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老药新用是药物设计的重要途径之一，采用此方法可以获得药物研究所需的先导化合物，迄今为止已有许多成功的案例，特别是在新型冠状病毒肺炎治疗药物研究中采用此策略，获得了很多有价值的药物[1-3]。阿司匹林从发明至今已有百年的历史，最初用于解热、镇痛和抗炎。随着医学科学的发展，在临床上发现阿司匹林的新用途，能够抑制血小板的聚集，抑制心脑血管疾病的发生[4-5]。因此，从上市药物中寻找新的适应证或将其作为先导物进行结构优化的老药新用设计方法成为药物研究的有效手段[6-7]。
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实验所用试剂均为分析纯；6种药物原料药：苄普地尔、保泰松、阿洛西林、盐酸氮䓬斯汀、盐酸多沙普伦、美芬洛酮（南京多点化工有限公司）；还原型辅酶Ⅱ(NADPH，东京化学工业有限公司)；混合人肝微粒体(美国BD Gentest公司）。
Biotek Synergy H2多功能酶标仪、MK-2全自动酶标仪、戴安公司Ultimate3000液相色谱系统(包括三元输液泵、柱温箱、自动进样器和真空脱气机)和AB公司4000Q-Trap型串联质谱仪，配有电喷雾电离源，以及AB公司Analyst (version 1.5.1)、LightSight (version 2.2.1)数据采集及分析软件。
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将荧光肽(PMDM-F，Anaspec)用缓冲溶液(100 mmol/L磷酸钾、0.02%叠氮化钠、100 μg/ml牛丙种球蛋白，用蒸馏水定容至500 ml，pH 7.5)稀释至10 nmol/L，加入到梯度稀释的MDM2癌基因蛋白中，30ºC避光孵育30 min。荧光各向异性值用Biotek Synergy H2多功能酶标仪读取，蛋白结合常数根据荧光各向异性值用Mathematica 9软件拟合得到。
将购买的6个药物溶于二甲基亚砜(DMSO)，缓冲液稀释至所需要浓度(最终缓冲液中含有1%DMSO)。然后将20 μl化合物加入到60 μl含有10 nmol/L PMDM-F肽和100 nmol/L MDM2蛋白的溶液中，30ºC避光孵育1 h。荧光各向异性值用Biotek Synergy H2多功能酶标仪读取，蛋白结合常数根据荧光各向异性值用Mathematica 9软件拟合得到。
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将人肺腺癌上皮细胞(A549)培养，待细胞生长至70%～80%时，加药处理。药物处理不同时间后，用0.25%胰酶消化，离心收集细胞，再用胞浆蛋白核蛋白裂解液4 ℃裂解，提取胞浆蛋白及核蛋白。采用12 %SDS-PAGE凝胶电泳，将蛋白转移到固相支持膜(PVDF膜)上，封闭液室温封闭1～2 h，用等渗缓冲盐溶液(tris-buffered saline tween-20, TBST)洗膜5 min，洗3次。采用TBST稀释抗体，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜5 min，洗3次。然后用TBST稀释HRP标记的二抗，室温孵育1 h，TBST洗膜5 min，洗3次。暗室内采用ECL显色，X线片曝光成像。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参照，分析成像光片灰度值，并以对照组为基准进行量化。
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样品配制：用DMSO溶解后，加入磷酸缓冲盐溶液(PBS)配成1000 μg/ml的溶液或均匀的混悬液，然后用含DMSO的PBS稀释。
MTT比色法：96孔板每孔加入浓度为(5～6)×104个/ml的细胞悬液100 μl，置37ºC，5% CO2培养箱内。24 h后，加入样品液，10 μl/孔，设双复孔，37ºC、5% CO2作用72 h。每孔加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl，作用4 h后加入溶解液，100 μl/孔，置培养箱内，溶解后用MK-2全自动酶标仪测定570 nm处A值，计算IC值。
IC(%) =[(空白对照孔A值-给药孔A值) /空白对照孔A值]×100%
根据不同浓度的IC值，进行线性回归，计算出抑制肿瘤细胞生长50%的药物浓度，即IC50。
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每个孵育体系总体积为200 µl，介质为100 mmol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.4)，包括终浓度为1 mg/ml的肝微粒体蛋白、50 µmol/L的苄普地尔和2 mmol/L的还原型辅酶Ⅱ(NADPH)，用37°C水浴进行孵育，60 min后加入同体积冰冷乙腈终止反应。被终止反应的肝微粒体孵化样品，离心5 min(13000 r/min)，取出全部上清液置于10 ml试管中，于40ºC空气流下吹干，残留物以100 μl乙腈/水(10: 90, V/V)复溶，取10 μl进行HPLC/Q-Trap MS分析。色谱条件为色谱柱为Kromasil® C18(150 mm×2.1 mm，5 μm)，Agilent C18保护柱(12.5 mm ×2.1 mm，5 μm)。流动相：乙腈(A)–10 mmol/L甲酸铵水溶液(B)，梯度洗脱：0～2 min，10% A；10～15 min，90% A；15.1～18 min，10% A；流速为0.3 ml/min；柱温为室温；进样量为10 μl。质谱条件为电喷雾离子化源(ESI)，正离子检测。雾化温度为500 ℃，电喷雾电压为5200 V，气帘气流速20 L/min，雾化气50 L/min，辅助气流速50 L/min。扫描方式为MRM\MIM簇发EPI。
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课题组在针对p53-MDM2靶标进行虚拟筛选过程中，发现Wayne等已运用计算机构象筛选法对ZINC数据库中3244个FDA已批准上市药物进行了筛选，鉴别出与p53-MDM2抑制剂Nutlin-3a结构不同，但具有类似形状电荷分布的化合物[12]。然后，通过Autodock软件与MDM2蛋白进行分子对接，根据结合能获得打分函数排名前15的化合物，但未用分子药理学实验证实其作用靶标。因此，课题组购买了可售的6个药物(图1)。对这6个药物进行蛋白结合抑制活性实验，以Nutlin-3为阳性对照药，结果见表1。
图 1 6个市售药物的化学结构
表 1 蛋白结合抑制活性和体外抗肿瘤活性测试结果
化合物 Ki
(μmol/L)IC50
(μmol/L)U-2OS
(wt-p53)Saos-2
(p53 null)A549
(wt-p53)NCI-H1299
(p53 null)Nutlin-3 0.093 12.2 8.38 2.18 1.97 美芬诺酮 5.79 >100 >100 8.43 >100 盐酸氮䓬斯汀 216.3 6.38 3.80 1.54 4.32 苄普地尔 0.456 2.58 1.56 1.04 1.39 保泰松 155.5 71.31 >100 91.45 >100 阿洛西林 NA >100 >100 >100 >100 盐酸多沙普仑 NA >100 >100 60.68 >100 从表1中可以看出，6个药物中美芬诺酮、盐酸氮䓬斯汀、苄普地尔和保泰松4个药物体现出一定的p53-MDM2蛋白结合抑制活性，其余2个药物无活性。其中，钙离子拮抗剂苄普地尔的Ki值达到0.456 μmol/L，显示出优异的p53-MDM2蛋白结合抑制活性。
为验证苄普地尔是否能抑制p53-MDM2蛋白结合，采用免疫印迹试验测定相关蛋白的表达变化，结果如图2。从图中可以看出，苄普地尔对p53蛋白表达作用相对较小，并且随着苄普地尔浓度上升到10 μmol/L，反而出现下降。但苄普地尔能显著降低MDM2蛋白的表达，而且呈剂量依赖关系，初步说明苄普地尔能明显抑制p53-MDM2蛋白结合。
图 2 苄普地尔对A549细胞中MDM2及p53蛋白表达的调节作用（μmol/L）
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课题组选择骨肉瘤(U-2OS、Saos-2)和肺癌(A549、NCI-H1299) 2组细胞株进行了6个药物的体外抗肿瘤活性测试(表1)。从表1中可以看出，苄普地尔对4种细胞株均具有优秀的抗肿瘤活性，其IC50值均低于3 μmol/L，优于阳性对照药Nutlin-3。而美芬诺酮尽管具有中等的p53-MDM2蛋白结合抑制活性(Ki=5.79 μmol/L)，但除对A549具有较好的抗肿瘤活性，其余细胞株均未显示出活性。令人意外的是盐酸氮䓬斯汀尽管具有较弱的p53-MDM2蛋白结合抑制活性，但对4种肿瘤细胞株也显示出较好的活性。
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课题组进一步对苄普地尔开展了人肝微粒体中代谢产物研究，结果见表2、图3和图4。发现在经人肝微粒孵化后的样品中除原形药物(M0，m/z 367)外，在保留时间为9.8 min处检测到1个色谱峰，命名为M1，其m/z为383。推测其分子式组成为C24H34N2O2，比原形增加1个O，可能为单氧化代谢产物。在MS/MS扫描质谱图中，由M1获得的主要碎片离子为m/z 312、212、184(图4)，其中m/z 312、212比原形的主要碎片离子m/z 296、196，相对分子质量增加16，而碎片184与原形的相同，且未见相对分子质量少18的碎片，推测其为苯环羟基化代谢产物。
表 2 苄普地尔在肝微粒体孵化体系中的代谢产物信息
编号 代谢途径 质荷比 分子式 保留时间（t/min） M0 原形 367 C24H34N2O 11.6 M1 氧化 383 C24H34N2O2 9.8 
图 3 苄普地尔在肝微粒体孵化体系中代谢产物的色谱图
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基于老药新用的药物设计思想，课题组验证发现钙离子拮抗剂苄普地尔具有优秀的抗肿瘤活性和较强的p53-MDM2蛋白结合抑制活性。进一步通过免疫印迹试验发现，苄普地尔能显著降低MDM2蛋白的表达，而且呈剂量依赖。体外代谢研究发现，苄普地尔在人肝微粒体中的代谢产物主要是苯环羟基化单氧化代谢产物。研究结果表明，苄普地尔可作为p53-MDM2蛋白结合小分子抑制剂先导化合物，用于后续的结构优化设计研究。
图 4 代谢产物M1的MS/MS质谱图
Discovery of bepridil as a valuable lead compound with potent p53-MDM2 inhibitory activity
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摘要:
目的 采用老药新用药物设计方法，探寻p53-MDM2蛋白结合小分子抑制剂的先导化合物。 方法 通过荧光偏振（FP）法和蛋白印迹试验法，分别测定化合物的p53-MDM2蛋白结合抑制活性和相关蛋白的表达变化，采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT法）测试其体外抗肿瘤活性，并且测定人肝微粒体中代谢产物。 结果 发现苄普地尔具有优秀的体外抗肿瘤活性和较强的p53-MDM2蛋白结合抑制活性，能显著降低MDM2蛋白的表达，而且呈剂量依赖性。在人肝微粒体中的代谢产物主要为苯环羟基单氧化代谢产物。 结论 苄普地尔可作为p53-MDM2蛋白结合小分子抑制剂先导化合物，用于后续的结构优化设计研究。 -
关键词:
- 老药新用 /
- 药物设计 /
- 苄普地尔 /
- p53-MDM2蛋白结合抑制剂
Abstract:Objective To find novel lead compounds as p53-MDM2 inhibitors by drug repurposing strategy. Methods The p53-MDM2 inhibitory activities of compounds were determined by FP and western blotting. MTT method was used to determine the in-vitro antitumor activities. The metabolites in human liver microsomes were tested. Results Bepridil showed excellent in-vitro anti-tumor activity and strong p53-MDM2 protein binding inhibitory activity, which can significantly reduce the expression of MDM2 protein in a dose-dependent manner. The metabolites in human liver microsomes are mainly benzene ring hydroxyl mono-oxidation metabolites. Conclusion Bepridil can be used as a lead compound for p53-MDM2 protein binding small molecule inhibitors for subsequent structural optimization design studies. -
Key words:
- new uses of old drugs strategy /
- drug design /
- bepridil /
- p53-MDM2 inhibitor
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骨质疏松症是一种全身性骨代谢疾病，其典型特征是骨密度下降、骨脆性增加和骨微环境被破坏[1]。骨稳态失衡是其发生的主要病理学基础。骨稳态是指成骨细胞行使的骨形成功能和破骨细胞行使的骨吸收功能处在一个相对平衡的过程[2]。破骨细胞分化及其功能的过度活化是导致骨稳态失衡的重要因素[3]。中国骨质疏松症流行病学调查显示，我国50岁以上人群骨质疏松发病率为19.2%，65岁以上人群发病率为32%[4]。目前临床上治疗骨质疏松症的药物主要是骨吸收抑制剂，其在抑制骨吸收的同时，也干扰骨形成进程。因而发掘更好的治疗骨质疏松的药物是迫切需要的。
骨髓来源的巨噬细胞(BMMs)向破骨细胞分化需要重组小鼠巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子κB受体活化因子配体(RANKL)的持续刺激[5]。M-CSF增加了早期BMMs的增殖，RANKL与受体RANK结合激活肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)，进而激活细胞凋亡信号调节激酶1(ASK1)和NF-κB抑制物激酶(IKKs)，活化的ASK1和IKKs磷酸化JNK、ERK和P38以及NF-κB特异性抑制因子IκB特定部位的丝氨酸，激活MAPK和NF-κB信号。活化的MAPK和NF-κB使c-Fos、NFATc1表达增加，促进DC-STAMP、ATP6V0d2、TRAP、CTSK等破骨细胞特异性基因的转录与表达，导致破骨细胞分化[6]。研究表明，减弱破骨细胞分化及功能，能够有效地治疗骨质疏松症[7]。
冬虫夏草是一味传统中药，有增强免疫、抗炎、抗氧化和延缓衰老等作用[8]。先前的研究表明，富含锶的冬虫夏草菌丝发酵液对去卵巢骨质疏松大鼠有良好的治疗效果，其机制是提高了血清中的雌二醇水平，但是该研究仅基于整体水平解释了冬虫夏草作用于骨质疏松症的机制，对冬虫夏草的菌种也未作鉴定，并且野生的冬虫夏草提取液在骨质疏松症中的作用也未见报道[9-11]。本研究旨在探讨冬虫夏草提取液(CSE)对去卵巢小鼠的治疗作用以及对破骨细胞分化和功能的影响，为CSE防治骨质疏松症提供实验依据。
1. 材料
1.1 动物
SPF级雌性C57BL/6小鼠（上海西普尔-必凯实验动物有限公司），12周龄24只，6周龄7只，体质量20～22 g，合格证号：SCXK（沪）2018-0006。本实验经江西中医药大学实验动物伦理委员会批准（批号JZLLSC2019-0194），且遵循中国伦理委员会指导原则。
1.2 试剂
α-MEM培养基（美国Hyclone，批号：SH30265.01）；胎牛血清（美国Gbico，批号：10099-141）；重组小鼠RANKL、M-CSF蛋白（美国R&D，批号：462-TEC-010、416-ML-010）；TRAP染色试剂盒（浙江卓腾生物公司）；RNAiso Plus、TB Green（日本Takara，批号：9109、RR420B）；p-JNK、JNK、p-ERK1/2、ERK1/2、p-P38、P38和GAPDH兔单克隆抗体（美国CST，批号：4668、9252、4370、4695、4511、8690、5174）；山羊抗兔IgG H&L (IRDye® 800CW)预吸附二抗（美国Abcam，批号：ab216773）；冬虫夏草（上海雷允上药业有限公司）；羟基磷灰石涂板/96孔板（美国Corning，批号：3989）；小鼠抗酒石酸酸性磷酸酶、骨钙素、骨碱性磷酸酶ELISA试剂盒（上海生工，批号：D721140、D721126、D721049）。
1.3 仪器
371型细胞培养箱（美国Thermo）；Cytation 5多功能酶标仪（美国Bio-Tek）；CFX96型实时荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad）；SA型近红外双色激光成像系统（美国odyssey）；TI-SR型倒置显微镜（日本Nikon）；RM2016型病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）；JB-P5型包埋机（武汉俊杰）。
2. 方法
2.1 CSE制备
冬虫夏草(Cordyceps sinensis)药材产地为青海玉树，购自上海雷允上药业有限公司，经海军军医大学黄宝康教授鉴定。提取详情见引文[12]。
2.2 BMMs分离与培养
选取6周龄C57BL/6小鼠，使用颈椎脱臼法处死，取双侧股骨和胫骨，使用PBS将骨髓从骨髓腔中冲出，收集PBS并离心，弃上清液，使用α-MEM培养基重悬，于T75培养瓶内（含10%血清，1%青霉素-链霉素溶液及30 ng/ml M-CSF完全培养基）培养3 d。使用PBS清洗去除未贴壁细胞，加入适量新鲜完全培养基，直至细胞数量达到5×106个[13]。
2.3 CCK-8法检测BMMs细胞活性
在96孔板中，BMMs以8×103个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.125、0.25、0.5、1、2、4 mg/ml CSE干预处理，培养48 h或96 h，加入CCK-8检测液，37 ℃孵育1 h后在波长480 nm处检测吸光度。
2.4 体外破骨细胞分化实验
在96孔板中，BMMs以6×103个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE干预处理，同时加入50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF，阴性对照组不加入RANKL；每2 d更换一次培养基，直至第5天对破骨细胞进行TRAP染色。
将同样密度的BMMs接种于96孔板，孵育过夜；记过夜后为第1天，分别于第1、3、5天加入1 mg/ml CSE干预处理，每2 d更换一次培养基至第7天（仅加药1次，之后更换培养基均不加CSE），进行TRAP染色[14]。
2.5 F-actin环染色和骨吸收实验
在96孔板中，BMMs以6×103个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE干预处理，同时加入50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF，每2 d更换一次培养基。第5天用鬼笔环肽和DAPI分别对F-actin环和细胞核进行染色。
骨吸收实验：BMMs以5×105个/孔的密度接种于6孔板，孵育过夜；加入含50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF完全培养基，每2 d换液，至第4天出现小的破骨样细胞，胰酶消化以8×103个/孔密度重新接种至羟基磷灰石涂板内，并且加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE处理。培养3 d后，用次氯酸钠洗去细胞，PBS清洗后晾干，于光学显微镜下拍照，统计每个孔的骨陷窝面积[15]。
2.6 q-PCR检测
在12孔板中，BMMs以5×104个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE干预处理，同时加入50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF，每2 d更换一次培养基至第5天。抽提RNA，逆转录后使用q-PCR检测DC-STAMP、ATP6V0d2、TRAP、CTSK、NFATc1基因的表达，引物序列详情见引文[16]。
2.7 蛋白印迹法检测
在6孔板中，BMMs以5×105个/孔的密度接种，孵育过夜；使用无血清的α-MEM培养基饥饿细胞1 h，实验组更换含1 mg/ml的CSE的完全培养基，对照组更换含相同体积PBS的完全培养基，孵育3 h；均使用50 ng/ml RANKL刺激5、10、20、30、60 min，未被刺激的细胞作为0 min。刺激完成后，抽提总蛋白。经SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、5%脱脂奶粉封闭1 h，4 ℃下一抗孵育过夜，室温下荧光素偶联的二抗孵育1 h，用odyssey成像系统扫膜，分析JNK(1∶2000)、p-JNK(1∶2000)、ERK(1∶2000)、p-ERK(1∶2000)、P38(1∶2000)、p-P38(1∶2000)的表达。
2.8 动物造模、分组及给药
在24只12周龄小鼠中随机挑选6只作为假手术组（Sham组），其余小鼠使用异氟烷气麻，去除背部毛发，切开皮肤和背膜，使卵巢暴露，切除双侧卵巢并使用可吸收缝合线结扎、缝合（假手术组仅切开背部皮肤和腹膜）[14]。术后1周，按照文献报道方法[17]，将卵巢切除小鼠随机分为3组：模型组（OVX组）、CSE低剂量组、CSE高剂量组，每组6只。术后7 d开始给药，由预实验确定给药浓度为312.5和625 mg/kg，按照每只200 μl/d连续灌胃给药6周。
2.9 HE染色和TRAP染色
小鼠处死后取双侧股骨，4%多聚甲醛固定后进行脱钙处理，之后常规脱水、石蜡包埋，切成4 μm切片，分别进行HE染色和TRAP染色。统计破骨细胞数量/骨表面积（N. Oc/BS）、破骨细胞面积/骨表面积（Oc. S/BS）和骨体积/组织体积（BV/TV）。
2.10 ELISA法检测血清生化指标
小鼠处死前统一摘除小鼠左眼取血，将全血收集并在4 ℃静置30 min，之后在4 ℃下2 000 r/min离心20 min，吸取上清液置于−80 ℃冰箱中保存。按照Elisa试剂盒《用户操作手册》检测血清中TRAP、ALP、BGP含量。
2.11 统计学方法
使用Image J统计破骨细胞面积和个数、F-actin环面积和环内核数、骨陷窝面积、蛋白条带灰度值、N. Oc/BS、Oc. S/BS和BV/TV。使用SPSS 21.0统计学软件对数据进行分析。计量资料用均数±标准差（
$\bar x $ ±s）表示，多组间比较使用方差分析，以P<0.05认为差异具有统计学意义。3. 结果
3.1 CSE对BMMs细胞活力的影响
CCK-8结果显示，与空白组比较，CSE浓度范围在0.125～4 mg/ml时，48 h内和96 h内CSE对BMMs无细胞毒性（图1）。据此结果选择0.5、1、2 mg/ml作为之后的细胞实验浓度。
3.2 CSE对RANKL诱导的破骨细胞分化的影响
TRAP染色显示，与空白组比较，RANKL组的BMMs分化为成熟的TRAP阳性多核巨噬细胞（有完整的圆形状细胞形态且细胞核数目≥3）。与RANKL组比较，CSE不同剂量组的TRAP阳性多核巨噬细胞数量明显减少，且呈剂量依赖的方式下降，并且破骨细胞的大小也被显著抑制（图2A-C）。结果表明CSE不仅抑制破骨细胞的分化也阻碍了破骨细胞前体细胞的融合。
图 2 CSE对破骨细胞分化的影响（n=3）A.破骨细胞图像（×40）；B.每孔TRAP阳性多核细胞（细胞核数≥3）面积百分比；C.每孔TRAP阳性多核细胞（细胞核数≥3）个数；D.不同时间段加入CSE处理后的破骨细胞图像（×40）；E.加药时间示意图；F.每孔TRAP阳性多核细胞（细胞核数≥3）个数**P<0.01，与RANKL组比较在RANKL持续刺激的BMMs中按时段加入CSE。染色结果显示，与空白组比较，0 d组的BMMs几乎全部分化为成熟的破骨细胞，数量多，且形状完整。与0 d组比较，给予CSE1～3 d组的BMMs分化为成熟破骨细胞的数量最少，3～5 d组其次，5～7 d组最多（图2D、2E、2F）。结果表明CSE对破骨细胞生成的任一阶段均有作用，在早期阶段作用最为明显。
3.3 CSE对RANKL诱导的破骨细胞F-actin环形成和骨吸收功能的影响
鬼笔环肽和DAPI染色显示，RANKL组的F-actin环形成完整，数量多且面积大，环内细胞核数量多。与RANKL组比较，CSE不同剂量组的F-actin环数量和大小均下降，环内细胞核数量也明显减少（图3A、3B、3C）。
图 3 CSE对破骨细胞F-actin环形成和骨吸收功能的影响（n=3）A.F-actin环和细胞核共聚焦图像（×100）；B.每孔内F-actin环面积百分比；C.单个F-actin环内细胞核个数；D.骨陷窝图像（×40）；E.每孔未吸收面积百分比**P<0.01，与RANKL组比较骨板吸收显示，RANKL组未被吸收面积为70%， 1 mg/ml CSE组未被吸收面积为85%，2 mg/ml CSE组为95%，与RANKL组比较，不同剂量的CSE均有效的减少了骨板吸收的面积（图3D、3E）。结果表明CSE显著抑制了成熟破骨细胞骨吸收的功能。
3.4 CSE对RANKL诱导的破骨细胞特异性基因表达的影响
q-PCR结果显示，与RANKL组比较，CSE中、高剂量组显著性地抑制了破骨细胞特异性基因TRAP、CTSK、ATP6V0d2、DC-STAMP和NFATc1的表达，且呈剂量依赖性（图4）。这与CSE抑制破骨细胞分化及功能的结果相一致。
图 4 CSE对破骨细胞特异性基因表达的影响（n=3）A.TRAP；B.CTSK; C.ATP6V0d2; D.DC-STAMP; E.NFATc1*P<0.05，**P<0.01，与RANKL组比较3.5 CSE对破骨细胞分化过程中MAPK通路的影响
Wsetern-blot结果显示，RANKL组各时间段JNK、ERK和P38蛋白磷酸化显著。与RANKL组比较， CSE组p-JNK蛋白表达在第10～30 min明显下降，p-ERK蛋白表达在第20～60 min明显下降和p-P38蛋白表达在第10～60 min明显下降，见图5。结果表明在破骨细胞的分化过程中，CSE作用于MAPK通路JNK、ERK和P38的磷酸化。
3.6 CSE对卵巢切除小鼠的影响
HE和TRAP染色显示，与假手术组比较，OVX组小鼠的骨小梁数目和面积明显减少（BV/TV值下降）且间距变大，骨小梁表面破骨细胞数量增多、面积变大（N. Oc/BS、Oc. S/BS值上升）。与OVX组比较，CSE低剂量和高剂量组小鼠的骨小梁数目和面积均增加（BV/TV值上升）且间距减小，骨小梁表面破骨细胞数量减少、面积变小（N. Oc/BS、Oc. S/BS值下降），见图6。结果表明，CSE可以增加卵巢切除小鼠骨小梁数目，抑制破骨细胞活性，缓解骨量流失。
图 6 CSE对去卵巢小鼠股骨破骨细胞数量和骨小梁的影响（n=6）A.HE染色和TRAP染色；B.BV/TV；C.Oc. S/BS；D.N. Oc/BS；**P<0.01，与OVX组比较；##P<0.01，与假手术组比较3.7 CSE对TRAP、ALP、BGP含量的影响
ELISA结果显示，与假手术组比较，OVX组小鼠血清中的TRAP含量明显增加，BGP含量明显减少，ALP含量无明显变化；CSE高剂量组小鼠血清中的TRAP、BGP含量无明显变化， ALP含量明显增加。与OVX组比较，CSE低剂量和高剂量组小鼠血清中的ALP、BGP含量明显增加，TRAP含量明显减少（图7）。结果表明，CSE可以调节骨代谢相关指标，具有平衡骨稳态作用。
图 7 CSE对TRAP、ALP和BGP含量的影响（n=6）A.TRAP；B.ALP；C.BGP；*P＜0.05，**P<0.01，与OVX组比较；##P<0.01，与假手术组比较4. 讨论
骨质疏松症是一种与年龄相关的骨代谢疾病，骨重建失衡是其发生的主要原因，因绝经造成的骨质疏松占骨质疏松症的绝大部分。研究表明，雌激素对骨骼的生长、发育和维持至关重要，因雌激素缺失致使RANKL介导的信号通路过度活化，进而使破骨细胞功能异常，是绝经后骨质疏松症主要原因[18]。因而抑制破骨细胞的分化及其功能是治疗骨质疏松的有效途径[19]。在本研究中，我们发现CSE通过抑制MAPK信号通路的激活来抑制RANKL介导的破骨细胞生成，同时对OVX小鼠的骨质流失具有良好的保护作用。
研究表明，在RANKL的刺激下，BMMs中的MAPK通路被激活，进而刺激破骨细胞特异性基因的表达，促进BMMs分化为破骨细胞[19-21]。NFATc1和DC-STAMP是破骨细胞分化和前体破骨细胞融合的主要调控者，TRAP、CTSK、ATP6V0d2是反映破骨细胞活性和骨吸收状态的特异性指标[22-23]。本研究表明，CSE显著抑制RANKL介导的破骨细胞分化，而且在破骨细胞分化的早期阶段作用最为明显。其机制是抑制JNK、ERK和P38的激活，进而抑制破骨细胞特异性基因的表达。
F-actin环是分化成熟的破骨细胞在骨面上极化，使骨架重排，F-actin紧密排列形成的一个环，是破骨细胞进行骨吸收的先决条件。因而阻碍破骨细胞前体细胞的融合，能够有效抑制F-actin环的形成和骨吸收功能[24]。本研究发现CSE显著性地抑制F-actin环的形成，并降低了环内细胞核数以及骨陷窝面积，这表明CSE阻碍了破骨细胞前体细胞的融合和骨吸收功能，与CSE抑制破骨细胞分化及其特异性基因表达的结果相一致。
我们构建了去卵巢小鼠模型模拟绝经后的骨质疏松症，经CSE灌胃给药6周后，采用HE和TRAP染色对小鼠股骨进行骨组织形态学分析以及ELISA检测血清中ALP、TRAP、BGP含量。TRAP是酸性磷酸酶的同工酶，其血清浓度可反映破骨细胞的活性[25]。ALP是一种磷酸单酯酶，由成骨细胞分泌，能有效地反映成骨细胞的活性[27]。BGP由成骨细胞合成及分泌，绝大部分的BGP随成骨细胞矿化在骨基质中沉积，仅有一小部分进入到血液循环[14]。血液中的BGP是成骨细胞分泌完成后直接进入血液，并非是破骨细胞降解骨基质而进入血液，因而检测血液中的BGP含量，对评判机体经药物治疗后变化有较大的参考价值。结果显示，CSE能有效缓解骨量丢失，表现在CSE各剂量组小鼠的骨小梁数量增多，间距减少，以及骨表面破骨细胞数量和面积减少，表明了CSE对去卵巢小鼠的骨量流失具有良好的保护作用。同时CSE提高了血清中ALP含量，使BGP和TRAP含量回归正常水平，说明其可抑制破骨细胞分化，减弱骨吸收功能，具有缓解骨量流失和调节骨代谢作用。
总之，本研究发现CSE在体外抑制了RANKL诱导的破骨细胞分化及其骨吸收功能，其可能机制部分归因于CSE抑制了级联信号中ERK、JNK和P38的激活，在体内有效的缓解了因卵巢切除造成的骨量丢失，这为CSE防治骨质疏松症提供了初步的药理学证据。
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表 1 蛋白结合抑制活性和体外抗肿瘤活性测试结果
化合物 Ki
(μmol/L)IC50
(μmol/L)U-2OS
(wt-p53)Saos-2
(p53 null)A549
(wt-p53)NCI-H1299
(p53 null)Nutlin-3 0.093 12.2 8.38 2.18 1.97 美芬诺酮 5.79 >100 >100 8.43 >100 盐酸氮䓬斯汀 216.3 6.38 3.80 1.54 4.32 苄普地尔 0.456 2.58 1.56 1.04 1.39 保泰松 155.5 71.31 >100 91.45 >100 阿洛西林 NA >100 >100 >100 >100 盐酸多沙普仑 NA >100 >100 60.68 >100 
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表 2 苄普地尔在肝微粒体孵化体系中的代谢产物信息
编号 代谢途径 质荷比 分子式 保留时间（t/min） M0 原形 367 C24H34N2O 11.6 M1 氧化 383 C24H34N2O2 9.8
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[1] PARSONS C G. CNS repurposing-potential new uses for old drugs: Examples of screens for Alzheimer's disease, Parkinson's disease and spasticity[J]. Neuropharmacology,2019,147:4-10. doi: 10.1016/j.neuropharm.2018.08.027 [2] LIU Y X, WU W, LIANG Y J, et al. New uses for old drugs: the tale of artemisinin derivatives in the elimination of schistosomiasis japonica in China[J]. Molecules,2014,19(9):15058. doi: 10.3390/molecules190915058 [3] CHEN V C, CHAN H L, HSU T C, et al. New use for old drugs: The protective effect of atypical antipsychotics on hepatocellular carcinoma[J]. Int J Cancer,2019,144(10):2428-2439. doi: 10.1002/ijc.31980 [4] YEOMANS N D. Aspirin: old drug, new uses and challenges[J]. J Gastroenterol Hepatol,2011,26(3):426-431. doi: 10.1111/j.1440-1746.2010.06569.x [5] PATRONO C. Aspirin: new cardiovascular uses for an old drug[J]. Am J Med,2001,110(1A):62S-65S. [6] YANG B W, SHI J L. Developing new cancer nanomedicines by repurposing old drugs[J]. Angew Chem Int Ed Engl,2020,59(49):21829-21838. doi: 10.1002/anie.202004317 [7] NELSON B S, KREMER D M, LYSSIOTIS C A. New tricks for an old drug[J]. Nat Chem Biol,2018,14(11):990-991. doi: 10.1038/s41589-018-0137-x [8] 赵方振, 庄春林, 郭子照, 等. 1H-吡咯-2(5H)-酮类化合物的合成及生物活性[J]. 药学实践杂志, 2012, 30(6):430-432, 456. [9] LI J, WU Y L, GUO Z Z, et al. Discovery of 1-arylpyrrolidone derivatives as potent p53-MDM2 inhibitors based on molecule fusing strategy[J]. Bioorg Med Chem Lett,2014,24(12):2648-2650. doi: 10.1016/j.bmcl.2014.04.063 [10] MIAO Z Y, ZHU L J, DONG G Q, et al. A new strategy to improve the metabolic stability of lactone: discovery of (20S, 21S)-21-fluorocamptothecins as novel, hydrolytically stable topoisomerase I inhibitors[J]. J Med Chem,2013,56(20):7902-7910. doi: 10.1021/jm400906z [11] ZHUANG C L, MIAO Z Y, ZHU L J, et al. Discovery, synthesis, and biological evaluation of orally active pyrrolidone derivatives as novel inhibitors of p53-MDM2 protein-protein interaction[J]. J Med Chem,2012,55(22):9630-9642. doi: 10.1021/jm300969t [12] WARNER W A, SANCHEZ R, DAWOODIAN A, et al. Identification of FDA-approved drugs that computationally bind to MDM2[J]. Chem Biol Drug Des,2012,80(4):631-637. doi: 10.1111/j.1747-0285.2012.01428.x 期刊类型引用(1)
1. 王楠. 小剂量口服避孕药对妇女血凝的影响研究. 实用妇科内分泌电子杂志. 2023(23): 82-84 . 
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