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性早熟是儿童常见的内分泌疾病，女童主要表现为8岁前出现第二性征发育或10岁前月经来潮。青春期提前可导致发育进程加速、骨骼提前闭合，进而影响儿童成年后的身高[1-2]。目前性早熟发病率呈逐年上升的趋势。中医将性早熟分为3个证型，其中以阴虚火旺型最为常见[3]。
复方地黄合剂是上海市儿童医院的院内制剂，于20世纪90年代开始应用于临床，由知母、黄柏、生地黄、制山茱萸、赤芍、泽泻、茯苓、熟地黄、黄芩片、制女贞子、制香附、焦栀子、广郁金和当归14味中药组成，具有滋阴泻火，理气活血的功效，用于阴虚火旺型女童真性性早熟的辅助治疗[4-7]。目前文献多采用高效液相色谱法（HPLC）测定复方地黄合剂中黄芩苷的含量[5,7]，存在检测指标单一，质量控制不全面，分析时间较长，灵敏度相对低等缺点。本研究采用超高效液相色谱串联质谱法（UPLC-MS/MS）同时测定了复方地黄合剂中10种成分的含量，具有灵敏度高、重现性好、稳定易操作的特点，以期为复方地黄合剂的质量控制提供参考。
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十万分之一天平CPA225D型[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；涡旋混合机TYXH-Ⅱ（天悦电子）；5427R高速离心机（Eppendorf）；10~
1000 μl可调式移液器（Eppendorf）；Waters ACQUITYTM UPLC超高效液相色谱仪（Waters）；TRIPLE QUAD5500 三重四级杆质谱仪（SCIEX）。 -
小檗碱（货号：B21379，>98%）、芒果苷（货号：B20837，>98%）、马钱苷（货号：B20822，>98%）、栀子苷（货号：B21661，>98%）（上海源叶生物科技有限公司）；黄柏碱（批号：111896-201805）、莫诺苷（批号：111998-202205）、芍药苷（批号：110736-202246）、黄芩苷（批号：110715-202223）、特女贞苷纯度（>98%）、毛蕊花糖苷（>98%）（天津众合生物科技有限公司）；复方地黄合剂（批号：230903、230906、230908、231001、231002、231006、231101，上海美优制药有限公司）。
甲醇（色谱纯，Sigma-Aldrich）；水（超纯水，屈臣氏）。
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色谱柱：ACQUITY UPLC BEH-C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相：0.1%甲酸水（A）-甲醇（B），梯度洗脱，程序见表1；柱温：35℃；样品室温度：15℃；流速：0.3 ml/min；进样量：2 μl。
表 1 色谱洗脱条件
时间（t/min） A（%） B（%） 0.0 95 5 2.0 60 40 7.0 55 45 8.0 3 97 10.0 0 100 10.1 95 5 12.0 95 5 -
AB Sciex TRIPLE QUAD
5500 三重四级杆质谱，正负离子模式分析，多反应监测（MRM）扫描方式；离子源电压：5 500 V；离子源温度：500℃。MRM方法参数见表2。表 2 10种成分质谱参数
成分 离子源
模式母离子
（m/z）子离子
（m/z）去簇电压
（DP/V）碰撞能量
（CE/V）小檗碱 + 336.1 320.2 60.0 41.0 黄柏碱 + 342.3 192.3 15.0 32.0 特女贞苷 + 709.4 547.1 20.0 42.0 芒果苷 − 421.2 301.0 19.1 39.1 莫诺苷 − 451.2 243.0 20.0 23.0 马钱苷 − 435.3 227.0 64.3 18.6 芍药苷 − 524.9 449.2 80.0 20.0 栀子苷 − 433.1 225.1 34.0 20.0 黄芩苷 − 445.1 269.0 41.0 32.0 毛蕊花糖苷 − 623.1 161.1 190.0 46.0 -
精密称取小檗碱、黄柏碱、特女贞苷、芒果苷、莫诺苷、马钱苷、芍药苷、栀子苷、黄芩苷、毛蕊花糖苷对照品适量，用50%甲醇/水分别配制成1.0 mg/ml的对照品储备液。置于4℃冰箱。精密吸取各对照品储备液适量，用50%甲醇/水逐级稀释成6个不同浓度梯度的混合对照品溶液。
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取复方地黄合剂1 ml，14 000 r/min离心取上清10 μl，加入50%甲醇/水990 μl，涡旋3 min，14 000 r/min离心取上清10 μl，加入50%甲醇/水990 μl，即得供试品溶液。
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以上述色谱条件和质谱条件进样分析，小檗碱、黄柏碱、特女贞苷、莫诺苷、芒果苷、栀子苷、马钱苷、芍药苷、毛蕊花糖苷和黄芩苷的保留时间分别为2.55、4.04、4.29、2.76、3.09、3.16、3.26、3.33、3.66、6.51 min，峰形良好，基线平稳。表明在此色谱和质谱条件下，复方地黄合剂中其他成分对测定结果无干扰，见图1。
图 1 10种成分的色谱图
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吸取“2.3.1”项下混合对照品溶液，取各个浓度进样分析，以对照品峰面积（Y）为纵坐标，对照品浓度（X）为横坐标做线性回归，得标准曲线方程。将标准曲线中最低浓度的混合对照品溶液逐步稀释，分别以S/N=3和S/N=10时各对照品的浓度作为检测限（LOD）和定量限（LOQ）。10种成分在各自浓度范围内线性关系良好（表3）。
表 3 10种成分的标准曲线回归方程
化合物 线性方程 r 线性范围（ng/ml） LOD（ng/ml） LOQ（ng/ml） 小檗碱 Y=104 000X+19 800 0.999 2 5~200 0.003 0.008 黄柏碱 Y=391 000X+37 700 0.997 2 2~100 0.031 0.125 特女贞苷 Y=240X−225 0.996 1 5~200 0.125 0.250 芒果苷 Y=1 290X−1 890 0.999 0 2~100 0.063 0.125 莫诺苷 Y=5 460X+35 0.999 2 2~200 0.125 0.250 马钱苷 Y=1 890X+225 0.999 3 2~100 0.125 0.250 芍药苷 Y=8 910X−1 060 0.999 1 10~500 0.125 0.250 栀子苷 Y=8 600X+453 0.999 5 10~500 0.125 0.250 黄芩苷 Y=1 250X+5 080 0.996 0 50~ 1000 0.250 1.000 毛蕊花糖苷 Y=8 350X−1 760 0.998 4 2~100 0.003 0.008 -
取批号为230906的复方地黄合剂，按“2.3.2”项下制备供试品溶液，以上述色谱条件和质谱条件进样分析，重复进样6次，记录各对照品的浓度，并计算其相对标准偏差（RSD）值。结果显示，小檗碱、黄柏碱、特女贞苷、芒果苷、莫诺苷、马钱苷、芍药苷、栀子苷、黄芩苷、毛蕊花糖苷10种成分的峰面积RSD分别为1.1%、1.5%、1.9%、1.3%、2.7%、1.2%、1.0%、2.0%、0.8%、0.9%，表明该仪器的精密度良好。
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取批号为230906的复方地黄合剂，按“2.3.2”项下制备供试品溶液6份，以上述色谱条件和质谱条件进样分析，记录各对照品的浓度，并计算其RSD值。结果显示，小檗碱、黄柏碱、特女贞苷、芒果苷、莫诺苷、马钱苷、芍药苷、栀子苷、黄芩苷、毛蕊花糖苷10种成分的峰面积RSD分别为1.8%、3.8%、4.1%、1.4%、2.0%、1.8%、2.0%、3.1%、2.4%、2.1%，表明该方法的重复性良好。
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取批号为230906的复方地黄合剂，按“2.3.2”项下制备供试品溶液1份，分别于0、4、8、12、24 h进样，测得各对照品的浓度，考察样品在进样器中放置稳定性，计算其RSD值。结果表明样品中小檗碱、黄柏碱、特女贞苷、芒果苷、莫诺苷、马钱苷、芍药苷、栀子苷、黄芩苷和毛蕊花糖苷的RSD分别为2.0%、3.6%、3.8%、0.9%、2.0%、1.9%、3.9%、3.9%、2.5%、2.8%，表明在进样器中放置24 h稳定性良好。
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吸取批号为230906的复方地黄合剂已知含量样品1 ml，分别精密加入小檗碱、黄柏碱、特女贞苷、芒果苷、莫诺苷、马钱苷、芍药苷、栀子苷、黄芩苷和毛蕊花糖苷的对照品溶液适量，14 000 r/min离心取上清5 μl，加入995 μl 50%甲醇/水，涡旋，14 000 r/min离心取上清10 μl，加入990 μl 50%甲醇/水，涡旋，14 000 r/min离心取上清200 μl，平行制备6份，按上述色谱条件和质谱条件进样分析，计算平均加样回收率和RSD。结果表明样品中小檗碱、黄柏碱、特女贞苷、芒果苷、莫诺苷、马钱苷、芍药苷、栀子苷、黄芩苷和毛蕊花糖苷的平均加样回收率分别为93.2%、108.7%、112.1%、106.7%、106.2%、106.9%、104.8%、103.8%、104.4%、86.7%，RSD分别为1.9%、0.9%、3.3%、3.5%、2.7%、3.6%、3.0%、3.0%、3.5%、1.8%，表明该方法的回收率良好。
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7批次复方地黄合剂按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，以上述色谱条件和质谱条件进样测定，计算小檗碱、黄柏碱、特女贞苷、芒果苷、莫诺苷、马钱苷、芍药苷、栀子苷、黄芩苷和毛蕊花糖苷的含量，平行测定3次，结果见表4。
表 4 复方地黄合剂中10种成分的含量测定结果（μg/ml，n=3）
化合物 批号 230903 230906 230908 231001 231002 231006 231101 小檗碱 92.0 91.1 94.2 91.2 95.6 91.4 89.7 黄柏碱 164.7 168.7 177.7 173.0 173.7 177.0 164.0 特女贞苷 610.0 540.0 566.3 571.7 608.0 558.7 595.3 芒果苷 416.7 408.7 409.3 412.3 424.0 417.7 429.0 莫诺苷 749.7 795.3 793.0 745.7 795.3 825.0 726.0 马钱苷 549.3 540.7 566.3 550.0 572.0 531.3 503.7 芍药苷 1 490.0 1 506.7 1 496.7 1 473.3 1 540.0 1 480.0 1 380.0 栀子苷 2 596.7 2 666.7 2 803.3 2 810.0 2 896.7 2 713.3 2 630.0 黄芩苷 4 866.7 5 193.3 5 230.0 5 403.3 5 520.0 5 293.3 5 123.3 毛蕊花糖苷 62.7 65.6 66.9 64.1 67.2 64.7 61.8 -
本实验所选择的指标性成分以复方地黄合剂的配伍和药典各中药的含量测定指标性成分为基准，结合文献，最终选择10种能代表复方地黄合剂的指标性成分进行含量测定研究。
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本实验分别考察了0.1%甲酸水-甲醇和0.1%甲酸水-乙腈作为流动相对10种成分分离效果的影响。选用0.1%甲酸水-甲醇为流动相时，10种成分的峰形和响应强度较好，故选用0.1%甲酸水-甲醇作为流动相。
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本实验前期采用超高效液相色谱法检测复方地黄合剂中的10种成分，但由于莫诺苷、芒果苷、栀子苷、马钱苷、芍药苷极性相近，无法达到基线分离，且在色谱柱中分离时间长。因此采用UPLC-MS/MS，正负离子切换的模式同时测定复方地黄合剂中10种成分的含量，并优化去簇电压和碰撞能量。小檗碱、黄柏碱和特女贞苷在正离子模式下响应更好，芒果苷、莫诺苷、马钱苷、芍药苷、栀子苷、黄芩苷和毛蕊花糖苷在负离子模式下响应更强。
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本实验建立了UPLC-MS/MS同时测定小檗碱、黄柏碱、特女贞苷、芒果苷、莫诺苷、马钱苷、芍药苷、栀子苷、黄芩苷和毛蕊花糖苷10种成分在复方地黄合剂中含量的方法。该方法样品前处理简便，结果灵敏准确、重现性好，分析时间短，可用于复方地黄合剂的含量测定。
样品含量测定结果显示，复方地黄合剂中黄芩苷的含量最高，符合该制剂黄芩苷含量不少于1.5 mg/ml的质控标准。小檗碱、黄柏碱、特女贞苷、芒果苷、莫诺苷、马钱苷、芍药苷、栀子苷和毛蕊花糖苷的含量稳定，可作为考察复方地黄合剂质量标准的指标性成分。本实验建立的方法为复方地黄合剂的成分检测提供参考，为其质量控制及质量标准提升提供依据。
Quantitative analysis of 10 components in Compound Dihuang oral solution by UPLC-MS/MS
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摘要:
目的 建立超高效液相色谱串联质谱法（UPLC-MS/MS）同时测定复方地黄合剂中小檗碱、黄柏碱、特女贞苷、芒果苷、莫诺苷、马钱苷、芍药苷、栀子苷、黄芩苷和毛蕊花糖苷10种成分的含量。 方法 采用UPLC-MS/MS法，色谱柱为ACQUITY UPLC BEH-C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流动相为0.1%甲酸水（A）-甲醇（B），梯度洗脱，流速为0.2 ml/min，柱温30℃，进样量2 μl。采用多反应离子检测模式（MRM）。 结果 复方地黄合剂中10种成分在各自浓度范围内线性关系良好,精密度、重复性、稳定性和加样回收率结果均符合要求；7批次样品中小檗碱、黄柏碱、特女贞苷、芒果苷、莫诺苷、马钱苷、芍药苷、栀子苷、黄芩苷和毛蕊花糖苷的含量分别为（89.7~95.6） μg/ml、（164.0~177.7） μg/ml、（540.0~610.0） μg/ml、（408.7~429.0） μg/ml、（726.0~825.0） μg/ml、（503.7~572.0） μg/ml、（ 1380.0 ~1540.0） μg/ml、（2596.7 ~2896.7） μg/ml、（4866.7 ~5520.0） μg/ml、（61.8~67.2） μg/ml。结论 该方法重复性好、操作简便,可快速准确地测定复方地黄合剂中10种成分的含量，并为其质量控制提供参考。 -
关键词:
- 复方地黄合剂 /
- 超高效液相色谱串联质谱法 /
- 含量测定
Abstract:Objective To develop an ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS） method to simultaneously determine 10 main components, including berberine, phellodendrine, specnuezhenide, mangiferin, loganin, paeoniflorin, geniposide, baicalin, and acteoside in Compound Dihuang oral solution. Methods An UPLC-MS/MS method was established with an ACQUITY UPLC BEH-C18 （2.1 mm×100 mm, 1.7 μm）column and mobile phase of 0.1% formic water（A）-methanol solution（B） in a gradient elution manner. The flow rate of mobile phase was 0.2 ml/min.The temperature of column was 30℃. The injection volume was 2 μl. The MS detection was in MRM mode. Results 10 components in Compound Dihuang oral solution had a good linear relationship within their concentration range,and the precision, repeatability, stability and recovery met the requirements. The contents of berberine, phellodendrine, specnuezhenide, mangiferin, loganin, paeoniflorin, geniposide, baicalin, and acteoside in 7 batches of samples were （89.7-95.6） μg/ml, （164.0-177.7） μg/ml, （540.0-610.0） μg/ml, （408.7-429.0） μg/ml, （726.0-825.0） μg/ml, （503.7-572.0） μg/ml, （ 1380.0 -1540.0） μg/ml , （2596.7- 2896.7) μg/ml , （4866.7 -5520.0) μg/ml , （61.8-67.2) μg/ml, respectively.Conclusion The established method was easy to be repeated and operated. The contents of 10 components in Compound Dihuang oral solution could be determined quickly and accurately, which provided a reference for the quality control of hospital preparation. -
Key words:
- Compound Dihuang oral solution /
- UPLC-MS/MS /
- quantitative determination
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图 1 10种成分的色谱图
A. 对照品溶液色谱图；B.供试品溶液色谱图注：1.小檗碱；2.黄柏碱；3.特女贞苷；4.莫诺苷；5.芒果苷；6.栀子苷；7.马钱苷；8.芍药苷；9.毛蕊花糖苷；10.黄芩苷。
表 2 10种成分质谱参数
成分 离子源
模式母离子
（m/z）子离子
（m/z）去簇电压
（DP/V）碰撞能量
（CE/V）小檗碱 + 336.1 320.2 60.0 41.0 黄柏碱 + 342.3 192.3 15.0 32.0 特女贞苷 + 709.4 547.1 20.0 42.0 芒果苷 − 421.2 301.0 19.1 39.1 莫诺苷 − 451.2 243.0 20.0 23.0 马钱苷 − 435.3 227.0 64.3 18.6 芍药苷 − 524.9 449.2 80.0 20.0 栀子苷 − 433.1 225.1 34.0 20.0 黄芩苷 − 445.1 269.0 41.0 32.0 毛蕊花糖苷 − 623.1 161.1 190.0 46.0 
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表 3 10种成分的标准曲线回归方程
化合物 线性方程 r 线性范围（ng/ml） LOD（ng/ml） LOQ（ng/ml） 小檗碱 Y=104 000X+19 800 0.999 2 5~200 0.003 0.008 黄柏碱 Y=391 000X+37 700 0.997 2 2~100 0.031 0.125 特女贞苷 Y=240X−225 0.996 1 5~200 0.125 0.250 芒果苷 Y=1 290X−1 890 0.999 0 2~100 0.063 0.125 莫诺苷 Y=5 460X+35 0.999 2 2~200 0.125 0.250 马钱苷 Y=1 890X+225 0.999 3 2~100 0.125 0.250 芍药苷 Y=8 910X−1 060 0.999 1 10~500 0.125 0.250 栀子苷 Y=8 600X+453 0.999 5 10~500 0.125 0.250 黄芩苷 Y=1 250X+5 080 0.996 0 50~ 1000 0.250 1.000 毛蕊花糖苷 Y=8 350X−1 760 0.998 4 2~100 0.003 0.008
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表 4 复方地黄合剂中10种成分的含量测定结果（μg/ml，n=3）
化合物 批号 230903 230906 230908 231001 231002 231006 231101 小檗碱 92.0 91.1 94.2 91.2 95.6 91.4 89.7 黄柏碱 164.7 168.7 177.7 173.0 173.7 177.0 164.0 特女贞苷 610.0 540.0 566.3 571.7 608.0 558.7 595.3 芒果苷 416.7 408.7 409.3 412.3 424.0 417.7 429.0 莫诺苷 749.7 795.3 793.0 745.7 795.3 825.0 726.0 马钱苷 549.3 540.7 566.3 550.0 572.0 531.3 503.7 芍药苷 1 490.0 1 506.7 1 496.7 1 473.3 1 540.0 1 480.0 1 380.0 栀子苷 2 596.7 2 666.7 2 803.3 2 810.0 2 896.7 2 713.3 2 630.0 黄芩苷 4 866.7 5 193.3 5 230.0 5 403.3 5 520.0 5 293.3 5 123.3 毛蕊花糖苷 62.7 65.6 66.9 64.1 67.2 64.7 61.8
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