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肾病综合征（NS）是一类临床表现为大量蛋白尿、低蛋白血症、水肿及高脂血症的肾小球疾病[1]。2021年全球肾脏病预后指南指出，他克莫司（TAC）可作为难治性NS患者的一线治疗药物[2]。但TAC的治疗窗窄、不良反应多、药动学个体差异大，受体质量、基因、联合用药等多种因素的影响明显[3-4]，用药时需进行治疗药物监测（TDM）。目前，我国仅有四成医院具备TDM条件[5]，由于监测结果滞后且费用昂贵，传统TDM在临床应用中存在一定的局限性。
机器学习（ML）是指利用数据集构建数学模型并不断训练优化，来实现对未知数据的预测或分类[6]。作为人工智能技术的一大重要分支，近年来，越来越多的研究将ML预测模型应用于TDM和个体化用药中。相较于传统TDM，基于ML的TDM模型不仅精确度高，还具有高效率、低成本和普及率高等优点，在个体化用药领域备受瞩目。目前，使用ML算法预测TAC个体化用药的研究主要集中于器官移植和NS两方面[7–9]，但其在NS中的研究尚未见综述报道。基于此，该研究对ML算法在NS患者TAC个体化用药中的应用进行综述，以期为后续研究提供参考。
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ML根据学习方式可分为监督式学习、半监督式学习、非监督式学习及强化学习等[13]。目前，监督式学习在NS患者TAC个体化用药预测模型中应用最广泛。部分研究在使用监督式学习的同时引入集成学习算法。现将这两类算法的建模方法及优缺点介绍如下。
监督式学习是一种用于寻找输入变量和已知输出变量间函数关系的ML算法。已知的监督式学习算法包括线性回归、逻辑回归、决策树、支持向量机及朴素贝叶斯等。虽然该算法常伴有过拟合问题，但因其可解释性强，监督式学习仍然是医学领域应用范围最广的ML算法。集成学习是一种集多模型于一体的ML算法。虽然集成学习的预测结果常因模型复杂而难以解释，但因其可综合多个模型的预测结果且精确度高，近年来在医学领域应用广泛[14]。
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基于ML的TAC预测模型构建步骤如下：①资料收集：收集患者的临床数据，包括一般资料、实验室检查及给药信息等；②数据预处理：对临床数据进行格式调优、缺失值填补等操作，将其设置为有可比性的计算机语言，建立数据集[15]；③模型构建：对纳入变量进行特征筛选，根据预测目标和数据类型选择适宜的ML算法训练模型，并对模型进行参数调优；④性能评估：收集验证数据评估模型的真实预测效果，并使用R2、均方误差、准确度等指标评价模型性能；⑤结果解释及应用：解释模型的预测结果，并将其与临床对接，辅助个体化用药决策。
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药动学是研究个体化用药的基础，NS患者的TAC药动学研究主要集中在血药浓度预测领域。Zheng等[16]对比了14种基于线性回归和ML算法的TAC血药浓度预测模型，综合评价XG Boost预测模型性能最优。Huang等[17]和Mo等[18]将遗传因素纳入预测指标，建立了NS患儿的TAC谷浓度预测模型，并首次结合群体药动学和ML算法预测NS患儿的TAC清除率。除血药浓度外，药动学还涉及生物利用度、维持剂量等指标，未来研究还需纳入更多药动学指标。
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监测TAC的不良反应是临床合理用药的重要议题，治疗过程中患者常因不能耐受TAC的不良反应而减量或停药，从而导致治疗失败。目前，ML在TAC不良反应监测中的研究集中在肾毒性和震颤两方面。Mo等[19]利用229例NS患儿的不良反应数据，基于5种ML算法和遗传因素，预测TAC肾毒性的发生率。Shao等[20]采用252例NS患者的震颤相关指标，开发人工神经网络模型，预测TAC的震颤发生率。由于TAC的不良反应多，未来仍需对TAC的不良反应预测模型进行开发。
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疗效是评价药物安全性和有效性的基本指标，与患者的生命安全直接相关。TAC的疗效个体差异显著，相同方案治疗不同患者往往疗效各异。因此，早期预测TAC疗效并及时调整治疗方案对NS患者的治疗至关重要。目前，TAC疗效预测领域的研究较少。Mo等[21]运用两种疗效评价标准建立NS患者TAC疗效预测模型。结果显示，两种疗效评价标准下RF模型的综合性能最优。此外，研究还发现了TAC疗效的新型生物标志物，为后续疗效研究提供依据。在TAC疗效领域，影响NS患者疗效的遗传因素尚不明确，预测NS患者疗效的ML模型存在较大空缺，未来应对该领域开展进一步研究。
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构建性能良好的ML预测模型需要研究样本、预测变量、模型算法、性能评价及模型验证等多因素共同作用。各预测模型的数据特征见表1。
表 1 应用ML预测TAC临床应用的数据特征
文献研究 研究目的 样本选择 预测变量 最佳预测变量 模型 模型性能 验证方法 Zheng等[16]
（2021）预测自身免疫性疾病患者TAC的血药浓度 自身免疫性疾病患者
（123人）52个，包括人口学特征、药物信息、实验室检查及联合用药 身高、TAC日剂量、其他免疫抑制剂、LDL、MCV、MCH、WBC、DBIL、HCT 5种线性模型、
9种ML模型XG Boost模型效果最佳，R2 0.54，MAE 0.25，MSE 0.11，ACC 74.4% 内部验证：随机分配，训练组、测试组比例8∶2；
外部验证：未进行Mo等[19]
（2021）预测NS患儿TAC肾毒性的发生风险 16岁以下难治性NS患儿
（229人）291个，包括疾病诊断、病理检查、药物信息及基因分型 SD11B1 (rs846910)、MAP2K6 (rs17823202)、SCARB2 (rs6823680)、TRPC6 (rs3824934) XG Boost、GBDT、ET、RF、LR XG Boost模型预测效果最佳，SE 0.750，
ACC 77.3%，SP 0.778，AUC 0.789内部验证：随机分配，训练组、测试组比例7∶3，5倍交叉验证；外部验证：11例其他中心NS患儿 Shao等[20]
（2022）预测NS患者TAC诱导震颤的发生风险 NS患者，TAC治疗>3个月
（252人）64个，包括人口学特征及实验室
检查肌酐、D-二聚体、总蛋白、钙离子、血小板分布宽度、钾离子、纤维蛋
白原RFE-NN RFE-NN模型性能良好，训练集：AUC 0.973，ACC 93.4%，SE 0.971，SP 0.759；外部验证集：ACC 82.1%，SE 0.838，SP 0.700 内部验证：随机分配，训练组、测试组比例7∶3，10倍交叉验证；外部验证：71例NS患者 Huang等[17]
（2022）结合群体药动学模型预测NS患儿TAC清除率 18岁以下难治性NS患者
（139人）43个，包括人口学特征、实验室检查、药动学数据及基因分型 年龄、合用五酯胶囊、CYP3A5 *3 (rs776746)、CTLA4 (rs4553808) XG Boost、RF、Xtra-Trees、GBDT、Ada Boost、Lasso Lasso模型性能最优，R2 0.42，MAE 1.51、MSE 3.98 内部验证：随机分配，训练组、测试组比例8∶2，5倍交叉验证，1000 次自举验证；外部验证：未进行 Yuan等[22]
（2022）预测NS患者TAC的血药浓度 NS患者
（913人）19个，包括人口学特征、实验室检测、医嘱信息 肌酐、体质量、年龄、身高、TAC剂量、合用匹多莫德、合用百灵、合用黄奎 XG Boost、LR、RF、Ada Boost、GBDT、LGBM XG Boost模型性能最佳，ACC 73.3%， AUC 0.553，召回率0.969，精确度0.739 内部验证：随机分配，训练组、测试组比例8∶2；
外部验证：115例患者和180次血液检测Mo等[18]
（2022）预测难治性NS患儿的TAC谷浓度 16岁以下难治性NS患儿
（171人）326个，包括用药资料、人口学特征、基因分型、实验室检查 年龄、性别、ALB、ACTN4 (rs3745859)等10个单核苷酸多态性 ET、GBDT、RF、XG Boost、Lasso GBDT算法在全组及CYP3A5非表达组表现最佳，R2 0.44，MSE 591.03，MAE 20.78；ET算法在CYP3A5表达组表现最佳，R2 0.38，MSE 1839.45，MAE 31.26 内部验证：随机分配，训练组、测试组比例8∶2，5倍交叉验证；外部验证：30例NS患儿 Mo等[21]
（2023）预测难治性NS患儿的TAC疗效 16岁以下难治性NS患儿
（238人）289个，包括人口学特征、实验室检测、药物信息、临床表现、单核苷酸多态性 尿液红细胞数、类固醇类型、ITGB4 (rs2290460)等8个单核苷酸多态性 LR、ET、GBDT、RF、XG Boost RF模型在两种疗效评价标准下均性能最佳，召回率 0.357~0.914，ACC 72.1%~75.4%，SP 0.500~0.980，AUC 0.803~0.807 内部验证：随机分配，训练组、测试组比例7∶3，5倍交叉验证；外部验证：35例NS患儿 注：LDL：低密度脂蛋白；MCV：平均红细胞体积；MCH：平均红细胞血红蛋白量；WBC：白细胞计数；DBIL：直接胆红素；HCT：红细胞压积；ALB：血清白蛋白；XG Boost：极端梯度提升；GBDT：梯度提升决策树；ET：极端随机树；RF：随机森林；LR：逻辑回归；RFE:递归特征消除；NN：神经网络；Ada Boost：自适应提升；LGBM：梯度提升决策树；ET：极随机树；R2：确定系数；MAE：平均绝对误差；MSE：均方误差；AUC：ROC曲线下的面积；ACC：准确度；SE：灵敏度；SP：特异性。 -
样本选择方面，研究人群主要为16岁以下儿童，样本数多在250例以下，给药周期为15 d~3个月[16,18,20]。变量选择方面，各研究选取的预测变量和变量数目差别较大，但变量类别主要集中于人口学特征、给药信息及实验室检查3类。肌酐水平、年龄、身高、TAC日剂量、CTLA4（rs4553808）基因型和TRPC6（rs3824934）基因型是多数研究者认可的最佳预测变量。
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算法选择方面，XG Boost、GBDT、RF、LR及Lasso回归是最常见的5种ML算法。多项研究[16,19,22]表明，XG Boost算法拟合的模型在TAC个体化用药预测中性能最佳。此外，85%以上的研究涉及集成学习算法。
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性能评价方面，ML模型的评价指标主要分为区分度和校准度两个层面。区分度可以反映模型对结局事件的预测准确度，校准度能体现模型预测结果与实际观测值之间的吻合程度。其中，ACC、AUC是区分度使用频率最高的指标[16,19-22]；R2、MAE、MSE在校准度使用频率最高[16-18]。当前研究中，大部分预测模型的区分度较高（AUC:0.553~0.973，ACC:0.721~0.821），校准度良好（R2:0.420~0.540）[16,19-22]。
模型验证是检验ML模型普适性的重要步骤，包括内部验证和外部验证。研究常用的内部验证方法为拆分样本和交叉验证，70%以上的研究包含外部验证，但涉及多中心的研究较少[19]。
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随着人工智能技术的发展，ML逐渐成为辅助临床用药决策的重要手段。该研究综述了ML在NS患者TAC个体化用药中的应用，总结了ML模型的类型及优缺点，介绍了ML模型的构建步骤，详细阐述了ML在NS患者TAC个体化用药中的应用，梳理和对比了TAC预测模型的构建要点。目前，ML在预测TAC个体化用药方面已取得了一定进展，但仍存在不足之处。
首先，当前的ML模型在TAC临床预测方面开发不足。未来，拓宽ML模型在TAC预测领域的广度和深度是研究的重点。广度方面，后续研究可探究TAC在更多疾病中的临床应用，并探索不同人群的TAC用药情况[23]；深度方面，后续研究可进一步探索TAC的其他药动学指标及用药情况，并纳入更多ML算法。
其次，TAC预测模型的性能亟待提高。目前的TAC预测模型性能不高，部分研究未能同时涉及区分度和校准度[19-22]。未来研究应进一步丰富纳入变量，将更多血流动力学、影像学及生物信息学数据纳入研究变量，并丰富模型评价指标，提高模型性能。
再次，现有TAC预测模型的样本量较小，距临床应用尚缺乏持续训练和多中心验证。未来应在持续训练模型性能的基础上，开展多中心、大样本预测，提高模型的普适性。此外，现有医疗系统在数据采集和数据共享方面仍存在缺陷，导致多中心样本收集的难度较大。未来医疗系统应逐步规范各医院患者的信息录入标准，提高诊疗信息收录质量并开放更多医疗信息共享平台，使医疗数据能更好地推动ML临床预测。
综上所述，随着人工智能在个体化用药领域的不断发展，ML算法将被更加广泛地应用于治疗药物研究，从而为患者带来更加精准高效的个体化用药服务。
Application of machine learning in individualized medication of tacrolimus in patients with nephrotic syndrome
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摘要: 他克莫司是治疗肾病综合征的常用药物，因其治疗窗窄、药动学个体差异大，临床用药时需进行治疗药物监测。在治疗药物监测过程中，基于机器学习的他克莫司个体化用药预测模型可从大量临床数据中挖掘用药规律，辅助临床决策，实现个体化精准用药。本文围绕机器学习模型概述、机器学习在肾病综合征患者他克莫司个体化用药中的应用进展、机器学习预测模型的建模要点及当前预测模型的局限性等方面进行综述，以期为后续研究提供参考。Abstract: Tacrolimus is a commonly used medication for the treatment of nephrotic syndrome. Due to its narrow therapeutic window and significant pharmacokinetic differences among individuals, therapeutic drug monitoring is required during its clinical use. In the process of therapeutic drug monitoring, machine learning-based personalized dosing prediction models for tacrolimus can excavate medication patterns from a large amount of clinical data, assist in clinical decision-making, and achieve individualized precise medication. Machine learning models, the application progress of machine learning in personalized administration of tacrolimus for patients with nephrotic syndrome, modeling points of machine learning prediction models, and the limitations of current prediction models were reviewed in this paper, which could provide references for future research in this field.
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Key words:
- tacrolimus /
- nephrotic syndrome /
- machine learning
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据国际癌症研究机构（IARC，https://www.iarc.who.int/）提供的数据显示，2020年女性乳腺癌现已成为全球最常见的癌症之一[1]。其中有15%～25%的乳腺肿瘤存在人类表皮生长因子受体2（HER2）过表达。HER2阳性的乳腺癌浸润性强、无病生存期短、预后差，对化疗敏感性差，且易复发[2]。曲妥珠单抗是一株靶向HER2的人源化单克隆抗体。虽然曲妥珠单抗单药对乳腺癌治疗起到了很好的改善的效果, 但其疗效还有所不足，如对HER2过表达的乳腺癌患者初次治疗有效率仅在30%左右[3]。EGCG是绿茶中主要的多酚[4]，有抑制肿瘤细胞生长、增殖、转移和血管生成，诱导细胞凋亡和增强抗肿瘤免疫等多种抗肿瘤作用[5-9]。据报道，EGCG在乳腺癌、胃癌、白血病、膀胱癌治疗中均显示有抗肿瘤作用[10-13]。本实验旨在探讨曲妥珠单抗与EGCG对HER2过表达细胞株是否具有协同增殖抑制作用，为HER2高表达乳腺癌的治疗提供新的思路。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 材料
EGCG（MedChemExpress公司），CCK-8检测试剂盒（美国bimake生物科技有限公司）；GAPDH一抗、AKT一抗、p-AKT一抗、MAPK一抗、p-MAPK一抗、EGFR一抗、p-EGFR一抗、HER2一抗、p-HER2一抗、抗兔IgG一抗、抗鼠IgG一抗、HRP抗体二抗（美国Cell Signaling Technology公司），凝胶过滤层析标准品（美国BIO-RAD公司），二抗Goat pAb to Human IgG（英国Abcam公司）。
1.1.2 细胞株
人乳腺癌细胞系BT474、SK-BR-3（购自中国科学院细胞库并保存于本实验室）。
1.1.3 仪器
AKTA Avant 25蛋白纯化仪、Imager 600超灵敏多功能成像仪（美国Cytiva公司）； Agilent 1200 series高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；Spark多功能酶标仪（瑞士TECAN）； Intellicyt® iQue3 高通量流式细胞仪（德国赛多利斯）。
1.2 方法
1.2.1 曲妥珠单抗的表达与纯化
用含有曲妥珠单抗重链和轻链表达载体的质粒共转染Expi293F细胞7 d后收集培养上清液，用Protein A亲和层析法进行纯化。SEC-HPLC对抗体的纯度进行检测，并用流式细胞术检测曲妥珠单抗抗体与HER2过表达细胞株SK-BR-3、BT474的结合活性。
1.2.2 流式细胞术
细胞按3×104个细胞/孔铺于V型底96孔板中，每孔30 μl。曲妥珠单抗按100 nmol/L的起始浓度，3倍比稀释，分成11个浓度梯度，末孔为PBS作为阴性对照，加入铺有细胞的96孔板中，每孔30 μl。曲妥珠单抗与细胞4℃共孵育1～2 h，用含0.1% BSA的PBS洗1遍，加入二抗Goat pAb to Human IgG，1∶200稀释，每孔30 μl，4℃孵育30 min。二抗孵育结束，用含0.1% BSA的PBS洗2遍，每孔加入30 μl 含0.1% BSA的PBS，用 Intellicyt® iQue3 高通量流式细胞仪进行检测。
1.2.3 细胞培养
采用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养SK-BR-3细胞，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养BT474细胞，培养条件为5% CO2，37℃。当细胞密度达到80%～90%时进行传代，每周2～3次。取对数生长期的细胞进行实验。
1.2.4 CCK8检测细胞增殖
将细胞按1×104个细胞/孔的数量接种于96孔板中，在37℃、5% CO2条件下培养24 h。每孔加入100 μl含设定浓度药物的培养基，培养48 h后，弃去孔内培养基，每孔加入100 μl含10%CCK8试剂的培养基，继续培养1～3 h，用酶标仪在450 nm测定光密度值（A），并计算细胞的增殖抑制率。增殖抑制率=（A对照−A实验）/（A对照−A背景）。联合给药组用CompuSyn软件计算CI值（药物联合指数），通过CI值的数值可以定量判断药物间相互作用的强度以及性质（CI>1为拮抗作用；CI=1为相加作用；CI<1为协同作用）。
1.2.5 Western blot检测
根据分组将细胞按5×105个细胞/孔的数量接种于6孔板培养24 h。弃去原培养基，加入含设定浓度药物的培养基继续培养24 h。采用细胞裂解液试剂盒提取各组细胞总蛋白，用BCA试剂盒测定蛋白浓度。按每泳道30 μg蛋白样品的上样量进行聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转移至PVDF膜。用5%脱脂奶粉在摇床上室温封闭1 h，加入一抗4 ℃孵育过夜，加入二抗室温孵育1 h。一抗、二抗均按照抗体使用说明书稀释。洗膜后，加ECL发光液，用超灵敏多功能成像仪进行显影，并用ImageJ软件对条带进行灰度值分析。目的蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/内参GAPDH灰度值 。
1.2.6 统计学方法
采用 GraphPad prism 8.0软件（Version X，USA）进行统计学分析和作图，用compuSyn软件计算联合指数。两组数据之间比较采用t检验，多组数据之间比较采用单因素方差分析（ANOVA）。P<0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 SEC-HPLC检测曲妥珠单抗的纯度
将表达纯化后的曲妥珠单抗用SEC-HPLC进行检测，结果显示曲妥珠单抗的纯度为100%，且分子量大小在150 kDa（1kDa=1×103）左右（图1）。
2.2 流式细胞术验证曲妥珠单抗与SK-BR-3、BT474的结合活性
采用流式细胞术测定曲妥珠单抗与HER2过表达乳腺癌细胞株SK-BR-3和BT474的结合活性。结果显示，曲妥珠单抗以浓度依赖性的方式结合SK-BR-3和BT474细胞，其中，曲妥珠单抗与SK-BR-3细胞株结合的EC50值为1.128 nmol/L，与BT474细胞株结合的EC50值为1.203 nmol/L，两者EC50值大约一致（图2）。
2.3 用CCK8法测定 EGCG 、曲妥珠单抗单独及联合对BT474的增殖抑制作用
采用CCK8法测定EGCG单药、曲妥珠单抗单药及两者联合对BT474的增殖抑制作用。图3A和图3B结果显示， EGCG和曲妥珠单抗对BT474细胞均显示出浓度依赖性的增殖抑制作用。图3C结果显示EGCG和曲妥珠单抗联合给药组的增殖抑制作用显著强于单药组。图3D结果显示EGCG在一定浓度范围内（45～200 μmol/L）与16.67 nmol/L 曲妥珠单抗联用时显示有协同抗肿瘤作用（CI<1）。
图 3 EGCG单药组、曲妥珠单抗单药组及两者联用组对BT474细胞增殖的影响注：A.EGCG对BT474细胞增殖的影响；B.曲妥珠单抗对BT474细胞增殖的影响；C.16.67 nmol/L曲妥珠单抗、16.67 nmol/L IgG 曲妥珠单抗同型对照、45 μmol/L EGCG、16.67 nmol/L曲妥珠单抗与45 μmol/L EGCG联用对BT474细胞增殖的影响；D.16.67 nmol/L曲妥珠单抗联合不同浓度EGCG对BT474细胞增殖的影响，计算联合指数（CI），Fa表示效应值；*P<0.05，****P<0.0001，与空白组比较；△△△△P<0.0001，与IgG组比较；####P<0.0001，与曲妥珠单抗组比较2.4 用CCK8法测定 EGCG 、曲妥珠单抗单独及联合对SK-BR-3细胞的增殖抑制作用
采用CCK8法测定EGCG单药、曲妥珠单抗单药及两者联合对SK-BR-3的增殖抑制作用。图4A和图4B结果显示，EGCG和曲妥珠单抗均对SK-BR-3细胞显示出浓度依赖性的增殖抑制作用。图4C结果显示，EGCG和曲妥珠单抗联合给药组的增殖抑制作用显著强于单药组。图4D结果显示，EGCG在一定浓度范围内（7.5～120 μmol/L）与16.67 nmol/L曲妥珠单抗联用时有协同抗肿瘤作用（CI<1）。
图 4 EGCG单药组、曲妥珠单抗单药组及两者联用组对SK-BR-3细胞增殖的影响注：A.EGCG对SK-BR-3细胞增殖的影响；B. 曲妥珠单抗对SK-BR-3细胞增殖的影响；C. 16.67 nmol/L 曲妥珠单抗、16.67 nmol/L IgG 曲妥珠单抗同型对照、15 μmol/L EGCG、16.67 nmol/L曲妥珠单抗与15 μmol/L EGCG联用对SK-BR-3细胞增殖的影响；D. 16.67 nmol/L曲妥珠单抗联合不同浓度EGCG对SK-BR-3细胞增殖的影响，计算联合指数（CI），Fa表示效应值；**P<0.01，***P<0.001，与空白组比较；△△△P<0.001，与IgG组比较；####P<0.0001，与曲妥珠单抗组比较2.5 Western blot法检测EGCG、曲妥珠单抗单用及二者联用对BT474细胞中EGFR、HER2、Akt、MAPK及其磷酸化蛋白表达的影响
图5A-F结果显示，EGCG单药、曲妥珠单抗单药及两者联用组均能显著降低BT474细胞中p-Akt、p-MAPK、p-EGFR的表达。图5G-H结果显示，曲妥珠单抗单药组能显著降低BT474细胞p-HER2的表达，EGCG单药组虽然无显著性差异（P>0.05），但对p-HER2的表达有一定抑制作用。与EGCG和曲妥珠单抗单药组相比，EGCG与曲妥珠单抗联用可进一步显著降低BT474细胞p-Akt、p-MAPK、p-EGFR、p-HER2蛋白的表达。
图 5 EGCG单药组、曲妥珠单抗单药组及两者联用组对BT474细胞中MAPK、Akt、EGFR、HER2及其磷酸化蛋白的表达的影响注：A. p-Akt、Akt的蛋白表达水平；B. p-Akt、Akt的相对蛋白表达量；C. p-MAPK、MAPK的蛋白表达水平；D. p-MAPK、MAPK的相对蛋白表达量；E. p-EGFR、EGFR的蛋白表达水平；F. p-EGFR、EGFR的相对蛋白表达量；G. p-HER2、HER2的蛋白表达水平；H. p-HER2、HER2的相对蛋白表达量；****P<0.0001，与对照组比较；##P<0.01、###P<0.001、 ####P<0.0001，与曲妥珠单抗组比较3. 讨论
ErbB-2(HER-2/neu)是一种分子量为1.85×105的穿膜受体络氨酸激酶，属于表皮生长因子受体家族[14]。该家族由4个紧密相关的络氨酸激酶（TK）受体组成：HER1(EGFR)、HER2、HER3和HER4。HER2主要是通过与家族中的其他成员形成同源或异源二聚体，激活下游的RAS/MAPK和磷脂酰肌醇-3/激酶（PI3K）/ATK信号通路，进而促进细胞增殖、迁移、血管生成以及抑制细胞的凋亡[15-16]。ERK/MAPK通路是参与细胞增殖控制的主要细胞内信号通路之一。 PI3K/ATK信号通路在控制Her-2/neu过表达细胞的生长和转化表型中起重要作用[17-18]。HER2过表达的癌症表现出较强的转移能力和浸润能力，对化疗敏感性差，且易复发。
曲妥珠单抗是一株靶向HER2的人源化单克隆抗体。1998年，被美国食品药品监督管理局（FDA）批准应用于治疗HER2阳性的转移性乳腺癌[19]。曲妥珠单抗可能通过下调HER2受体在细胞膜上的表达，阻断HER2和HER3形成异源二聚体从而抑制下游通路，导致细胞周期阻滞，以及抗体依赖的细胞介导的细胞毒性活性[20]等。虽然曲妥珠单抗单药治疗起到了一定的效果, 但大部分HER2过表达的乳腺癌患者对曲妥珠单抗治疗不产生反应，初次治疗有效率大约在30%, 即使对曲妥珠单抗产生反应的患者也有约50%会在1年内发生耐药。
茶多酚可以抑制多种与细胞增殖和肿瘤进展相关的酶活性。EGCG是茶多酚中的主要成分之一。研究显示，在人A431表皮样癌细胞中，EGCG可能通过阻断EGF与其受体的结合进而抑制EGFR活性[21]。EGCG能抑制结肠癌细胞中EGFR、HER2、HER3的激活，并抑制细胞生长[22]。
为了进一步提高HER2靶向治疗疗效，在本研究中我们探讨了曲妥珠单抗和EGCG在乳腺癌细胞的联合抗肿瘤作用。实验结果发现EGCG与曲妥珠单抗在一定浓度范围内可以协同抑制HER2过表达乳腺癌细胞的生长，提示临床治疗中如果利用EGCG和曲妥珠单抗联合治疗则需重点关注两者各自的剂量。可以先利用乳腺癌荷瘤小鼠模型对不同剂量的EGCG和曲妥珠单抗的联合抗肿瘤作用进行评价，并参考动物体内药效实验的结果进行EGCG和曲妥珠单抗联合用药临床试验的设计，通过临床试验的结果确定临床治疗时最佳的联合用药剂量。
本研究还对EGCG和曲妥珠单抗的联合抗肿瘤作用机制进行了阐明：与EGCG和曲妥珠单抗单药组相比，EGCG与曲妥珠单抗联用可进一步显著降低BT474细胞中p-EGFR、p-HER2和p-Akt、p-MAPK的表达，提示EGCG和曲妥珠单抗联用对HER2过表达乳腺癌细胞的协同增殖抑制活性可能与其显著增强的对Akt和MAPK信号通路的抑制作用有关。本研究为EGCG与曲妥珠单抗的联合应用提供了理论支持，并为HER2过表达乳腺癌的治疗提供新的思路。
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图 1 1999−2023年发表的ML领域TAC相关文章数量及趋势图
注：本次统计的检索数据库为中国知网、万方数据库、PubMed、Web of Science，检索词为他克莫司、FK506、人工智能、机器学习、Tacrolimus、Machine Learning、Artificial Intelligence，检索时间为建库至2023年8月1日，排除重复文献。
表 1 应用ML预测TAC临床应用的数据特征
文献研究 研究目的 样本选择 预测变量 最佳预测变量 模型 模型性能 验证方法 Zheng等[16]
（2021）预测自身免疫性疾病患者TAC的血药浓度 自身免疫性疾病患者
（123人）52个，包括人口学特征、药物信息、实验室检查及联合用药 身高、TAC日剂量、其他免疫抑制剂、LDL、MCV、MCH、WBC、DBIL、HCT 5种线性模型、
9种ML模型XG Boost模型效果最佳，R2 0.54，MAE 0.25，MSE 0.11，ACC 74.4% 内部验证：随机分配，训练组、测试组比例8∶2；
外部验证：未进行Mo等[19]
（2021）预测NS患儿TAC肾毒性的发生风险 16岁以下难治性NS患儿
（229人）291个，包括疾病诊断、病理检查、药物信息及基因分型 SD11B1 (rs846910)、MAP2K6 (rs17823202)、SCARB2 (rs6823680)、TRPC6 (rs3824934) XG Boost、GBDT、ET、RF、LR XG Boost模型预测效果最佳，SE 0.750，
ACC 77.3%，SP 0.778，AUC 0.789内部验证：随机分配，训练组、测试组比例7∶3，5倍交叉验证；外部验证：11例其他中心NS患儿 Shao等[20]
（2022）预测NS患者TAC诱导震颤的发生风险 NS患者，TAC治疗>3个月
（252人）64个，包括人口学特征及实验室
检查肌酐、D-二聚体、总蛋白、钙离子、血小板分布宽度、钾离子、纤维蛋
白原RFE-NN RFE-NN模型性能良好，训练集：AUC 0.973，ACC 93.4%，SE 0.971，SP 0.759；外部验证集：ACC 82.1%，SE 0.838，SP 0.700 内部验证：随机分配，训练组、测试组比例7∶3，10倍交叉验证；外部验证：71例NS患者 Huang等[17]
（2022）结合群体药动学模型预测NS患儿TAC清除率 18岁以下难治性NS患者
（139人）43个，包括人口学特征、实验室检查、药动学数据及基因分型 年龄、合用五酯胶囊、CYP3A5 *3 (rs776746)、CTLA4 (rs4553808) XG Boost、RF、Xtra-Trees、GBDT、Ada Boost、Lasso Lasso模型性能最优，R2 0.42，MAE 1.51、MSE 3.98 内部验证：随机分配，训练组、测试组比例8∶2，5倍交叉验证，1000 次自举验证；外部验证：未进行 Yuan等[22]
（2022）预测NS患者TAC的血药浓度 NS患者
（913人）19个，包括人口学特征、实验室检测、医嘱信息 肌酐、体质量、年龄、身高、TAC剂量、合用匹多莫德、合用百灵、合用黄奎 XG Boost、LR、RF、Ada Boost、GBDT、LGBM XG Boost模型性能最佳，ACC 73.3%， AUC 0.553，召回率0.969，精确度0.739 内部验证：随机分配，训练组、测试组比例8∶2；
外部验证：115例患者和180次血液检测Mo等[18]
（2022）预测难治性NS患儿的TAC谷浓度 16岁以下难治性NS患儿
（171人）326个，包括用药资料、人口学特征、基因分型、实验室检查 年龄、性别、ALB、ACTN4 (rs3745859)等10个单核苷酸多态性 ET、GBDT、RF、XG Boost、Lasso GBDT算法在全组及CYP3A5非表达组表现最佳，R2 0.44，MSE 591.03，MAE 20.78；ET算法在CYP3A5表达组表现最佳，R2 0.38，MSE 1839.45，MAE 31.26 内部验证：随机分配，训练组、测试组比例8∶2，5倍交叉验证；外部验证：30例NS患儿 Mo等[21]
（2023）预测难治性NS患儿的TAC疗效 16岁以下难治性NS患儿
（238人）289个，包括人口学特征、实验室检测、药物信息、临床表现、单核苷酸多态性 尿液红细胞数、类固醇类型、ITGB4 (rs2290460)等8个单核苷酸多态性 LR、ET、GBDT、RF、XG Boost RF模型在两种疗效评价标准下均性能最佳，召回率 0.357~0.914，ACC 72.1%~75.4%，SP 0.500~0.980，AUC 0.803~0.807 内部验证：随机分配，训练组、测试组比例7∶3，5倍交叉验证；外部验证：35例NS患儿 注：LDL：低密度脂蛋白；MCV：平均红细胞体积；MCH：平均红细胞血红蛋白量；WBC：白细胞计数；DBIL：直接胆红素；HCT：红细胞压积；ALB：血清白蛋白；XG Boost：极端梯度提升；GBDT：梯度提升决策树；ET：极端随机树；RF：随机森林；LR：逻辑回归；RFE:递归特征消除；NN：神经网络；Ada Boost：自适应提升；LGBM：梯度提升决策树；ET：极随机树；R2：确定系数；MAE：平均绝对误差；MSE：均方误差；AUC：ROC曲线下的面积；ACC：准确度；SE：灵敏度；SP：特异性。 
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