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白念珠菌（candida albicans）是一种机会致病菌，通常存在于人体的消化道及泌尿生殖道。当人体免疫力下降时，白念珠菌可能侵入人体，造成侵袭性真菌感染。近年来，随着器官移植者、艾滋病人等免疫功能低下人群数量的增多，白念珠菌的侵袭性感染愈发常见[1, 2]。目前，临床用于预防和治疗侵袭性真菌感染的药物主要包括棘白菌素类、多烯类和三唑类等，其中两性霉素B（AmB）为多烯类抗真菌药物的代表，主要通过破坏真菌的细胞膜，引起细胞内液外溢，致使真菌死亡[3]。AmB具有抗菌谱广、疗效好等优点，但长期用药存在肝肾毒性、低钾血症和静脉炎等不良反应，并产生严重耐药性[4, 5]。
通常，不同种类药物联合使用可有协同或拮抗作用，其中协同作用的药物联合使用具有扩大抗菌谱、减轻毒副作用和减少耐药等优点，因此在临床上越来越受到关注[6]。针对抗真菌药物的联合用药，目前在进行多维度的试验和可行性探索。临床上常将AmB与氮唑类药物联合应用以减少副作用的发生。此外，中药活性成分丁香酚与AmB联用可以促进活性氧的产生，从而发挥协同抗真菌作用[7]。
烟酰胺（NAM）是维生素B3的衍生物，在抗真菌药物和护肤品中均有广泛的应用[7]。课题组前期研究表明，NAM是一种有效的抗真菌药物增效剂，与多种抗真菌药物联合应用均能发挥协同作用，其作用机制包括增加细胞内活性氧的产生，增强对细胞被膜的抑制作用等[8, 9]。本研究将NAM与AmB联用，从代谢组学角度探究NAM协同AmB抑制白念珠菌的潜在作用机制，为临床抗真菌药物的联用提供参考。
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Thermo Trace GC Ultra and DSQII气相色谱-质谱联用仪（Thermo fisher，USA）；METTLER AE 240型电子天平（瑞士梅特勒公司）；SW-CT-IF 型超净化工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；HZ-9610KB 恒温培养箱（江苏太仓实验设备厂）；电子分析天平 AUW 220D（日本SHIMADZU 公司）；Infinite M200 多功能酶标仪（Austria TECAN 公司）。
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甲氧基胺盐酸盐（Sigma Aldrich 公司）；吡啶（Sigma Aldrich 公司）； N-甲基-N-（三甲基硅烷）三氟乙酰胺（MSTFA，Sigma Aldrich 公司）；三甲基氯硅烷（TMCS，Sigma Aldrich 公司）；二甲基亚砜（DMSO，Sigma Aldrich 公司）；烟酰胺（Sigma Aldrich 公司）；两性霉素B（中国食品药品检定研究院）；正己烷（分析纯，购于国药试剂公司）。
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白念珠菌SC5314（由瑞士V audois州立大学医学中心Dominique Sanglard教授惠赠）；酵母浸出粉胨葡萄糖（YPD）培养液：酵母浸膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，溶解于1000 ml三蒸水，高压灭菌，4 ℃保存；RPMI 1640培养基：RPMI 1640培养基粉末10 g，吗啡啉丙磺酸34.5 g，碳酸氢钠2.0 g，加入三蒸水900 ml溶解，用氢氧化钠室温下调节pH至7.0，三蒸水定容至1 000 ml，0.22 µm微孔滤膜过滤除菌后于4 ℃保存。
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取单克隆白念珠菌，接种至1 ml YPD培养液于30 ℃，200 r/min，培养16 h至对数生长期后，用RPMI 1640培养基稀释菌液至浓度为5×103 cells/ml。为确定白念珠菌对药物的敏感性，采用肉汤微量稀释法并进行适当的调整，两种药物分别在96孔板按两倍递减稀释，NAM的浓度为0.313~80 mmol/L，AmB的浓度为0.005~2 μg/ml。与无药物组相比，将药物干预组的生长抑制率为80%时的药物浓度确定为MIC80。
在此基础上，将培养至对数生长后期的菌液于多功能酶标仪中测定600 nm处的光密度值（OD600）。使用RPMI 1640培养液调整菌液浓度至OD600值为0.1，继续培养至OD600值为0.2时，分别加入AmB和NAM进行干预，使AmB终浓度分别为0.005、0.01、0.02、0.04、0.08 µg/mL，NAM终浓度分别为0.125、0.25、0.5、1、2 mmol/L，继续培养4 h。对照组中加入相同体积的DMSO，其浓度应小于0.05%，以确保不影响白念珠菌的生长。将NAM-AmB联用组OD600值降低至对照组OD600值一半时对应的浓度确定为后续代谢组学研究中的给药浓度。
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挑取单克隆白念珠菌，接种至1 ml YPD培养液于30 ℃，200 r/min，培养16 h至对数生长期，用YPD培养液调整菌液浓度至1x106 cells/ml，取20 ml置于锥形瓶中培养，至OD600值为0.2时进行药物干预。对于NAM组，加入适当浓度的NAM对照品溶液，使其浓度为1 mmol/L；对于AmB组，加入适当浓度的AmB对照品溶液，使其浓度为0.04 µg/ml；对于NAM-AmB联用组，加入适当浓度的NAM和AmB对照品溶液，使其浓度分别为1 mmol/L和0.04 µg/ml；对于对照组，加入相同体积的DMSO。继续培养4 h，收集样品，每组重复6个独立样本。
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样品收集后，用灭菌的PBS清洗两次，3000 r/min离心3 min，弃上清。重悬于1 ml水，静置15 min。放入−80 ℃冰箱15 min后取出，60 ℃金属浴15 min，重复冻融操作3次，13 200 r/min离心，取上清液，冷冻干燥。
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向上述冷冻干燥的样品中加入75 µl甲氧胺盐酸盐的吡啶溶液（20 mg/ml），涡旋5 min，70 ℃温孵1 h，再加入75 µl MSTFA溶液（含1%TMCS），50 ℃温孵30 min，13200 r/min离心5 min，取上清液1µl，注入气相色谱-质谱联用仪分析。
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将样品沉淀物在室温下风干至恒重，称量样品干重，用于各样本质量校正。
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色谱条件：采用Agilent DB-5MS石英毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 µm）进行代谢物分离；进样口温度：260 ℃；升温程序：起始温度为70 ℃，保持3 min，4 ℃/min升至220 ℃，再8 ℃/min升至310 ℃，保持10 min；载气：高纯氦气；流速：1.0 ml/min。进样量为1µl。质谱条件：电子轰击源（EI源），温度：200 ℃，扫描范围50~800 amu。
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将原始数据转化成CDF格式，利用R软件XCMS包对数据进行峰校正、对齐和积分，样品各峰面积分别以各自的细胞干重和内标进行校正。利用SIMCA 14.1.0（Umetrics，Sweden）软件进行偏最小二乘法判别分析（PLS-DA），以VIP>1.5或<0.5，P<0.05为阈值筛选差异代谢物，然后运用NIST库检索，进行差异代谢物的鉴定。
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采用微量液基稀释法考察NAM与AmB对白念珠菌SC5314的作用，结果如表1所示。单独使用NAM和AmB时MIC80分别为20 mmol/L、0.64 μg/mL，联用后的MIC80分别为2 mmol/L、0.08 μg/mL。NAM或AmB单独使用时均表现出抗菌作用，而NAM和AmB的联用显著降低了MIC80值。以部分抑制浓度指数（FICI）评价NAM与AmB的作用方式，结果显示NAM和AmB联用的FICI值为0.38（通常FICI<0.5为协同作用），表明两者联用具有协同抗真菌的作用。当联用组NAM和AmB浓度分别为1 mmol/L和0.04 μg/mL时，其OD600值约为对照组的1/2，而单独给予该剂量下的NAM组与对照组相比OD600几乎没有变化，AmB组OD600约为对照组的75%，表现出轻微的抑制作用。为真实反映联用后代谢物的变化情况，本研究选择NAM和AmB药物的干预浓度分别为1 mmol/L和0.04 μg/mL。
表 1 NAM和AmB抗白念珠菌作用
单独使用 联合使用 NAM
（mmol/L）AmB
（μg/mL）NAM
（mmol/L）AmB
（μg/ml）MIC80 20 0.64 2 0.08 FICI指数 − − 0.38 -
按2.4气相色谱-质谱条件进代谢物的分离分析，最终得到典型的总离子流图（图1）。从代谢物峰的相对强度可以看出，对照组与NAM组代谢轮廓比较相似，而AmB组和联用组与对照组相比存在明显差异。将原始数据按2.5的方法进行处理并使用PLS-DA分析，结果如图2所示。对照组和NAM组未有明显分离，表明该剂量下的烟酰胺的干预未导致白念珠菌的代谢轮廓发生显著变化。AmB组及联用组与对照组分离趋势明显，表明该剂量下的药物干预引起了白念珠菌代谢轮廓的显著变化。AmB组与联用组相比，代谢轮廓也存在明显差异，表明两组间的代谢物差异较大。
图 1 不同用药情况的GC-MS典型总离子流图(A.对照组、B.NAM组、C.AmB组、D.联用组)
图 2 对照组、NAM组、AmB组、联用组PLS-DA得分图
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将对照组、NAM组、AmB组和联用组的胞内代谢物的变化情况进行统计分析和可视化呈现，结果如表2和图3所示。
表 2 对照组、AmB组、联用组（NAM-AmB）差异代谢物鉴别结果
序号 保留时间
（min）代谢物 AmB组 vs 对照组 联用组 vs 对照组 联用组 vs AmB组 变化趋势 FC值 变化趋势 FC值 变化趋势 FC值 1 9.66 L-丙氨酸 − − ↓ 0.64* − − 2 10.93 羟胺乙醚 ↑ 16.31*** ↑ 20.30*** ↑ 1.24 3 11.46 L-亮氨酸 − − ↑ 1.56 ↑ 1.69** 4 11.92 4-氨基丁酸 ↑ 1.69** − − ↓ 0.62* 5 12.03 L-脯氨酸 − − ↑ 1.60 ↑ 1.37** 6 12.13 L-异亮氨酸 − − ↑ 2.05** ↑ 1.78*** 7 13.34 L-缬氨酸 ↓ 0.46*** ↓ 0.42*** − − 8 14.77 L-丝氨酸 − − ↑ 1.29 ↑ 1.49* 9 14.97 乙醇胺 ↑ 3.01*** ↑ 4.12*** ↑ 1.37 10 15.42 甘油 ↑ 2.86*** ↑ 3.17*** ↑ 1.10 11 15.94 L-苏氨酸 ↓ 0.22*** ↓ 0.46** − − 12 16.76 琥珀酸 ↑ 2.48*** ↑ 1.89*** ↓ 0.76* 13 17.99 2-丁烯二酸 ↑ 10.00 ↑ 8.47*** ↓ 0.85* 14 20.3 L-天冬氨酸 − − ↑ 1.67** ↑ 1.58*** 15 22.35 苹果酸 ↑ 15.19*** ↑ 9.58*** ↓ 0.63*** 16 23.19 L-焦谷氨酸 ↓ 0.42** ↓ 0.67* − − 17 23.76 甘氨酰-L-谷氨酸 ↑ 1.99* ↑ 2.61 − − 18 23.97 L-苯丙氨酸 ↓ 0.49*** ↓ 0.58** − − 19 24.73 4-羟基苯乙醇 ↑ 6.93*** ↑ 4.06*** ↓ 0.59** 20 25.41 2-苯基-1-丙胺 ↓ 0.15*** ↓ 0.23*** − − 21 29.3 1,4-丁二胺 ↑ 4.90*** ↑ 6.07*** ↑ 1.24 22 30.18 甘油磷酸 ↑ 2.36*** ↑ 1.98* − − 23 31.64 柠檬酸 ↑ 33.56*** ↑ 26.16*** − − 24 37.36 十六烷酸 ↑ 2.98*** ↑ 3.64*** ↑ 1.22** 25 38.03 纤维醇 ↓ 0.39*** ↓ 0.70** ↑ 1.81*** 26 46.46 1-甲基腺苷 ↑ 1.61** ↑ 1.95* ↑ 1.21 27 48.03 海藻糖 ↑ 4.75*** ↑ 4.07*** − − 28 49.25 甘露糖 ↑ 12.88*** ↑ 8.68** ↓ 0.68 29 49.71 半乳糖醇 ↑ 2.32*** ↑ 3.12*** ↑ 1.34* 注：FC值=实验组平均值/对照组平均值；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与对照组比较。 
图 3 不同药物干预后差异代谢物热图分析
与对照组相比，联用组有28个代谢物发生变化；而AmB组与联用组比较，差异代谢物减少至19个。NAM组和对照组之间的聚类分组不明显，说明该剂量下的NAM未影响白念珠菌的生长和代谢。AmB单独干预时对白念珠菌具有一定的抑制作用，与对照组相比有23个代谢物发生显著变化。
利用 MetaboAnalyst 5.0对差异代谢物进行通路分析，发现主要涉及甘油酯代谢、氨基酸代谢、三羧酸循环等通路的变化。联用组与对照组相比有28个代谢物发生变化，其中5个代谢物在AmB单独给药时未发生变化。此外，联用组与AmB族相比有19个代谢物发生显著变化，其中4个代谢物（L-亮氨酸，L-异亮氨酸，L-天冬氨酸，纤维醇）含量变化趋势明显（FC值>1.5或<0.5），表明联合用药在一定程度上改变了AmB抑制白念珠菌的作用模式。
氨基酸是真核生物正常生命活动中不可或缺的物质，氨基酸的代谢失衡会导致白念珠菌的生长和繁殖缺乏能量供应，同时影响氮平衡、糖类代谢等相关通路[10]。氨基酸代谢异常是联合给药干预后白念珠菌的主要特征之一。与对照组相比，联用组中的L-亮氨酸、L-脯氨酸、L-异亮氨酸、L-丝氨酸、L-天冬氨酸的FC值>1.5，含量发生显著变化，而这些代谢物在AmB单独干预时的变化没有统计学差异（见图4A和4B），表明在此剂量下AmB单独干预对于白念珠菌的轻微抑制作用并没有对其氨基酸的合成和代谢造成很大影响。然而，加入NAM后氨基酸含量的变化清晰地呈现了氨基酸代谢通路的变化。支链氨基酸含量的变化与机体的能量代谢密切相关，L-亮氨酸和L-异亮氨酸含量升高，推测可能由于NAM和AmB联用后激活了作用于支链氨基酸合成和代谢通路中的相关酶，并对外界刺激做出了应激反应。
图 4 差异代谢物相对含量柱状图（ Mean±SD, n=6）
此外，三羧酸循环是生物体内营养物质氧化的主要过程，与白念珠菌的CO2感应及菌丝发育的调控密切相关，该过程活性下降会导致白念珠菌利用碳源的能力降低，导致细胞的生长速度明显放缓[11]。与对照组相比，AmB组和联用组中柠檬酸、琥珀酸、苹果酸等三羧酸循环相关代谢物FC值均>1.5，表明给药后三羧酸循环相关代谢物均出现蓄积，但联用组蓄积情况反而低于AmB组。与对照组相比，AmB组和联用组中的羟胺乙醚、乙醇胺、甘油、1,4-丁二胺、软脂酸、甲基腺苷、半乳糖醇的FC值>1.5，含量明显升高，并且联用组中的含量显著高于AmB组（见图4C和4D）。
在白念珠菌中，鸟氨酸经过鸟氨酸脱羧酶能代谢为腐胺，而腐胺又能进一步转化为精胺、亚精胺等其他多胺。已有研究表明，干扰多胺合成通路能增强AmB抑制白念珠菌生物被膜合成的作用[12]，推测NAM可能干扰了白念珠菌的多胺合成通路，从而增强AmB对白念珠菌的抑制作用。总之，以上结果表明，NAM与AmB联用并不仅仅增强了AmB原有的作用途径，还在一定程度上改变了其单独干预时的作用模式。
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本研究利用气相色谱-质谱联用技术分析NAM与AmB作用下白念珠菌的代谢轮廓，筛选出的差异代谢物包括氨基酸、有机酸、多胺、糖类等成分，且涉及白念珠菌的氨基酸合成、三羧酸循环、甘油酯代谢等通路。NAM与AmB联用后，与对照组相比，部分代谢物变化趋势与单独使用AmB时一致，且变化幅度更大；同时也有部分代谢物在AmB单独作用时未发生变化，而联用后则发生显著变化，说明NAM增强了AmB在原代谢通路中的作用，同时在一定程度上改变了其作用途径。因此，推测NAM与AmB联用后可能通过影响白念珠菌的三羧酸循环，干扰其氨基酸代谢，影响其多胺合成等途径，发挥对AmB的增效作用。
The mechanism of nicotinamide combined with amphotericin B against Candida albicans based on metabolomics technology
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摘要:
目的 基于代谢组学的方法研究烟酰胺（NAM）协同两性霉素B（AmB）抑制白念珠菌的潜在作用机制。 方法 分别使用适当浓度的NAM、AmB单独处理和二者联用处理浮游型白念珠菌，再基于气相色谱-质谱联用技术分析其胞内代谢物，通过多元统计分析筛选差异代谢物，并用NIST数据库进行检索鉴定。 结果 与对照组相比，NAM单独干预组与之分离趋势不明显，而AmB组、联用组与之具有明显的分离趋势。AmB干预后有23个代谢物发生显著性变化，NAM+AmB联合干预后有28个代谢物发生显著性变化，包括氨基酸、有机酸、多胺、糖类等成分。 结论 NAM是白念珠菌的内源性代谢物，其与AmB联用后可增强AmB在原代谢通路中的作用，同时一定程度上改变了其作用途径，推测NAM与AmB联用后可能通过调整白念珠菌的三羧酸循环、干扰其氨基酸代谢、影响多胺的合成等途径来发挥其对AmB的增效作用。 Abstract:Objective To investigate the potential mechanism of nicotinamide combined with amphotericin B against Candida albicans based on metabolomics. Methods The intracellular metabolites of C. albicans intervened by different drugs including NAM, AmB, and their combination with a proper concentration were analyzed by gas chromatography-mass spectrometry. The differential metabolites were screened by multivariate statistical analysis and identified by searching the NIST database. Results Compared with the control group, the NAM intervention group was hardly separated from it, while the AmB group and NAM+AmB group showed a clear trend separation. Under the intervention of AmB, 23 metabolites significantly changed compared with the control group, and 28 metabolites remarkably changed after NAM+AmB intervention, including amino acids, organic acids, sugars and other components. Conclusion NAM, as an endogenous metabolite of C. albicans, combined with AmB could enhance the effects of AmB in the original metabolic pathway and changed it to a certain extent. It is speculated that AmB combined with NAM may pose more antifungal effect on Candida albicans by regulating the tricarboxylic acid cycle, interfering with amino acid metabolism and influencing polyamine synthesis. -
Key words:
- gas chromatography-mass spectrometry /
- amphotericin B /
- nicotinamide /
- candida albicans /
- metabolomics
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卡培他滨是一种新型的氟尿嘧啶类口服药，它是5-氟尿嘧啶（5-FU）的前体药物。卡培他滨口服给药方便、依从性好、疗效确切，是治疗结直肠癌的基石药物，但在治疗过程中产生的不良反应（手足综合征等）极大地影响了患者的治疗。手足综合征（HFS）是卡培他滨引起的不良反应中较为特殊的反应，也是卡培他滨在治疗过程中的药物剂量限制性不良反应，主要表现为皮肤红肿、水泡、出血、疼痛。合并使用环氧合酶、尿素霜、维生素B6、奥美拉唑也不能完全阻断手足综合征的发生[1-3]；合并使用中草药如白芍、桂枝、甘草等可降低手足综合征的发生率[4]。口服卡培他滨的患者手足综合征发生率高达60%[1]，严重降低患者用药依从性，严重手足综合征（约17%）的患者只能减少药物摄入量乃至停止服用药物，影响化疗按期、足量进行[5-6]。明确手足综合征的发生机制和有效干预对卡培他滨安全有效的应用具有重要价值。目前手足综合征模型的建立还没有统一的金标准，本实验尝试用ICR小鼠灌胃卡培他滨后建立手足综合征模型，为卡培他滨致手足综合征模型的建立及机制研究提供参考。
1. 材料与方法
1.1 动物与药品
雄性ICR小鼠，SPF级，5周龄左右，共42只小鼠，小鼠由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供。经上海中医药大学动物伦理委员会批准，实验动物伦理审查号为PZSHUTCM210715004。将小鼠随机编号1~42号，对照组ICR小鼠6只，实验组ICR小鼠36只。卡培他滨（商品名希罗达，上海罗氏制药有限公司，规格：0.5 g/片，国药准字号H20073024）；羧甲基纤维素钠（CMC-Na）(国药集团)；离心管（Titan公司）；动物解剖手术器材（瑞沃德公司）；消毒酒精、棉花球、锡箔纸（国药集团）。
1.2 饲养条件与环境
造模前小鼠先饲养1周，保证充足的水源与饲料，42只ICR小鼠自由摄取食物，环境湿度保持区间50%~60%（±5%），控制温度在(23±1) ℃，调节光照为12 h（6: 30至18: 30光照），其余时间为光暗周期。定期观察小鼠培养环境，定期为小鼠更换垫料，清理排泄物。
1.3 给药剂量、方式及周期
卡培他滨0.5 g/片，溶解于10 ml CMC-Na（0.5%）中，制得50 mg/ml悬浊液备用。实验组ICR小鼠（36只），灌胃给药，按275 mg/kg（即小鼠0.15 ml/30g）连续灌胃14 d，2次/d（按照卡培他滨临床给药方案1 250 mg/kg，2次/d的剂量换算）。对照组ICR小鼠（6只），灌胃给予CMC-Na（0.5%）溶液，按照4 ml/kg剂量连续的灌胃14 d，2次/d。
1.4 手足综合征阳性判断标准
1.4.1 小鼠手足综合征观察
取ICR小鼠的后足跖部皮肤组织，用生理盐水冲洗并擦干，以多聚甲醛（4%）对小鼠组织进行固定，石蜡包埋切片，使用苏木精-伊红对小鼠组织染色（H&E染色），使用普通光镜（比例尺5 μm）检测（注：染色呈现蓝色的为表皮层，该层位于淡粉色的角质层和淡蓝色的真皮层之间）。每天肉眼观察，若小鼠出现足跖部特征性改变，立即拍照并记录手足综合征发生时间，每3 d拍照记录小鼠足跖部皮肤变化情况。
1.4.2 小鼠体重观察
实验组与对照组自由饲养1周后称重，记录原始体重，灌胃给药后每3 d对所有实验小鼠称重一次并记录体重变化。
1.4.3 手足综合征阳性参考标准
标准参考美国国家癌症研究所（NCI）关于手足综合征的分级规定，建模实验中若实验小鼠足跖部的皮肤呈现了红色斑块、组织肿胀、角质层脱屑、溃疡、角质层厚度明显增加及其他明显体征者均可判定为手足综合征阳性。
1.5 样本收集方案
1.5.1 手足综合征阳性ICR小鼠的血浆和足趾部皮肤组织样本制备
对于手足综合征阳性的小鼠，在出现手足综合征后，经眼眶采样，用1.5 ml离心管（肝素钠抗凝）取血约0.5 ml，12 000 r/min离心10 min，收集血浆约0.25 ml，置于−80 ℃冰箱冷冻保存。采集小鼠血样后按照实验动物伦理要求规范处死小鼠，用手术剪取小鼠手足部皮肤，生理盐水冲洗后用锡纸包裹住样本并标号。所有样本置于−80 ℃冰箱冷冻保存，所有操作在1 h内完成。
1.5.2 手足综合征阴性ICR小鼠的血浆和足趾部皮肤组织样本制备
小鼠经过14 d给药未出现手足综合征阳性反应，则认定该类小鼠为造模失败小鼠，在第15天对该类小鼠统一进行眼眶采血和足趾部皮肤组织样本收集，方法同“1.5.1”。对照组小鼠在第15天收集样本，方法同“1.5.1”。
1.6 统计分析
数据采用平均值±标准差（mean±SD）表示，组与组之间根据数据分布状态比较采用学生t检验或秩检验，P<0.05认为有统计学差异。制图采用Excel或Graphpad 8.0软件。
2. 结果与讨论
2.1 小鼠体重变化及生存状态
通过对比对照组与实验组ICR小鼠体重变化，发现对照组ICR小鼠，灌胃14 d后，体重明显增加；而实验组ICR小鼠，灌胃14 d后，体重明显降低。表1和图1 为14 d内ICR小鼠的体重变化，实验过程中实验组小鼠死亡3只。
表 1 实验周期内小鼠体重变化情况（m/g，$ \bar{x}\pm s $ ）组别 n 0 d 7 d 14 d 对照组 6 28.54±0.71 32.56±0.88 34.66±1.07 实验组 33 29.07±0.76 26.84±1.74*** 23.15±2.31*** *** P<0.001，与对照组比较。 2.2 小鼠手足综合征病理观察
与对照组ICR小鼠相比，19只实验组小鼠的足底皮肤明显出现红斑、肿涨并出现少许水泡（图2），认为该小鼠出现手足综合征，按照伦理要求将小鼠处死，收集足底皮肤组织样本和血浆样本。
2.3 小鼠足底皮肤H&E染色
将ICR小鼠四肢皮肤用4%多聚甲醛固定后进行H&E染色（因苏木精呈碱性，细胞核内的染色质与胞质内的核酸显紫蓝色；伊红呈酸性，细胞质和细胞外基质中的成分显红色），如图3显示。与正常ICR小鼠相比，手足综合征阳性小鼠皮肤表皮层增厚，角质层呈现粉红色，真皮层呈现浅蓝色，表皮层处在二者之间呈现蓝色。发生HFS小鼠皮肤颗粒层变薄，基底层和棘层间细胞数量减少。正常小鼠角质层明显较薄。
2.4 小鼠手足综合征发生率
ICR小鼠共39只（对照组6只，实验组33只），19只实验组ICR小鼠出现手足综合征阳性症状，发生率为57.58%。实验组ICR小鼠灌胃给药1周，出现手足综合征阳性小鼠与未出现手足综合征小鼠相比：实验组小鼠足底皮肤颜色变深（深红色），少量小鼠四肢掌心有透明水泡样组织出现；在灌胃给药10 d后，实验组小鼠出现手足综合征阳性症状，四肢出现了红斑、脱屑、水泡（红斑出现最多，脱屑其次，水泡最少）等情况。
2.5 卡培他滨及其代谢产物暴露浓度分析
将收集的血浆样本按照前期报道的方法进行卡培他滨及其5种代谢产物（5'-脱氧-5-氟胞嘧啶核苷、去氧氟尿苷、5'-氟-2'-脱氧尿苷、5-氟尿嘧啶、5-氟二氢嘧啶-2,4-二酮[7]）定量（ng/ml，mean±SD）。结果发现，发生手足综合征小鼠与未发生手足综合征小鼠相比，卡培他滨浓度(ng/ml)分别为(58.08±44.54)和(39.23±26.98)，5'-脱氧-5-氟胞嘧啶核苷浓度(ng/ml)分别为(
6047.42 ±3331.94 )和(4442.77 ±2140.44 )，去氧氟尿苷浓度(ng/ml)分别为(2899.28 ±1821.15 )和(2018.81 ±1037.86 )，5'-氟-2'-脱氧尿苷浓度(ng/ml)分别为(112.89±36.85) 和(122.23±19.16)，5-氟尿嘧啶浓度(ng/ml)分别为(46.86±23.08)和(38.33±20.62)，5-氟二氢嘧啶-2,4-二酮浓度(ng/ml)分别为(24.45±14.79)和(27.34±17.84)。卡培他滨及其代谢产物在发生和未发生手足综合征小鼠体内暴露水平均无明显差异（P>0.05，图4）。
图 4 卡培他滨及其代谢产物暴露浓度分析注：Cap：卡培他滨；5-DFCR：5'-脱氧-5-氟胞嘧啶核苷；5-DFUR：去氧氟尿苷；2-DFUR：5'-氟-2'-脱氧尿苷；5-FU：5-氟尿嘧啶；FUH2：5-氟二氢嘧啶-2,4-二酮。3. 讨论
体内药物暴露水平同药物疗效和不良反应密切相关。目前药物暴露水平常用的参数有曲线下面积（AUC）、稳态浓度（css）、峰浓度（cmax）、谷浓度（cmin）等。有研究发现[8]，根据5-FU的AUC调整给药剂量后，患者血液系统出现3~4级不良反应发生率从之前的17.5%下降为 7.6%（P<0.05），黏膜炎的发生率也从5%降低为0%（P<0.01），总生存时间显著增加，从原来的16个月延长到22个月（P<0.01）。因此，5-FU在体内浓度可能成为预测疗效及不良反应的潜在预警生物标志物之一[9-10]。本研究中未发现卡培他滨及其代谢产物同手足综合征具有相关性，但Daher Abdi在20名75岁以上老年患者中发现，卡培他滨及其代谢产物在发生手足综合征患者体内暴露水平明显较高[11]，但体外研究表明，5-FU同手足综合征无明显关联[12]。另有研究表明，手足皮肤局部较高表达的胸苷磷酸化酶可产生局部较高浓度的5-FU，同卡培他滨引发的手足综合征密切相关[13]。总之，卡培他滨引发手足综合征的机制仍需进一步研究。
在卡培他滨致手足综合征模型的建立方面，黎鹏等灌胃给予SD大鼠200~400 mg/d，2次/d，用药1~2周（1周后停药3 d），建立了卡培他滨致手足综合征模型，并认为200 mg/kg的剂量，灌胃2周可较好地建立手足综合征模型（造模成功率77.5%）[14]。但有研究显示，卡培他滨在大鼠体内的代谢过程与人体不同，因大鼠体内胞苷脱胺酶活性较低，5-DFCR通过糖基化生成其他产物，产生的5-FU较少，而卡培他滨在小鼠体内的代谢过程与人体基本相同，可能是最好的动物模型[15-16]；Hiromoto [3]等利用ICR小鼠，灌胃给予200 mg/kg，1次/d，5次/周的方法建立手足综合征模型，3周建立手足综合征模型，但成功率未报道。He和Chen等给予ICR小鼠灌胃200 mg/kg，1次/d，连续灌胃30 d后，6只小鼠中仅有1只未发生手足综合征[17]。前期预实验中，采用灌胃200 mg/kg，2次/d的方法在ICR小鼠上建立手足综合征模型，灌胃1周后，6只小鼠仅有1只发生手足综合征。因此，根据临床卡培他滨用药剂量（1 250 mg/kg，2次/d）换算小鼠剂量为275 mg/kg，2次/d，既缩短了给药时间，又提高了建模成功率（57.6%），且较少有小鼠死亡（3只）。
4. 小结
本实验成功建立了卡培他滨致手足综合征的ICR小鼠模型，在给药时长、造模成功率方面均有一定优势。卡培他滨及其代谢产物在小鼠体内暴露浓度同手足综合征发生可能无关。手足综合征的发生机制仍需进一步研究。
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图 4 差异代谢物相对含量柱状图（ Mean±SD, n=6）
A,B.联用组特有的变化；C,D. AmB组和联用组共有的变化*P<0.05， **P<0.01， ***P<0.001，与对照组比较
表 1 NAM和AmB抗白念珠菌作用
单独使用 联合使用 NAM
（mmol/L）AmB
（μg/mL）NAM
（mmol/L）AmB
（μg/ml）MIC80 20 0.64 2 0.08 FICI指数 − − 0.38 
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表 2 对照组、AmB组、联用组（NAM-AmB）差异代谢物鉴别结果
序号 保留时间
（min）代谢物 AmB组 vs 对照组 联用组 vs 对照组 联用组 vs AmB组 变化趋势 FC值 变化趋势 FC值 变化趋势 FC值 1 9.66 L-丙氨酸 − − ↓ 0.64* − − 2 10.93 羟胺乙醚 ↑ 16.31*** ↑ 20.30*** ↑ 1.24 3 11.46 L-亮氨酸 − − ↑ 1.56 ↑ 1.69** 4 11.92 4-氨基丁酸 ↑ 1.69** − − ↓ 0.62* 5 12.03 L-脯氨酸 − − ↑ 1.60 ↑ 1.37** 6 12.13 L-异亮氨酸 − − ↑ 2.05** ↑ 1.78*** 7 13.34 L-缬氨酸 ↓ 0.46*** ↓ 0.42*** − − 8 14.77 L-丝氨酸 − − ↑ 1.29 ↑ 1.49* 9 14.97 乙醇胺 ↑ 3.01*** ↑ 4.12*** ↑ 1.37 10 15.42 甘油 ↑ 2.86*** ↑ 3.17*** ↑ 1.10 11 15.94 L-苏氨酸 ↓ 0.22*** ↓ 0.46** − − 12 16.76 琥珀酸 ↑ 2.48*** ↑ 1.89*** ↓ 0.76* 13 17.99 2-丁烯二酸 ↑ 10.00 ↑ 8.47*** ↓ 0.85* 14 20.3 L-天冬氨酸 − − ↑ 1.67** ↑ 1.58*** 15 22.35 苹果酸 ↑ 15.19*** ↑ 9.58*** ↓ 0.63*** 16 23.19 L-焦谷氨酸 ↓ 0.42** ↓ 0.67* − − 17 23.76 甘氨酰-L-谷氨酸 ↑ 1.99* ↑ 2.61 − − 18 23.97 L-苯丙氨酸 ↓ 0.49*** ↓ 0.58** − − 19 24.73 4-羟基苯乙醇 ↑ 6.93*** ↑ 4.06*** ↓ 0.59** 20 25.41 2-苯基-1-丙胺 ↓ 0.15*** ↓ 0.23*** − − 21 29.3 1,4-丁二胺 ↑ 4.90*** ↑ 6.07*** ↑ 1.24 22 30.18 甘油磷酸 ↑ 2.36*** ↑ 1.98* − − 23 31.64 柠檬酸 ↑ 33.56*** ↑ 26.16*** − − 24 37.36 十六烷酸 ↑ 2.98*** ↑ 3.64*** ↑ 1.22** 25 38.03 纤维醇 ↓ 0.39*** ↓ 0.70** ↑ 1.81*** 26 46.46 1-甲基腺苷 ↑ 1.61** ↑ 1.95* ↑ 1.21 27 48.03 海藻糖 ↑ 4.75*** ↑ 4.07*** − − 28 49.25 甘露糖 ↑ 12.88*** ↑ 8.68** ↓ 0.68 29 49.71 半乳糖醇 ↑ 2.32*** ↑ 3.12*** ↑ 1.34* 注：FC值=实验组平均值/对照组平均值；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与对照组比较。
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