtSDR2与小蓬草Erigeron canadensis (XP_043636506.1)同源性最高；CtSDR3与小豆蔻Cynara cardunculus var. scolymus (KVI09206.1)同源性最高。Prot-param分析CtSDR1基因所编码的蛋白质分子式C2230H3346N606O639S7，相对分子量为49.2×103，理论等电点pI=9.61；CtSDR2基因所编码的蛋白质分子式C1289H2072N360O379S13，相对分子量为29×103，理论等电点pI=8.63；CtSDR1基因所编码的蛋白质分子式C1691H2614N442O481S9，相对分子量为37.1×103，理论等电点pI=6.80。Prot Scale分析预测CtSDR1、CtSDR2和CtSDR3蛋白为亲水性蛋白，无信号肽属非分泌蛋白。蛋白跨膜性分析显示CtSDR1、CtSDR2和CtSDR3不含有跨膜区域，为非跨膜蛋白。对CtSDR1、CtSDR2和CtSDR3蛋白二级结构的预测显示均属于不规则结构。对CtSDR1、CtSDR2、CtSDR3蛋白质三维结构预测如图3所示。系统进化树如图4所示。亚细胞定位预测显示，CtSDR1、CtSDR2、CtSDR3均可能定位于细胞质。
2.3 目的基因表达模式分析
取红花花期的Ⅳ期的红花各个部位进行分析，发现红花花冠内的CtSDR1、CtSDR2、CtSDR3基因表达量从高到低依次均为花冠>叶>茎>根。其中CtSDR1在花冠中的相对表达量约为根中的3倍、而CtSDR2、CtSDR3在花冠中的相对表达量约为根中的4倍。将4个花期的红花花冠进行qRT-PCR分析表明，CtSDR1、CtSDR2、CtSDR3花冠中表达量均随着花冠发育逐渐升高，特别是CtSDR1、CtSDR2、CtSDR3的Ⅳ期花冠对比Ⅲ期花冠的表达量分别提高了7.2倍、2.7倍、2.3倍（图5）。
2.4 CtSDR3植物表达载体构建及红花体内功能初步验证
构建真和表达载体并通过PCR鉴定后，我们从19株农杆菌浸染的子代植株中得到5株pMT39-CtSDR3阳性红花植株（图6）。通过qPCR对其CtSDR3基因转录水平进行测定，结果发现阳性红花植株中CtSDR3基因的转录水平得到显著增加，约为空白组株系的2～3倍，CtSDR3的在花冠部位的高表达也证明了研究成功获取CtSDR3过表达红花植株（图7）。通过UPLC-QTOF/MS技术测定阳性转基因红花株系组和空白对照组的目标化合物含量，包括7个红花花冠主要黄酮类化合物及苯丙烷类代谢途径上游关键物质苯丙氨酸（图8），分别为：野黄芩素（scutellarein）、Carthamin、HSYA、山柰酚（kaempferol）、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷（kaempferol-3-O-β-D-glucoside）、山柰酚-3-O-β-D-芸香糖苷（kaempferol-3-O-β-rutinoside）、芦丁（rutin）和苯丙氨酸（D-Phenylalanine）。由图8可知，与空白组相比，CtSDR3过表达株系相较于空白组野黄芩素提高了3.6%～9.8%，HSYA提高了7.1%～16.6%，以及苯丙氨酸含量提高了5.5%～15.7%，具有显著性升高。其他化合物含量则有无显著性变化趋势。通过对过表达株系与空白组的含量分析，我们认为CtSDR3基因过表达会引起红花中黄酮类物质的变化，尤其是HSYA含量升高显著。同时，苯丙氨酸代谢途径属于植物重要的次生代谢途径，过表达组引起苯丙氨酸含量的显著上升，上述指标性成分的变化也进一步说明CtSDR3对红花黄酮类化合物次生代谢途径具有一定的影响，但目前我们尚难以判断CtSDR3红花中影响次生代谢产物积累的明确途径。
图 6 真核表达载体构建及阳性鉴定电泳图注：1. CtSDR3基因开放阅读框（ORF）区扩增产物电泳图，a、b泳道均为CtSDR3基因ORF区克隆PCR产物；2. 真核表达载体pMT-39载体酶切产物电泳图，a、b泳道为CtSDR3 PCR产物，c泳道为pMT-39载体，d、e泳道为pMT-39线性化载体；3. pMT39-CtSDR3重组载体阳性转化子鉴定电泳图，a、b泳道为阳性转化子菌液PCR产物；4. pMT39-CtSDR3质粒转化农杆菌GV3101，a、c和e泳道为空白对照组，b、d和f泳道为阳性克隆菌液PCR产物；5. 红花pMT39-CtSDR3阳性转化植株鉴定PCR产物电泳图，1～19为待鉴定植株，p为pMT39-CtSDR3质粒，k为空白组，WT为野生型红花植株
图 8 阳性植株黄酮类化合物含量测定注：A.黄芩素；B.Carthamin；C.HSYA；D.山柰酚；E.山柰酚-3-O-葡萄糖苷；F.山柰酚-3-O-芸香糖苷；G.芦丁；H.苯丙氨酸；CK.空白组株系；OVX.阳性过表达株系2.5 原核表达载体构建及蛋白表达
目的片段成功扩增，将目的条带进行胶回收、纯化。CtSDR1、CtSDR1、CtSDR1构建的pGEX-6p-1、pET-28a原核表达载体均有在大肠杆菌内表达，但是CtSDR1-pGEX-6p-1、 CtSDR2-pGEX-6p-1、CtSDR3-pGEX-6p-1、CtSDR1-pET-28、CtSDR2-pET-28a、CtSDR3-pET-28a表达的目的蛋白均形成包涵体，存在于沉淀中。无法进行下一步大量纯化实验，唯有CtSDR2-pGEX-6p-1诱导表达了存在于上清液的目的蛋白，明显可以在上清液中观察到分子量约为50 000的蛋白条带（图9）。
图 9 目的片段PCR产物电泳及表达蛋白电泳分析注：A.目的片段PCR产物电泳：1～5为CtSDR1，6～10为CtSDR2，11～15为CtSDR3（其对应的PCR反应Tm值分别为67 ℃、65 ℃、63 ℃、59 ℃、57 ℃）；B.pGEX-6p-1蛋白表达电泳分析；C.pET-28a蛋白表达电泳分析3. 讨论
越来越多的红花药理学相关研究表明，红花的主要药效物质包括查尔酮类、黄酮醇类等多种黄酮类化合物，其中，查尔酮类HSYA对脑缺血具有保护作用，并且还能抗脑血栓形成以及抗氧化等。研究HSYA的生物合成分途径，对于HSYA的工业化生产具有重要意义。
本研究借助生物学分子技术、结合代谢组分析测定，筛选出3个参与HSYA生物合成途径的关键短链脱氢还原酶基因CtSDR1、CtSDR2和CtSDR3，这3个基因序列具有高度保守性，在不同器官的表达模式均呈现出花冠>叶>茎>根的特点，而且在花冠中的表达量随花冠发育逐渐升高，表明其很有可能参与红花中HSYA等主要药用成分的积累。进一步研究发现，转CtSDR3过表达T2代阳性植株花冠中CtSDR3基因的转录水平增加了2~3倍，次生代谢物HSYA的含量提高了7.1%～16.6%（P<0.05），验证了我们对CtSDR3在红花体内参与黄酮类化合物生物合成功能的推测。本研究中，体外表达CtSDR3蛋白，得到目的蛋白条带，但由于包涵体等原因，蛋白表达和纯化条件仍需要进一步摸索。下一步，我们将对可能起黄酮类生物合成途径的关键SDRs进行深入的生物学特性特别是酶结合位点的研究，为更好地阐释SDRs的生物学功能、利用分子生物育种技术培育高HSYA含量的红花新品种奠定基础。
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表 1 纳入研究的基本特征
研究项目 例数（单药组/联用组） 年龄 干预措施 疗程(t/d) 结局指标 单用β-内酰胺 β-内酰胺联合大环内酯类 朱宏斌2005[2] 39/42 4～14岁 头孢曲松钠针50～80 mg/(kg·d) 头孢曲松50～80 mg/(kg·d)
阿奇霉素5～10 mg/(kg·d)6～9 ① 李秋双2008[3] 39/41 6个月至14岁 头孢曲松钠针80 mg/(kg·d) 头孢曲松钠针80 mg/(kg·d)
阿奇霉素颗粒10 mg/(kg·d)6～9 ①② 罗亚辉2008[4] 46/46 6个月至7岁 头孢曲松钠针50～80 mg/(kg·d) 头孢曲松50～80 mg/(kg·d)
阿奇霉素10 mg/(kg·d)5～7 ①③④ 高永强2008[5] 63/67 3～12岁 头孢曲松钠60～80 mg/(kg·d) 头孢曲松钠60～80 mg/(kg·d)
阿奇霉素10 mg/(kg·d)5～10 ①② 冯光毅2008[6] 45/45 5个月至14岁 头孢噻肟钠50～100 mg/(kg·d) 头孢噻肟50～100 mg/(kg·d)
阿奇霉素10 mg/(kg·d)3～5 ①②③④ 黄芪2011[7] 69/69 3个月至14岁 头孢曲松钠80 mg/(kg·d) 头孢曲松钠80 mg/(kg·d)
阿奇霉素10 mg/(kg·d)5～10 ①② 刘卫东2013[8] 34/34 2～5岁 头孢他啶50～100 mg/(kg·d) 头孢他啶50～100 mg/(kg·d)
阿奇霉素10～15 mg/（kg·d）5～10 ①③④ 陈荣2014[9] 40/40 1～13岁 头孢他啶50～100 mg/(kg·d) 头孢他啶50～100 mg/(kg·d)
阿奇霉素10 mg/(kg·d)7～14 ①④ 范小萍2015[10] 34/34 2～13岁 头孢菌素80 mg/(kg·d) 头孢菌素80 mg/(kg·d)
阿奇霉素8～10 mg/(kg·d)14 ① Ambroggio 2015[11] 570/147 1～18岁 β-内酰胺 β-内酰胺联合大环内酯 14 ①② 夏剑萍2016[12] 54/54 6个月至7岁 头孢曲松钠1.0 g/d 头孢曲松钠1.0 g/d
阿奇霉素5～10 mg/(kg·d)5 ①② 齐艳芳2017[13] 34/34 2～13岁 第三代头孢菌素 第三代头孢菌素
阿奇霉素8～10 mg/(kg·d)7 ①②③ 戚海波2018[14] 34/34 未阐述范围 头孢西丁13.3～26.7 mg/kg，
q6或20～40 mg/kg，q8头孢西丁13.3～26.7 mg/kg，q6或
20～40 mg/kg，q8
阿奇霉素干混悬液10 mg/(kg·d)5 ①③④ 注：①表示治愈率；②表示发热消退时间；③表示肺部啰音消失时间；④表示不良反应发生率。 
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表 2 纳入研究的偏倚风险评价
研究项目 随机方法 分配隐藏 盲法 结果数据完整性 选择性报告 其他偏倚 朱宏斌[2] 随机分组 不清楚 否 完整 不清楚 不清楚 李秋双[3] 随机分组 不清楚 否 完整 不清楚 不清楚 罗亚辉[4] 随机分组 不清楚 否 完整 不清楚 不清楚 高永强[5] 随机分组 不清楚 否 完整 不清楚 不清楚 冯光毅[6] 随机分组 不清楚 否 完整 不清楚 不清楚 黄芪[7] 随机分组 不清楚 否 完整 不清楚 不清楚 刘卫东[8] 随机分组 不清楚 否 完整 不清楚 不清楚 陈荣[9] 随机分组 不清楚 否 完整 不清楚 不清楚 范小萍[10] 随机分组 不清楚 否 完整 不清楚 不清楚 Ambroggio[11] 随机分组 不清楚 不清楚 完整 不存在 存在 夏剑萍[12] 随机分组 不清楚 否 完整 不清楚 不清楚 齐艳芳[13] 随机分组 不清楚 否 完整 不清楚 不清楚 戚海波[14] 随机数字法 不清楚 否 完整 不清楚 不清楚
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