Agilent 1260 Infinity型高效液相色谱仪（安捷伦），KUDOS超声波清洗机（上海科导超声仪器有限公司），Sartorius CP124S电子天平（赛多利斯、万分之一），Sartorius MCE125S-2CCN-U电子天平（赛多利斯、十万分之一），大容量高速台式冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）。

没食子酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号110831-202408，含量：96.5%），供含量测定用。四草克银凝胶（皮肤病医院，批号24052701、24060501、24061801，规格：20 g/支）。甲醇为色谱纯（Fisher Scientific）、氯化钠（国药集团化学试剂有限公司），其他试剂均为分析纯、水为纯化水。

Agilent Eclipse XDB-C₁₈柱（4.6 mm ×25 mm，5 μm），流动相甲醇-0.05%磷酸（5∶95），流速1.0 ml/min，紫外检测波长为272 nm，柱温30℃，进样体积10 μl。

精密称取没食子酸对照品10.40 mg于100 ml量瓶中，用水溶解并定容至刻度，稀释制成每1 ml中含100.4 μg没食子酸的对照品储备溶液。

取四草克银凝胶约1.0 g，精密称定，置20 ml量瓶中，加入1 ml饱和氯化钠溶液，涡旋1 min，加水适量，超声20 min，用水稀释并定容至刻度，摇匀，转移至50 ml的离心管中，转速为9 000 r/min，4℃条件下，高速离心10 min，取上清液，用0.45 μm滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液，进样。

另取缺地榆阴性样品（批号24112501），按照“2.2.2”项下同法操作，制成缺地榆阴性对照溶液。

取对照品储备液5 ml，用水稀释至100 ml，作为专属性考察对照品溶液。取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液，注入液相色谱仪，记录峰面积和保留时间。结果显示，供试品溶液色谱图中呈现与对照品色谱图中没食子酸对照品保留时间相同的色谱峰。对照品溶液中没食子酸的保留时间为6.158 min，供试品溶液中没食子酸的保留时间为6.162 min，理论板数大于9 000，主峰与相邻杂质峰分离度大于2.0。阴性对照溶液色谱图中，在与没食子酸相同保留时间处无干扰。表明该方法专属性良好。液相色谱图详见图1。

图  1  四草克银凝胶液相色谱图

精密吸取对照品储备液1、5、5、5、5 ml分别置100、100、50、25、10 ml量瓶中，加水稀释并定容至刻度，分别制得浓度为1.004、5.020、10.04、20.08、50.20 μg/ml没食子酸系列对照品溶液。精密吸取对照品溶液各10 μl依次注入HPLC仪，测定峰面积，以对照品浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为Y = 31.85 X + 2.408（r=0.999 9），结果表明，在上述色谱条件下，没食子酸在1.004 ～ 50.20 μg/ml浓度范围内与峰面积线性关系良好。

精密吸取对照品储备液5 ml于50 ml的量瓶中，加水稀释至刻度，取上述溶液按照S/N=3和S/N=10时制备并测定检出限和定量限。测得检出限浓度为0.03 μg/ml，定量限浓度为0.07 μg/ml。

精密量取对照品溶液（浓度为5.020 μg/ml），按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，测定并记录峰面积，结果按峰面积计算，RSD为0.33%，结果表明精密度良好。

取同一供试品（批号24052701）约1.0 g，精密称定，按“2.2.2”项下方法，平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，精密吸取10 μl进样，测定并计算没食子酸的含量，结果为73.86 μg/g，RSD为0.70%。表明该方法重复性良好。

取供试品（批号24052701）约1.0 g，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备，按“2.1”项下方法测定，在0~24 h内分别进样（0、2、4、8、12、16、24 h），每次10 μl，计算峰面积，考察其稳定性，测得RSD=1.03%。表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

精密称取已知没食子酸含量的同一批供试品（批号 24052701），没食子酸含量为74.04 μg/g，取供试品约0.5 g，精密称定，共称取9份，置于20 ml量瓶中，分别精密加入对照品储备溶液0.3、0.4和0.5 ml，平行操作3份，加入1 ml饱和氯化钠溶液，按“2.2.2”项下方法制备，按“2.1”项下方法测定，计算没食子酸的回收率。结果见表1。

取3批四草克银凝胶样品，各自操作3份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，测定，计算没食子酸的含量，结果见表2。

没食子酸的检测可以通过分光光度法、液相色谱法等 ^[11-14]实现。分光光度法需要通过辅助显色等实现，如福林酚试剂、三氯化铁试液等，操作复杂且专属性不佳。而液相色谱法作为最常用的方法，适用于药品、化妆品、植物提取物等复杂样品的分析，因此，我们最终采用液相色谱法。在选择波长时，考虑到没食子酸在220、272、280 nm等波长下均有较好吸收，最终参考2020年版《中国药典》一部中地榆的含量测定^[15]，结合响应值大小、阴性无干扰等条件，选择272 nm为最终检测波长。四草克银凝胶配方中的紫草也为本制剂的主药，但是其主要成分紫草素的含量测定面临多项技术难点，主要源于其复杂的理化特性，且样品基质对于提取有效成分具有干扰。紫草素对光、热敏感，全程需避光操作，在提取和分析的过程中可能降解造成测得含量不准确。样品中紫草素的提取需经多步萃取纯化，如碱液提取、酸中和、有机溶剂萃取、硅胶柱层析等预分离步骤，操作繁琐且易引入误差^[16-17]。综合考察四草克银凝胶中几味药，地榆为本制剂的君药，其含有的大量鞣质具有收敛作用，能迅速干燥创面、减少渗出、缓解瘙痒。地榆中的特征成分没食子酸性质稳定，提取过程方便，其测定结果能较好的反映样品中总酚的含量，因此，选择没食子酸作为四草克银凝胶的质量控制指标。

根据考察的各种流动相组成，例如，乙腈-三乙胺-磷酸水溶液^[18]、甲醇-磷酸溶液^[19]、乙腈-磷酸溶液^[20]以及甲醇-冰醋酸水溶液^[21]等体系后，最终采用甲醇-0.05%磷酸（5∶95）为流动相，结果表明，本文采用的流动相峰形良好，洗脱效果佳，分离度良好，基线平稳，分析时间适中。在柱温条件方面，分别考察了25、30、35℃，结果表明，当柱温25℃时，色谱峰易存在拖尾现象；柱温35℃时，没食子酸出峰过快，与杂质的分离度不如柱温30℃时好，因此，选择柱温为30℃。

针对本凝胶剂，先后采用甲醇直接提取^[22]、加稀盐酸溶液后提取 ^[23]以及加氯化钠溶液后提取^[24]等方法。实验结果发现用溶剂直接提取的供试品含量检测偏低，加稀盐酸或加饱和氯化钠溶液的供试品含量结果相当，但是稀盐酸对液相色谱基线有干扰、对于色谱柱的损耗较大。因此，选择了加饱和氯化钠溶液涡旋混匀后用水溶解，作为供试品溶液的预处理方法。在加饱和氯化钠溶液提取过程中依次采用了超声处理、水浴回流、索氏提取等方法，因产品中凝胶基质的关系，加热后提取溶液难以过滤澄清且回流提取耗费时间较久；而超声提取温度上升不明显，操作简便效率高。考察不同超声提取时间，取供试品分别超声提取5、10、20、30 min，超声提取5 min及10 min时测得没食子酸含量均低于20 min时，而超声提取30 min时测得的含量与20 min时相当，表明经过超声提取20 min已基本能将没食子酸提取完全，因此，选择超声提取20 min为最佳预处理时间。最终确定本文供试品溶液的制备方法为加1 ml饱和氯化钠溶液涡旋1 min混匀后，加水适量，超声提取20 min后定容。

地榆作为传统中医药治疗皮肤病的要药，具有解毒敛疮、凉血活血、抗炎抑菌的作用，常用于疮痈肿毒、湿疹皮炎、水火烫伤等。其含有的没食子酸、槲皮素、地榆皂苷等都对皮肤病的治疗起到重要作用。四草克银凝胶作为上海市皮肤病医院的新制剂品种，还未建立有效、可控的质量标准体系。本文考察了采用HPLC法测定四草克银凝胶中没食子酸的含量，该方法专属性强，线性良好，定量准确，操作简便。测得的3个批次样品中，没食子酸含量稳定，批次之间差异不大，可为四草克银凝胶的质量控制提供坚实可靠的参考依据，更好的保障临床有效性。