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炎症性肠病（IBD）是一种慢性、进行性的自身免疫性疾病，包括溃疡性结肠炎（UC）、克罗恩病（CD）及症状不典型的IBD。IBD 在经济发达的西方国家发病率约为0.5%，近几年来亚洲国家也在迅速增加。心房颤动（房颤）是一种以心房电活动紊乱为特征的心房快速性室上性心律失常，严重影响患者生活质量，显著增加死亡、卒中及心力衰竭等风险[1]。IBD可能通过炎症与自主神经失调触发房颤，增加房颤风险；相反，房颤抗栓治疗可能影响IBD黏膜愈合、甚至出血[2]。IBD合并房颤的长期用药管理对于减少不良事件的发生及患者后期的康复具有重要意义，本文就1例IBD合并房颤患者的药物治疗方案进行分析，旨在为该类患者联合用药提供合理的依据。
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患者，女性，46岁，身高163 cm，体重78.2 kg，BMI 29.43 kg/m2。2023-04-13外院肠镜检查：回肠末端10 cm内见多处小溃疡；病理：回肠末端小肠黏膜组织、间质淋巴组织增生，伴挤压伤。2023-12-12复查肠镜：回肠末端多发溃疡，大者0.5*0.8 cm，表面白苔，对照8个月前明显增多；病理：回肠末端黏膜慢性炎伴固有层淋巴组织增生活跃及糜烂。有腹泻症状，每日3~4次，予美沙拉嗪缓释颗粒治疗，未遵医嘱服用。2024-01-05至我院就诊，小肠胶囊内镜：小肠多发溃疡。给予美沙拉嗪缓释片1g bid，无不适。既往史：自诉2020年诊断阵发性房颤、腺肌病，规律服用盐酸胺碘酮片0.1g qd，达比加群酯胶囊150 mg bid，后更换为甲苯磺酸艾多沙班片60 mg qd；地诺孕素片2 mg qd。家族史：父亲患有房颤。
2024-01-14以“小肠多发溃疡”收入院，入院后给予甲苯磺酸艾多沙班片30mg qd房颤抗栓治疗，盐酸胺碘酮片0.1g qd房颤节律和心室率控制治疗，地诺孕素片2mg qd腺肌病治疗。入院后完善相关检查，粪便钙卫蛋白206.9 μg/g；小肠增强三维重建：小肠多发局限性管壁增厚，炎症性肠病可能性大；病理会诊：回肠末段黏膜慢性炎伴活动，小肠绒毛水肿，固有层全层可见较多淋巴细胞、浆细胞浸润。给予肠内营养粉剂（TP）、愈肠颗粒（自制）20g bid IBD诱导缓解治疗。
入院后第6天，常规心电图：正常范围心电图，动态心电图：窦性心律、房性早搏，心脏超声：心脏各房室大小正常、左室收缩功能正常，经多学科综合治疗协作组（MDT）再次评估房颤卒中风险（CHA2DS2-VASc-60）为1分，停用甲苯磺酸艾多沙班片。甲状腺功能检查：促甲状腺素受体抗体4.00 IU/L、甲状腺素184.50 mol/L 、抗甲状腺球蛋白抗体577.0 IU/mL、甲状腺过氧化物酶抗体365.0 IU/mL、甲状腺球蛋白1.23 ng/mL、游离T3 7.96 pmol/L 、游离T4 34.63 pmo1/L、促甲状腺激素<0.005 mIU/L，甲亢且炎症明显，停用盐酸胺碘酮片，更换为索他洛尔片40 mg bid。入院后第7天出院，带肠内营养粉剂（TP）、愈肠颗粒（自制）20g bid及美沙拉嗪缓释片1g tid 诱导缓解治疗。
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该病例为典型的IBD合并房颤患者，最近有多项研究表明，IBD患者房颤发作的风险显著增加，即使在确诊IBD 25年后，风险依然存在[1，3-6]。一篇纳入3项研究的荟萃分析认为IBD患者房颤风险增加了2.2倍，UC和CD患者均增加了房颤风险[3]。来自英国的一项大型队列研究发现，女性CD患者房颤的发病率较高，而UC仅在男性患者中较高。这可能与雌激素受体介导IBD发病机制有关，通常男性患结肠炎的比例高于女性，而女性的回肠炎比例更高[4]。Kristensen等[5]发现在IBD活动期，房颤风险增加了2倍，卒中风险增加了1.5倍，而在缓解期并没有。Choi等[6]发现接受免疫抑制剂（HR:1.46 ，95% CI: 1.31～1.89）、全身皮质类固醇（HR:1.37 ，95% CI: 1.10～1.71）或生物制剂（HR:2.38，95% CI: 1.51～3.75）的患者患房颤的风险更高。IBD患者房颤发病率增加，可能是该类患者动脉血栓事件风险更高的一个原因[7]。IBD患者房颤风险增加的机制还不清楚，可能是IBD的炎症改变了心房电生理和促进心房结构重组，从而增加了房颤的易感性。Can等[8]对79例IBD患者进行的前瞻性研究发现，IBD组心房传导时间被延长，存在严重心房心律失常的潜在风险。
另一方面，消化道出血是房颤抗凝治疗最常见的并发症之一，这可能不仅导致消化性溃疡，且让IBD患者溃疡难以愈合，进而延长IBD的治疗时间。Rahman等[9]回顾性研究发现相比单独诊断IBD组（650 264例），合并房颤患者（64 599例）的下消化道出血（OR=1.09， 95% CI: 1.04~1.1）和出血需要输血（OR=1.2， 95% CI: 1.17~1.37）的比例更高。目前还未发现有房颤长期抗栓治疗直接影响IBD患者黏膜愈合的相关研究，这是未来需要关注的问题之一。
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患者3年前诊断阵发性房颤，规律服用达比加群，后更换为艾多沙班。9个月前体检发现回肠末端多发小溃疡，我院胶囊镜检查示：回肠末端黏膜呈多发凹陷性病变、上覆薄苔、周边充血水肿、伴多发片状糜烂灶，虽病理会诊考虑IBD可能性大，但UC或CD黏膜病变特征不典型，不排除长期规律口服NOAC导致回肠末端多发溃疡的可能性。
不同类型IBD消化道黏膜损伤的特征不一样，UC主要累及大肠黏膜与黏膜下层，呈弥漫性连续性分布，由直肠黏膜向近端结肠蔓延，呈“倒灌性”改变；CD可累及肠壁全层，主要位于回肠末端及临近结肠，可累及全消化道，呈节段性病变、纵行溃疡及“卵石样”改变。除IBD疾病本身外，非甾体抗炎药、抗栓药等常见口服药亦能导致消化性溃疡[10]。口服抗栓药物分为抗血小板药物和抗凝药物，口服抗血小板药物包括环氧化酶抑制剂阿司匹林和P2Y12受体拮抗剂格雷类，阿司匹林主要通过抑制环氧化酶介导的前列腺素合成及局部刺激作用导致胃肠黏膜损伤，引起黏膜糜烂、溃疡和出血等并发症，常与剂量相关[11]；P2Y12 受体拮抗剂可抑制血小板衍生生长因子和血小板源性血管内皮生长因子的释放，阻碍新生血管生成，延缓黏膜修复并可加重消化道黏膜损伤。
口服抗凝药物（OAC）分为维生素K拮抗剂华法林及非维生素K拮抗剂口服抗凝药（NOAC），NOAC主要包括Ⅱa因子抑制剂达比加群和Ⅹa因子抑制剂沙班类。OAC主要通过局部和全身作用导致消化道损伤或易损部位的出血，Benamouzig等[12]总结了服用NOAC上消化道出血的主要原因是胃十二指肠溃疡，而下消化道出血主要因有憩室、血管发育不良和内痔等。华法林消化道出血风险与抑制维生素K依赖性凝血因子产生的抗凝作用相关，而NOAC引起的消化道损伤与小肠黏膜通透性糖蛋白（P-gp）的调节相关，P-gp调节消化道内NOAC的浓度，联合应用影响P-gp的药物可增加出血风险[13]。
不同Ⅹa因子抑制剂的消化道出血风险存在差异，利伐沙班2 mg qd 高于华法林，阿哌沙班5 mg bid与华法林相似。达比加群和艾多沙班消化道出血风险与剂量有关，达比加群150 mg bid高于华法林，而110 mg bid则相似；艾多沙班 60 mg qd高于华法林，而30 mg qd则较低[14]。
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IBD治疗原则是诱导并维持缓解，药物治疗包括氨基水杨酸类制剂、激素、免疫抑制剂及生物制剂，对于轻度（初治）活动性IBD，建议口服5-氨基水杨酸2 ~ 4 g/d诱导缓解，疗效与剂量成正比，顿服与分次服用疗效相同[15-16]。且未发现有氨基水杨酸类制剂导致房颤风险增加的报道。全或部分肠内营养治疗不仅能有效改善IBD患者的营养不良和降低营养风险，还可以有效或加速诱导活动期缓解，疗程通常为6~8周[17]。愈肠颗粒是我院自制中成药制剂，具有健脾益气、清热燥湿、疏肝止泻之功效，对IBD具有较好的疗效。部分患者长期服用，未见明显毒副反应发生，治疗效果明显，具有较好的安全性[18]。住院时及出院后联合使用肠内营养粉剂（TP）、愈肠颗粒（自制）20g bid及美沙拉嗪缓释片1g tid诱导IBD缓解治疗方案合理。
房颤治疗包括卒中预防、节律控制及心室率控制，CHA2DS2-VASc-60评分是目前应用最广泛的卒中风险评估工具，卒中预防抗栓治疗应首选NOAC，品种选择应考虑潜在的药物相互作用及不良反应等。艾多沙班抗栓标准剂量60 mg qd、低剂量30 mg qd，低剂量艾多沙班在消化道出血不良事件方面低于达比加群[7]，患者院外将达比加群酯胶囊150mg bid更换为甲苯磺酸艾多沙班片60mg qd合理。盐酸胺碘酮片属于中度P-gp抑制剂，合用控制节律治疗后能提高艾多沙班40%的抗凝作用[19]，患者入院前服用艾多沙班片60mg qd剂量偏高，临床药师建议调整至低剂量30 mg qd。住院期间MDT团队再次评估CHA2DS2-VASc-60为1分，评分为0分的男性或1分的女性患者不应以预防卒中为目的使用NOAC[14]，临床药师建议暂时停用艾多沙班，一方面排除长期服用NOAC导致小肠多发溃疡的可能性，另一方面可消除对IBD溃疡黏膜愈合的潜在影响，但需关注IBD疾病本身及药物治疗后增加的房颤发作及卒中风险。
房颤长期节律和心室率控制常选用抗心律失常药（AAD），AAD 选择应强调安全性第一、有效性第二的原则。胺碘酮具有多通道阻滞作用，具有控制节律和心室率双重作用，在所有AAD中最为有效，但副作用也最多，如严重的肺、甲状腺及肝毒性等，一般推荐胺碘酮应用于其他 AAD无效或有禁忌证情况下的节律控制[14]。患者甲功检查示甲亢且炎症明显，根据患病先后时间及服药长短，考虑胺碘酮的甲状腺毒副作用可能性大，建议更换胺碘酮，停用胺碘酮3~4个月后甲功可恢复。患者从2020年诊断阵发性房颤开始，一直服用盐酸胺碘酮片，品种选择不适宜，可先考虑毒副作用较小的AAD。患者目前心功能正常，可选ADD种类较多。索他洛尔是选择性钾通道阻滞剂，兼具β受体阻滞剂作用，低剂量时主要阻滞β受体，较高剂量时可发挥Ⅲ类AAD效应，且未见有抑制P-gp的作用。一般推荐索他洛尔用于房颤患者控制节律剂量为80~160 mg/d bid，从小剂量开始，逐渐加量，合并室性心动过速可用至160~480 mg/d[14]。索他洛尔同样具有节律和心室率双重控制作用，一药两用，可提高患者用药依从性，临床药师建议把盐酸胺碘酮片换成索他洛尔片40mg bid，但需密切监测 QT 间期、血清钾水平及CrCl 等。
该患者IBD合并房颤，入院前房颤予以艾多沙班60 mg qd抗栓治疗、胺碘酮0.1 g qd 进行节律和心室率控制，考虑胺碘酮中度P-gp抑制作用，入院后立即调整艾多沙班为低剂量30 mg qd。完善心功能等检查，MDT团队再次评估房颤卒中为低风险，停用艾多沙班。甲功提示甲亢，考虑胺碘酮的毒副作用，更换为同样具有节律和心室率双重控制作用的索他洛尔40 mg bid。联合使用肠内营养粉剂（TP）、愈肠颗粒（自制）20 g bid及美沙拉嗪缓释片1 g tid诱导IBD缓解治疗。出院1个月后电话随访，大便黄色成形，每日1~2次，偶心悸气短，房颤症状对日常生活基本不受影响，提示经临床药师药物重整后的治疗方案对IBD治疗有效，且对房颤影响有限。若该患者卒中风险较高，不能停止抗栓治疗，应使用对消化道损伤最小的一线抗栓药物及剂量，如艾多沙班30 mg qd，必要时仍可再降低剂量；房颤长期节律和心室率控制药物除了考虑安全性与双重控制作用外，还应选择对P-gp抑制作用弱的品种。患者予以美沙拉嗪诱导IBD缓解有效，若出现不能控制炎症的情况，需更改为免疫抑制剂、激素或生物制剂治疗，但有报道这些药物能增加房颤发作的风险[6]，使用时应予以评估，目前尚无相关研究。患者出院后应密切关注腹痛腹泻及房颤症状，建议6~12个月复查肠镜观察黏膜愈合情况，定期监测心电图及心脏超声评估房颤风险。
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IBD与房颤之间存在双向关系，一方面IBD疾病本身及药物治疗可能增加房颤发作的风险，另一方面房颤抗栓治疗可能延长IBD黏膜愈合的时间、甚至导致出血，但确切的病理生理机制与临床影响仍不清楚。IBD与房颤两种疾病均需长期用药，甚至终身管理。需定期评估房颤卒中与出血风险、监测IBD炎症指标恢复与黏膜愈合情况，在房颤抗栓治疗与IBD抗炎治疗之间寻找一个平衡点，由消化科、心内科及相关专业临床药师组成的MDT团队在发现、确定和保持这个平衡点方面可以发挥重要的作用。
Pharmaceutical care of a patient with inflammatory bowel disease with atrial fibrillation
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摘要:
目的 探讨炎症性肠病合并心房颤动患者的疾病特征与药学监护要点。 方法 临床药师通过参与1例炎症性肠病合并心房颤动患者的药学实践过程，查阅相关资料，提出药学建议，协助治疗方案的优化。 结果 治疗方案经重整及药学监护后，患者病情趋于好转。 结论 炎症性肠病与房颤治疗相互影响复杂，通过慢病用药管理与药学监护，可以促进临床安全合理用药。 Abstract:Objective To investigate the disease characteristics and key points of pharmaceutical care in patients with inflammatory bowel disease and atrial fibrillation. Methods Clinical pharmacist participated in the pharmaceutical practice process of a patient with inflammatory bowel disease and atrial fibrillation. Relevant data were consulted, pharmaceutical suggestions were put forward, and the treatment plan were optimized. Results After the reorganization of the treatment plan and pharmaceutical care, the patient's treatment effect had been improved. Conclusion The interaction of treatment between inflammatory bowel disease and atrial fibrillation is complex. Through chronic disease medication management and pharmaceutical care, safe and rational drug use could be promoted. -
药品非无菌产品微生物限度检查中微生物计数法（后简称计数法）是药品检验的重要组成部分，是对能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的定量计数[1]。计数法检验流程概括为：取供试品根据其理化和生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。倍比稀释，选取1～3个合适的稀释级（根据样品特性和污染情况）用平皿法、薄膜过滤法或MPN法做供试品检查。供试样品的制备过程中使样品充分溶解或分散，并有效降低或消除药品本身的抑菌性在检验过程中尤为重要，是得到准确的微生物计数检验结论的关键点。过去的研究主要集中在对计数法检验有影响的菌株选择和保存、培养基质量控制、操作环境控制及被检样品方法适用性研究，而对药品的前处理（即供试液的制备方法）尤其是中成药的前处理法研究甚少。据佘凡等报道[2-7]，影响微生物限度检验误差因素分析中因前处理所产生误差在各因素中占比重较高。李超美等[8]曾组织同省9个药检所对同厂家、同批号中成药“香莲丸”做微生物限度验证，发现验证方法并不完全相同，以致验证结果不同，影响实验结果一致性评价。分析其主要原因是选择了不同的前处理方法，样品经前处理后是否完全溶解或分散，供试液中颗粒大小和沉降速度，取供试液时是振摇混匀还是取上清液、样品抑菌性是否被中和等因素直接影响微生物的回收率，致使各实验室有的采用常规法，有的采用培养基稀释法，有的采用薄膜过滤法才能使回收率达到药典规定的要求。
鉴于中成药微生物限度计数法前处理工作对提高中成药的检验质量影响较大，本文就中成药前处理关键影响因素和优化方法进行了系统的分析和综述。
1. 影响计数法前处理的因素分析
1.1 中成药溶解性分类
《中国药典》2020版与欧美药典[1,9,10]在样品供试液制备时（前处理）都根据药品的理化特性和生物学特性将药品分类。一般口服制剂除肠溶、结肠溶和膜剂供试品外基本分为三类：水溶性供试品、水不溶性非油脂类供试品、油脂类供试品。中成药配方复杂，成分多样，制法较西药特殊。如片剂中牛黄解毒片是由人工牛黄、雄黄、石膏、大黄、黄芩、桔梗、冰片、甘草8味药组成，制法是：以上八味，雄黄水飞成极细粉；大黄粉碎成细粉；人工牛黄、冰片研细；其余黄芩等四味加水煎煮二次，合并滤液浓缩成稠膏或干燥成干浸膏，加入大黄、雄黄粉末，制粒，干燥，再加入人工牛黄、冰片粉末，混匀，压制成片[11]。丸剂中防风通圣丸由防风、大黄、芒硝、栀子、滑石、白术、白芍、当归等17味中药组方。制法是以上十七味，滑石粉碎成极细粉；其余防风等十六味粉碎成细粉，过筛，混匀，用水制丸，干燥，用滑石粉包衣， 打光，干燥，即得。或以上十七味，粉碎成细粉，过筛，混匀，用水制丸，干燥，即得[11]。从以上两个中成药的配方、制法可以看出中成药是药材提取物与原粉的混合，雄黄、石膏是矿物质，冰片是植物提取物结晶，都不溶于水，其他生药原粉也不能完全溶于水。所以较难将其简单分成水溶性、不溶性非油脂类供试品、油脂类供试品。这是影响各实验室选择前处理方法制备样品最直接的因素。
1.2 缓冲液pH值
《中国药典》2020版和欧洲药典的缓冲液pH值范围基本相同[1,10]，为pH7.0、pH7.2、pH6.8、pH7.6，供试液制备时如需要，应调节pH值至6~8。中成药组方成分和制造工艺多样，决定产品的pH值范围较广，所需缓冲能力较大，缓冲范围涵盖pH值6~8的缓冲液。如麻仁丸配方为火麻仁、枳实（炒）、苦杏仁、大黄、炒白芍、姜厚朴。其制法为以上六味，除火麻仁、苦杏仁外，其余大黄等粉碎成细粉，再与火麻仁、苦杏仁掺研成细粉，过筛，混匀。粉末用炼蜜加适量的水制丸，干燥，制成水蜜丸；或加炼蜜制成小蜜丸或大蜜丸，即得[11]。这一制作过程没有对成品的酸碱度有特殊要求。又如一清胶囊的处方为黄连、大黄、黄芩。其制法是以上三味，分别加水煎煮两次，合并煎液，滤过，滤液分别减压浓缩，喷雾干燥，制得黄芩浸膏粉及大黄和黄连的混合浸膏粉。两种浸膏粉分别制颗粒，干燥，粉碎，加入淀粉、滑石粉和硬脂酸镁适量，混匀，装入胶囊，制粒，即得。整个过程没有测定酸碱度[11]。再如乙肝益气解郁颗粒配方为柴胡（醋炙）、白芍、枳壳、橘叶、黄芪、丹参、党参、茯苓、桂枝、瓜蒌、刺五加、黄连、法半夏、山楂、决明子、五味子。其制法是以上16味，白芍、茯苓、法半夏分别粉碎，过筛，依次取细粉混匀，备用；剩余的粗粉备用。五味子粉碎后用80％乙醇回流提取两次，合并提取液，回收乙醇，备用。其余柴胡（醋炙）等12味及白芍等三味的粗粉加水煎煮两次，合并煎液，静置 12小时，取上清液，与上述五味子提取液合并，浓缩，加入上述细粉及适量糖粉混匀，制成颗粒[11]。从以上丸剂、胶囊剂、颗粒剂的举例中可以看出中成药的pH范围会比较宽泛，将被检样品的前处理液加入胰酪大豆胨琼脂做菌落总数的培养，或许会改变培养基的酸碱度进而影响菌落的生长繁殖，从而影响菌落计数结果的准确性。根据细菌适应酸碱度不同可将微生物分成：中性微生物、嗜酸性微生物、耐酸性生物、嗜碱性微生物、耐碱性微生物等。培养基酸碱环境的改变，必然影响微生物的生长繁殖。另有研究表明，药品的分散度也会影响供试液的pH值，进而影响微生物的生长造成实验结果的差异[12]。
1.3 非离子表面活性剂的添加浓度
增加被检样品的分散度和溶解度有利于样品中的微生物更均匀的分布于处理液中。取样均匀性的提升有助于提高微生物的检出率。吐温80为非离子型表面活性剂，亲水性强，是优良的O/W型乳化剂，对植物油、矿物油、动物油脂等均有良好的乳化作用。根据《中国药典》2020版四部通则1105，供试液前处理添加吐温80浓度为0.1%，如水不溶性非油脂类分散力较差的供试品，可在稀释液中加入无菌0.1%的聚山梨酯80。油脂类供试品可加入无菌十四烷酸异丙酯，或与最少量并能使供试品乳化的无菌聚山梨酯80或其他无抑菌性的无菌表面活性剂充分混匀[1]。表面活性剂浓度过高会使细菌细胞膜中的脂类溶解而造成菌体死亡[13-16]。因此合适浓度的表面活性剂的使用尤为重要。王康[17]等增加吐温 80比例制备中药提取物穿心莲内酯固体分散体发现其能有效地提高穿心莲内酯的溶出速率。高飞[18]等在化妆品检测使用含1 g/L卵磷脂和7 g/L的吐温80生理盐水做缓冲液，可中和化妆品中防腐剂对绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用。张华光[19]等在缓冲液中添加3%吐温80和0.3%卵磷脂中和抑菌性较强的药品。中成药原料来源广泛，有动植物矿物等，所以表面活性剂对于中成药在计数法前处理中的最适用量仍有待研究。
1.4 中和剂或灭活方法
中成药种类多且成分复杂，难以归入药典列出的干扰物种类中。许多中成药对临床耐药细菌具有较好的抑制作用，临床上也常用抗菌中成药和抗生素联合应用以降低细菌的耐药性。深入研究中药抑菌作用和机制，大致可分为直接和间接抑制作用。直接抑制作用包括消除或逆转细菌耐药质粒、抑制细菌β-内酰胺酶活性和外排泵、改变细胞膜的通透性与消除生物膜等。间接抑制作用主要是：中药通过提高机体免疫力对抗耐药性细菌。据研究[20-22]，许多中药有抑菌作用，如黄芩、黄连、连翘、五倍子、五味子、乌梅、金银花等57种，中成药包括黄连上清片、穿心莲内酯胶丸、妇必舒胶囊等。有些中药的抗菌作用机制不是单一的，而是能够在多个方面发挥作用，所以药典常见中和剂或灭活方法（详见表1）是否能满足、何种浓度能满足有抑菌成分中成药的计数法检验要求尚待研究。
表 1 《中国药典》2020版常见的中和剂或灭活方法[1]干扰物 可选用的中和剂或灭活方法 戊二醛、汞制剂 亚硫酸氢钠 酚类、乙醇、醛类、吸附物 稀释法 醛类 甘氨酸 季铵化合物、对羟基苯甲酸、
双胍类化合物卵磷脂 季铵化合物、碘、对羟基苯甲酸 聚山梨酯 水银 巯基醋酸盐 水银、汞化物、醛类 硫代硫酸盐 EDTA、唆喏酮类抗生素 镁或钙离子 磺胺类 对氨基苯甲酸 β-内酰胺类抗生素 β-内酰胺酶 2. 优化中成药前处理的方法
陶明[23-24]等发现影响抑菌干混悬剂微生物限度方法适用性的因素主要是样品原料的分散性和中和剂的有效单位。对药品进行微生物限度计数法前处理的目的是：在生物样本安全的前提下通过前处理使被检样品成为均匀的溶液或悬浊液，以保证取样的均匀性。这样吸取供试液时，既可保证液体分散均匀，又可避免只吸取上清液或沉淀物，还可防止被检样品溶散不均造成制备液pH不同而形成结果偏离[4,7,25]。优化中成药前处理的方法有利于最终选取合适的检验方法（常规、稀释、中和、薄膜过滤法）消除样品的抑菌性，取得科学、准确的实验结果。
2.1 减小被检样品的粒度
中成药大致分为口服和外用两种使用方式，口服剂型大多为片剂、胶囊、丸剂等。无论中成药成分多复杂，减小被检样品的粒度从而增加样品的溶解度和分散度都是较佳选择。最直接减小被检样品的粒度方法就是提高匀浆效率。《中国药典》2020版对前处理匀浆的转速没有特别规定，而《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》（GB4789.2-2020）中规定检测样品的匀浆转数常规为8 000～10 000 r/min，持续1～2 min[26-27]。有研究[28]分别用匀浆仪和研磨法对9种丸剂和3种片剂进行前处理，从各组实验所得的细菌数平均值来看，匀浆法测定的细菌数大于研磨法，并呈显著性差异，如槐角丸、益肝丸、通窍鼻炎片在研磨时菌落数为4.0×102、2.7×103、2.9×102CFU/g，经均质器细匀后菌落数为8.7×102、3.4×104、6.4×102CFU/g，说明样品均质的细腻均匀可提高细菌检出率。庞云娟等[29]报道，供试液制备过程中被检样品分散度和溶解度不足是造成实验结果偏离的原因之一。以上研究表明适当提高匀浆效率可增加样品的分散度和溶解度，进而提高细菌检出率以达到提升检验准确度的目的。均质器转速和时间可参考食品菌落总数检测标准。
2.2 选择pH7.2的磷酸盐缓冲溶液体系
磷酸盐缓冲溶液可以通过H2PO4−和HPO42-在不同的pH下形成缓冲体系。当H2PO4−和HPO42-的浓度比为1∶1时，此时溶液的pH值为6.86，也被称为磷酸盐缓冲液的电中性点。在电中性点的pH值下，磷酸盐缓冲溶液的缓冲能力最弱。随着pH值的升高，H2PO4−的浓度逐渐降低，溶液的缓冲能力逐渐增强。当pH升到7.21时，H2PO4−和HPO42-的浓度比为1∶2，此时溶液的缓冲能力最强，称为磷酸盐缓冲溶液的最大缓冲范围。随着pH值的继续上升，HPO42-的浓度逐渐升高，H2PO4−的浓度逐渐降低，溶液的缓冲能力逐渐减弱。磷酸盐缓冲溶液的缓冲范围在pH值5.8~8.0之间，这个范围是根据H2PO4−和HPO42-的浓度比和pH值的关系所确定的，并且在pH值7.21左右具有最大的缓冲能力[30]，所以pH7.2的磷酸盐缓冲溶液最适合中成药的前处理。
2.3 选取合适的表面活性剂浓度
许多中成药含抑菌成分，通过添加表面活性剂吐温80，可提高非水溶性成份在稀释剂中溶解度和分散度。研究[31,32]表明，添加表面活性剂效果优于调节pH值，因当药品含有抑菌性成分时，降低pH值会增加药品的抑菌性。为方便分析中成药的抑菌性，我们将中成药分为以下几类：①清热解毒类中成药常含有板蓝根、黄芩、金银花等有较强抑菌能力；②止咳平喘类的中成药若含有麻黄、川贝母、薄荷脑等成分的药物的抑菌性也比较强；③胃肠道类中成药如含有广藿香、紫苏叶等成分的药物也有较强的抑菌作用；④抗感冒类药大多含有较高金银花、甘草、柴胡等中药抑菌性较强；⑤妇科内服类中成药比外用药抑菌性弱；⑥镇痛抗炎抗风外用中成药如含有黄柏对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌有抑制作用[33]。欧洲药典11.0对有抑菌作用药品选用的缓冲液其中含3%聚山梨脂80和0.3%蛋黄卵磷脂[10]，既能增加被测样品的分散度和溶解度，又能中和药品本身的抑菌成分同时又可增加样品中细菌的检出率。[19]
2.4 选取合适的稀释液
既满足方法适应性菌株的回收率要求又提高样品溶解度和悬浊液的稳定性，是优化前处理过程的关键。稀释液在前处理的过程中起着重要的作用，一方面需要最大程度提供各类菌株的生存条件，另一方面要易于药品的溶解和分散。《中国药典》2015年版药品微生物限度检查方法实例中保济丸在微生物限度计数检验选用了两种稀释液，先用胰酪大豆液体培养基将被检样品制成1∶100的供试液，再取上清液薄膜过滤，并用含0.1%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜[34]。前者可提高菌株回收率，后者可增加溶解和分散。另外有研究[35]表明，参考《中国药典》使用标准菌株进行化妆品微生物指标检验的供试液制备，研究不同的前处理方法的适用性结果显示：使用含中和剂的大豆酪蛋白葡萄糖卵磷酯吐温80（SCDLP）液体培养基、改良卵磷脂肉汤、戴伊恩格利中和肉汤（D/E中和肉汤）制备供试液，加菌计数回收试验结果及控制菌（耐热大肠菌群、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌）阳性检出率，均优于按照《化妆品安全技术规范》（2015年版）用生理盐水制备供试液，其中采用 D/E 中和肉汤进行样品制备，对样品中防腐剂的中和效果最好。
3. 小结与展望
《中国药典》2020年版要求生产厂家进行一厂、一品、一规的微生物限度标准制订和验证实验，验证报告要完整、可靠。作为药品检验机构由于检验周期所限，实际抽检工作中不可能像生产厂家去一一验证。因此，分析研究中成药这一大类非无菌药品计数法检验的特点，优化检验过程，特别是样品前处理是检验中成药的重要环节。中成药成分多为动植物和矿物，使计数法前处理时难以简单用溶解度分类，往往同一种药品各实验室选择不同检验方法，导致检验结果差异加大。且中药炮制工艺多样使中成药的酸碱度范围宽泛，如果药品前处理时稀释液的缓冲能力不强，会影响后续培养基的酸碱度，进而影响检验结果的准确性。有些中成药本身具有抑菌性，若不中和或去除会造成假阴性结果。
以上因素直接影响中成药计数法的检出率和准确度，寻找一种分散度和溶解度好，缓冲力强且能中和药品抑菌性，又对受损细菌有修复力的缓冲液显得尤为迫切。本文从影响中成药计数法检验因素入手，层层分析寻找解决方案。综合中国药典和美国药典以及相关文献内容归纳出解决的途径：首先在稀释液中加入适宜的非离子表面活性剂吐温80和卵磷脂（3%吐温80和0.3%卵磷脂）等中和剂，可以起到增加药品分散度和溶解度并中和部分抑菌性的作用；其次通过增加适宜浓度的磷酸盐缓冲离子对（Na2HPO4和KH2PO4），使缓冲液达到最大缓冲能力，用以降低中成药因偏酸或偏碱对培养基的影响；再则增加缓冲液中生长因子和维生素以利于受损细菌的快速恢复。最后选择合适的匀浆速度和时间，在适宜剪切力的作用下使缓冲液和被检样品充分混和均匀。
随着课题研究进一步深入，最终可创新出一款可加强分散度和溶解度、提高取样均匀性、降低中成药抑菌性、加强缓冲能力、加强短时间修复受损细菌能力的改良缓冲液。以提高中成药计数法检验结果的准确性、重复性及工作效率，解决中成药计数法检验中遇到的诸多问题。为监测中成药计数法这类非无菌制剂的安全性和有效性提供现实的应用价值。
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