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药物在体内的跨质膜运输，大部分由药物转运体介导。这些药物转运体一般分为溶质载体（SLC）家族和ATP结合盒（ABC）家族。这些转运体不仅介导治疗药物的跨膜转运，还转运各种内源性化合物。因此，除了参与药物的处理，使其产生临床疗效或毒性外[1]，这些转运蛋白还通过调节内源性化合物的转运在维持细胞稳态方面发挥重要作用。转运体是体内位于细胞膜上的功能性膜蛋白，是介导物质和能量跨膜转运的关键结构，在药物的吸收、分布、代谢、排泄动力学过程中发挥重要作用。近年来，许多研究表明，多数药物性损伤可能与机体某部位上转运蛋白的表达改变有关。转运体是体内位于细胞膜上的功能性膜蛋白，是介导物质和能量跨膜转运的关键结构。转运体的异常表达或功能缺失是引起药物毒性的重要原因之一。
药物的吸收主要在肠道中进行，其中，肠道转运体发挥着重要作用。近年来研究发现，肠道菌群可以通过影响肠道转运体蛋白的表达来影响吸收转运。同时，中药成分也可以通过调控肠道菌群来影响肠道转运体。明确中药和肠道菌群对转运体表达的影响，有利于提高药物的安全性和有效性，指导临床合理用药。
在我国，中医药已有几千年的应用历史，在改善人体亚健康、防治重大疾病等方面发挥重要作用。有研究表明，中药（天然药物提取物和中草药配方）可以显著改善肠道菌群的组成和代谢功能，有助于维持肠道菌群稳态，从而调节物质代谢与吸收转运。例如，冬凌草素[2]被证明可以通过改变肠道微生物群和促进肝尿素循环来减少肝损伤；化瘀排痰方、葛根芩连汤可显著上调Claudin-1、occludin和ZO-1的表达，修复肠黏膜屏障，防止慢性炎症的发生[3]。
人体肠道中的肠道菌群是肠道微生态系统的重要组成部分。研究发现胃肠道中至少包含9个细菌门，其中，双歧杆菌属、乳酸杆菌属、拟杆菌属、肠杆菌属、肠球菌属、梭菌属等为胃肠道主要的优势菌属。正常情况下[4]，一个组合合理、协调平衡的胃肠道菌群生态体系具有重要的生理作用，包括生物屏障作用、营养代谢作用、免疫作用、抗衰老及抗肿瘤作用等。因此，人类肠道微生物群已经成为控制肠道屏障和新陈代谢的关键 [5]。目前已有一些研究对肠道菌群如何调控药物代谢进行了探索，但其具体机制仍不清楚。本综述旨在介绍中药使用过程中，中药成分如何影响肠道菌群，以及肠道菌群对转运蛋白的影响，揭示肠道菌群直接或间接发挥作用影响转运体的表达。
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肠道菌群已被证实会影响多种口服药物的药动学过程，其除了直接影响药物的肠道代谢转化外，还可以通过调节转运体的表达和活性，间接影响药物作用。
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紧密连接蛋白是上皮细胞和内皮细胞中细胞间连接复合体的最顶端成分。它们分离顶端和基底外侧细胞表面域（栅栏功能），并抑制溶质和水通过细胞旁空间流动（屏障功能）[6]。其由整合膜蛋白claudins、occludin和连接黏附分子（JAM）以及许多外周膜蛋白形成，包括膜相关鸟苷酸激酶（MAGUK）家族、ZO-1、ZO-2、ZO-3、具有反向取向的膜相关鸟糖苷酸激酶1（MAGI-1）、细胞极性分子ASIP/PAR-3、PAR-6和非典型蛋白激酶C（PKC）[7]。Occludin是首个被报道的紧密连接的整合膜蛋白，并且在最顶端的基底外侧膜上表达最普遍。此外，occludin还直接参与紧密连接屏障和栅栏功能[8]。
肠道菌群与肠黏膜机械屏障中紧密连接蛋白的表达关系密切。肠道菌群失调后，会引起肠黏膜紧密连接蛋白Claudin-1、occludin和ZO-1的表达降低，紧密连接被破坏，发生肠黏膜细胞核易位等现象[9]。研究发现，剧烈运动可引起胃肠痉挛、腹泻等肠道症状，这可能是由于运动引起体温升高导致肠道热损伤和菌群变化[10]，使得肠道中有害菌直接与肠上皮细胞表面分子结合，改变紧密连接蛋白occludin、ZO-1等的表达，破坏紧密连接结构，损害细胞骨架，从而增大细胞间“空隙”，增加细胞旁通透性，损伤肠黏膜屏障，引发内毒素血症。瘤胃球菌已被证明可以促使杯状细胞分泌黏蛋白，阻止有害细菌的入侵[11]。类副杆菌作为有益微生物，可以降低促炎细胞因子的水平，形成稳态定植以维持肠黏膜屏障[12]。这些益生菌[13]是维持肠道细菌之间生物对抗性的主要菌种，有助于肠道兼性细菌的生长，增强细胞免疫和体液免疫，减少肠上皮细胞的炎症反应，增强肠道防御功能，并在调节肠道菌群组成方面发挥重要作用。
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外排转运蛋白，如P-糖蛋白、ABCB1或MDR1，可以主动将广泛的化学性化合物泵出细胞，保护肠黏膜免受异生物质和代谢产物（包括药物）的影响。缺乏P-糖蛋白，可导致异生物质在细胞的积累和毒性增加，并伴有严重的副作用。肠道细菌可以调节宿主P-糖蛋白的功能[14]。例如，阿克曼菌可以参与肠道炎症的调节[15, 16]，通过上调短链脂肪酸（SCFA）的产生使得小鼠肠道中P-gp的表达下降。革兰阴性肠杆菌和克雷伯菌可产生外膜囊泡（OMV），其作用于TL受体，改变CYP3A和P-gp的表达[17]。Caco-2单层膜和葡聚糖硫酸钠诱导结肠炎小鼠模型实验显示，嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌通过磷酸肌苷3-激酶和ERK1/2 MAPK途径刺激P-gp活性，同时可使回肠和结肠中mdr1a/P-gp mRNA和蛋白表达增加2~3倍[18]。肠道菌群通过影响外排转运蛋白的表达来影响肠道的吸收转运功能，为之后中药成分调控肠道菌群来影响肠道吸收转运奠定基础。
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中药通过肠道菌群发挥吸收转运的调节作用，主要包括改变肠道菌群组成、影响肠道菌群代谢以及影响肠道屏障功能3种途径。
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临床无菌模型和粪便移植疗法证明，肠道菌群可以靶向细菌，达到中医治疗疾病的目的，主要体现在中药有效成分对肠道菌群结构、组成和代谢产物的影响。例如，白藜芦醇可以重塑不同水平肠道菌群的多样性和组成[19]。在门水平上，厚壁细菌数量显著增加，拟杆菌数量显著减少;在科水平上，丹毒科增加;在属水平上，奥氏菌含量增加。白芦醇通过丰富以上肠道菌群的结构，从而影响肠道屏障的紧密连接功能[19]，同时通过下调炎症因子（IL-1、TNF- α、MyD88和TLR-4）改善肝脏炎症，进而改进吸收转运的功能。鸡腿菇多糖是食用菌Coprinus comatus的多糖提取物，已被证明具有类似益生元的作用，可以增加肠道微生物群的多样性（厚壁菌和乳酸菌科相对丰度显著较高）[20]，通过丰富厚壁菌增加紧密连接蛋白和乳酸杆菌来激活P-gp活性，从而影响肠道吸收转运。此外，人参提取物和酸枣种子（GS）显著提高了大鼠乳酸菌和双歧杆菌的相对丰度，降低了链球菌、大肠杆菌-志贺杆菌、绒毛杆菌和肠球菌的相对丰度，提示GS提取物可能通过平衡肠道微生物群的结构和多样性[21]进而恢复吸收转运的功能，是一种有前景的酒精性肝病（ALD）治疗药物。
此外，一些中药[22]可以直接抑制微生物的生长。例如，肉桂精油可以抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。粪便微生物学结合16S rDNA分析表明，加味逍遥散显著改变了肠道微生物群的组成[23]，增加有益菌，减少有害菌的组成，并影响了11种差异代谢产物（初级胆汁酸生物合成、苯丙氨酸代谢、泛酸和辅酶A生物合成、代谢途径、胆固醇代谢、胆汁分泌等），从而达到影响吸收转运的目的。小檗碱是从草药中提取的一种天然异喹啉生物碱,是黄连和小檗的主要活性成分。小檗碱处理后，大鼠肠道菌群的多样性和丰富度发生了变化[24]，拟杆菌的丰度提高，乳酸菌显著上调，变形杆菌和疣状微生物的丰度降低。小檗碱通过重塑肠道菌群结构来改变紧密连接蛋白和外排转运蛋白的表达，进而影响肠道吸收转运功能。在没食子酸（GA）对多重耐药大肠杆菌的杀菌活性研究中表明，GA具有杀菌活性，并能抑制细菌生物膜的形成。进一步的形态学改变和外排泵基因表达分析证实[25]，GA损伤了大肠杆菌的外膜和内膜，并抑制了与膜通透性有关的acrA、acrB、tolC、acrD和acrF的mRNA表达。Yang等[26]发现，芦丁可通过增加肠道菌中Bacillus 、Bacteroides 和Veillonella 的丰度，促进β-葡萄糖苷酶活性,使其转化成易吸收的代谢物。
肠道内产生的某些酶会使肠上皮受到损伤。白藜芦醇、菊粉、大黄、槲皮素等的中药制剂，如四脉丸、金芪降糖T片、黄连解毒司等均可增加阿克曼菌的丰度，降低大肠杆菌的丰度。因为大肠杆菌不利于维持肠道屏障的完整性，其产生的代谢酶StcE会分解黏蛋白[27]，增加肠道通透性，诱发肠道炎症。上述的中药成分可以降低大肠杆菌的丰度，从而维护人体的肠道屏障，进而改善吸收转运功能。Shen等[28]通过粪便温孵人参皂苷Rb1体外代谢研究和ABXco-2细胞单层转运研究，证明人参多糖（GP）减轻了葡聚糖硫酸钠（DSS）引起的结肠炎样症状，并通过增强微生物的糖基化、肠上皮细胞对Rb1的吸收来提高Rb1的全身暴露量。这些发现进一步证明了多糖与肠道菌群相互作用在中药传统汤剂整体效用中的重要作用。Guo等[29]比较了对照组和伪无菌大鼠组给药三七皂苷后的代谢产物数量，发现对照组有73种代谢产物，伪无菌大鼠中仅检测到11种代谢产物，表明肠道菌群参与体内三七皂苷的生物转化。Song等[30]发现大黄提取物和大黄酸均可在肠道菌群介导下发生还原、水解或进一步乙酰化等生物转化。Huang等[31]也证明肠道菌群介导的大黄中蒽醌和蒽酮还原、水解、乙酰化、氧化、去甲基化、甲基化、羟基化、脱羟基化等反应在其体内生物活性中起重要作用。
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相关研究证明，肠道菌群[32]可以通过水解、氧化、还原和异构化反应产生低极性和相对稳定的中药代谢物，从而加速肠道吸收，提高中药的生物利用度。例如，Racova等[33]采用体外粪便培养方式研究黄酮类化合物的代谢产物，发现其主要代谢途径为水解、去糖基化、羟基化等，随后粪便细菌形成的代谢物被肠道酶进一步发生谷胱甘肽偶联或葡萄糖醛酸化，表明肠道菌与黄酮类化合物的代谢存在联系。有研究表明，肠道微生物代谢产物胆汁酸（BA）能通过抑制P-gp ATP酶来调节P-gp活性[34]，Telbisz等[35]证明糖胆酸、牛磺胆酸和胆酸等多种BA可显著降低基础BCRP ATP酶活性；短链脂肪酸丁酸盐促进上皮屏障功能，通过诱导编码紧密连接（TJ）成分的基因来巩固肠道屏障[36]，从而影响肠道吸收转运。当肠道微生物群发生紊乱时，肠道微生物群代谢物（短链脂肪酸、三甲胺N-氧化物、BA、脂多糖等）[37]会相应地发生变化，肠道屏障会被破坏。传统中药可以通过干预肠道微生物群代谢物来改善肠道环境，从而影响肠道吸收转运。例如，生物碱（尤其是小檗碱）被证明可以调节胆固醇到BA的转化并促进粪便BA排泄[38]。脾胆健清汤的主要成分为黄芪、黄连、黄芩、苍术、丹参、荔枝。脾胆健清汤对糖尿病的临床治疗有良好的干预作用，对于吸收转运功能有极大的影响。其作用机制为，在属水平上，脾胆健清汤提高了乳酸菌、布鲁菌、拟杆菌、脱硫弧菌和阿克曼菌的相对丰度，降低了普雷沃菌的相对丰度，从而增加短链脂肪酸的生成[39]。相关分析表明[40]，脾胆健清汤对色氨酸代谢、组氨酸代谢和三羧酸（TCA）循环途径的调节作用与乳杆菌、拟杆菌和阿克曼细菌的丰度变化有关。因此，脾胆健清汤通过对肠道菌群代谢物的影响治疗糖尿病，同时影响吸收转运功能。
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肠黏膜屏障是存在于肠道中的一种高选择性的功能屏障系统，可以防止有害物质，如病原微生物和内毒素通过肠黏膜，同时选择性地吸收肠内营养物质。也在免疫防御和维持肠黏膜完整性方面发挥重要作用[41]。肠黏膜损伤、炎症因子升高与代谢性疾病（糖尿病、酒精性脂肪肝等）有关。中药通过增加肠道黏液和紧密连接蛋白来减轻代谢性炎症[42]，进而改善吸收转运功能。许多研究表明，中药可以通过改善肠黏膜微循环、修复肠黏膜完整性、降低肠黏膜通透性来维持机械屏障功能。一项研究表明[43]，黄芩苷可提高粪便中丁酸盐的水平，丁酸盐水平的增加可提高UC大鼠ZO-1、Occludin和Muc2的表达，调节Th17/Treg平衡，减少肠黏膜损伤，增强肠道屏障功能，从而影响肠道吸收。姜黄多糖（TPS）是从中国植物药姜黄中提取的,在用TPS处理的UC小鼠中，盲肠色氨酸分解代谢产物吲哚-3-乙酸（IAA）及其配体芳烃受体（AhR）的表达显著增加。据推测，TPS通过激活AhR上调上皮紧密连接蛋白肠屏障功能发挥保护作用，从而影响肠道吸收功能[44]。单宁酸和黄连素是从中草药（大黄和黄连）中提取的两种活性成分，可以恢复紧密连接相关蛋白的表达，对UC发挥治疗作用，增强肠道屏障功能，对肠道吸收产生影响[45]。白头翁汤（PD）是临床上常用于治疗UC的中药配方，PD能缓解UC小鼠的症状，PD高剂量治疗组（PDHT）效果最佳。PDHT组中[46]Occludin、Occluden小带-1 （ZO-1）、Claudin1、Claudin5、G蛋白偶联受体43 （GPR43）蛋白的表达水平以及ZO-1和Occludin mRNA的相对表达量均显著升高，从而增强肠道屏障的功能，对肠道吸收转运产生影响。
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近年来，随着肠道微生物在健康调控和代谢控制中的作用逐步得到确认，肠道微生物相关健康科学得到了飞速发展。利用中药优化肠道菌群结构进而提升人类健康水平以及探究肠细胞上机械屏障和外排转运蛋白对肠道吸收转运机制的影响具有重要意义。肠道菌群对转运蛋白的影响呈现双面性，了解肠道菌群对转运蛋白的影响可能有助于开发毒性较小的转运蛋白调节剂，指导临床合理用药。例如，Ghosh等[47]研究肠道微生物代谢物尿石素对逆转5-氟尿嘧啶耐药结肠癌的影响和机制时发现，尿石素及其结构类似物能下调MDR5、BCRP、MRP1和MRP2等药物转运蛋白的表达和活性，使结肠癌细胞化学敏化，5-氟尿嘧啶的外排减少，有利于癌症治疗。
然而，尚有一些问题值得进一步探讨。首先，中药优化肠道菌群结构、调节肠道机械屏障和外排转运蛋白是否能提高合理用药的效率；其次，具体调节机制仍需要深入挖掘；最后，除了转运体表达外，是否有其他肠道内成分可以起到影响药物排出的作用。另外，肠道菌群除了受中药成分影响外，与日常生活方式、运动习惯、饮食结构也有很大关系，需要进一步的研究。
Research progress on the regulation of intestinal flora and effect on intestinal absorption and transport by TCM components
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摘要: 概括介绍中药成分调控肠道菌群影响肠道吸收转运作用的国内外研究进展，为后续以肠道菌群为靶点研究临床合理用药提供帮助。通过查阅近年来肠道菌群与肠道吸收转运方面的文献，分析总结现有相关研究，阐述中药成分调控肠道菌群对药物吸收转运的作用机制。研究发现中药成分改变肠道菌群进而影响肠道屏障功能和吸收转运，对临床合理用药具有重要意义。Abstract: The domestic and international research progress on the regulation of gut microbiota by Traditional Chinese Medicine (TCM) ingredients and their impact on intestinal absorption and transportation were summarized, which provided assistance for subsequent clinical rational drug use targeting gut microbiota. Literature on the relationship between gut microbiota and intestinal absorption and transportation in recent years were reviewed and analyzed, and the mechanism of TCM ingredients regulating gut microbiota on drug absorption and transportation was elucidated. Research has found that TCM ingredients alter gut microbiota, thereby affecting intestinal barrier function and absorption of transport proteins, which is of great significance for rational clinical medication.
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骨质疏松症是一种全身性骨代谢疾病，其典型特征是骨密度下降、骨脆性增加和骨微环境被破坏[1]。骨稳态失衡是其发生的主要病理学基础。骨稳态是指成骨细胞行使的骨形成功能和破骨细胞行使的骨吸收功能处在一个相对平衡的过程[2]。破骨细胞分化及其功能的过度活化是导致骨稳态失衡的重要因素[3]。中国骨质疏松症流行病学调查显示，我国50岁以上人群骨质疏松发病率为19.2%，65岁以上人群发病率为32%[4]。目前临床上治疗骨质疏松症的药物主要是骨吸收抑制剂，其在抑制骨吸收的同时，也干扰骨形成进程。因而发掘更好的治疗骨质疏松的药物是迫切需要的。
骨髓来源的巨噬细胞(BMMs)向破骨细胞分化需要重组小鼠巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子κB受体活化因子配体(RANKL)的持续刺激[5]。M-CSF增加了早期BMMs的增殖，RANKL与受体RANK结合激活肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)，进而激活细胞凋亡信号调节激酶1(ASK1)和NF-κB抑制物激酶(IKKs)，活化的ASK1和IKKs磷酸化JNK、ERK和P38以及NF-κB特异性抑制因子IκB特定部位的丝氨酸，激活MAPK和NF-κB信号。活化的MAPK和NF-κB使c-Fos、NFATc1表达增加，促进DC-STAMP、ATP6V0d2、TRAP、CTSK等破骨细胞特异性基因的转录与表达，导致破骨细胞分化[6]。研究表明，减弱破骨细胞分化及功能，能够有效地治疗骨质疏松症[7]。
冬虫夏草是一味传统中药，有增强免疫、抗炎、抗氧化和延缓衰老等作用[8]。先前的研究表明，富含锶的冬虫夏草菌丝发酵液对去卵巢骨质疏松大鼠有良好的治疗效果，其机制是提高了血清中的雌二醇水平，但是该研究仅基于整体水平解释了冬虫夏草作用于骨质疏松症的机制，对冬虫夏草的菌种也未作鉴定，并且野生的冬虫夏草提取液在骨质疏松症中的作用也未见报道[9-11]。本研究旨在探讨冬虫夏草提取液(CSE)对去卵巢小鼠的治疗作用以及对破骨细胞分化和功能的影响，为CSE防治骨质疏松症提供实验依据。
1. 材料
1.1 动物
SPF级雌性C57BL/6小鼠（上海西普尔-必凯实验动物有限公司），12周龄24只，6周龄7只，体质量20～22 g，合格证号：SCXK（沪）2018-0006。本实验经江西中医药大学实验动物伦理委员会批准（批号JZLLSC2019-0194），且遵循中国伦理委员会指导原则。
1.2 试剂
α-MEM培养基（美国Hyclone，批号：SH30265.01）；胎牛血清（美国Gbico，批号：10099-141）；重组小鼠RANKL、M-CSF蛋白（美国R&D，批号：462-TEC-010、416-ML-010）；TRAP染色试剂盒（浙江卓腾生物公司）；RNAiso Plus、TB Green（日本Takara，批号：9109、RR420B）；p-JNK、JNK、p-ERK1/2、ERK1/2、p-P38、P38和GAPDH兔单克隆抗体（美国CST，批号：4668、9252、4370、4695、4511、8690、5174）；山羊抗兔IgG H&L (IRDye® 800CW)预吸附二抗（美国Abcam，批号：ab216773）；冬虫夏草（上海雷允上药业有限公司）；羟基磷灰石涂板/96孔板（美国Corning，批号：3989）；小鼠抗酒石酸酸性磷酸酶、骨钙素、骨碱性磷酸酶ELISA试剂盒（上海生工，批号：D721140、D721126、D721049）。
1.3 仪器
371型细胞培养箱（美国Thermo）；Cytation 5多功能酶标仪（美国Bio-Tek）；CFX96型实时荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad）；SA型近红外双色激光成像系统（美国odyssey）；TI-SR型倒置显微镜（日本Nikon）；RM2016型病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）；JB-P5型包埋机（武汉俊杰）。
2. 方法
2.1 CSE制备
冬虫夏草(Cordyceps sinensis)药材产地为青海玉树，购自上海雷允上药业有限公司，经海军军医大学黄宝康教授鉴定。提取详情见引文[12]。
2.2 BMMs分离与培养
选取6周龄C57BL/6小鼠，使用颈椎脱臼法处死，取双侧股骨和胫骨，使用PBS将骨髓从骨髓腔中冲出，收集PBS并离心，弃上清液，使用α-MEM培养基重悬，于T75培养瓶内（含10%血清，1%青霉素-链霉素溶液及30 ng/ml M-CSF完全培养基）培养3 d。使用PBS清洗去除未贴壁细胞，加入适量新鲜完全培养基，直至细胞数量达到5×106个[13]。
2.3 CCK-8法检测BMMs细胞活性
在96孔板中，BMMs以8×103个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.125、0.25、0.5、1、2、4 mg/ml CSE干预处理，培养48 h或96 h，加入CCK-8检测液，37 ℃孵育1 h后在波长480 nm处检测吸光度。
2.4 体外破骨细胞分化实验
在96孔板中，BMMs以6×103个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE干预处理，同时加入50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF，阴性对照组不加入RANKL；每2 d更换一次培养基，直至第5天对破骨细胞进行TRAP染色。
将同样密度的BMMs接种于96孔板，孵育过夜；记过夜后为第1天，分别于第1、3、5天加入1 mg/ml CSE干预处理，每2 d更换一次培养基至第7天（仅加药1次，之后更换培养基均不加CSE），进行TRAP染色[14]。
2.5 F-actin环染色和骨吸收实验
在96孔板中，BMMs以6×103个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE干预处理，同时加入50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF，每2 d更换一次培养基。第5天用鬼笔环肽和DAPI分别对F-actin环和细胞核进行染色。
骨吸收实验：BMMs以5×105个/孔的密度接种于6孔板，孵育过夜；加入含50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF完全培养基，每2 d换液，至第4天出现小的破骨样细胞，胰酶消化以8×103个/孔密度重新接种至羟基磷灰石涂板内，并且加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE处理。培养3 d后，用次氯酸钠洗去细胞，PBS清洗后晾干，于光学显微镜下拍照，统计每个孔的骨陷窝面积[15]。
2.6 q-PCR检测
在12孔板中，BMMs以5×104个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE干预处理，同时加入50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF，每2 d更换一次培养基至第5天。抽提RNA，逆转录后使用q-PCR检测DC-STAMP、ATP6V0d2、TRAP、CTSK、NFATc1基因的表达，引物序列详情见引文[16]。
2.7 蛋白印迹法检测
在6孔板中，BMMs以5×105个/孔的密度接种，孵育过夜；使用无血清的α-MEM培养基饥饿细胞1 h，实验组更换含1 mg/ml的CSE的完全培养基，对照组更换含相同体积PBS的完全培养基，孵育3 h；均使用50 ng/ml RANKL刺激5、10、20、30、60 min，未被刺激的细胞作为0 min。刺激完成后，抽提总蛋白。经SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、5%脱脂奶粉封闭1 h，4 ℃下一抗孵育过夜，室温下荧光素偶联的二抗孵育1 h，用odyssey成像系统扫膜，分析JNK(1∶2000)、p-JNK(1∶2000)、ERK(1∶2000)、p-ERK(1∶2000)、P38(1∶2000)、p-P38(1∶2000)的表达。
2.8 动物造模、分组及给药
在24只12周龄小鼠中随机挑选6只作为假手术组（Sham组），其余小鼠使用异氟烷气麻，去除背部毛发，切开皮肤和背膜，使卵巢暴露，切除双侧卵巢并使用可吸收缝合线结扎、缝合（假手术组仅切开背部皮肤和腹膜）[14]。术后1周，按照文献报道方法[17]，将卵巢切除小鼠随机分为3组：模型组（OVX组）、CSE低剂量组、CSE高剂量组，每组6只。术后7 d开始给药，由预实验确定给药浓度为312.5和625 mg/kg，按照每只200 μl/d连续灌胃给药6周。
2.9 HE染色和TRAP染色
小鼠处死后取双侧股骨，4%多聚甲醛固定后进行脱钙处理，之后常规脱水、石蜡包埋，切成4 μm切片，分别进行HE染色和TRAP染色。统计破骨细胞数量/骨表面积（N. Oc/BS）、破骨细胞面积/骨表面积（Oc. S/BS）和骨体积/组织体积（BV/TV）。
2.10 ELISA法检测血清生化指标
小鼠处死前统一摘除小鼠左眼取血，将全血收集并在4 ℃静置30 min，之后在4 ℃下2 000 r/min离心20 min，吸取上清液置于−80 ℃冰箱中保存。按照Elisa试剂盒《用户操作手册》检测血清中TRAP、ALP、BGP含量。
2.11 统计学方法
使用Image J统计破骨细胞面积和个数、F-actin环面积和环内核数、骨陷窝面积、蛋白条带灰度值、N. Oc/BS、Oc. S/BS和BV/TV。使用SPSS 21.0统计学软件对数据进行分析。计量资料用均数±标准差（
$\bar x $ ±s）表示，多组间比较使用方差分析，以P<0.05认为差异具有统计学意义。3. 结果
3.1 CSE对BMMs细胞活力的影响
CCK-8结果显示，与空白组比较，CSE浓度范围在0.125～4 mg/ml时，48 h内和96 h内CSE对BMMs无细胞毒性（图1）。据此结果选择0.5、1、2 mg/ml作为之后的细胞实验浓度。
3.2 CSE对RANKL诱导的破骨细胞分化的影响
TRAP染色显示，与空白组比较，RANKL组的BMMs分化为成熟的TRAP阳性多核巨噬细胞（有完整的圆形状细胞形态且细胞核数目≥3）。与RANKL组比较，CSE不同剂量组的TRAP阳性多核巨噬细胞数量明显减少，且呈剂量依赖的方式下降，并且破骨细胞的大小也被显著抑制（图2A-C）。结果表明CSE不仅抑制破骨细胞的分化也阻碍了破骨细胞前体细胞的融合。
图 2 CSE对破骨细胞分化的影响（n=3）A.破骨细胞图像（×40）；B.每孔TRAP阳性多核细胞（细胞核数≥3）面积百分比；C.每孔TRAP阳性多核细胞（细胞核数≥3）个数；D.不同时间段加入CSE处理后的破骨细胞图像（×40）；E.加药时间示意图；F.每孔TRAP阳性多核细胞（细胞核数≥3）个数**P<0.01，与RANKL组比较在RANKL持续刺激的BMMs中按时段加入CSE。染色结果显示，与空白组比较，0 d组的BMMs几乎全部分化为成熟的破骨细胞，数量多，且形状完整。与0 d组比较，给予CSE1～3 d组的BMMs分化为成熟破骨细胞的数量最少，3～5 d组其次，5～7 d组最多（图2D、2E、2F）。结果表明CSE对破骨细胞生成的任一阶段均有作用，在早期阶段作用最为明显。
3.3 CSE对RANKL诱导的破骨细胞F-actin环形成和骨吸收功能的影响
鬼笔环肽和DAPI染色显示，RANKL组的F-actin环形成完整，数量多且面积大，环内细胞核数量多。与RANKL组比较，CSE不同剂量组的F-actin环数量和大小均下降，环内细胞核数量也明显减少（图3A、3B、3C）。
图 3 CSE对破骨细胞F-actin环形成和骨吸收功能的影响（n=3）A.F-actin环和细胞核共聚焦图像（×100）；B.每孔内F-actin环面积百分比；C.单个F-actin环内细胞核个数；D.骨陷窝图像（×40）；E.每孔未吸收面积百分比**P<0.01，与RANKL组比较骨板吸收显示，RANKL组未被吸收面积为70%， 1 mg/ml CSE组未被吸收面积为85%，2 mg/ml CSE组为95%，与RANKL组比较，不同剂量的CSE均有效的减少了骨板吸收的面积（图3D、3E）。结果表明CSE显著抑制了成熟破骨细胞骨吸收的功能。
3.4 CSE对RANKL诱导的破骨细胞特异性基因表达的影响
q-PCR结果显示，与RANKL组比较，CSE中、高剂量组显著性地抑制了破骨细胞特异性基因TRAP、CTSK、ATP6V0d2、DC-STAMP和NFATc1的表达，且呈剂量依赖性（图4）。这与CSE抑制破骨细胞分化及功能的结果相一致。
图 4 CSE对破骨细胞特异性基因表达的影响（n=3）A.TRAP；B.CTSK; C.ATP6V0d2; D.DC-STAMP; E.NFATc1*P<0.05，**P<0.01，与RANKL组比较3.5 CSE对破骨细胞分化过程中MAPK通路的影响
Wsetern-blot结果显示，RANKL组各时间段JNK、ERK和P38蛋白磷酸化显著。与RANKL组比较， CSE组p-JNK蛋白表达在第10～30 min明显下降，p-ERK蛋白表达在第20～60 min明显下降和p-P38蛋白表达在第10～60 min明显下降，见图5。结果表明在破骨细胞的分化过程中，CSE作用于MAPK通路JNK、ERK和P38的磷酸化。
3.6 CSE对卵巢切除小鼠的影响
HE和TRAP染色显示，与假手术组比较，OVX组小鼠的骨小梁数目和面积明显减少（BV/TV值下降）且间距变大，骨小梁表面破骨细胞数量增多、面积变大（N. Oc/BS、Oc. S/BS值上升）。与OVX组比较，CSE低剂量和高剂量组小鼠的骨小梁数目和面积均增加（BV/TV值上升）且间距减小，骨小梁表面破骨细胞数量减少、面积变小（N. Oc/BS、Oc. S/BS值下降），见图6。结果表明，CSE可以增加卵巢切除小鼠骨小梁数目，抑制破骨细胞活性，缓解骨量流失。
图 6 CSE对去卵巢小鼠股骨破骨细胞数量和骨小梁的影响（n=6）A.HE染色和TRAP染色；B.BV/TV；C.Oc. S/BS；D.N. Oc/BS；**P<0.01，与OVX组比较；##P<0.01，与假手术组比较3.7 CSE对TRAP、ALP、BGP含量的影响
ELISA结果显示，与假手术组比较，OVX组小鼠血清中的TRAP含量明显增加，BGP含量明显减少，ALP含量无明显变化；CSE高剂量组小鼠血清中的TRAP、BGP含量无明显变化， ALP含量明显增加。与OVX组比较，CSE低剂量和高剂量组小鼠血清中的ALP、BGP含量明显增加，TRAP含量明显减少（图7）。结果表明，CSE可以调节骨代谢相关指标，具有平衡骨稳态作用。
图 7 CSE对TRAP、ALP和BGP含量的影响（n=6）A.TRAP；B.ALP；C.BGP；*P＜0.05，**P<0.01，与OVX组比较；##P<0.01，与假手术组比较4. 讨论
骨质疏松症是一种与年龄相关的骨代谢疾病，骨重建失衡是其发生的主要原因，因绝经造成的骨质疏松占骨质疏松症的绝大部分。研究表明，雌激素对骨骼的生长、发育和维持至关重要，因雌激素缺失致使RANKL介导的信号通路过度活化，进而使破骨细胞功能异常，是绝经后骨质疏松症主要原因[18]。因而抑制破骨细胞的分化及其功能是治疗骨质疏松的有效途径[19]。在本研究中，我们发现CSE通过抑制MAPK信号通路的激活来抑制RANKL介导的破骨细胞生成，同时对OVX小鼠的骨质流失具有良好的保护作用。
研究表明，在RANKL的刺激下，BMMs中的MAPK通路被激活，进而刺激破骨细胞特异性基因的表达，促进BMMs分化为破骨细胞[19-21]。NFATc1和DC-STAMP是破骨细胞分化和前体破骨细胞融合的主要调控者，TRAP、CTSK、ATP6V0d2是反映破骨细胞活性和骨吸收状态的特异性指标[22-23]。本研究表明，CSE显著抑制RANKL介导的破骨细胞分化，而且在破骨细胞分化的早期阶段作用最为明显。其机制是抑制JNK、ERK和P38的激活，进而抑制破骨细胞特异性基因的表达。
F-actin环是分化成熟的破骨细胞在骨面上极化，使骨架重排，F-actin紧密排列形成的一个环，是破骨细胞进行骨吸收的先决条件。因而阻碍破骨细胞前体细胞的融合，能够有效抑制F-actin环的形成和骨吸收功能[24]。本研究发现CSE显著性地抑制F-actin环的形成，并降低了环内细胞核数以及骨陷窝面积，这表明CSE阻碍了破骨细胞前体细胞的融合和骨吸收功能，与CSE抑制破骨细胞分化及其特异性基因表达的结果相一致。
我们构建了去卵巢小鼠模型模拟绝经后的骨质疏松症，经CSE灌胃给药6周后，采用HE和TRAP染色对小鼠股骨进行骨组织形态学分析以及ELISA检测血清中ALP、TRAP、BGP含量。TRAP是酸性磷酸酶的同工酶，其血清浓度可反映破骨细胞的活性[25]。ALP是一种磷酸单酯酶，由成骨细胞分泌，能有效地反映成骨细胞的活性[27]。BGP由成骨细胞合成及分泌，绝大部分的BGP随成骨细胞矿化在骨基质中沉积，仅有一小部分进入到血液循环[14]。血液中的BGP是成骨细胞分泌完成后直接进入血液，并非是破骨细胞降解骨基质而进入血液，因而检测血液中的BGP含量，对评判机体经药物治疗后变化有较大的参考价值。结果显示，CSE能有效缓解骨量丢失，表现在CSE各剂量组小鼠的骨小梁数量增多，间距减少，以及骨表面破骨细胞数量和面积减少，表明了CSE对去卵巢小鼠的骨量流失具有良好的保护作用。同时CSE提高了血清中ALP含量，使BGP和TRAP含量回归正常水平，说明其可抑制破骨细胞分化，减弱骨吸收功能，具有缓解骨量流失和调节骨代谢作用。
总之，本研究发现CSE在体外抑制了RANKL诱导的破骨细胞分化及其骨吸收功能，其可能机制部分归因于CSE抑制了级联信号中ERK、JNK和P38的激活，在体内有效的缓解了因卵巢切除造成的骨量丢失，这为CSE防治骨质疏松症提供了初步的药理学证据。
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[1] LIU X D. Overview: role of drug transporters in drug disposition and its clinical significance[J]. Adv Exp Med Biol, 2019, 1141:1-12. [2] HONG M K, LIU H H, CHEN G H, et al. Oridonin alters hepatic urea cycle via gut microbiota and protects against ace-taminophen-induced liver injury[J]. Oxid Med Cell Longev, 2021, 2021:3259238. [3] LIU M, SHI W, HUANG Y F, et al. Intestinal flora: a new target for traditional Chinese medicine to improve lipid metabolism disorders[J]. Front Pharmacol, 2023, 14:1134430. doi: 10.3389/fphar.2023.1134430 [4] FUJIMURA K E, SLUSHER N A, CABANA M D, et al. Role of the gut microbiota in defining human health[J]. Expert Rev Anti Infect Ther, 2010, 8(4):435-454. doi: 10.1586/eri.10.14 [5] DE VOS W M, TILG H, VAN HUL M, et al. Gut microbiome and health: mechanistic insights[J]. Gut, 2022, 71(5):1020-1032. doi: 10.1136/gutjnl-2021-326789 [6] GUMBINER B M. Breaking through the tight junction barrier[J]. J Cell Biol, 1993, 123(6):1631-1633. doi: 10.1083/jcb.123.6.1631 [7] BAAS A F, KUIPERS J, VAN DER WEL N N, et al. Complete polarization of single intestinal epithelial cells upon activation of LKB1 by STRAD[J]. Cell, 2004, 116(3):457-466. doi: 10.1016/S0092-8674(04)00114-X [8] TSUKITA S, FURUSE M, ITOH M. Multifunctional strands in tight junctions[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2001, 2(4):285-293. doi: 10.1038/35067088 [9] ROSE E C, ODLE J, BLIKSLAGER A T, et al. Probiotics, prebiotics and epithelial tight junctions: a promising approach to modulate intestinal barrier function[J]. Int J Mol Sci, 2021, 22(13):6729. doi: 10.3390/ijms22136729 [10] SUZUKI T. Regulation of the intestinal barrier by nutrients: the role of tight junctions[J]. Anim Sci J, 2020, 91(1):e13357. doi: 10.1111/asj.13357 [11] ADEWOLE D, AKINYEMI F. Gut microbiota dynamics, growth performance, and gut morphology in broiler chickens fed diets varying in energy density with or without bacitracin methylene disalicylate (BMD)[J]. Microorganisms, 2021, 9(4):787. doi: 10.3390/microorganisms9040787 [12] LI Y F, UDAYAKUMAR V, SATHUVAN M, et al. Effects of laminarin zwitterionic carboxylate and sulfonate on the intestinal barrier function and gut microbiota[J]. Carbohydr Polym, 2022, 278:118898. doi: 10.1016/j.carbpol.2021.118898 [13] YADAV M K, KUMARI I, SINGH B, et al. Probiotics, prebiotics and synbiotics: safe options for next-generation therapeutics[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2022, 106(2):505-521. doi: 10.1007/s00253-021-11646-8 [14] MERCADO-LUBO R, MCCORMICK B A. The interaction of gut microbes with host ABC transporters[J]. Gut Microbes, 2010, 1(5):301-306. doi: 10.4161/gmic.1.5.12925 [15] ZHAI Q X, FENG S S, ARJAN N, et al. A next generation probiotic, Akkermansia muciniphila[J]. Crit Rev Food Sci Nutr, 2019, 59(19):3227-3236. doi: 10.1080/10408398.2018.1517725 [16] GRAJEDA-IGLESIAS C, DURAND S, DAILLÈRE R, et al. Oral administration of Akkermansia muciniphila elevates systemic antiaging and anticancer metabolites[J]. Aging, 2021, 13(5):6375-6405. doi: 10.18632/aging.202739 [17] BEHROUZI A, VAZIRI F, RIAZI RAD F, et al. Comparative study of pathogenic and non-pathogenic Escherichia coli outer membrane vesicles and prediction of host-interactions with TLR signaling pathways[J]. BMC Res Notes, 2018, 11(1):539. doi: 10.1186/s13104-018-3648-3 [18] SAKSENA S, GOYAL S, RAHEJA G, et al. Upregulation of P-glycoprotein by probiotics in intestinal epithelial cells and in the dextran sulfate sodium model of colitis in mice[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2011, 300(6):G1115-G1123. doi: 10.1152/ajpgi.00027.2011 [19] DU F, HUANG R F, LIN D, et al. Resveratrol improves liver steatosis and insulin resistance in non-alcoholic fatty liver disease in association with the gut microbiota[J]. Front Microbiol, 2021, 12:611323. doi: 10.3389/fmicb.2021.611323 [20] LI W D, WANG Y X, SUN M, et al. The prebiotic-like effects of Coprinus comatus polysaccharides on gut microbiota in normal mice and those with acute alcoholic liver injury: a comparative study[J]. Evid Based Complementary Altern Med, 2020, 2020:2027570. [21] LI F T, YANG D, SONG F Y, et al. In vitro effects of ginseng and the seed of Zizyphus jujuba var. spinosa on gut microbiota of rats with spleen deficiency[J]. Chem Biodivers, 2020, 17(9):e2000199. doi: 10.1002/cbdv.202000199 [22] ZHANG Y B, LIU X Y, WANG Y F, et al. Antibacterial activity and mechanism of cinnamon essential oil against Escherichia coli and Staphylococcus aureus[J]. Food Contr, 2016, 59:282-289. doi: 10.1016/j.foodcont.2015.05.032 [23] LI Z X, ZHAO Y X, CHENG J L, et al. Integrated plasma metabolomics and gut microbiota analysis: the intervention effect of Jiawei Xiaoyao San on liver depression and spleen deficiency liver cancer rats[J]. Front Pharmacol, 2022, 13:906256. doi: 10.3389/fphar.2022.906256 [24] YANG Y N, CAO S J, XU W Y, et al. Dual modulation of gut bacteria and fungi manifests the gut-based anti-hyperlipidemic effect of Coptidis Rhizoma[J]. Biomed Pharmacother, 2022, 153:113542. doi: 10.1016/j.biopha.2022.113542 [25] TIAN Q M, WEI S M, SU H R, et al. Bactericidal activity of Gallic acid against multi-drug resistance Escherichia coli[J]. Microb Pathog, 2022, 173:105824. doi: 10.1016/j.micpath.2022.105824 [26] YANG J, QIAN D, JIANG S, et al. Identification of rutin deglycosylated metabolites produced by human intestinal bacteria using UPLC-Q-TOF/MS[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 2012, 898:95-100. doi: 10.1007/s12272-017-0986-y [27] BAO Y, HAN X, LIU D, et al. Gut microbiota: the key to the treatment of metabolic syndrome in traditional Chinese medicine - a case study of diabetes and nonalcoholic fatty liver disease[J]. Front Immunol, 2022, 13:1072376. doi: 10.3389/fimmu.2022.1072376 [28] SHEN H, GAO X J, LI T, et al. Ginseng polysaccharides enhanced ginsenoside Rb1 and microbial metabolites exposure through enhancing intestinal absorption and affecting gut microbial metabolism[J]. J Ethnopharmacol, 2018, 216:47-56. doi: 10.1016/j.jep.2018.01.021 [29] GUO Y P, SHAO L, CHEN M Y, et al. In vivo metabolic profiles of Panax notoginseng saponins mediated by gut microbiota in rats[J]. J Agric Food Chem, 2020, 68(25):6835-6844. doi: 10.1021/acs.jafc.0c01857 [30] SONG R, XU L, XU F G, et al. Metabolic analysis of rhubarb extract by rat intestinal bacteria using liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Biomed Chromatogr, 2011, 25(3):417-426. doi: 10.1002/bmc.1467 [31] HUANG Z H, XU Y, WANG Q, et al. Metabolism and mutual biotransformations of anthraquinones and anthrones in rhubarb by human intestinal flora using UPLC-Q-TOF/MS[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 2019, 1104:59-66. doi: 10.1016/j.jchromb.2018.10.008 [32] GOC J, LV M Z, BESSMAN N J, et al. Dysregulation of ILC3s unleashes progression and immunotherapy resistance in colon cancer[J]. Cell, 2021, 184(19): 5015-5030. [33] RACOVA Z, ANZENBACHEROVA E, PAPOUSKOVA B, et al. Metabolite profiling of natural substances in human: in vitro study from fecal bacteria to colon carcinoma cells (Caco-2)[J]. J Nutr Biochem, 2020, 85:108482. doi: 10.1016/j.jnutbio.2020.108482 [34] ENRIGHT E F, GOVINDARAJAN K, DARRER R, et al. Gut microbiota-mediated bile acid transformations alter the cellular response to multidrug resistant transporter substrates in vitro: focus on P-glycoprotein[J]. Mol Pharm, 2018, 15(12):5711-5727. doi: 10.1021/acs.molpharmaceut.8b00875 [35] TELBISZ Á, ÖZVEGY-LACZKA C, HEGEDŰS T, et al. Effects of the lipid environment, cholesterol and bile acids on the function of the purified and reconstituted human ABCG2 protein[J]. Biochem J, 2013, 450(2):387-395. doi: 10.1042/BJ20121485 [36] KELLY C J, ZHENG L, CAMPBELL E L, et al. Crosstalk between microbiota-derived short-chain fatty acids and intestinal epithelial HIF augments tissue barrier function[J]. Cell Host Microbe, 2015, 17(5):662-671. doi: 10.1016/j.chom.2015.03.005 [37] LI Y Y, JI X Y, WU H N, et al. Mechanisms of traditional Chinese medicine in modulating gut microbiota metabolites-mediated lipid metabolism[J]. J Ethnopharmacol, 2021, 278:114207. doi: 10.1016/j.jep.2021.114207 [38] CHEN M Y, LIAO Z Q, LU B Y, et al. Huang-Lian-Jie-du-decoction ameliorates hyperglycemia and insulin resistant in association with gut microbiota modulation[J]. Front Microbiol, 2018, 9:2380. doi: 10.3389/fmicb.2018.02380 [39] LOUIS P, HOLD G L, FLINT H J. The gut microbiota, bacterial metabolites and colorectal cancer[J]. Nat Rev Microbiol, 2014, 12(10):661-672. doi: 10.1038/nrmicro3344 [40] XIE X H, LIAO J B, AI Y L, et al. Pi-Dan-Jian-qing decoction ameliorates type 2 diabetes mellitus through regulating the gut microbiota and serum metabolism[J]. Front Cell Infect Microbiol, 2021, 11:748872. doi: 10.3389/fcimb.2021.748872 [41] KRAEHENBUHL J P, PRINGAULT E, NEUTRA M R. Review article: intestinal epithelia and barrier functions[J]. Aliment Pharmacol Ther, 1997, 11(s3):3-9. doi: 10.1111/j.1365-2036.1997.tb00803.x [42] GAO Z Z, LI Q W, WU X M, et al. New insights into the mecha-nisms of Chinese herbal products on diabetes: a focus on the “bacteria-mucosal immunity-inflammation-diabetes” axis[J]. J Immunol Res, 2017, 2017:1813086. [43] SHEN J, CHENG J Z, ZHU S G, et al. Regulating effect of baicalin on IKK/IKB/NF-kB signaling pathway and apoptosis-related proteins in rats with ulcerative colitis[J]. Int Immunopharmacol, 2019, 73:193-200. doi: 10.1016/j.intimp.2019.04.052 [44] YANG C C, DU Y, REN D Y, et al. Gut microbiota-dependent catabolites of tryptophan play a predominant role in the protective effects of turmeric polysaccharides against DSS-induced ulcerative colitis[J]. Food Funct, 2021, 12(20):9793-9807. doi: 10.1039/D1FO01468D [45] CHEN S Y, CHEN Z J, WANG Y, et al. Targeted delivery of Chinese herb pair-based berberine/tannin acid self-assemblies for the treatment of ulcerative colitis[J]. J Adv Res, 2022, 40:263-276. doi: 10.1016/j.jare.2021.11.017 [46] NIU C, HU X L, YUAN Z W, et al. Pulsatilla decoction improves DSS-induced colitis via modulation of fecal-bacteria-related short-chain fatty acids and intestinal barrier integrity[J]. J Ethnopharmacol, 2023, 300:115741. doi: 10.1016/j.jep.2022.115741 [47] GHOSH S, SINGH R, VANWINKLE Z M, et al. Microbial metabolite restricts 5-fluorouracil-resistant colonic tumor progression by sensitizing drug transporters via regulation of FOXO3-FOXM1 axis[J]. Theranostics, 2022, 12(12):5574-5595. doi: 10.7150/thno.70754 期刊类型引用(1)
1. 王楠. 小剂量口服避孕药对妇女血凝的影响研究. 实用妇科内分泌电子杂志. 2023(23): 82-84 . 
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