下载:
下载:
-
放线菌是天然药用活性分子的重要源头[1]。然而，近年陆生放线菌来源化合物的重复发现率日趋增高，海洋来源放线菌因其特殊的生长环境和丰富的次生代谢产物越发引起关注[1-2]。
海绵作为代表性的海洋底栖共生生物体，是产生功能分子的重要源头[3]。而越来越多的证据表明共附生微生物是海绵化学多样性的重要来源[4-6]。因此，开展海绵共附生微生物化学成分的研究，寻找新颖的、具有活性功能的小分子化合物显得十分必要。
课题组从海绵共附生放线菌Streptomyces sp. LHW2432发酵物中发现了2个生物碱类化合物1和2，以及3个吡喃酮类化合物3~5（图1）。其中，1为新型天然产物，具有抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和耻垢分支杆菌的微弱活性，并可作为合成神经细胞保护剂三环咔唑类生物碱的关键前体[7]。
图 1 化合物1~5的结构式
-
Agilent 600 MHz 核磁共振仪（Agilent）；Xevo G2-XS QTOF质谱仪（Waters）；Acquity UPLC 高效液相色谱仪（Waters）；Interchim PuriFlash 450中压色谱仪（Interchim）；ODS（YMC，C18，21.2 mm × 250 mm，5 μm）；XBridge C18半制备型液相色谱柱（Waters, XBridge Prep C18，10 mm × 250 mm，5 μm）；C18制备型液相色谱柱（Phenomenex，Luna C18，21.2 mm × 250 mm，5 μm）；N-1000型旋转蒸发仪（上海爱郎）；SK5200H型超声仪（上海科导）；振荡培养箱（上海知楚）；培养箱（上海博远）。色谱级溶剂（Merk）；分析纯试剂（上海化学试剂公司）；氘代试剂（Cambridge Isotope Laboratories）。
-
TSBY培养基：胰蛋白胨大豆肉汤（30 g/L）、酵母提取物（5 g/L）、蔗糖（100 g/L）、消泡剂（1 ml/L）；SFM培养基：低温黄豆饼粉（20 g/L）、琼脂（20 g/L）、甘露醇（20 g/L），pH 7.2~7.4；MH培养基（Solarbio®）：MH肉汤（22 g/L）；PDA培养基：马铃薯（200 g/L）、琼脂（20 g/L）、葡萄糖（20 g/L）。
-
链霉菌LHW2432分离自南海海绵（红色指状，种属未鉴定，本实验室编号1524），经16S rRNA基因序列（1376 bp）比对，与Streptomyces purpurascens相似度达99.42%，鉴定为链霉菌。
指示菌蕈状芽胞杆菌（Bacillus mycoides）、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus CICC10201）、耻垢分支杆菌（Mycobacterium smegmatis mc2155）、大肠杆菌（Escherichia coli）和白色念珠菌（Candida albicans）均取自上海交通大学医学院仁济医院药学部海洋药物研究中心菌种库。
-
将LHW2432接种于SFM平板，30 ℃培养5 d，挑取单菌落接种于装有10 ml TSBY培养基的100 ml三角瓶中（加有不锈钢弹簧），30 ℃，220 r/min培养3 d，作为一级种子液；一级种子液以1∶20（V/V）接种于装有150 ml TSBY培养基的500 ml三角瓶中（加有不锈钢弹簧），30 ℃，220 r/min培养3 d，该发酵液作为二级种子液，继续同样条件的发酵，最终得到12 L发酵液。用等体积乙酸乙酯萃取发酵液3次，萃取液浓缩悬干后得到11.3 g浸膏。
-
通过正相硅胶柱色谱分离粗浸膏，二氯甲烷-甲醇洗脱梯度：150∶1、100∶1、80∶1、50∶1、25∶1、15∶1、5∶1、1∶1，共得到13个馏分A～M。合并F与G馏分（1.91 g干重）后经中压ODS色谱柱继续分离[乙腈-水（0.1%甲酸）：5%～95%梯度洗脱，6 h，15 ml/min]，得到16个馏分FG1～FG16。
化合物1（3.1 mg）和4（7.7 mg）由FG12（42.3 mg干重）馏分经制备型HPLC分离获得，洗脱条件为：9 ml/min，53%甲醇-水（0.1%甲酸）。
化合物3（9.0 mg）和5（2.1 mg）由FG10（37.4 mg干重）馏分经制备型HPLC分离获得。FG10经洗脱[9 ml/min，42%甲醇-水（0.1%甲酸）]得到化合物3和组分FG10-5（7.5 mg干重）；组分FG10-5进一步洗脱得到化合物5，洗脱条件为：3 ml/min，30%乙腈-水（0.1%甲酸）。
化合物2（121 mg）分离自馏分J。J馏分（4.357 g干重）经凝胶柱色谱[流动相：二氯甲烷-甲醇（1∶1）]砍断得到5个亚馏分J1～J5。选取J4（1.112 g干重）再经中压ODS柱色谱[甲醇-水（0.1%甲酸）：10%～95%梯度洗脱，2 h，15 ml/min]分离获得化合物2。
-
如表1所示，将200 μl~2 ml过夜生长的5种指示菌的菌液加入水解酪蛋白琼脂培养基（MHA）或马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）中（约50 ℃）稀释，摇匀后倒入培养皿中。待凝固后，滴加溶解于3 μl DMSO溶液的样品（约10 μg），设置一个阳性对照和一个DMSO阴性对照，平板于相应条件培养12 h后观察抑菌圈（表1）。
表 1 5种指示菌平板培养条件及遴选的阳性对照药
指示菌 培养条件 阳性药 B. mycoides(蕈状芽胞杆菌） MHA, 37 ℃ 万古霉素 S. aureus(金黄色葡萄球菌) MHA, 37 ℃ 万古霉素 M. smegmatis(耻垢分支杆菌) MHA, 37 ℃ 卡那霉素 E. coli(大肠杆菌) MHA, 37 ℃ 萘啶酮酸 C. albicans(白色念珠菌) PDA, 30 ℃ 两性霉素 -
使用肉汤稀释法进行96孔板实验[8]。样品和阳性对照药分别设置3个平行组，先将过夜培养的指示菌用MH肉汤培养基进行1 000倍稀释后加入96孔板，每孔50 μl。第1列至第10列样品浓度依次为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 μg/ml。加样后37 ℃培养18 h，通过分光光度计（A600）检测菌液澄清度。最后，根据实验结果调整测试药物浓度梯度，重复实验。
-
化合物1：红棕色固体。ESI-MS m/z 270.1133 [M+H]+（calcd for C16H16NO3，270.112 5），提示其相对分子质量为269，推测该化合物结构中含有一个N原子，结合1H-NMR和13C-NMR确定其分子式为C16H15NO3，计算其不饱和度为8。1H-NMR在低场区显示出4个芳烃质子信号δH 7.85 (1H，m)、7.51 (1H，m)、7.23 (2H，dd，J = 6.0，3.1 Hz)，高场区显示2个甲基质子信号δH 1.92 (3H，s)和1.25 (3H，d，J = 6.1 Hz)，1个亚甲基质子信号δH 2.77 (2H，m)，1个连氧次甲基质子信号δH 3.96 (1H，dt，J = 8.0，6.1 Hz)；13C-NMR和DEPT谱，在低场区显示出2个羰基碳信号 (δC 172.8，183.6)、4个芳基次甲基碳信号 (δC 113.4，120.2，123.9，124.1)，6个芳基或双键季碳信号 (δC 110.9，125.7，134.8，137.1，139.8，146.5)，在高场区显示出2个甲基碳信号 (δC 12.2，23.8)、1个亚甲基碳信号 (δC 37.8) 和1个连氧次甲基碳信号 (δC 65.9)；将波谱信号进行归属，1H-NMR (600 MHz，DMSO-d6)：δ 7.85 (m，H-5)，7.51 (m，H-8)，7.23 (dd，J = 6.0，3.1 Hz，H-6，7)，3.96 (dt，J = 8.0，6.1 Hz，H-11)，2.76 (m，H-10)，1.92 (s，H-13)，1.25 (d，J = 6.1 Hz，H-12)。13C NMR (151 MHz，DMSO-d6)：δ 183.6 (C-3)，172.8 (C-4)，146.5 (C-9a)，139.8 (C-1)，137.1 (C-8a)，134.8 (C-2)，125.7 (C-4b)，124.1 (C-7)，123.9 (C-6)，120.2 (C-5)，113.4 (C-8)，110.9 (C-4a)，65.9 (C-11)，37.8 (C-10)，23.8 (C-12)，12.2 (C-13)。化合物数据与文献[9-10]报道一致，结构鉴定为咔唑-3，4-邻醌生物碱descycloavandulyl-lavanduquinocin。
化合物2：白色无定型粉末。ESI-MS m/z 180.1022 [M+H]+（calcd for C10H14NO2，180.101 9），相对分子质量为179，说明该化合物可能含有一个N原子，结合13C-NMR确定其分子式为C10H13NO2，计算不饱和度为5。1H-NMR中包含4个芳烃质子信号δH 6.97 (2H，m)、6.67 (2H，m)，结合13C-NMR中的6个双键碳信号，推断该化合物中含有一个对位二取代的苯环，其中一个碳信号 (δC 155.6) 化学位移值向低场偏移，说明是一个连氧取代的芳基碳原子；归属该化合物的波谱信号，1H-NMR (600 MHz，DMSO-d6)：δ 9.20 (brs，1′-OH)，7.87 (t，J = 5.5 Hz，1-NH)，6.97 (m，H-3′，H-5′)，6.67 (m，H-2′，H-6′)，3.17 (m，H-8′)，2.56 (dd，J = 8.4，6.6 Hz，H-7′)，1.77 (s，H-2)；13C NMR (151 MHz，DMSO-d6)：δ 169.1 (C-1)，155.6 (C-1′)，129.6 (C-4′)，129.5 (C-1′，C-5′)，115.1 (C-2′，C-6′)，40.6 (C-8′)，34.5 (C-7′)，22.7 (C-2)。与文献数据[11-12]比对，该化合物被鉴定为N-乙酰酪胺（N-acetyltyramine）。
化合物3：淡黄色固体。ESI-MS m/z 183.1028 [M+H]+（calcd for C10H15O3，183.101 6），提示其相对分子质量为182，结合1H和13C-NMR数据推测其分子式为C10H14O3，不饱和度为4。1H-NMR的低场区显示出一个双键质子信号δH 5.95 (1H，s)，高场区显示3个甲基质子信号δH 0.81 (3H，t，J = 7.4 Hz)、1.10 (3H，d，J = 6.9 Hz) 和1.73 (3H，s)，1对亚甲基质子信号δH 1.54 (1H，m)、1.44 (1H，m)，1个次甲基质子信号δH 2.43 (1H，m)；13C-NMR和DEPT谱显示共有10个碳信号，包括4个双键或羰基季碳信号，1个sp2杂化的双键次甲基碳信号，1个sp3杂化的次甲基碳信号，1个sp3杂化的亚甲基碳信号，3个甲基碳信号。如下为化合物的波谱信号归属，1H-NMR (600 MHz，DMSO-d6)：δ 5.95 (s，H-5)，2.43 (m，H-7)，1.73 (s，H-11)，1.54 (m，H-8a)，1.44 (m，H-8b)，1.10 (d，J = 6.9 Hz，H-10)，0.81 (t，J = 7.4 Hz，H-9)。13C NMR (151 MHz，DMSO-d6)：δ 165.8 (C-2)，165.5 (C-4)，165.2 (C-6)，98.9 (C-5)，96.2 (C-3)，38.7 (C-7)，26.9 (C-8)，17.7 (C-10)，11.3 (C-9)，8.5 (C-11)。结合比对文献[13]核磁谱图数据，该化合物鉴定为phomapyrone C。
化合物4：棕色固体。ESI-MS m/z 197.1181 [M+H]+（calcd for C11H17O3，197.1172），提示其相对分子质量为196，结合1H和13C-NMR数据推测其分子式为C11H16O3，不饱和度为4。比较化合物4和3的核磁数据，发现4的1H-NMR低场区存在一个双键质子信号δH 5.95 (1H，s)，13C-NMR 低场区存在4个双键或羰基季碳信号 (δC 165.8，165.2，164.7，102.5)、1个双键次甲基碳信号 (δC 98.8)，这些核磁数据与化合物3的吡喃-2-酮单元的数据基本一致，提示其存在一个相同的骨架结构。化合物4和3的结构不同之处在于，化合物4的1H和13C -NMR数据中多一个亚甲基信号 (δH 2.26，δC 16.2)。其信号具体归属如下：1H-NMR (600 MHz，DMSO-d6)：δ 5.93 (s，H-5)，2.42 (m，H-7)，2.26 (q，J = 7.4 Hz，H-11)，1.55 (m，H-8a)，1.44 (m，H-8b)，1.10 (d，J = 6.9 Hz，H-10)，0.94 (t，J = 7.4 Hz，H-12)，0.81 (t，J = 7.4 Hz，H-9)。13C NMR (151 MHz，DMSO-d6)：δ 165.8 (C-2)，165.2 (C-4)，164.7 (C-6)，102.5 (C-3)，98.8 (C-5)，38.7 (C-7)，26.8 (C-8)，17.6 (C-10)，16.2 (C-11)，12.6 (C-12)，11.4 (C-9)。以上数据与文献[14]基本一致，故被鉴定为germicidin A。
化合物5：棕色固体。ESI-MS显示[M+ H]+分子离子峰m/z 183.1021(calcd for C10H15O3，183.101 6)，确定其相对分子质量为182，结合1H和13C-NMR数据确定其分子式为C10H14O3，不饱和度为4。该化合物氢谱存在一个双键质子δH 5.95 (1H，s) 信号，碳谱存在4个季碳信号 (δC 165.8，165.2，164.7，102.5)、1个双键次甲基碳信号 (δC 98.8)，提示其含有和化合物3一样的吡喃-2-酮骨架结构。化合物5和3的分子量相同，是同分异构体，但其1H和13C -NMR数据中存在特征性的偕甲基信号 [δH 0.88 (H-9，H-10)，δC 21.9 (C-9，C-10)]。具体的信号归属如下：1H-NMR (600 MHz，DMSO-d6)：δ 5.92 (s，H-5)，2.25 (d，J = 7.2 Hz，H-7)，1.90 (m，H-8)，1.72 (s，H-11)，0.88 (d，J = 6.6 Hz，H-9，H-10)。13C NMR (151 MHz，DMSO-d6)：δ 165.3 (C-2)，165.2 (C-4)，161.2 (C-6)，101.1 (C-5)，95.9 (C-3)，41.7 (C-7)，26.3 (C-8)，21.9 (C-9)，21.9 (C-9)，8.5 (C-11)。以上数据与文献[15]基本一致，故被鉴定为germicidin I。
-
平板涂布结果显示：化合物1仅对MRSA和耻垢分支杆菌出现中等大小抑菌圈，阳性药物对相应指示菌均产生显著大小抑菌圈，其他化合物未使5种指示菌产生明显抑菌圈。
-
根据初筛结果，以MRSA和耻垢分支杆菌为指示菌，采用微量稀释法，最终确定化合物1对MRSA和耻垢分支杆菌的MIC值分别为100和64 μg/ml。
-
生物碱是一类含氮的天然药用分子，抗癌药紫杉醇、止痛药吗啡和抗疟疾的奎宁类药物均属此类[16]。文献报道，具有脂肪族侧链的三环咔唑生物碱可通过自由基清除作用保护神经细胞[9,17-18]，例如lavanduquinocin，neocarazostatins和carquinostatins[7,19-20]。
课题组以一株中国南海海绵共附生链霉菌Streptomyces sp. LHW2432为研究对象，发现了2个生物碱类化合物1和2，以及3个吡喃酮类化合物3~5（图1）。化合物2此前发现于真菌和放线菌中[21-22]，具有自由基清除功能[23]。有报道化合物3~5在链霉菌形态分化中具有抑制产孢的功能[24]。化合物1为三环咔唑生物碱类新天然产物，课题组发现其具有抑制MRSA和耻垢分支杆菌的微弱活性。此外，化合物1可作为化学合成药用活性三环咔唑类生物碱的重要前体[9]，本研究首次发现了产生化合物1的宿主菌，为通过发酵手段廉价获取该中间体分子提供了可能。
Study on secondary metabolites from sponge-symbiotic Streptomyces sp. LHW2432
-
摘要:
目的 从海绵共附生菌Streptomyces sp. LHW2432的发酵产物中发现药用活性分子。 方法 采用正向硅胶柱、ODS反向柱以及高效液相色谱分离技术，对LHW2432的发酵萃取物进行分离纯化；通过现代波谱技术和文献调研确定化合物结构；利用平板涂布法和微量稀释法，评价化合物对芽胞杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、耻垢分支杆菌、白色念珠菌和大肠杆菌的抑菌活性。 结果 从LHW2432发酵物中共分离鉴定了5个化合物：descycloavandulyl-lavanduquinocin ( 1 )、N-acetyltyramine ( 2 )、phomapyrone C ( 3 )、germicidin A ( 4 ) 和germicidin I ( 5 )。化合物 1 对MRSA和耻垢分支杆菌的最小抑菌浓度（MIC）值分别为100和64 μg/ml。 结论 从LHW2432菌中分离得到5个化合物，其中，化合物 1 是新天然产物，可作为神经保护活性三环咔唑类生物碱的合成前体，其对G+菌有微弱的抑制活性。 Abstract:Objective To discover the medicinal active molecules from the fermentation extract of sponge-symbiotic Streptomyces sp. LHW2432. Methods Compounds were isolated and purified from the fermentation extract of LHW2432 by silica gel, ODS chromatographic columns, and HPLC. The structures of the compounds were elucidated based on the analyses of modern spectrum technologies and the related literatures research. Through plate coating method and broth microdilution method, the antimicrobial activities were tested by the indicator strains of Bacillus mycoides, methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), Mycobacterium smegmatis, Candida Albicans, and Escherichia coli. Results Five compounds were discovered and their structures were identified as descycloavandulyl-lavanduquinocin ( 1 ), N-acetyltyramine ( 2 ), phomapyrone C ( 3 ), germicidin A ( 4 ), and germicidin I ( 5 ). Compound 1 showed inhibitory activities against MRSA (MIC, 100 μg/ml) and M. smegmatis (MIC, 64 μg/ml), respectively. Conclusion Five compounds were discovered from LHW2432, among which compound 1 was a new natural product and could be used as a precursor of the tricyclic carbazole alkaloids with neuroprotective activity. Moreover, compound 1 showed weak inhibitory activities against gram-positive pathogenic bacteria. -
西罗莫司（sirolimus，SRL），又称雷帕霉素，是第三代免疫抑制剂，在临床上常用于抑制肝、肾等器官移植后的免疫排斥反应。SRL属于生物药剂学分类Ⅱ类药物，在水中的溶解度极低，而渗透性良好[1-4]。SRL药理活性高，但因水溶性差，且易被肠壁和肝中的CYP3A4同工酶广泛代谢，致使其口服生物利用度较低。这是临床应用SRL的重要缺陷之一。目前，已上市的SRL制剂主要是纳米结晶片，生物利用度约为17%[5-7]。
通过适当的制剂技术提高SRL在胃肠道中的溶解度，可提高其口服生物利用度。在前期研究中，课题组分别独立进行了含SRL的自微乳（self-microemulsifying drug delivery system，SMEDDS）、固体分散体（solid dispersion，SD）和纳米结构脂质载体（nanostructured lipid carriers，NLC）的构建，均显著改善了SRL的体外溶出。本实验在前期研究的基础上，新增环糊精衍生物对SRL的增溶研究，结合体外溶出度和体内生物利用度，综合分析和评价各增溶制剂的优势和缺陷，从而为解决口服难溶性药物的研究提供参考。
1. 仪器与试剂
1.1 仪器
Agilent 1200型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；Starter 2C型pH计(上海奥豪斯仪器公司)；RCZ-6BZ型药物溶出仪(上海黄海药检仪器公司)；真空冷冻干燥箱(北京博医康试验仪器公司)；NS1001L2K高压匀质机(意大利NiroSoavi公司)；UV-2800AH型紫外可见分光光度仪(上海优尼科仪器有限公司)；液相色谱-质谱联用仪(美国AB-SCIEX有限公司)。
1.2 试剂
SRL对照品(含量99.9%)、SRL原料药(含量99.6%)，购自福建科瑞药业有限公司；子囊霉素对照品(上海齐奥化工科技有限公司)，Rapamune®(美国惠氏制药)。聚乙二醇6000(PEG 6000）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP K30）均购自国药集团化学试剂有限公司；聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(Poloxamer 188)、聚氧乙烯35蓖麻油(Cremophor EL）、聚氧乙烯氢化蓖麻油(Cremophor RH40）均购自德国BASF公司；油酸聚乙二醇甘油酯(Labrafil M1944CS)、二乙二醇单乙基醚(Transcutol P)、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯(Labrasol)、棕榈酸硬脂酸甘油酯(Precirol ATO5)、月桂酸聚乙二醇甘油酯 (Gelucire 44/14)均购自法国GATTEFOSSE公司；HP-β-CD、DM-β-CD、SBE-β-CD(山东滨州智源生物科技有限公司)。
2. 方法
2.1 SRL含量测定方法
采用高效液相色谱仪（HPLC）测定样品中的SRL含量[8]。色谱柱为Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-甲醇-水（45∶34∶21），流速为1 ml/min，检测波长为278 nm，柱温为50 ℃，进样量为20 μl。配制浓度为2、4、8、12、16、20 μg/ml的SRL对照品溶液，得标准曲线为Y=54.712X+1.221，r=0.999 9，表明在2~20 μg/ml浓度范围内线性关系良好。另外，精密度、回收率符合要求。
2.2 SRL增溶方法
2.2.1 SRL-SMEDDS的制备
参考前期研究[9]，称取1 g SRL原料药，加入19 g的助乳化剂Transcutol HP，超声至全部溶解后，加入22 g油相Labrafil M1944CS及39 g乳化剂Cremophor EL，涡旋混匀，得到淡黄色澄清溶液，即SRL-SMEDDS。
2.2.2 SRL-NLC的制备
参考前期研究[10-11]，取Gelucire44/14和Crodamol GTCC在75 ℃水浴中完全熔融后，加入SRL原料药搅拌均匀成澄明油相，再将同温度吐温−80的水溶液迅速倒入油相，以300 r/min搅拌30 min制备初乳，再经高压匀质机90 MPa乳匀5次，即得SRL-NLC分散液，其中SRL为0.21%，Gelucire44/14:Crodamol GTCC（1∶2.1），脂质总量为10%，吐温−80为7.33%。随后，将SRL-NLC（42.6%）加入微晶纤维素和聚乙烯吡咯烷酮（50%，4∶1）中，研磨混合并放置过夜以充分吸附，加入甘露醇（冻干保护剂，3%），经冷冻干燥过夜后，所得固体粉末中加入低取代羟丙基纤维素（崩解剂，4%）和二氧化硅（助流剂，0.4%）即得固化纳米脂质体。
2.2.3 SRL-SD的制备
采用溶剂-熔融法制备SRL-SD。称取载体材料，于80 ℃水浴加热熔融，滴入SRL乙醇溶液，充分混匀，待乙醇挥发完全后，迅速将其倾倒于冰浴条件下的不锈钢板上成薄膜，固化，再于−18 ℃放置4 h后，将固体分散体从不锈钢板上刮下，置真空干燥器中干燥，待脆化后研细，过80目筛，即得SRL-SD。以载体种类、药物-载体比例为考察因素，以0.4% SDS中的溶出度为指标，对SRL-SD进行单因素分析。
2.2.4 SRL-IC的制备
称取适量β-环糊精衍生物溶于去离子水中，缓慢滴加SRL乙醇溶液，在一定温度下磁力搅拌至澄清透明，减压挥发4 h，使乙醇挥发完全，再置于4 ℃冰箱冷藏12 h，降低SRL的溶解度，从而使游离的SRL发生结晶。经0.22 μm微孔滤膜过滤除去结晶，滤液冷冻干燥24 h，所得固体研磨细化，过80目筛，即得SRL-IC。
称取一定量的SRL-IC置10 ml容量瓶中，加入50%甲醇水溶液，超声至全部溶解后，定容至刻度，并采用HPLC测定SRL含量，根据公式：包封率（%）=[（SRL投入量-SRL测定量）/ SRL投入量]×100%，进行计算。以环糊精衍生物的种类、浓度、温度、乙醇体积和投药量为考察因素，以包封率为指标，对SRL-IC进行单因素分析。
2.3 体外溶出试验
参考《中国药典》2015年版四部通则0931项下溶出度与释放度测定法，考察SRL原料药、市售片（Rapamune®）、SRL-SMEDDS、SRL-NLC、SRL-IC及SRL-SD的溶出曲线。除市售片外，其余样品均装入硬胶囊中，每个胶囊含1 mg SRL。采用桨法，搅拌速度为100 r/min，溶出介质体积为250 ml，分别以0.4% SDS、水、pH 1.2盐酸溶液、pH 4.5醋酸盐缓冲液、pH 6.8磷酸盐缓冲液、pH 7.4磷酸盐缓冲液为溶出介质。将两颗胶囊或药片置于沉降篮中，投入溶出介质，在10、30、45、60、90、120 min，吸取2 ml介质，并补充等温等体积的介质，采用HPLC测定样品中的药物含量，绘制溶出曲线。
2.4 体内药代动力学试验
选用比格犬为实验动物，采用6周期6交叉实验设计，进行SRL原料药、市售片（Rapamune®）、SRL-SMEDDS、SRL-NLC、SRL-IC及SRL-SD的药代动力学试验。给药剂量为1 mg SRL，实验动物试验开始前12 h禁食不禁水，给药4 h后自由饮水，2次给药间隔2周以上的清洗期。于给药前，0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、24、36、48及72 h分别经前肢小静脉采血2 ml，置于含肝素和EDTA的抗凝管中，−20 ℃保存备用。血样处理与测定方法参照课题组前期研究[12]。
3. 结果
3.1 SRL-SD的制备
3.1.1 载体种类
如图1A所示，不同载体材料制备的SRL-SD的溶出曲线显示了明显的差异，溶出速率为PEG6000>F68>PVP K30>HPMC606>HPMC-AS-MF。同时，各载体材料的溶出度均不理想（≤50%），因此进一步考察采用二元载体制备SRL-SD。
选择PEG6000联合F68制备二元载体固体分散体[13]，两者比例为3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3。随PEG6000/F68比例的增大，则SRL溶出度呈增大趋势，在PEG6000/F68为2∶1时的溶出度达到最大（图1B）。
3.1.2 药物-载体比例
在PEG6000/F68=2∶1的基础上，进一步考察药物-载体比例对SRL-SD溶出的影响。药物-PEG6000/F68载体比例为1∶2∶1、1∶4∶2及1∶6∶3所制的SRL-SD的溶出曲线相似，没有明显差别，2 h的溶出度都接近100%（图1C）。因此优选载药量最大，即药物- PEG6000/F68载体比例为1∶2∶1。
3.2 SRL-IC的制备
3.2.1 β-环糊精衍生物种类
在其他条件相同的情况下，HP-β-CD、SBE-β-CD和DM-β-CD对SRL的包封率分别为（11.21±3.35）%、（8.24±3.11）%和（31.86±3.26）%，见图2A。因此，优选DM-β-CD制备SRL-IC。
图 2 单因素考察包合物的制备工艺对包合率的影响A.β-环糊精衍生物种类的影响，**P<0.01，与DM-β-CD比较；B. 温度的影响，**P<0.01，与10 ℃比较；C. 环糊精衍生物浓度的影响，*P<0.05，与200 mg/ml比较；D. 乙醇体积的影响；E. SRL投药量的影响3.2.2 温度
采用DM-β-CD制备SRL-IC，考察不同温度对包封率的影响。结果显示（图2B），温度越低，包封率越高，10 ℃条件下制备的SRL-IC的包封率显著高于30 ℃和50 ℃（P<0.01），为（58.61±4.16）%。因此，优选10 ℃制备SRL-IC。
3.2.3 环糊精衍生物浓度
DM-β-CD的浓度由200 mg/ml增大至300 mg/ml，SRL的包封率由（52.12±4.17）%增大至（58.61±4.11）%（P<0.05，图2C）。进一步增大DM-β-CD的浓度至600 mg/ml，包封率没有明显变化（P>0.05）。因此，优选DM-β-CD的浓度为300 mg/ml制备SRL-IC。
3.2.4 乙醇体积
乙醇体积由0.5 ml增大至2 ml，包封率呈增大趋势（图2D）。因此，优选乙醇体积为0.5 ml制备SRL-IC。
3.2.5 投药量
SRL的投药量6 mg增大至8 mg，包封率显著降低，6 mg SRL的包封率为（95.21±1.10）%，见图2E。因此，优选SRL的投药量为6 mg。
3.3 体外溶出度
考察SRL-SD、SRL-IC、SRL-SMEDDS及SRL-NLC在不同介质中的溶出曲线。如图3所示，在0.4% SDS中，各制剂在2 h的溶出度均超过80%，尤其是SMEDDS和NLC的溶出度接近100%。
在pH 6.8和水中，SRL-SD的溶出速率减小，2 h的溶出度分别为（65.00±4.90）%和（76.70±1.95）%。在pH 4.5和pH 7.4的介质中，SRL-SD的溶出在1 h达到最大值，分别为（53.20±4.34）%和（55.20±4.34）%，随后溶出度逐渐降低。在pH 1.2的介质中，未检测到SRL。
在水、pH 4.5、pH 6.8和pH 7.4中，SRL-IC在40 min内的溶出速率有所减小，但2 h的累积溶出没有明显变化，均在80%以上。在pH 1.2的介质中，SRL-IC的溶出度在30 min达到最大值，为（49.84±7.21）%，随后溶出度逐渐降低。
SRL-SMEDDS和SRL-NLC显示了与SRL-SD相似的溶出趋势，即在水和pH 6.8中的溶出度低于0.4% SDS，但大于80%。在pH 4.5和pH 7.4的介质中，溶出达到峰值（约80%）后逐渐降低。
3.4 比格犬体内药动学试验
SRL血药浓度-时间曲线见图4，经DAS 3.2.6软件处理后，具体参数见表 1。
表 1 非房室模型体内药动学参数（$ \bar x$ ±s）参数 SRL SRL-SD SRL-IC SRL- NLC SRL-SMEDDS Rapamune® AUC0→72(µg·h/ml) 0.70±0.13 2.06±0.79 3.66±2.64 8.60±2.03 10.76±1.57 11.02±2.73 AUC0→t(µg·h/ml) 0.73±0.15 2.07±0.81 3.78±2.84 8.67±1.95 11.15±2.11 11.75±3.13 t1/2 (t/h) 16.53±1.50 14.50±2.15 20.64±5.45 8.97±6.87 12.97±5.67 14.54±5.67 tmax(t/h) 1.04±0.25 1.25±0.28 1.04±0.25 1.13±0.31 1.50±0.38 1.83±0.26 cmax (ng/ml) 0.16±0.05 0.36±0.05 0.53±0.13 0.90±0.09 1.23±0.07 1.28±0.13 以原料药为参比制剂，SRL-SD、SRL-IC、SRL-SMEDDS、SRL-NLC、Rapamune®的相对生物利用度分别为332.8%、522.9%、1 228.6%、1 537.1%、1 574.3%，表明各增溶方法都显著提高了SRL的生物利用度。
以市售纳米晶片Rapamune®为参比制剂，SRL-SD、SRL-IC、SRL-NLC、SRL-SMEDDS的相对生物利用度分别为18.7%、33.2%、78.0%、97.6%，可见在各增溶方法中，SMEDDS对SRL体内吸收的作用最显著，与市售制剂相当。
4. 讨论
本研究同时制备和比较了SRL的4种增溶制剂，均显示了良好的体外溶出度。同时，各制剂都提高了SRL的生物利用度，但体内吸收程度有较明显的差异。
首先，SRL本身的性质是影响体内吸收的重要因素。在理化性质方面，SRL在电解质溶液中可发生开环水解，特别是在强酸和碱性条件下，降解速率显著增加[14]。在生理因素方面，SRL是肠道内CYP3A4酶和P糖蛋白的底物，对肠道吸收有较大影响[15]。
其次，制剂本身的特点对体内吸收有重要影响。SMEDDS和NLC均可形成纳米级的脂质微粒，在胃肠道消化后可形成乳糜胶束[16-17]均减轻了胃肠液的pH对SRL的降解作用，因此SMEDDS和NLC对脂质微粒中的SRL有一定的保护作用。相比之下，SD中的SRL快速释放后，载体材料失去了对药物的隔离保护作用，导致SRL在极短的时间内发生降解。另外，环糊精的空腔可以容纳药物分子[18]，不仅提高了SRL的溶解度，而且降低了H+和OH-对SRL的作用概率，减缓了SRL的降解。本研究的体外溶出试验也证实了不同增溶制剂中SRL稳定性的差异。
同时，SMEDDS的辅料Labrafil M1944 CS和Cremophor EL[9, 19-21]和NLC中的脂质及其代谢产物能够抑制CYP3A4酶的代谢和P糖蛋白外排，消化后形成的乳糜胶束还可通过淋巴途径吸收[22]，从而提高了生物利用度[10-11]。
另外，由于SRL分子量较大，分子结构可能仅有部分插入环糊精的空腔中。因此，尽管环糊精提高了SRL的溶出度，但包合物的稳定性较差，进入胃肠道后，药物可被胃肠液中的成分替换[23]，导致SRL加速降解或发生重结晶，进而生物利用度下降。
-
表 1 5种指示菌平板培养条件及遴选的阳性对照药
指示菌 培养条件 阳性药 B. mycoides(蕈状芽胞杆菌） MHA, 37 ℃ 万古霉素 S. aureus(金黄色葡萄球菌) MHA, 37 ℃ 万古霉素 M. smegmatis(耻垢分支杆菌) MHA, 37 ℃ 卡那霉素 E. coli(大肠杆菌) MHA, 37 ℃ 萘啶酮酸 C. albicans(白色念珠菌) PDA, 30 ℃ 两性霉素 
下载: 导出CSV
-
[1] YANG C F, QIAN R, XU Y, et al. Marine actinomycetes-derived natural products[J]. Curr Top Med Chem,2019,19(31):2868-2918. [2] FENICAL W, JENSEN P R. Developing a new resource for drug discovery: marine actinomycete bacteria[J]. Nat Chem Biol,2006,2(12):666-673. doi: 10.1038/nchembio841 [3] BLUNT J W, CARROLL A R, COPP B R, et al. Marine natural products[J]. Nat Prod Rep,2018,35(1):8-53. doi: 10.1039/C7NP00052A [4] THOMAS T, MOITINHO-SILVA L, LURGI M, et al. Diversity, structure and convergent evolution of the global sponge microbiome[J]. Nat Commun,2016,7:11870. doi: 10.1038/ncomms11870 [5] MORI T, CAHN J K B, WILSON M C, et al. Single-bacterial genomics validates rich and varied specialized metabolism of uncultivated <italic>Entotheonella</italic> sponge symbionts[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2018,115(8):1718-1723. doi: 10.1073/pnas.1715496115 [6] TIANERO M D, BALAICH J N, DONIA M S. Localized production of defence chemicals by intracellular symbionts of <italic>Haliclona</italic> sponges[J]. Nat Microbiol,2019,4(7):1149-1159. doi: 10.1038/s41564-019-0415-8 [7] CHOSHI T, UCHIDA Y, KUBOTA Y, et al. Lipase-catalyzed asymmetric synthesis of desprenyl-carquinostatin A and descycloavandulyl-lavanduquinocin[J]. Chem Pharm Bull,2007,55(7):1060-1064. doi: 10.1248/cpb.55.1060 [8] Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically; approved standard-eighth edition[M]. CLSI document M07-A8. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Insitute, 2009. [9] FURUKAWA Y, SAWAMOTO A, YAMAOKA M, et al. Effects of carbazole derivatives on neurite outgrowth and hydrogen peroxide-induced cytotoxicity in Neuro2a cells[J]. Molecules,2019,24(7):E1366. doi: 10.3390/molecules24071366 [10] KOBAYASHI M, TOMITA T, SHIN-YA K, et al. An unprecedented cyclization mechanism in the biosynthesis of carbazole alkaloids in <italic>Streptomyces</italic>[J]. Angew Chem Int Ed Engl,2019,58(38):13349-13353. doi: 10.1002/anie.201906864 [11] GUTIÉRREZ M, CAPSON T L, GUZMÁN H M, et al. Antiplasmodial metabolites isolated from the marine octocoral Muricea austera[J]. J Nat Prod,2006,69(10):1379-1383. doi: 10.1021/np060007f [12] 陈明华, 巫晔翔, 董飚, 等. 链霉菌CPCC 202950的化学成分研究[J]. 中国中药杂志, 2015, 40(7):1320-1324. [13] SOLEDADE M, PEDRAS C, MORALES V M, et al. Phomapyrones: Three metabolites from the blackleg fungus[J]. Phytochemistry,1994,36(5):1315-1318. doi: 10.1016/S0031-9422(00)89658-2 [14] 王聪, 王立平, 范杰, 等. 深海链霉菌<italic>Streptomyces malaysiensis</italic> OUCMDZ-2167来源的细胞毒性产物[J]. 有机化学, 2017, 37(3):658-666. [15] MA M, RATEB M E, YANG D, et al. Germicidins H-J from <italic>Streptomyces sp</italic>. CB00361[J]. J Antibiot,2017,70(2):200-203. doi: 10.1038/ja.2016.100 [16] BUTLER M S, ROBERTSON A A B, COOPER M A. Natural product and natural product derived drugs in clinical trials[J]. Nat Prod Rep,2014,31(11):1612-1661. doi: 10.1039/C4NP00064A [17] SCHMIDT A W, REDDY K R, KNÖLKER H J. Occurrence, biogenesis, and synthesis of biologically active carbazole alkaloids[J]. Chem Rev,2012,112(6):3193-3328. doi: 10.1021/cr200447s [18] KNÖLKER H J, REDDY K R. Isolation and synthesis of biologically active carbazole alkaloids[J]. Chem Rev,2002,102(11):4303-4427. doi: 10.1021/cr020059j [19] KATO S, SHINDO K, KATAOKA Y, et al. Studies on free radical scavenging substances from microorganisms. Ⅱ. Neocarazostatins A, B and C, novel free radical scavengers[J]. J Antibiot,1991,44(8):903-907. doi: 10.7164/antibiotics.44.903 [20] SHIN-YA K, KUNIGAMI T, KIM J S, et al. Carquinostatin B, a new neuronal cell-protecting substance produced by <italic>Streptomyces exfoliatus</italic>[J]. Biosci Biotechnol Biochem,1997,61(10):1768-1769. doi: 10.1271/bbb.61.1768 [21] SOBOLEVSKAYA M P, DENISENKO V A, MOISEENKO A S, et al. Bioactive metabolites of the marine actinobacterium <italic>Streptomyces sp</italic>. KMM 7210[J]. Russ Chem Bull,2007,56(4):838-840. doi: 10.1007/s11172-007-0126-9 [22] 何其伟, 刘吉开, 杜子伟, 等. 齿贝栓菌的化学成分[J]. 安徽中医学院学报, 2011, 30(2):73-76. [23] HEIDARI B, MOHAMMADIPANAH F. Isolation and identification of two alkaloid structures with radical scavenging activity from <italic>Actinokineospora sp</italic>. UTMC 968, a new promising source of alkaloid compounds[J]. Mol Biol Rep,2018,45(6):2325-2332. doi: 10.1007/s11033-018-4395-1 [24] PETERSEN F, ZÄHNER H, METZGER J W, et al. Germicidin, an autoregulative germination inhibitor of <italic>Streptomyces viridochromogenes</italic> NRRL B-1551[J]. J Antibiot,1993,46(7):1126-1138. doi: 10.7164/antibiotics.46.1126 -
点击查看大图
计量
- 文章访问数: 6728
- HTML全文浏览量: 2587
- PDF下载量: 52
- 被引次数: 0
