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肾移植患者中19%～35%出现了肌肉骨骼疼痛，其中由钙调神经磷酸酶抑制剂（calcineurin inhibitors，CNIs）导致的一种双侧、对称性、难治性疼痛被称为钙调神经磷酸酶抑制剂致疼痛综合征（calcineurin inhibitor-induced pain syndrome，CIPS），最常累及双下肢。CIPS由Bouteiller等首次描述，并于1991年由Lucas等在肾移植患者中首次报道[1]，最终由Grotz等在2001年命名为CIPS[2]。近20年来，有关移植后疼痛综合征的报道不断出现，包括CIPS、无血管性坏死（AVN）以及反射性交感神经营养不良综合征（RSDS）等，其中CIPS越来越受到人们的关注。该综合征影响了1%～17%的肾、心脏、肺、肝脏、胰腺或骨髓移植患者[3]，且均报道与他克莫司或环孢素有关，移植受者中环孢素致CIPS的发生率为1.5%～14%，而他克莫司致CIPS的发生率为2.2%[4]。为了解肾移植受者中CIPS的临床特征及其治疗方法，本研究对目前已发表的病例报告进行了汇总和统计分析。
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通过检索PubMed和Google学术等获得可能相关的外文全文或摘要，检索关键词主要包括：calcineurin inhibitor-induced pain syndrome，post-transplant distal limb syndrome (PTDLS)，symmetric bone pain syndrome (SBPS)，CIPS in chronic kidney disease (CKD)，CIPS in chronic kidney disease stage 5 transplantation (CKD5T)。通过检索中国知网、万方、维普等获取相关的中文全文或摘要，检索关键词：钙调神经磷酸酶抑制剂致疼痛综合征，他克莫司致疼痛综合征，环孢素致疼痛综合征，移植后疼痛综合征，移植后骨疼痛。检索时间段为1991年1月至2020年12月，纳入标准为：肾移植受者、病例报告，排除标准为：非肾移植受者、综述和重复文献。经过筛选和研究入组后，共11篇文章，包括15例病例报告和患者。
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收集患者的年龄、性别、肾移植类型和原发病，患者发生CIPS的时间、临床表现和实验室检查结果，以及针对CIPS的治疗方法和症状改善时间。
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采用SPSS22.0进行统计分析。分类变量记录为频数和百分比。正态分布的测量值表示为（
$\bar x $ ±s）以及范围，非正态分布的表示为中位数和四分位间距（IQR）。 -
对所纳入的11篇文章（均为外文文章）中的15例肾移植受者进行了定性和定量分析。表1总结了肾移植受者中CIPS的研究[5-15]。诊断时患者的平均年龄为（44.6±8.31）岁（范围为23～59岁）。在这些患者中，有8名（53.3%）男性，7名（46.7%）女性。肾移植的类型包括：尸体肾移植（n=10，66.7%），活体供体（n=3，20%）和数据缺乏（n=2，13.3%）。导致肾脏移植的原发病包括：IgA肾病（n=3，20%），肾小球肾炎（n=1，6.7%），高血压肾病（n=2，13.3%），自身免疫性疾病（类风湿关节炎、系统性红斑狼疮，n=3，20%），镇痛性肾病（n=1，6.7%），左侧肾脏发育不全（n=1，6.7%），伯杰病（n=1，6.7%），病因不明的终末期肾脏疾病（ESRD）（n=2，13.3%）和数据缺乏（n=1，6.7%）。
表 1 肾移植受者中发生CIPS的患者特征
病例 年龄 性别 肾移植类型 原发病 参考文献 1 41 男 尸肾移植 不明原因的慢性肾功能衰竭 [5] 2 59 女 第二次活体肾脏移植 病因不明的ESRD [6] 3 44 男 左肾发育不全致终末期肾病的肾移植 左肾发育不全 [7] 4 53 女 原发性ABO不相容的活体肾脏移植 控制良好的类风湿性关节炎和慢性肾脏疾病 [8] 5 37 男 活体肾脏移植 伯杰病 [9] 6 48 女 尸肾移植 镇痛性肾病 [10] 7 49 男 尸肾移植 IgA肾病 [10] 8 50 男 尸肾移植 IgA肾病 [10] 9 40 女 尸肾移植 系统性红斑狼疮 [10] 10 50 女 尸肾移植 未提及 [11] 11 49 男 尸肾移植 高血压肾病 [12] 12 42 男 尸肾移植 动脉高血压 [12] 13 23 女 从一名41岁的头部外伤捐赠者那里接受了肾脏同种异体移植 狼疮性肾炎 [13] 14 43 女 第二次尸肾移植 肾小球肾炎 [14] 15 41 男 第二次尸肾移植 IgA肾病和高血压 [15] -
受累的关节表现包括: 双侧膝盖疼痛(n = 4, 26.7%), 双足对称性疼痛(n = 3, 20%), 双侧膝盖和双足疼痛(n = 2, 13.3%), 双足和脚踝疼痛(n = 1, 6.7%), 双侧膝盖和脚踝疼痛(n = 1, 6.7%), 双侧腕、肘、手和膝盖疼痛(n = 1, 6.7%), 双侧手、膝盖、脚踝和双足疼痛(n = 1, 6.7%), 双侧手、肘、膝盖、脚踝和双足疼痛(n = 1, 6.7%), 后背疼痛(n = 1, 6.7%)。肾移植后CIPS出现的平均时间为(2.42±3.07)个月(1例描述为肾移植后不久, 具体时间不详), 中位数为1.22个月, IQR为1～2个月。具体详见表 2。
表 2 发生CIPS的患者症状、累及关节和发生时间
病例 症状表现 累及关节 症状出现时间 1 双足对称性的严重疼痛 双足 过去的9年 (发生在肾移植后不久) 2 双侧踝关节和膝盖疼痛，双侧下肢左下踝外侧踝乏力 膝盖，脚踝 第2次肾移植后6周 3 首先是左脚疼痛，然后是双脚（在脚趾两侧）和膝盖（在两个膝盖的外侧）进行性疼痛，患处伴有水肿 膝盖，双足 移植后2个月 4 高热，疲劳和关节疼痛 手肘，手腕，膝盖 移植后14 d 5 双脚突发严重的对称性疼痛，行走受限 双足 肾移植后1年 6 突发严重的双侧膝关节疼痛 膝盖 移植后第1个月 7 突发严重的双侧膝关节疼痛 膝盖 移植后第1个月 8 突发严重的双侧膝关节疼痛 膝盖 移植后第1个月 9 突发严重的双侧膝关节疼痛，双足严重的骨痛 膝盖，双足 移植后第1个月 10 膝部进行性双侧对称性疼痛且行走困难 膝盖 移植后2个月 11 运动时多个关节剧烈疼痛，并在移植后2个月使用拐杖走路 双手，膝盖，脚踝和双足 移植后1个月 12 双足疼痛，无法行走 双足 移植后6个月 13 从胸腔到腰骶的严重后背钝痛，疼痛评分为10/10。背部伸展使疼痛加重，背部弯曲和躺下缓解。坐位时，尾骨区疼痛加重；背部中线以外无疼痛辐射 后背 移植后43 d 14 双足和脚踝进行性疼痛 双足和脚踝 术后1个月 15 双侧足部疼痛和轻微的脚踝疼痛，最后延伸至膝盖；4个月后，疼痛变得难以忍受，手和肘部出现轻微疼痛 双足，脚踝，膝盖，手和肘部 肾移植后73 d -
CNIs水平的影响在此研究中是无法估计的, 原因在于缺少实际治疗水平(谷浓度范围)的数据。CIPS发生时, CNIs水平升高或正常。7名(46.7%)患者使用环孢素作为初始免疫抑制药物, 其中6名(40%)测量了环孢素水平, 环孢素的平均全血谷浓度为(194.5±92.9) ng/ml(范围为38～278 ng/ml)。其中3名患者的环孢素谷浓度较高, 平均谷浓度为(268±12.5)ng/ml(范围为254～278 ng/ml)。8名(53.3%)患者使用他克莫司作为初始免疫抑制药物, 其中6名(40%)测量了他克莫司水平, 其平均全血谷浓度为(21.6±9.3) ng/ml(范围为5～28.2 ng/ml)。3名(20%)患者的碱性磷酸酶水平升高, 1名(6.7%)患者的碱性磷酸酶水平正常, 而11名(73.3%)患者的数据缺乏。4名(26.7%)患者的甲状旁腺激素(PTH)水平增加, 平均水平为(260±383)ng/L(范围为26～833 ng/L), 4名(26.7%)患者的PTH水平正常, 7名(46.7%)患者的数据缺乏。3名(20%)患者出现了高钙血症, 1名(6.7%)患者的血清钙水平正常, 11名(73.3%)患者的数据缺乏。2名(13.3%)患者出现低磷血症, 1名(6.7%)患者出现高磷血症, 1名(6.7%)患者血磷水平正常, 11名(73.3%)患者的数据缺乏。1名患者(6.7%)的C反应蛋白升高, 8名患者(53.3%)的C反应蛋白正常, 6名(40%)患者的数据缺乏。2名(13.3%)患者类风湿因子水平正常, 13名(86.7%)患者的数据缺乏。4名(26.7%)患者的尿酸水平正常, 11名(73.3%)患者的数据缺乏。
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在本研究纳入的15名患者中, 4名(26.7%)患者调整了环孢素剂量, 治疗后3个月症状缓解。1名(6.7%)患者将环孢素更换为依维莫司, 出院后两周和随访4个月后, 疼痛有所改善, 后给予降钙素治疗4周后无临床获益。1名(6.7%)患者开始使用氨氯地平并不能改善其症状, 但将小剂量环孢素更换为依维莫司后, 疼痛得到明显改善。6个月后, MRI显示骨髓水肿消失, 关节周围轻度积液缓解。2名(13.3%)患者在他克莫司减量后症状改善。1名(6.7%)患者在停用他克莫司并更换为CsA1周内其症状消失, 且血清肌酐水平正常, 肾移植术后无急性排斥反应和疼痛。2名患者(13.3%)将他克莫司更换为西罗莫司后症状均改善, 但其中1例在几周后由于华法林引起的脑出血而死亡。将依维莫司更换为小剂量环孢素后2个月, 1名(6.7%)患者的症状改善, 并且未采用任何特殊治疗, 发病后7个月其疼痛症状消失。1名(6.7%)患者在开始静脉注射帕米膦酸后其活动能力有所改善。1名(6.7%)患者在合用克霉唑2 d后出现背部疼痛, 考虑克霉唑导致他克莫司水平升高, 故停用克霉唑, 并给予硝苯地平治疗, 患者背部疼痛无缓解, 但在普瑞巴林首次给药后30 min内患者疼痛评分明显降低, 并在发病后3周疼痛症状消失。1名(6.7%)患者将他克莫司更换为依维莫司后疼痛未缓解, 给予曲马多、氨酚氢可酮、芬太尼、度洛西汀、西那卡塞和双膦酸盐后患者疼痛亦无明显缓解, 但在将硝苯地平更换为尼卡地平后患者疼痛缓解, 最终在移植后9个月症状完全缓解。13名患者的症状好转时间平均为(4.43±3.31)个月, 另外2名患者未描述。CIPS有效治疗方式的分布见图 1。
图 1 CIPS有放治疗方式的图解分布
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在本研究中, 肾移植术后出现CIPS的患者无明显性别差异且为中青年人群, 其肾移植类型多为尸体肾移植, 原发病主要为IgA肾病、自身免疫性疾病和高血压。既往研究报道CIPS主要累及下肢, 本研究显示可出现CIPS症状的部位众多, 涉及双侧手、肘、腕、膝盖、脚踝、双足以及后背。CIPS多表现为神经性症状, 如异常性疼痛和电击样疼痛, 也有相关瘙痒的报道。没有营养性皮肤变化或血管舒缩不稳的迹象。体格检查通常是正常的。
本研究中CIPS出现的时间范围为肾移植后14 d至1年, 经治疗后缓解期最短为20 d, 最长可达1年。实验室检查提示发生CIPS时CNIs的谷浓度升高或正常, 部分患者的碱性磷酸酶、甲状旁腺激素、血钙、C反应蛋白水平升高, 血磷水平异常, 而类风湿因子、尿酸水平正常。CIPS已被证实可能发生在肝、肾移植以及干细胞移植中。CNIs阻断可下调背景电流的脊髓钾离子通道, 进而通过影响动作电位传播的速度来增强兴奋性信号传导[16]。Grotz等提出了这样的假说, 即CNIs引起的血管紊乱导致骨髓血管通透性增加并伴有骨髓水肿, 后期报道的一些CIPS患者受累关节中示踪剂摄入增加和轻度骨髓水肿亦证实了这一假说。他克莫司可通过增加潜在的N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)活性导致不受限制的伤害性输入, 并且其磷酸化状态由蛋白激酶和蛋白磷酸酶活性之间的平衡动态控制。酪蛋白激酶II的激活可增加NMDARs的磷酸化和活性, 而钙调磷酸酶可以负反馈调节大脑中NMDARs的磷酸化及其功能。尽管CNIs导致脊髓NMDAR活性增加的机制尚不完全清楚, 但在CIPS中, CNIs可能通过抑制钙调磷酸酶的活性, 使脊髓背角中NMDARs的磷酸化/去磷酸化周期转变为以磷酸化状态为主[17]。初级感觉神经元和脊髓背角神经元的中央末端之间的第一感觉突触在感觉信息的传递和转换中起着重要作用。谷氨酸是一种重要的兴奋性神经递质, 而NMDARs在与背角疼痛传导相关的脊髓突触可塑性中起着关键作用[18]。
针对CIPS的药物治疗中, 阿片类镇痛药如吗啡、芬太尼、羟考酮等通常对CIPS无效。非甾体类抗炎药可以缓解症状, 但会对肾功能产生不利影响。据报道, 核心减压可迅速改善短暂性骨髓水肿的症状, 但如果保守处理, CIPS和短暂性骨髓水肿通常会在2～4个月内改善。氯膦酸盐和降钙素的使用似乎可以通过抑制骨溶解来减轻疼痛。CNIs减量或停用也可以缓解疼痛症状。在许多情况下, CNIs交换(如从他克莫司更换为环孢素或从环孢素更换为他克莫司)是有效的。下肢疼痛时建议将腿抬高。使用不抑制细胞色素P450的钙通道拮抗剂似乎也能有效地降低骨内高压。前列环素类似物伊洛前列素可能至少在重症患者中是一种安全的治疗选择。在Tillmann等进行的一项原始研究中, 采用标准方案静注伊洛前列素治疗10名患者, 通过评分从1～10的视觉类似量表测量, 结果表明伊洛前列素可促进疼痛的缓解: 治疗前(5.6±1.5), 治疗后(2.1±1.3), P = 0.0004[19]。Taşoğlu等的病例报告中首次描述了通常能有效用于神经性疼痛的γ-氨基丁酸(GABA)类似物, 如加巴喷丁或普瑞巴林。作者介绍了一名48岁接受了肝移植手术的男性患者, 该患者出现了双脚剧烈疼痛, 且疼痛程度逐渐增加, 有时甚至累及到膝盖。而给予普瑞巴林150 mg, 每天2次, 显著减轻了他的疼痛[20]。尽管已描述了在使用双膦酸盐(30 mg)后, CIPS症状得到改善, 但目前对其有效性仍存在争议。本研究中76.9%(10/13)的肾移植受者通过将CNIs减量或将CNIs更换为同类药物中的另一种药物, 使CIPS症状得到了缓解, 其他缓解症状的方法还包括静脉注射帕米膦酸、使用普瑞巴林以及尼卡地平。而使用阿片类镇痛药、双磷酸盐、降钙素、氨氯地平或硝苯地平未能明显改善症状。
CIPS是移植受者中发生的一种难治性疼痛综合征, 受累部位广泛, 病程长短不一, 其发病机制仍有待进一步研究。CIPS的最有效治疗方法是减少CNIs的剂量和更换免疫抑制剂, 其他治疗方式包括GABA类似物、帕米膦酸钠静脉注射、钙通道阻滞剂和保守疗法等。
Clinical features and treatment of calcineurin inhibitor-induced pain syndrome in renal transplant recipients
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摘要:
目的 了解肾移植受者中钙调神经磷酸酶抑制剂致疼痛综合征（calcineurin inhibitor induced pain syndrome，CIPS）的临床特征及其治疗方法。 方法 通过检索1991年1月至2020年12月PubMed、Google学术、中国知网、万方、维普等获得可能相关的全文或摘要，剔除综述、非肾移植受者以及重复的文献。最终纳入11篇文章，共包括15例病例报告。 结果 诊断CIPS时患者的平均年龄为（44.6±8.31）岁，男性患者比例为53.3%。CIPS出现的平均时间为肾移植后（2.42±3.07）个月。受累的部位主要包括双侧手、肘、腕、膝盖、脚踝、双足以及后背。实验室检查提示：发生CIPS时钙调神经磷酸酶抑制剂（calcineurin inhibitors，CNIs）的谷浓度升高或正常，部分患者的碱性磷酸酶、甲状旁腺激素、血钙、C反应蛋白水平升高，血磷水平异常，而类风湿因子、尿酸水平正常。通过减少CNIs剂量或更换CNIs种类，静脉注射帕米膦酸，加用普瑞巴林、钙通道拮抗剂等，多数患者CIPS症状消失，症状好转时间为（4.43±3.31）个月。 结论 CIPS的最有效治疗方法是减少CNIs的剂量和更换免疫抑制剂，其他治疗方式包括给予GABA类似物、帕米膦酸钠、钙通道阻滞剂和保守疗法。 -
关键词:
- 肾移植 /
- 钙调神经磷酸酶抑制剂 /
- 疼痛综合征 /
- 临床特征 /
- 治疗
Abstract:Objective To understand the clinical features and therapeutic methods for calcineurin inhibitor-induced pain syndrome (CIPS) in kidney transplant recipients. Methods The related articles or abstracts from January 1991 to December 2020 were obtained by searching PubMed, Google Scholar, CNKI, Wanfang and VIP databases. The reviews, duplicate literatures and the articles involved in non-kidney transplant recipients were excluded. 11 full papers were included with 15 case reports. Results The average age of patients at the time of diagnosis of CIPS was (44.6±8.31) years, and the 53.3% of the patients was male. The average appearance time of CIPS was (2.42±3.07) months after kidney transplantation. CIPS mainly affected bilateral hands, elbows, wrists, knees, ankles, feet and back. The patients had normal or elevated trough concentrations of calcineurin inhibitors (CNIs) when CIPS occurred. Some patients had elevated alkaline phosphatase, parathyroid hormone, blood calcium, C-reactive protein levels, and abnormal phosphorus levels, while rheumatoid factor and uric acid levels were normal. CIPS symptoms in most patients disappeared with dose reduction of CNIs, change to different class of CNIs, pamidronate IV injection, pregabalin, calcium channel antagonists, etc. The average recovery time was (4.43±3.31) months. Conclusion The most effective treatment for CIPS is to reduce the dose of CNIs and replace immunosuppressants. Other treatments include GABA analogs, intravenous pamidronate, calcium channel blockers and conservative therapy. -
Key words:
- renal transplantation /
- calcineurin inhibitors /
- pain syndrome /
- clinical features /
- treatment
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骨质疏松症是一种全身性骨代谢疾病，其典型特征是骨密度下降、骨脆性增加和骨微环境被破坏[1]。骨稳态失衡是其发生的主要病理学基础。骨稳态是指成骨细胞行使的骨形成功能和破骨细胞行使的骨吸收功能处在一个相对平衡的过程[2]。破骨细胞分化及其功能的过度活化是导致骨稳态失衡的重要因素[3]。中国骨质疏松症流行病学调查显示，我国50岁以上人群骨质疏松发病率为19.2%，65岁以上人群发病率为32%[4]。目前临床上治疗骨质疏松症的药物主要是骨吸收抑制剂，其在抑制骨吸收的同时，也干扰骨形成进程。因而发掘更好的治疗骨质疏松的药物是迫切需要的。
骨髓来源的巨噬细胞(BMMs)向破骨细胞分化需要重组小鼠巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子κB受体活化因子配体(RANKL)的持续刺激[5]。M-CSF增加了早期BMMs的增殖，RANKL与受体RANK结合激活肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)，进而激活细胞凋亡信号调节激酶1(ASK1)和NF-κB抑制物激酶(IKKs)，活化的ASK1和IKKs磷酸化JNK、ERK和P38以及NF-κB特异性抑制因子IκB特定部位的丝氨酸，激活MAPK和NF-κB信号。活化的MAPK和NF-κB使c-Fos、NFATc1表达增加，促进DC-STAMP、ATP6V0d2、TRAP、CTSK等破骨细胞特异性基因的转录与表达，导致破骨细胞分化[6]。研究表明，减弱破骨细胞分化及功能，能够有效地治疗骨质疏松症[7]。
冬虫夏草是一味传统中药，有增强免疫、抗炎、抗氧化和延缓衰老等作用[8]。先前的研究表明，富含锶的冬虫夏草菌丝发酵液对去卵巢骨质疏松大鼠有良好的治疗效果，其机制是提高了血清中的雌二醇水平，但是该研究仅基于整体水平解释了冬虫夏草作用于骨质疏松症的机制，对冬虫夏草的菌种也未作鉴定，并且野生的冬虫夏草提取液在骨质疏松症中的作用也未见报道[9-11]。本研究旨在探讨冬虫夏草提取液(CSE)对去卵巢小鼠的治疗作用以及对破骨细胞分化和功能的影响，为CSE防治骨质疏松症提供实验依据。
1. 材料
1.1 动物
SPF级雌性C57BL/6小鼠（上海西普尔-必凯实验动物有限公司），12周龄24只，6周龄7只，体质量20～22 g，合格证号：SCXK（沪）2018-0006。本实验经江西中医药大学实验动物伦理委员会批准（批号JZLLSC2019-0194），且遵循中国伦理委员会指导原则。
1.2 试剂
α-MEM培养基（美国Hyclone，批号：SH30265.01）；胎牛血清（美国Gbico，批号：10099-141）；重组小鼠RANKL、M-CSF蛋白（美国R&D，批号：462-TEC-010、416-ML-010）；TRAP染色试剂盒（浙江卓腾生物公司）；RNAiso Plus、TB Green（日本Takara，批号：9109、RR420B）；p-JNK、JNK、p-ERK1/2、ERK1/2、p-P38、P38和GAPDH兔单克隆抗体（美国CST，批号：4668、9252、4370、4695、4511、8690、5174）；山羊抗兔IgG H&L (IRDye® 800CW)预吸附二抗（美国Abcam，批号：ab216773）；冬虫夏草（上海雷允上药业有限公司）；羟基磷灰石涂板/96孔板（美国Corning，批号：3989）；小鼠抗酒石酸酸性磷酸酶、骨钙素、骨碱性磷酸酶ELISA试剂盒（上海生工，批号：D721140、D721126、D721049）。
1.3 仪器
371型细胞培养箱（美国Thermo）；Cytation 5多功能酶标仪（美国Bio-Tek）；CFX96型实时荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad）；SA型近红外双色激光成像系统（美国odyssey）；TI-SR型倒置显微镜（日本Nikon）；RM2016型病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）；JB-P5型包埋机（武汉俊杰）。
2. 方法
2.1 CSE制备
冬虫夏草(Cordyceps sinensis)药材产地为青海玉树，购自上海雷允上药业有限公司，经海军军医大学黄宝康教授鉴定。提取详情见引文[12]。
2.2 BMMs分离与培养
选取6周龄C57BL/6小鼠，使用颈椎脱臼法处死，取双侧股骨和胫骨，使用PBS将骨髓从骨髓腔中冲出，收集PBS并离心，弃上清液，使用α-MEM培养基重悬，于T75培养瓶内（含10%血清，1%青霉素-链霉素溶液及30 ng/ml M-CSF完全培养基）培养3 d。使用PBS清洗去除未贴壁细胞，加入适量新鲜完全培养基，直至细胞数量达到5×106个[13]。
2.3 CCK-8法检测BMMs细胞活性
在96孔板中，BMMs以8×103个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.125、0.25、0.5、1、2、4 mg/ml CSE干预处理，培养48 h或96 h，加入CCK-8检测液，37 ℃孵育1 h后在波长480 nm处检测吸光度。
2.4 体外破骨细胞分化实验
在96孔板中，BMMs以6×103个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE干预处理，同时加入50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF，阴性对照组不加入RANKL；每2 d更换一次培养基，直至第5天对破骨细胞进行TRAP染色。
将同样密度的BMMs接种于96孔板，孵育过夜；记过夜后为第1天，分别于第1、3、5天加入1 mg/ml CSE干预处理，每2 d更换一次培养基至第7天（仅加药1次，之后更换培养基均不加CSE），进行TRAP染色[14]。
2.5 F-actin环染色和骨吸收实验
在96孔板中，BMMs以6×103个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE干预处理，同时加入50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF，每2 d更换一次培养基。第5天用鬼笔环肽和DAPI分别对F-actin环和细胞核进行染色。
骨吸收实验：BMMs以5×105个/孔的密度接种于6孔板，孵育过夜；加入含50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF完全培养基，每2 d换液，至第4天出现小的破骨样细胞，胰酶消化以8×103个/孔密度重新接种至羟基磷灰石涂板内，并且加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE处理。培养3 d后，用次氯酸钠洗去细胞，PBS清洗后晾干，于光学显微镜下拍照，统计每个孔的骨陷窝面积[15]。
2.6 q-PCR检测
在12孔板中，BMMs以5×104个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE干预处理，同时加入50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF，每2 d更换一次培养基至第5天。抽提RNA，逆转录后使用q-PCR检测DC-STAMP、ATP6V0d2、TRAP、CTSK、NFATc1基因的表达，引物序列详情见引文[16]。
2.7 蛋白印迹法检测
在6孔板中，BMMs以5×105个/孔的密度接种，孵育过夜；使用无血清的α-MEM培养基饥饿细胞1 h，实验组更换含1 mg/ml的CSE的完全培养基，对照组更换含相同体积PBS的完全培养基，孵育3 h；均使用50 ng/ml RANKL刺激5、10、20、30、60 min，未被刺激的细胞作为0 min。刺激完成后，抽提总蛋白。经SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、5%脱脂奶粉封闭1 h，4 ℃下一抗孵育过夜，室温下荧光素偶联的二抗孵育1 h，用odyssey成像系统扫膜，分析JNK(1∶2000)、p-JNK(1∶2000)、ERK(1∶2000)、p-ERK(1∶2000)、P38(1∶2000)、p-P38(1∶2000)的表达。
2.8 动物造模、分组及给药
在24只12周龄小鼠中随机挑选6只作为假手术组（Sham组），其余小鼠使用异氟烷气麻，去除背部毛发，切开皮肤和背膜，使卵巢暴露，切除双侧卵巢并使用可吸收缝合线结扎、缝合（假手术组仅切开背部皮肤和腹膜）[14]。术后1周，按照文献报道方法[17]，将卵巢切除小鼠随机分为3组：模型组（OVX组）、CSE低剂量组、CSE高剂量组，每组6只。术后7 d开始给药，由预实验确定给药浓度为312.5和625 mg/kg，按照每只200 μl/d连续灌胃给药6周。
2.9 HE染色和TRAP染色
小鼠处死后取双侧股骨，4%多聚甲醛固定后进行脱钙处理，之后常规脱水、石蜡包埋，切成4 μm切片，分别进行HE染色和TRAP染色。统计破骨细胞数量/骨表面积（N. Oc/BS）、破骨细胞面积/骨表面积（Oc. S/BS）和骨体积/组织体积（BV/TV）。
2.10 ELISA法检测血清生化指标
小鼠处死前统一摘除小鼠左眼取血，将全血收集并在4 ℃静置30 min，之后在4 ℃下2 000 r/min离心20 min，吸取上清液置于−80 ℃冰箱中保存。按照Elisa试剂盒《用户操作手册》检测血清中TRAP、ALP、BGP含量。
2.11 统计学方法
使用Image J统计破骨细胞面积和个数、F-actin环面积和环内核数、骨陷窝面积、蛋白条带灰度值、N. Oc/BS、Oc. S/BS和BV/TV。使用SPSS 21.0统计学软件对数据进行分析。计量资料用均数±标准差（
$\bar x $ ±s）表示，多组间比较使用方差分析，以P<0.05认为差异具有统计学意义。3. 结果
3.1 CSE对BMMs细胞活力的影响
CCK-8结果显示，与空白组比较，CSE浓度范围在0.125～4 mg/ml时，48 h内和96 h内CSE对BMMs无细胞毒性（图1）。据此结果选择0.5、1、2 mg/ml作为之后的细胞实验浓度。
3.2 CSE对RANKL诱导的破骨细胞分化的影响
TRAP染色显示，与空白组比较，RANKL组的BMMs分化为成熟的TRAP阳性多核巨噬细胞（有完整的圆形状细胞形态且细胞核数目≥3）。与RANKL组比较，CSE不同剂量组的TRAP阳性多核巨噬细胞数量明显减少，且呈剂量依赖的方式下降，并且破骨细胞的大小也被显著抑制（图2A-C）。结果表明CSE不仅抑制破骨细胞的分化也阻碍了破骨细胞前体细胞的融合。
图 2 CSE对破骨细胞分化的影响（n=3）A.破骨细胞图像（×40）；B.每孔TRAP阳性多核细胞（细胞核数≥3）面积百分比；C.每孔TRAP阳性多核细胞（细胞核数≥3）个数；D.不同时间段加入CSE处理后的破骨细胞图像（×40）；E.加药时间示意图；F.每孔TRAP阳性多核细胞（细胞核数≥3）个数**P<0.01，与RANKL组比较在RANKL持续刺激的BMMs中按时段加入CSE。染色结果显示，与空白组比较，0 d组的BMMs几乎全部分化为成熟的破骨细胞，数量多，且形状完整。与0 d组比较，给予CSE1～3 d组的BMMs分化为成熟破骨细胞的数量最少，3～5 d组其次，5～7 d组最多（图2D、2E、2F）。结果表明CSE对破骨细胞生成的任一阶段均有作用，在早期阶段作用最为明显。
3.3 CSE对RANKL诱导的破骨细胞F-actin环形成和骨吸收功能的影响
鬼笔环肽和DAPI染色显示，RANKL组的F-actin环形成完整，数量多且面积大，环内细胞核数量多。与RANKL组比较，CSE不同剂量组的F-actin环数量和大小均下降，环内细胞核数量也明显减少（图3A、3B、3C）。
图 3 CSE对破骨细胞F-actin环形成和骨吸收功能的影响（n=3）A.F-actin环和细胞核共聚焦图像（×100）；B.每孔内F-actin环面积百分比；C.单个F-actin环内细胞核个数；D.骨陷窝图像（×40）；E.每孔未吸收面积百分比**P<0.01，与RANKL组比较骨板吸收显示，RANKL组未被吸收面积为70%， 1 mg/ml CSE组未被吸收面积为85%，2 mg/ml CSE组为95%，与RANKL组比较，不同剂量的CSE均有效的减少了骨板吸收的面积（图3D、3E）。结果表明CSE显著抑制了成熟破骨细胞骨吸收的功能。
3.4 CSE对RANKL诱导的破骨细胞特异性基因表达的影响
q-PCR结果显示，与RANKL组比较，CSE中、高剂量组显著性地抑制了破骨细胞特异性基因TRAP、CTSK、ATP6V0d2、DC-STAMP和NFATc1的表达，且呈剂量依赖性（图4）。这与CSE抑制破骨细胞分化及功能的结果相一致。
图 4 CSE对破骨细胞特异性基因表达的影响（n=3）A.TRAP；B.CTSK; C.ATP6V0d2; D.DC-STAMP; E.NFATc1*P<0.05，**P<0.01，与RANKL组比较3.5 CSE对破骨细胞分化过程中MAPK通路的影响
Wsetern-blot结果显示，RANKL组各时间段JNK、ERK和P38蛋白磷酸化显著。与RANKL组比较， CSE组p-JNK蛋白表达在第10～30 min明显下降，p-ERK蛋白表达在第20～60 min明显下降和p-P38蛋白表达在第10～60 min明显下降，见图5。结果表明在破骨细胞的分化过程中，CSE作用于MAPK通路JNK、ERK和P38的磷酸化。
3.6 CSE对卵巢切除小鼠的影响
HE和TRAP染色显示，与假手术组比较，OVX组小鼠的骨小梁数目和面积明显减少（BV/TV值下降）且间距变大，骨小梁表面破骨细胞数量增多、面积变大（N. Oc/BS、Oc. S/BS值上升）。与OVX组比较，CSE低剂量和高剂量组小鼠的骨小梁数目和面积均增加（BV/TV值上升）且间距减小，骨小梁表面破骨细胞数量减少、面积变小（N. Oc/BS、Oc. S/BS值下降），见图6。结果表明，CSE可以增加卵巢切除小鼠骨小梁数目，抑制破骨细胞活性，缓解骨量流失。
图 6 CSE对去卵巢小鼠股骨破骨细胞数量和骨小梁的影响（n=6）A.HE染色和TRAP染色；B.BV/TV；C.Oc. S/BS；D.N. Oc/BS；**P<0.01，与OVX组比较；##P<0.01，与假手术组比较3.7 CSE对TRAP、ALP、BGP含量的影响
ELISA结果显示，与假手术组比较，OVX组小鼠血清中的TRAP含量明显增加，BGP含量明显减少，ALP含量无明显变化；CSE高剂量组小鼠血清中的TRAP、BGP含量无明显变化， ALP含量明显增加。与OVX组比较，CSE低剂量和高剂量组小鼠血清中的ALP、BGP含量明显增加，TRAP含量明显减少（图7）。结果表明，CSE可以调节骨代谢相关指标，具有平衡骨稳态作用。
图 7 CSE对TRAP、ALP和BGP含量的影响（n=6）A.TRAP；B.ALP；C.BGP；*P＜0.05，**P<0.01，与OVX组比较；##P<0.01，与假手术组比较4. 讨论
骨质疏松症是一种与年龄相关的骨代谢疾病，骨重建失衡是其发生的主要原因，因绝经造成的骨质疏松占骨质疏松症的绝大部分。研究表明，雌激素对骨骼的生长、发育和维持至关重要，因雌激素缺失致使RANKL介导的信号通路过度活化，进而使破骨细胞功能异常，是绝经后骨质疏松症主要原因[18]。因而抑制破骨细胞的分化及其功能是治疗骨质疏松的有效途径[19]。在本研究中，我们发现CSE通过抑制MAPK信号通路的激活来抑制RANKL介导的破骨细胞生成，同时对OVX小鼠的骨质流失具有良好的保护作用。
研究表明，在RANKL的刺激下，BMMs中的MAPK通路被激活，进而刺激破骨细胞特异性基因的表达，促进BMMs分化为破骨细胞[19-21]。NFATc1和DC-STAMP是破骨细胞分化和前体破骨细胞融合的主要调控者，TRAP、CTSK、ATP6V0d2是反映破骨细胞活性和骨吸收状态的特异性指标[22-23]。本研究表明，CSE显著抑制RANKL介导的破骨细胞分化，而且在破骨细胞分化的早期阶段作用最为明显。其机制是抑制JNK、ERK和P38的激活，进而抑制破骨细胞特异性基因的表达。
F-actin环是分化成熟的破骨细胞在骨面上极化，使骨架重排，F-actin紧密排列形成的一个环，是破骨细胞进行骨吸收的先决条件。因而阻碍破骨细胞前体细胞的融合，能够有效抑制F-actin环的形成和骨吸收功能[24]。本研究发现CSE显著性地抑制F-actin环的形成，并降低了环内细胞核数以及骨陷窝面积，这表明CSE阻碍了破骨细胞前体细胞的融合和骨吸收功能，与CSE抑制破骨细胞分化及其特异性基因表达的结果相一致。
我们构建了去卵巢小鼠模型模拟绝经后的骨质疏松症，经CSE灌胃给药6周后，采用HE和TRAP染色对小鼠股骨进行骨组织形态学分析以及ELISA检测血清中ALP、TRAP、BGP含量。TRAP是酸性磷酸酶的同工酶，其血清浓度可反映破骨细胞的活性[25]。ALP是一种磷酸单酯酶，由成骨细胞分泌，能有效地反映成骨细胞的活性[27]。BGP由成骨细胞合成及分泌，绝大部分的BGP随成骨细胞矿化在骨基质中沉积，仅有一小部分进入到血液循环[14]。血液中的BGP是成骨细胞分泌完成后直接进入血液，并非是破骨细胞降解骨基质而进入血液，因而检测血液中的BGP含量，对评判机体经药物治疗后变化有较大的参考价值。结果显示，CSE能有效缓解骨量丢失，表现在CSE各剂量组小鼠的骨小梁数量增多，间距减少，以及骨表面破骨细胞数量和面积减少，表明了CSE对去卵巢小鼠的骨量流失具有良好的保护作用。同时CSE提高了血清中ALP含量，使BGP和TRAP含量回归正常水平，说明其可抑制破骨细胞分化，减弱骨吸收功能，具有缓解骨量流失和调节骨代谢作用。
总之，本研究发现CSE在体外抑制了RANKL诱导的破骨细胞分化及其骨吸收功能，其可能机制部分归因于CSE抑制了级联信号中ERK、JNK和P38的激活，在体内有效的缓解了因卵巢切除造成的骨量丢失，这为CSE防治骨质疏松症提供了初步的药理学证据。
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表 1 肾移植受者中发生CIPS的患者特征
病例 年龄 性别 肾移植类型 原发病 参考文献 1 41 男 尸肾移植 不明原因的慢性肾功能衰竭 [5] 2 59 女 第二次活体肾脏移植 病因不明的ESRD [6] 3 44 男 左肾发育不全致终末期肾病的肾移植 左肾发育不全 [7] 4 53 女 原发性ABO不相容的活体肾脏移植 控制良好的类风湿性关节炎和慢性肾脏疾病 [8] 5 37 男 活体肾脏移植 伯杰病 [9] 6 48 女 尸肾移植 镇痛性肾病 [10] 7 49 男 尸肾移植 IgA肾病 [10] 8 50 男 尸肾移植 IgA肾病 [10] 9 40 女 尸肾移植 系统性红斑狼疮 [10] 10 50 女 尸肾移植 未提及 [11] 11 49 男 尸肾移植 高血压肾病 [12] 12 42 男 尸肾移植 动脉高血压 [12] 13 23 女 从一名41岁的头部外伤捐赠者那里接受了肾脏同种异体移植 狼疮性肾炎 [13] 14 43 女 第二次尸肾移植 肾小球肾炎 [14] 15 41 男 第二次尸肾移植 IgA肾病和高血压 [15] 
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表 2 发生CIPS的患者症状、累及关节和发生时间
病例 症状表现 累及关节 症状出现时间 1 双足对称性的严重疼痛 双足 过去的9年 (发生在肾移植后不久) 2 双侧踝关节和膝盖疼痛，双侧下肢左下踝外侧踝乏力 膝盖，脚踝 第2次肾移植后6周 3 首先是左脚疼痛，然后是双脚（在脚趾两侧）和膝盖（在两个膝盖的外侧）进行性疼痛，患处伴有水肿 膝盖，双足 移植后2个月 4 高热，疲劳和关节疼痛 手肘，手腕，膝盖 移植后14 d 5 双脚突发严重的对称性疼痛，行走受限 双足 肾移植后1年 6 突发严重的双侧膝关节疼痛 膝盖 移植后第1个月 7 突发严重的双侧膝关节疼痛 膝盖 移植后第1个月 8 突发严重的双侧膝关节疼痛 膝盖 移植后第1个月 9 突发严重的双侧膝关节疼痛，双足严重的骨痛 膝盖，双足 移植后第1个月 10 膝部进行性双侧对称性疼痛且行走困难 膝盖 移植后2个月 11 运动时多个关节剧烈疼痛，并在移植后2个月使用拐杖走路 双手，膝盖，脚踝和双足 移植后1个月 12 双足疼痛，无法行走 双足 移植后6个月 13 从胸腔到腰骶的严重后背钝痛，疼痛评分为10/10。背部伸展使疼痛加重，背部弯曲和躺下缓解。坐位时，尾骨区疼痛加重；背部中线以外无疼痛辐射 后背 移植后43 d 14 双足和脚踝进行性疼痛 双足和脚踝 术后1个月 15 双侧足部疼痛和轻微的脚踝疼痛，最后延伸至膝盖；4个月后，疼痛变得难以忍受，手和肘部出现轻微疼痛 双足，脚踝，膝盖，手和肘部 肾移植后73 d
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