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紫杉醇（PTX）是从裸子植物红豆杉树皮分离得到的天然次生代谢产物，属于微管蛋白抑制剂，在临床上广泛用于卵巢癌、非小细胞肺癌和乳腺癌的治疗[1]。传统的PTX注射液因添加了聚氧乙烯蓖麻油而导致过敏反应，并加重PTX的外周神经毒性，还影响药物分子向组织间扩散，影响抗肿瘤效应，且滴注时间过长[2]。前药设计在提高药物生物利用度，增加药物稳定性，减小毒副作用，延长药物作用时间等方面具有很大的优势[3]。其中，长链饱和脂肪酸如肉豆蔻酸（MA）[4]、棕榈酸（PA）[5]和硬脂酸（SA）[6]等常用于药物成酯前药修饰。例如，治疗类风湿性关节炎的上市药物地塞米松棕榈酸酯注射液，就是通过饱和脂肪酸棕榈酸与地塞米松成酯反应形成地塞米松棕榈酸酯前药，继而制备成纳米前药，极大地增加了制剂的稳定性与成药性[6]。
脂质体作为载体递送脂溶性药物近年来受到广泛关注，这为PTX脂质体制剂的研发提供了重要依据。据此，我们对PTX的C2′羟基进行酯化修饰形成脂溶性较强的PTX肉豆蔻酸酯（PTX-MA）、PTX棕榈酸酯（PTX-PA）和PTX硬脂酸酯（PTX-SA）等前药分子，然后将其分别制备成PTX-MA脂质体（PTX-MA-L）、PTX-PA脂质体（PTX-PA-L）和PTX-SA脂质体（PTX-SA-L），不仅可以解决PTX成药性差的问题，也可以提高载药量、增加药物稳定性、改善药代动力学和药效学[7-10]。
该研究以卡马西平为内标，成功建立了小鼠血浆中PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA含量的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）测定方法，在此基础上比较考察了其脂质体PTX-MA-L、PTX-PA-L和PTX-SA-L在小鼠体内的药代动力学特性，从而为PTX脂肪酸酯前药的纳米制剂研发提供科学依据。
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Vanquish™ 超高相液相色谱仪（美国Thermo scientific公司）；TSQ Altis™ 三重四级杆质谱仪（美国Thermo scientific公司）；台式高速冷冻离心机（上海伟进生物科技有限公司）。
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紫杉醇（纯度≥98%）购自江苏红豆杉生物医药科技股份有限公司；紫杉醇肉豆蔻酸酯（PTX-MA，纯度≥98%）及其脂质体（PTX-MA-L）、紫杉醇棕榈酸酯（PTX-PA，纯度≥98%）及其脂质体（PTX-PA-L）、紫杉醇硬脂酸酯（PTX-SA，纯度≥98%）及其脂质体（PTX-SA-L）均为海军军医大学药学系药剂学教研室自制；甲酸、超纯水、甲醇和乙腈购自赛默飞世尔（中国）有限公司，均为色谱纯；卡马西平购自上海源叶生物科技有限公司。
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ICR小鼠[雌性，（18±2） g，购自浙江维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号：SCXK（浙）2020-0002]。
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色谱柱：Eclipse Plus C8色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；流动相：0.2%甲酸水溶液（A）-甲醇（B）梯度洗脱；梯度洗脱程序：20% B~ 60% B（0~0.3 min），60% B~ 98% B（0.3~ 3.9 min），98% B~ 60% B（3.9~ 4.8 min），60% B~ 20% B（4.8~ 5.2 min），20% B（5.2~ 7.0 min）；流速：0.3 ml/min；进样量：10 µl；柱温：30 ℃。
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电喷雾离子源（ESI）采用正离子采集模式。离子源参数：电喷雾电压：3.5 kV（+）；离子传输管温度：325 ℃；雾化温度：275 ℃；鞘气压力：35 Arb；辅气压力：5 Arb；毛细管压力：1.5 mTorr。定量分析离子分别为：m/z
1086.7 →518.3（PTX-MA），m/z1114.5 →546.3（PTX-PA），m/z1142.7 →574.4（PTX-SA），m/z 237.1→194.0（卡马西平，内标）。 -
分别精密称取10.00 mg 3种对照品（PTX-MA、PTX-PA、PTX-SA）置于10 ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成1.00 mg/ml的对照品储备液。吸取一定量的对照品储备液，用甲醇稀释成一系列浓度的工作溶液，置于4 ℃冰箱保存备用。
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精密称取10.00 mg卡马西平，用乙腈溶解并定容，配制成1.00 mg/ml的内标储备液。吸取一定量的内标储备液，用乙腈稀释成30.00 ng/ml工作溶液，置于4℃冰箱保存备用。
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精密量取100 μl小鼠血浆样品液于1.5 ml离心管中，加入300 µl内标溶液，涡旋混合1 min后，13 000 r/min离心10 min，吸取上清液，置于新的EP管中，于40 ℃下真空离心挥干溶剂。精密量取200 µl乙腈复溶样品，过0.22 μm尼龙滤膜，即制得小鼠血浆样品溶液。
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精密量取100 µl空白血浆，用300 µl乙腈代替300 µl内标液，按“2.3”项下方法处理后，再按“2.1”项下方法测定，记录空白血浆色谱图；精密量取100 µl空白血浆，按“2.3”项下操作处理后，再按“2.1”项下方法测定，记录含内标的血浆样品色谱图；精密量取含适量PTX-MA、PTX-PA、PTX-SA的空白血浆样品各100 µl，用300 µl乙腈代替300 µl内标液，按“2.3”项下方法处理后，再按“2.1”项下方法测定，记录含PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA的血浆样品色谱图。结果见图1，内标、PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA的色谱峰附近无明显内源性杂质峰干扰，其保留时间分别为2.41、4.37、4.84和5.28 min，表明血浆中内源性物质不干扰PTX-MA、PTX-PA、PTX-SA和内标的测定。
图 1 空白血浆及内标、PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA的血浆样品液的UPLC-MS/MS色谱图
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精密量取95 µl小鼠空白血浆，加入5 µl紫杉醇脂肪酸酯对照样品（PTX-MA或PTX-PA或PTX-SA）工作溶液配制成5.00、25.00、50.00、100.00、300.00和500.00 ng/ml的PTX-MA或PTX-PA或PTX-SA系列浓度对照样品小鼠血浆液，按“2.3”项下操作处理后，再按“2.1”项下进样测定。以PTX-MA或PTX-PA或PTX-SA对照样品浓度为横坐标（X），样品峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标（Y）进行线性回归分析，求得各自回归方程，结果见表1。
表 1 PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA的标准曲线参数
对照样品 回归方程 r 线性范围（ng/ml） PTX-MA Y=0.186 2 X−1.984 0.995 8 5.00~500.00 PTX-PA Y=0.668 5 X−12.977 0.998 4 5.00~500.00 PTX-SA Y=0.402 1 X−7.171 0.998 8 5.00~500.00 -
取空白小鼠血浆，分别配制含PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA浓度为10.00、250.00和375.00 ng/ml的低、中、高3个浓度的小鼠血浆样品溶液，置于−80 ℃低温冰箱保存。按“2.3”项下方法处理后，再按“2.1”项下方法进样分析测定。每个浓度5份，每天连续进样3次，连续3 d。根据测得PTX-MA、PTX-PA、PTX-SA和内标的峰面积，计算PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA的实测浓度，考察PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA低、中、高浓度在小鼠血浆中的日内及日间的准确度和精密度。如表2结果显示，PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA在低、中、高3个浓度的日内和日间的精密度RSD均<8.4%，准确度均>95%，表明仪器精密度良好。
表 2 PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA样本的精密度（n = 5）
对照样品 理论浓度（ng/ml） 日内精密度 日间精密度 实测浓度（ng/ml） 回收率（%） RSD（%） 实测浓度（ng/ml） 回收率（%） RSD（%） PTX-MA 10.00 9.93±0.83 99.36±8.32 8.38 10.37±0.61 103.67±6.06 5.84 250.00 242.29±10.93 96.84±4.51 4.51 247.42±5.30 98.97±2.12 2.14 375.00 371.31±6.30 99.02±1.68 1.70 373.37±6.20 99.57±1.65 1.66 PTX-PA 10.00 9.83±0.50 98.28±5.00 5.09 10.25±0.55 102.53±5.52 5.38 250.00 248.42±6.81 99.37±2.72 2.74 246.93±5.74 98.77±2.29 2.32 375.00 373.79±8.70 99.68±2.32 2.33 371.59±4.12 99.09±1.10 1.11 PTX-SA 10.00 9.59±0.51 95.90±5.08 5.30 10.33±0.67 103.27±6.72 6.50 250.00 248.81±7.89 99.53±3.16 3.17 245.92±5.04 98.37±2.01 2.05 375.00 374.36±8.81 99.83±2.35 2.35 371.26±2.43 99.00±0.65 0.65 -
取空白小鼠血浆，分别配制低、中、高3个浓度（10.00、250.00和375.00 ng/ml）的血浆样品（PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA）液各3份，分别于室温放置12 h、−20 ℃冻存5 d后复融或−20 ℃反复冻融3次，按“2.3”项下方法处理样本，再按“2.1”项下方法进样分析测定。结果显示，在上述考察条件下，PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA的低、中、高3个实测浓度的RSD均<10%，表明PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA的小鼠血浆样品在室温放置12 h、−20 ℃冻存5 d及−20 ℃反复冻融3次条件下稳定性良好。
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取空白小鼠血浆，分别配制低、中、高3个浓度（10.00、250.00和375.00 ng/ml）的血浆样品（PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA）液各3份，按“2.3”项下方法处理样本，再按“2.1”项下方法进样分析测定，计算所得浓度为A。另取空白血浆，按“2.3”项下方法处理样本后，再加入PTX-MA或PTX-PA或PTX-SA工作液形成终浓度分别为10.00、250.00和375.00 ng/ml的3种不同浓度的标准溶液，按“2.1”项下方法进样分析测定，计算所得浓度为B。用甲醇配制含内标（30 ng/ml）的低、中、高3个浓度（10.00、250.00 和375.00 ng/ml）的PTX-MA或PTX-PA或PTX-SA的样品溶液，按“2.1”项下方法进样分析测定，计算所得浓度为C。提取回收率为（A/B）×100%，基质效应为（B/C）×100%。结果见表3，PTX-MA、PTX-PA或PTX-SA的平均提取回收率和基质效应的RSD均<10%，符合测定要求。
表 3 小鼠血浆中PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA的提取回收率和基质效应（n = 3）
对照样品 理论浓度（ng/ml） 回收率（%） RSD（%）a 基质效应（%） RSD（%）b PTX-MA 10.00 79.82±6.60 8.28 95.36±6.55 6.87 250.00 88.35±2.84 3.22 96.28±3.59 3.73 375.00 92.08±2.46 2.67 98.86±1.46 1.48 PTX-PA 10.00 73.34±7.24 9.88 94.28±1.96 2.08 250.00 83.58±2.24 2.68 98.46±1.86 1.89 375.00 89.47±1.51 1.68 98.88±0.68 0.69 PTX-SA 10.00 61.90±4.11 6.63 95.90±5.08 5.30 250.00 77.26±2.88 3.73 98.78±2.22 2.25 375.00 84.43±1.21 1.44 99.08±1.01 1.02 注：a：回收率的相对标准偏差；b:基质效应的相对标准偏差。 -
雌性ICR小鼠90只，于实验前12 h禁食不禁水， 标记称重后分为PTX-MA-L、PTX-PA-L、PTX-SA-L 3组。以紫杉醇等摩尔剂量15.00 mg/kg小鼠尾静脉给药，分别于给药后2 min、30 min、1 h、2 h、4 h、6 h、12 h、1 d、3 d、14 d，小鼠眼眶静脉丛取血0.3 ml（每个时间点各取3只小鼠），置于装有肝素钠的离心管中，以10 000 r/min离心3 min后，上清液置于−80 ℃冰箱保存待测。上述血浆样品液按“2.3”项下方法处理后按“2.1”项下方法进样测定。所得数据用DSA2.0软件进行处理，以三房室模型计算得到药代动力学参数，结果见表4。
表 4 小鼠尾静脉注射3种紫杉醇脂肪酸酯前药脂质体药代动力学参数（n = 3）
关键参数 单位 PTX-MA-L PTX-PA-L PTX-SA-L Cmax ng/L 226 436.10±4 932.89 289 171.80±5 311.62 333 508.00±3 464.10 AUC0-14 d ng·h/L 502 384.75±3 464.10 776 973.44±5 196.15 1 668 984.05±6 350.85 AUC0-∞ ng·h/L 503 800.86±8 082.90 777 835.54±6 429.10 1 669 696.54±5 773.50 t1/2 h 14.78±2.00 44.49±3.51 69.32±2.15 V L/kg 45.68±1.00 62.57±1.53 68.58±3.10 CL L·kg/h 29.06±2.52 24.94±2.08 13.74±2.52 -
该研究以卡马西平为内标，建立了小鼠血浆中3种紫杉醇脂肪酸酯前药含量的UPLC-MS/MS测定方法。其中，内标、PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA色谱峰保留时间分别为2.41、4.37、4.84和5.28 min，均达到基线分离。相比前期研究中血浆PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA含量的传统HPLC测定方法存在分离度差、灵敏度低的缺陷而无法满足检测要求，该方法具有选择性更好、分离范围更广、分离能力更强、灵敏度及重现性更高等优点，并成功应用于3种紫杉醇脂肪酸酯前药脂质体（PTX-MA-L、PTX-PA-L和PTX-SA-L）的小鼠体内药代动力学参数的测定。
该研究采用乙腈直接沉淀血浆蛋白的方式，短时间内可检测小鼠血浆中3种紫杉醇脂肪酸酯，体现了方法的便捷性和可控性。另外，通过优化流动相组成以及比例，使得内源性杂质与药物样品具有较好的分离效果。特别是在流动相中加入甲酸，不仅可以改善峰形，也可促进样品离子化，提高质子化检测能力，从而提高该方法的检测灵敏度。
总之，该研究建立的UPLC-MS/MS测定方法专属性强、操作简便、灵敏度和精密度高、重现性和稳定性好， 可用于定量测定小鼠体内血浆中3种紫杉醇脂肪酸酯前药含量。小鼠体内药代动力学研究结果显示， 3种紫杉醇脂肪酸酯脂质体PTX-MA-L、PTX-PA-L和PTX-SA-L在小鼠体内的t1/2分别为14.78、44.49和69.32 h，清除率（CL）分别为29.06、24.94和13.74 L·kg/h，提示随着脂肪酸碳链长度的增加，紫杉醇脂肪酸酯在小鼠体内的t1/2大幅延长、CL则显著降低，表明紫杉醇经不同链长饱和脂肪酸酯化修饰可明显改变其体内药动学特性，其中，紫杉醇棕榈酸酯脂质体（PTX-PA）具有适宜的药动学参数，值得下一步深入开发研究。
Determination and pharmacokinetics investigation of prodrugs of paclitaxel fatty acid esters in mouse plasma by UPLC-MS/MS
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摘要:
目的 建立小鼠血浆中紫杉醇肉豆蔻酸酯（PTX-MA）、紫杉醇棕榈酸酯（PTX-PA）和紫杉醇硬脂酸酯（PTX-SA）等3种紫杉醇脂肪酸酯的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）测定方法，并初步考察其脂质体的小鼠体内药代动力学特性。 方法 采用Eclipse Plus C8色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm），0.2%甲酸水溶液（A）和甲醇（B）的不同比例混合液为流动相，梯度洗脱，三重四极杆串联质谱多重反应监检测（MRM），流速：0.3 ml/min，柱温：30℃，进样量：10 μl。 结果 PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA在5.0~500.0 ng/ml范围内均呈良好的线性关系（r >0.995 0），日内和日间精密度、稳定性、提取回收率和基质效应试验结果的RSD均小于10%；3种紫杉醇脂肪酸酯脂质体PTX-MA-L、PTX-PA-L和PTX-SA-L在小鼠体内的半衰期（t1/2）分别为14.78、44.49和69.32 h，清除率（CL）分别为29.06、24.94和13.74 L·kg/h。 结论 该方法专属性高、灵敏、操作简便、稳定性好，可用于小鼠血浆中紫杉醇脂肪酸酯的含量测定。小鼠体内药代动力学研究结果表明，随脂肪酸碳链增加，紫杉醇脂肪酸酯在小鼠体内t1/2呈大幅延长，清除率则显著降低，提示紫杉醇经不同链长饱和脂肪酸酯化修饰可改变其体内药代动力学特性，从而为紫杉醇脂肪酸酯前药的纳米制剂研发提供科学依据。 -
关键词:
- 紫杉醇 /
- 脂肪酸酯 /
- 前药 /
- 高效液相色谱-串联质谱法 /
- 药动学
Abstract:Objective To establish an UPLC-MS/MS method for determinating content of three paclitaxel fatty acid esters such as paclitaxel myristate （PTX-MA）, paclitaxel palmitate （PTX-PA） and paclitaxel myristate （PTX-SA） in mouse plasma, and preliminarily investigate the pharmacokinetic characteristics of their liposomes in mice. Methods Eclipse Plus C8 chromatography column （2.1 mm×50 mm, 1.8 μm） was used with different proportions of 0.2% formic acid aqueous solution （A） and methanol （B） mixture as mobile phase for gradient elution at a flow rate of 0.3 ml/min. The collum temperature was 30℃. The sample injection volume was 10 μl. The triple quadrupole mass series spectrometer was used as multi-reaction monitoring （MRM）. Results PTX-MA, PTX-PA and PTX-SA all exhibited a good linear relationship in the range of 5.0~500.0 ng/ml （r> 0.9950 ）. Their RSD of precision, stability, extraction recovery rate and matrix effect test results was all less than 10%. The half-lives （t1/2） for liposomes of three paclitaxel fatty acid esters PTX-MA-L、PTX-PA-L and PTX-SA-L in mice were 14.78 h, 44.49 h and 69.32 h individually, and their clearance rates （CL） were 29.06 L·kg/h, 24.94 L·kg/h and 13.74 L·kg/h, respectively.Conclusion This method had high specificity, sensitivity, easy operation and good stability, which could be used for the determination of paclitaxel fatty acid esters in mouse plasma. The results of pharmacokinetic studies in mice showed that t1/2 for paclitaxel fatty acid esters were significantly prolonged, and the clearance rate were significantly reduced with the length of fatty acid carbon chains increasement, which indicated that esterification of paclitaxel with different chain length saturated fatty acids could obviously alter its in vivo pharmacokinetic properties, which provided scientific basis for the research and development of nano formulations of paclitaxel fatty acid ester prodrug. -
Key words:
- Paclitaxel /
- Fatty acid esters /
- Prodrug /
- UPLC-MS/MS /
- Pharmacokinetics
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定量核磁共振技术（qNMR）在现代化学、生物医药、食品科学等领域中扮演着至关重要的角色[1, 2]。其原理是基于核磁共振现象，当将含有1H、13C、19F、31P等特定磁性核的样品置于外加磁场中，并施加一定的频率射频脉冲时，特定磁性核会吸收能量并进入激发态。当这些原子核回到基态时，会释放出能量，产生NMR信号[3]。通过分析这些信号的强度，可以定量分析样品中目标分子[4, 5]。与传统的化学分析方法相比，qNMR技术具有准确度高、操作简便、无需标记和高通量检测等优点，已相继被《美国药典》、《欧洲药典》、《中国药典》收录，并广泛应用于多个领域[6]。如用于药物成分的定量分析，检测食品中的添加剂和污染物，监测环境中的有害物质，评估环境污染程度。此外，qNMR还在代谢组学、材料科学等领域中有着重要的应用[7, 8]。
核磁共振磷谱是一种核磁共振分析方法。其用于鉴定含磷化合物的结构，定量分析含磷化合物的含量，或监测含磷化合物动力学及其在生物体中的代谢过程[9]。由于31P原子核天然丰度为100 %，旋磁比较高，化学位移范围宽，使得31P-NMR成为研究含磷化合物极为有效的工具[10, 11]。通过分析31P-NMR谱图，可以获得关于磷化合物的分子结构、化学环境等重要信息[12]。
磷酸氢钙咀嚼片是一种以磷酸氢钙为主要原料，蔗糖、淀粉、硬脂酸镁为辅料制成的补钙类药品，具有参与骨骼形成、骨组织重建、降低毛细血管通透性等药理作用，广泛应用于儿童生长发育的促进和钙质补充。现行中国药典采用乙二胺四醋酸二钠滴定法测定磷酸氢钙片剂中的磷酸氢钙的含量[13, 14]，但该法干扰因素多、灵敏度低、操作复杂。本研究建立了一种核磁共振磷谱定量（31P-qNMR）测定磷酸氢钙咀嚼片中磷酸氢钙含量的方法，相比于现有测定方法，操作简单，且专属性强，快速准确。
1. 仪器与试剂
仪器：600 MHz NMR（Bruker，AVANCE II）、分析天平（Shimadzu，AUW220D）、5 mm 同轴核磁管（Wilmad，535-pp-7）。
样品与试剂：某公司磷酸氢钙咀嚼片、重水（Cambridge Isotope Laboratories, Ins）、六甲基磷酰三胺（Adamas，含量≥98.0%，）、磷酸氢钙对照品（中国食品药品检定研究院，批号100410-201802）、稀盐酸（Adamas，分析纯）。
2. 实验方法
2.1 溶液配制
2.1.1 供试品溶液的制备
取20片磷酸氢钙咀嚼片，精密称定后研细，精密称取细粉适量（约相当于含磷酸氢钙0.60 g）于100 ml量瓶中，加入10 ml 0.1 mol/L盐酸溶液，超声5 min后加入重水10 ml，用水稀释至刻度，摇匀后过滤。制得含磷酸氢钙浓度约为6 mg/ml的供试品溶液，精密量取260 μl于同轴核磁管外管。
2.1.2 内标物溶液配制
精密量取40 mg六甲基磷酰三胺于5 ml量瓶中，加入0.5 ml重水后，用水稀释至刻度，摇匀，精密量取220 μl于同轴核磁管内管。
2.1.3 对照品溶液配制
精密称定磷酸氢钙对照品5.009 6 g于100 ml量瓶中，加10 ml 0.1 mol/L 稀盐酸溶解后定容，摇匀后得浓度为50.096 mg/ml的磷酸氢钙对照品储备液，稀释至适当浓度后精密量取260 μl于同轴核磁管外管。
2.2 测定条件与处理
精密量取260 μl待测样品、220 μl内标物溶液分别置于同轴核磁管外管和内管，进行数据采集。采用zgpg30脉冲序列在25 ℃下获取31P-NMR谱。具体实验参数设置如下：谱宽频率（SWH）= 39 682.5 Hz，采样点数（TD）= 65 K，采样时间（AQ）= 0.825 s，采样次数（NS）= 128，空扫次数（DS）= 4，增益（RG）= 1 150，其他实验参数均采用仪器推荐参数。采用Topspin3.1 软件进行数据处理。
3. 方法学考察
3.1 专属性
按“2.1”项对空白辅料、对照品、和实测样品进行处理后进样，图1表明辅料及溶剂成分对被测组分的测定没有干扰，且磷酸氢钙的化学位移为δ 1.06，内标的化学位移为δ 29.02，内标对药物的测定也没有干扰。
图 1 磷酸氢钙及内标的核磁共振磷谱检测图谱A.空白辅料的核磁共振磷谱检测图谱；B.磷酸氢钙对照品及内标的核磁共振磷谱检测图谱；C.实测样本的核磁共振磷谱检测图谱；600MHz NMR，溶剂D2O，内标（IS）六甲基磷酰三胺3.2 线性与范围
量取9.0、7.0、5.0、3.0、1.0 ml磷酸氢钙对照品储备液置于50 ml量瓶中，稀释至刻度，制成含磷酸氢钙对照品浓度为9.018、7.014、5.010、3.006、1.002 mg/ml 的标准曲线溶液。分别量取260 μl标准曲线溶液于同轴核磁管外管，按照“2.2”项下方法测定31P NMR谱。以磷酸氢钙对照品响应信号和内标响应信号比为纵坐标，标准曲线系列溶液浓度为横坐标（mg/ml）进行线性回归，计算得回归方程为：A=0.004 3+0.183 6C，表明磷酸氢钙在1.0～9.0 mg/ml 范围内线性范围较好，r=0.999 9。
3.3 重复性试验
按“2.1”项下重复精密称取6份片剂细粉，经相同处理后，按“2.2”项下进行检测，记录响应信号面积，根据工作曲线法计算其含量，得磷酸氢钙咀嚼片中磷酸氢钙含量为98.7 %，RSD为0.098 %，表明该方法重复性满足要求。
3.4 回收率测定
精密称定磷酸氢钙对照品1.002 g于100 ml量瓶中，加入10 ml 0.1 mol/L 盐酸溶解后加水至刻度线，摇匀后得浓度为10.02 mg/ml的磷酸氢钙对照品储备液。
移液管精密移取供试品储备液2.00 ml于5 ml容量瓶中，分别精确加入10.02 mg/ml对照品溶液0.75、1.00、1.25 ml，加水稀释至刻度线后得到低、中、高3种浓度的回收率测定溶液，每种浓度平行配制3份，测定并计算加样回收率，得平均回收率为98.02 %、98.16 %、98.47 %，RSD分别为 0.31 %、0.68 %、0.62 %（n=9），证明该方法准确度较好。
3.5 稳定性试验
取同一样品溶液分别在0、4、8、12 h下进行测定，记录供试品信号峰面积，计算样品中磷酸氢钙含量。4次测量的信号峰面积的RSD值仅为0.26 %，表明供试品溶液在室温下放置12 h稳定性较好。
3.6 磷酸氢钙含量测定
分别精密量取5份供试品溶液260 μl于同轴核磁管外管，按照“2.2”项下方法测定31P NMR谱图并计算样品中待测组分磷酸氢钙的含量，结果表明样品中磷酸氢钙平均含量为98.19 %，RSD = 0.10 %。
4. 结果与讨论
内标物的选择是定量核磁共振方法建立的关键，31P-qNMR定量检测中内标物质应选择结构稳定、不与待测样品发生反应、内标物信号峰与待测样品信号峰分离度高等特点。常见的磷核磁共振定量内标物有六甲基磷酰三胺（HMDA）、磷酸、甲基膦酸、亚甲基二磷酸等。其中，六甲基磷酰三胺易溶于氘代溶剂，且化学性质稳定，化学位移值约为δ 29.01，与待测物磷酸氢钙分离度好，无重叠，故本实验选取六甲基磷酰三胺作为内标物。经过方法学考察后，表明磷酸氢钙在1.0～9.0 mg/ml范围内线性相关，低、中、高3种浓度的加样回收率结果为98.0 %、98.1 %和98.4 %。本研究建立了一种精密度高、专属性强的含磷药物的含量检测方法，且无需自身对照物、前处理简便、检测速度快，为含磷药品质量控制提供了新的策略。
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图 1 空白血浆及内标、PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA的血浆样品液的UPLC-MS/MS色谱图
A.空白血浆；B.内标；C. PTX-MA；D. PTX-PA；E. PTX-SA
表 1 PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA的标准曲线参数
对照样品 回归方程 r 线性范围（ng/ml） PTX-MA Y=0.186 2 X−1.984 0.995 8 5.00~500.00 PTX-PA Y=0.668 5 X−12.977 0.998 4 5.00~500.00 PTX-SA Y=0.402 1 X−7.171 0.998 8 5.00~500.00 
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表 2 PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA样本的精密度（n = 5）
对照样品 理论浓度（ng/ml） 日内精密度 日间精密度 实测浓度（ng/ml） 回收率（%） RSD（%） 实测浓度（ng/ml） 回收率（%） RSD（%） PTX-MA 10.00 9.93±0.83 99.36±8.32 8.38 10.37±0.61 103.67±6.06 5.84 250.00 242.29±10.93 96.84±4.51 4.51 247.42±5.30 98.97±2.12 2.14 375.00 371.31±6.30 99.02±1.68 1.70 373.37±6.20 99.57±1.65 1.66 PTX-PA 10.00 9.83±0.50 98.28±5.00 5.09 10.25±0.55 102.53±5.52 5.38 250.00 248.42±6.81 99.37±2.72 2.74 246.93±5.74 98.77±2.29 2.32 375.00 373.79±8.70 99.68±2.32 2.33 371.59±4.12 99.09±1.10 1.11 PTX-SA 10.00 9.59±0.51 95.90±5.08 5.30 10.33±0.67 103.27±6.72 6.50 250.00 248.81±7.89 99.53±3.16 3.17 245.92±5.04 98.37±2.01 2.05 375.00 374.36±8.81 99.83±2.35 2.35 371.26±2.43 99.00±0.65 0.65
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表 3 小鼠血浆中PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA的提取回收率和基质效应（n = 3）
对照样品 理论浓度（ng/ml） 回收率（%） RSD（%）a 基质效应（%） RSD（%）b PTX-MA 10.00 79.82±6.60 8.28 95.36±6.55 6.87 250.00 88.35±2.84 3.22 96.28±3.59 3.73 375.00 92.08±2.46 2.67 98.86±1.46 1.48 PTX-PA 10.00 73.34±7.24 9.88 94.28±1.96 2.08 250.00 83.58±2.24 2.68 98.46±1.86 1.89 375.00 89.47±1.51 1.68 98.88±0.68 0.69 PTX-SA 10.00 61.90±4.11 6.63 95.90±5.08 5.30 250.00 77.26±2.88 3.73 98.78±2.22 2.25 375.00 84.43±1.21 1.44 99.08±1.01 1.02 注：a：回收率的相对标准偏差；b:基质效应的相对标准偏差。
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表 4 小鼠尾静脉注射3种紫杉醇脂肪酸酯前药脂质体药代动力学参数（n = 3）
关键参数 单位 PTX-MA-L PTX-PA-L PTX-SA-L Cmax ng/L 226 436.10±4 932.89 289 171.80±5 311.62 333 508.00±3 464.10 AUC0-14 d ng·h/L 502 384.75±3 464.10 776 973.44±5 196.15 1 668 984.05±6 350.85 AUC0-∞ ng·h/L 503 800.86±8 082.90 777 835.54±6 429.10 1 669 696.54±5 773.50 t1/2 h 14.78±2.00 44.49±3.51 69.32±2.15 V L/kg 45.68±1.00 62.57±1.53 68.58±3.10 CL L·kg/h 29.06±2.52 24.94±2.08 13.74±2.52
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