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右美托咪定是一种α-2肾上腺素受体激动剂，由于它对认知功能、血流动力学稳定性和呼吸的影响较小，已被广泛用作麻醉辅助剂用于抗焦虑、镇静、术后镇痛等[1-2]。在临床上，我们发现达到相同镇静效果，梗阻性黄疸患者使用右美托咪定的用量低于非黄疸者，故猜测梗阻性黄疸患者使用该药有可能影响其药动学特征。目前,在婴儿、儿童、成人以及在肥胖和低蛋白血症人群中已有右美托咪定的药动学报道[3-6]，而对梗阻性黄疸患者相关研究甚少。因此，本研究通过测定患者体内药物浓度，探讨梗阻性黄疸对右美托咪定药动学的影响。
目前已有多种分析方法用于测定血浆中的右美托咪定，包括高效液相色谱法、气相色谱-串联质谱法、高效液相色谱-串联质谱法[7-9]，但这些方法存在分析时间长、灵敏度低、回收率低等缺点。本研究建立一种快速、灵敏、稳定的超高效液相色谱-串联质谱法测定人血浆右美托咪定的浓度，为右美托咪定药动学研究提供一种可靠的分析方法。
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Agilent 1290 InfinityⅡ液相色谱仪、Agilent 6470三重四级杆质谱仪（Agilent Technologies，美国）；真空浓缩旋转仪、低温高速离心机（Thermo，德国）；XW 80A型涡旋混合器（医大仪器，上海）；Mettler AE240十万分之一电子天平（梅特勒-托利多，瑞士）；Millipore-Q超纯去离子水净化仪（Millipore，美国）。
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右美托咪定对照品（批号：100523-201301）、卡马西平对照品（批号：100142-201706）（中国食品药品检定研究院）；甲醇（色谱纯，美国Merck公司）；甲酸（色谱纯，SIGMA公司）；乙酸乙酯（分析纯，江苏强盛功能化学股份有限公司）。
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色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18 RRHD column (2.1 mm×50 mm, 1.8 μm)，甲醇-0.1%甲酸水 (75∶25)为流动相，流速0.2 ml/min，柱温：35 ℃，进样量2 μl，运行时间1.5 min。
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采用AJS ESI正离子模式，多反应离子监测模式(MRM)进行二级扫描；动态反应监测的离子对参数：右美托咪定201→95；卡马西平237→194。离子源参数设置：干燥气温度350 ℃；干燥气流速10 L/min；雾化器压力40 psi；鞘气温度400 ℃；鞘气流速11 L/min；毛细管电压4000 V；喷嘴电压500 V。右美托咪定保留时间为0.9 min，内标保留时间为1.1 min，色谱图如图1所示。
图 1 血浆中右美托咪定和内标卡马西平的色谱图
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精密称取右美托咪定对照品10.00 mg，置于10 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得质量浓度为1.00 mg/ml对照品储备液。再采用逐级稀释法配置质量浓度为0.01、0.05、0.1、0.5、1.00、5.00、10.00 ng/ml的系列对照品血浆溶液；随行质控样品中右美托咪定的低、中、高质量浓度分别为0.05、0.50、5.00 ng/ml。以上溶液量于4 ℃冰箱备用。
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取200 μl血浆样品于离心管中，加入20 μl内标溶液、20 μl NaOH (1 mol/L)溶液和1 ml乙酸乙酯-氯甲烷(4∶1, V/V)提取溶剂，涡旋60 s，4 ℃条件下3000×g离心10 min，取上清液800 μl加入离心管中，真空浓缩干燥，加入100 μl流动相溶液，涡旋30 s使残渣溶解，4 ℃条件下3000×g离心10 min，取上清液进样。
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按“2.3”和“2.4”项中的方法制备标准曲线，平行操作5份，按上述UPLC-MS/MS条件，连续进样分析，以对照品浓度 (X)为横坐标，右美托咪定的峰面积与内标的峰面积比值 (Y)为纵坐标，进行线性回归，得线性方程：Y=1.307 2X−0.015 6, r=0.999 8(r=0.999 9)，线性范围为0.01～10.00 ng/ml，以信噪比为5时（S/N=5)测得右美托咪定的最低定量限为10 pg/ml，以信噪比为3时（S/N=3)测得右美托咪定的最低检测限为5 pg/ml。
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按“2.3”和“2.4”项中的方法制备低、中、高3种浓度的质控样品，平行操作5份，连续3 d，计算实测浓度。如表1所示，精密度用相对标准偏差(RSD%)表示，结果日内精密度RSD%≤5.9%、日间精密度RSD%≤5.8%；准确度以相对回收率表示，实测浓度与理论加入浓度的比值即为相对回收率。结果表明日内、日间结果准确度范围在91.2%～105.6%。
表 1 右美托咪定在人血浆中的精密度和准确度(n=5)
浓度(ng/ml) 日内 日间 实测浓度（pg/ml） 精密度(%) 准确度(%) 实测浓度（pg/ml） 精密度(%) 准确度(%) 0.05 52.78±3.12 5.9 105.6 51.13±2.97 5.8 102.2 0.50 455.84±13.30 2.9 91.2 455.82±10.04 2.2 91.2 5.00 4939.46±33.17 0.7 98.8 4970.33±144.57 2.9 99.4 -
按“2.3”和“2.4”项中的方法制备低、中、高3种浓度含药血浆，平行操作5份，其待测物的峰面积作为Set 3；取空白人血浆按“2.4”项下处理，甲醇代替内标溶液，真空浓缩干燥后加入相应浓度对照品溶液使残渣溶解，使之浓度与Set 3的待测理论浓度一致，分别制备5份，其峰面积作为Set 2；将待测化合物标准溶液用甲醇稀释，使之与Set 3待测理论浓度一致，进样5次，其峰面积作为Set 1。基质效应为Set 2/Set 1，提取回收率计算公式为Set 3/Set 2，考察内标的基质效应和提取回收率操作步骤同上。低、中、高3种浓度待测物及内标提取回收率均在85.5%～93.1%之间，基质效应均在91.2%～95.6%之间，具体结果见表2。
表 2 待测物基质效应和提取回收率(n=5)
待测物 浓度(ng/ml) 提取回收率(%) 基质效应(%) 右美托咪定 0.05 87.7±s7.1 95.6±6.1 0.50 90.5±5.4 94.3±8.3 5.00 93.1±4.2 91.2±7.9 内标 10.00 85.5±6.8 94.5±6.6 -
按“2.3”和“2.4”项中的方法制备低、中、高3种浓度含药血浆，分别考察样品室温放置6 h后处理，样品前处理后室温放置24 h，3次冻融循环以及−80 ℃保存30 d的稳定性，按“1.9”项操作测定样品浓度，计平均值，并计算RSD%及相对偏差RE%，测定结果的RE范围为95.4%～103.5%，RSD均小于15%，表明样本稳定性良好。
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选取拟进行胆管手术的患者19名。根据术前血清总胆红素水平，分为黄疸组（n=11，平均年龄60.5岁，体重60.1 kg，身高159.8 cm）和对照组（n=8, 平均年龄60.5岁，体重60.1 kg，身高159.8 cm）。术前静脉输注右美托咪定（剂量为1.0 μg/kg），给药后使用含EDTA的采血管收集患者静脉血，采血时间点为0、0.5、1、2、3、5、10、12、15、20、30、40、60、90、120、180、240、300 min。血样经低温离心后，取其上清液于−80 ℃冰箱保存。待收集所有患者血浆后，使用本研究建立的UPLC-MS/MS法测定样品中右美托咪定的浓度。通过WinNonlin 7.0软件，非房室模型计算药动学参数，绘制平均血药浓度-时间曲线，如图2所示。使用SPSS 13.0软件，t-test分析比较两组数据的差异,结果见表3，与非黄疸组相比，梗阻性黄疸患者体内右美托咪定药动学参数cmax增加63.4%(P<0.01)，AUC(0−t)、AUC (0−∞)和Vz分别增加78.9%、66.4%、82.5%(P<0.005)，CLz降低42.1%(P<0.05)。结果显示，梗阻性黄疸患者体内右美托咪定消除减慢。
图 2 右美托咪定在患者体内的平均血药浓度-时间曲线
表 3 患者静脉推注右美托咪定后的平均药动学参数
参数 对照组 阻塞性黄疸组 P值 cmax (ng/ml) 2.43±0.39 3.97±1.00 <0.01 tmax (t/min) 8.13±2.59 7.91±3.02 NS t1/2 (t/min) 146.72±82.28 135.10±49.92 NS CLz/F (ml∙min−1∙kg−1) 10.20±2.34 6.10±1.05 <0.001 AUC(0-t) (ng∙min∙ml−1) 77.70±15.15 139.16±40.59 <0.005 AUC(0-∞) (ng∙min∙ml−1) 101.94±19.68 169.58±36.62 <0.001 AUMC(0-∞)(ng∙min2∙ml−1) 19 068.07±12619.6 27 436.85±10 299.48 NS Vz(ml/kg) 2 072.09±904.67 1 199.87±454.79 <0.05 MRT(0-∞) (t/min) 172.4±86.81 159.96±60.01 NS 注：cmax：血峰浓度，tmax：达峰时间，t1/2：半衰期，CLz/F：清除率，AUC(0-t)：药时曲线面积(0-t)，AUC(0-∞)：药时曲线面积(0-∞)，AUMC(0-∞)：一阶药时曲线面积(0-∞)，Vz：表观分布容积，MRT(0-∞)：平均驻留时间。 -
本文所建立的UPLC-MS/MS法快速、灵敏、稳定，能应用于右美托咪定血浆样品的高通量分析。右美托咪定主要在肝脏发生生物转化[10]，梗阻性黄疸可引起一定程度的肝功能异常（如药物代谢酶系统改变、胆管排泄功能受损、低蛋白血症）。根据总胆红素水平，将入组患者分为黄疸组（总胆红素水平>17.1 μmol/L）和非黄疸组（总胆红素水平<17.1 μmol/L）。本试验发现黄疸组患者右美托咪定的cmax、AUC(0−t)、AUC (0−∞)和Vz显著升高，CLz显著降低。结果提示，黄疸组与非黄疸组患者对右美托咪定药物处置存在差异，梗阻性黄疸可能会降低右美托咪定在患者体内的消除速度。该试验为右旋美托咪定在梗阻性黄疸患者中的临床使用剂量提供了一定的参考依据。
Effect of obstructive jaundice on pharmacokinetics of dexmedetomidine in vivo
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摘要:
目的 建立超高效液相色谱-串联质谱法测定人血浆右美托咪定的浓度，评价梗阻性黄疸对患者体内右美托咪定药动学参数的影响。 方法 样品经液-液萃取后测定，色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18，流动相为甲醇−0.1%甲酸水溶液，流速为0.2 ml/min，柱温为35 ℃，质谱检测采用动态多反应离子检测模式。 结果 人血浆中右美托咪定在0.01～10.00 ng/ml浓度范围内线性关系良好，日内和日间精密度均小于15.00%，提取回收率为85.5%～93.1%，基质效应为91.2%～95.6%，样品在分析期间稳定性良好。与对照组相比，梗阻性黄疸患者体内右美托咪定药动学参数cmax、AUC(0−t)、AUC(0−∞)和Vz分别增加63.4%、78.9%、66.4%、82.5%；CLz降低42.1%。 结论 该方法结果准确，灵敏度高，重现性好，适用于检测人血浆右美托咪定的浓度；梗阻性黄疸患者体内右美托咪定消除减慢。 -
关键词:
- 超高效液相色谱-串联质谱 /
- 梗阻性黄疸 /
- 右美托咪定 /
- 药动学
Abstract:Objective To establish a UPLC-MS/MS method for the determination of dexmedetomidine in human plasma and investigate the effect of obstructive jaundice on pharmacokinetics of dexmedetomidine in vivo. Methods Samples were obtained by liquid-liquid extraction. Agilent Eclipse Plus C18 column was used for chromatograph with methanol and 0.1% formic acid-water solution as mobile phase. Flow rate was 0.2 ml/min. The column temperature was 35 ℃, and the MS detection was selected in MRM mode. Results The calibration curves of dexmedetomidine showed good linearity in the ranges of 0.01−10.00 ng/ml. The results of intra and inter-day precisions were both within 15%. The recovery rate was 85.5%−93.1%. Matrix effect was 91.2%−95.6%. Samples remained stable during analysis. Compared with the control group, cmax、AUC(0−t)、AUC(0−∞) and Vz of dexmedetomidine in the patients with obstructive jaundice were increased by 63.4%, 78.9, 66.4%, 82.5%, respectively (P<0.01). CLz was decreased by 42.1%. Conclusion This method is accurate, sensitive and reproducible. It is suitable for dexmedetomidine assay in human plasma. The elimination rate of dexmedetomidine is slower in obstructive jaundice. -
Key words:
- UPLC-MS/MS /
- obstructive jaundice /
- dexmedetomidine /
- pharmacokinetics
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子宫内膜异位症（endometriosis，EM）是临床上最为常见的慢性妇科疾病之一，以慢性盆腔疼痛、月经紊乱和不孕为主要的临床表现。EM本质是血瘀证，临床治疗时以活血化瘀为主，常用的药物有桃仁、红花、泽兰、丹参、益母草、川牛膝、王不留行等，能够有效缓解患者痛经、非经期盆腔痛等症状[1]。
目前活血化瘀类中药对EM治疗的具体机制不是很清晰，其针对的靶点也不是很明了。网络药理学将生物网络作为研究对象，探究药物、靶点、疾病之间的联系，系统完整地研究药物的机制，可展现出药物对于多个靶点、多个通路不同影响。因为和中医整体观念天然契合，网络药理学现已广泛应用于中药研究中[2-3] 。在本研究中，笔者采用网络药理学的方法探究活血化瘀类中药治疗EM的作用机制，构建“化合物-靶标-通路-疾病”网络，并初步探析何种活血化瘀药在EM治疗中更具优势，为临床用药以及进一步实验研究提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 活血化瘀类中药确认
根据卫生部“十一五”规划教材《中药学》分类，确认桃仁、红花、泽兰、丹参、益母草、川牛膝、王不留行七味活血化瘀药为本次主要研究对象。
1.2 中药有效成分以及相关靶点的获取
利用中药化学成分数据库TCMSP平台（http:// lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），检索七味中药所含活性成分。依据数据库指南要求，将口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%以及类药性（drug-like，DL）≥0.18作为筛选条件，对活性成分进行筛选[4]。OB值是评价药物能否发挥药效的重要药动学参数，DL值是指化合物与所有已知药物之间的相似程度。上述2个参数是评价中药化学成分吸收、分布、代谢、排泄的关键参数。获得符合OB、DL参数有效活性成分后，利用TCMSP数据库查询各有效活性成分对应相关靶点。利用Venn图工具（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）对药物化学成分以及相关靶点进行共同点分析，寻找活血化瘀中药共有成分和作用靶点。
1.3 EM相关靶点基因确认
利用美国国立生物技术信息中心Gene数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）将所获靶点信息转换成基因名称。查询GeneCards（https://www.genecards.org/）数据库，获得与EM相关基因靶点。最后将每种中药的作用靶点对应的Gene Symbol与EM基因进行比对，获得每种中药可能影响EM的相关基因，利用Cytoscape 3.6.0软件构建化合物－靶点网络[5]。
1.4 构建蛋白互作网络
为进一步研究靶点之间的相互关系，将活血化瘀药共同靶点上传至线上软件 STRING(http://string db.org)，构建蛋白互作网络。物种选择为Homosapiens，minimum required interaction score调整为highest confidence，隐藏网络图中游离节点，获取PPI网络。
1.5 KGEE通路分析
利用KEGG数据库（https://www.keg g.jp/）查询每种中药针对EM的相关基因，获得相关KEGG通路信息。筛选各中药KEGG通路中相关基因富集情况，并利用Prism 8.0软件绘制通路靶点富集热图。
2. 结果
2.1 活血化瘀类中药有效成分及对应靶点的获取
按照要求从TCMSP数据库中筛选出各中药有效成分，删除重复项，共有94种有效成分（supplementary materials table S1）。其中丹参有效活性成分达到65个，而泽兰有效活性成分只有2个。未能发现七味活血化瘀药共同有效成分，但β-谷固醇为川牛膝、红花、桃仁、泽兰所共有，槲皮素为川牛膝、红花、王不留行、益母草所共有，是涉及活血化瘀类中药最多的2种有效成分（supplementary materials table S2）。与此同时，我们找到了七味中药所共有的19个作用靶点（表1），包括孕酮受体（progesterone receptor）、前列腺素G/H合成酶1（prostaglandin G/H synthase 1）、前列腺素G/H合成酶2（prostaglandin G/H synthase 2）、凋亡调节剂Bcl-2（apoptosis regulator Bcl-2）、核受体共激活剂（nuclear receptor coactivator 2）等。
表 1 七种活血化瘀中药共有的19个靶点序号 蛋白名称 基因名称 靶点标识码 1 钠通道蛋白5型亚基 SCN5A TAR00070 2 前列腺素G/H合成酶1 PTGS1 TAR00006 3 Beta-2型肾上腺素受体 ADRB2 TAR00261 4 毒蕈碱型乙酰胆碱受体M3 CHRM3 TAR00016 5 孕酮受体 PGR TAR00209 6 半胱天冬酶3 CASP3 TAR04087 7 热休克蛋白HSP 90 HSP90 TAR00444 8 钾电压门控通道亚家族H成员2 KCNH2 TAR00037 9 凋亡调节剂Bcl-2 BCL2 TAR00086 10 PKA催化亚基C-alpha PRKACA TAR00699 11 半胱天冬酶9 CASP9 TAR04090 12 γ-氨基丁酸受体亚基α-1 GABRA1 TAR00309 13 毒蕈碱型乙酰胆碱受体M1 CHRM1 TAR00038 14 前列腺素G/H合酶2 PTGS2 TAR00094 15 转录因子AP-1 JUN,FOS TAR00414 16 磷脂酰肌醇-4,5-双磷酸3-激酶催化亚基，γ亚型 PIK3CG TAR00491 17 毒蕈碱型乙酰胆碱受体M2 CHRM2 TAR00210 18 核受体共激活剂2 NCOA2 TAR03276 19 维甲酸受体RXR-alpha RARA TAR00158 2.2 EM相关靶点确认
利用人类基因数据库查找EM作用靶点，与七味中药有效成分对应靶点进行比对，发现红花所含相关靶点数量最多，达到103个；而桃仁、泽兰所含相关靶点数量最少，为14个（图1A）；王不留行所含相关靶点占有效成分作用靶点比例最高，为54.7%；而桃仁最低，为29.8%（图1B）。经过去重处理后，七味中药所含EM相关靶点共119个（supplementary materials table S3）。利用Cytoscape3.6.0软件进行成分－靶点网络分析，获得图2，其中共计216个节点，其中黄色节点为活血化瘀药有效活性成分，而蓝色节点代表EM相关靶点。利用软件自带分析功能，对于网络各节点度值进行分析，网络中某些节点度值较高，提示该节点为网络中的关键节点（supplementary materials table S4）。在各中药所含有效成分中，槲皮素展现出极高的连接度（度值=87），远超其他有效成分，而其余较高连接度值依次是木犀草素（度值=43）、山柰酚（度值=33）、黄芩素（度值=23）、丹参酮A（度值=20）、花生四烯酸（度值=20）、β-谷固醇（度值=18）。中药是一个多有效成分的复杂系统，一个有效成分可作用于多个靶点，协同作用于某种疾病的治疗。而在靶点的分析中，较高连接度的靶点可能在EM的治疗作用中起着重要的作用。前列腺素G/H合酶2(PTGS2，度值=82）、前列腺素G/H合酶1（PTGS1，度值=39）两者拥有最高的度值，是临床上炎性疾病治疗的主要靶点；核受体辅活化子2（NCOA2，度值=35）、核受体辅活化子1（NCOA1，度值=34)紧跟其后，同样在各炎症通路中作用显著；凝血酶(度值=31）是临床上治疗出血的重要靶点，直接作用于血液凝固过程的最后一环；Mu-type阿片受体（OPRM1，度值=30）则涉及到中枢镇痛功能。上述靶点均和EM症状及病机之间有着密切的关系。
图 1 七味活血化瘀中药EM相关靶点数量及所占比例A.基于OB≥30%和DL≥0.18标准，各中药EM相关靶点个数；B.基于OB≥30%、DL≥0.18标准，各中药EM相关靶点的比例2.3 PPI网络的构建与分析
利用STRING软件构建靶点PPI网络，图中包含119个节点，505条边，所有节点平均度值为8.49，具体见图3。根据“度值>均值”筛选出PPI网络中关键节点56个（supplementary materials table S6），前9位关键节点，平均度值为88，见表2，与PPI网络74%节点存在相互作用关系，提示它们在网络调控中起着关键作用，可能是活血化瘀药物治疗EM的关键所在。
表 2 PPI网络中关键节点节点名称 度值 节点名称 度值 节点名称 度值 ALB 97 IL6 92 PTGS2 83 AKT1 95 TNF 86 CASP3 80 VEGFA 94 MAPK8 83 MAPK1 80 2.4 KEGG通路分析
利用KEGG数据库查询每种中药针对EM的相关基因，获得相关KEGG通路信息。整理各中药KEGG通路相关基因富集情况，发现七味中药共有信号通路44条（supplementary materials table S5），筛选出与EM密切相关的19条通路（表3）。从表3中，不难发现，19条通路涉及性激素、炎症、细胞调亡以及血管生成等各个方面，其中炎症相关通路达到7条，为所有通路中最多。利用Prism 8.0软件绘制通路靶点富集热图，根据图4可知，在系列通路中，泽兰与桃仁作用均弱于其他五味中药。而在PI3K-Akt、IL-17、TNF三条信号通路中，多味中药靶点存在高度富集，红花在PI3K-Akt信号通路中显著富集，远超该药其他通路，值得注意。
表 3 七味活血化瘀中药的19条KEGG通路序号 标识码 信号通路名称 类别 1 hsa04151 PI3K-Akt信号通路 炎症相关 2 hsa04668 TNF信号通路 炎症相关 3 hsa04657 IL-17信号通路 炎症相关 4 hsa04625 C型凝集素受体信号通路 炎症相关 5 hsa04064 NF-κB信号通路 炎症相关 6 hsa04115 p53信号通路 炎症相关 7 hsa00590 花生四烯酸代谢 炎症相关 8 hsa01522 内分泌抵抗 激素相关 9 hsa04915 雌激素信号通路 激素相关 10 hsa04919 甲状腺激素信号通路 激素相关 11 hsa04921 催产素信号通路 激素相关 12 hsa04210 细胞凋亡 细胞凋亡 13 hsa04071 鞘脂信号通路 细胞凋亡 14 hsa01521 EGFR酪氨酸激酶抑制剂拮抗 血管相关 15 hsa04370 VEGF信号通路 血管相关 16 hsa01521 血小板活化 血管相关 17 hsa04722 神经营养蛋白信号通路 疼痛相关 18 hsa04725 胆碱能突触 疼痛相关 19 hsa04726 血清素能突触 疼痛相关 3. 讨论
本研究采用网络药理学的研究方法，从TCMSP数据库中提取出了94个符合标准的成分，通过VENE图去重以及分析网络图的拓扑特性后，发现槲皮素为四味活血化瘀药所共有，与83种EM相关靶点存在关联。现代研究表明，槲皮素具有抑制炎症、血小板聚集和血管平滑肌细胞增殖的作用，通过抗氧化作用诱导细胞凋亡，还可通过雌激素受体，调控受体下游多种底物及信号通路而调节雌激素[6-7]。木犀草素与41种EM靶点相关联，具有抗炎、抗纤维化、抑制血管生成等作用[8]。EM发生发展过程中慢性炎症反应一直贯穿始终，且存在纤维化病变，木犀草素或在EM治疗中有一定作用[9-10]。
通过VENE图，发现七味中药共有作用靶点19个，部分共有靶点与Cytoscape网络图以及PPI网络中关键节点高度对应，进一步强调了该部分共有靶点在EM中的作用。如PTGS2，该靶点所调控环氧合酶（COX-2）的高表达会导致细胞的高增殖性、高侵袭性，诱导血管生成从而加重EM的疼痛和不孕症状[11]。NCOA2、NCOA1的水平异常与EM的进展关联密切。趋化因子参与子宫内膜异位种植过程中趋化、黏附、侵袭、血管形成及细胞生长分化等多个重要环节[12]。Xiu等发现，在分泌期，NCOA1和趋化因子CXCL12在异位子宫内膜中的表达明显高于正常子宫内膜；活化血小板对异位内膜具有促炎、促血管生成的作用，促使异位内膜细胞的侵袭和增殖[13-14]，子宫内膜基质细胞可分泌F2，以密集依赖的方式诱导血小板活化和聚集，从而影响EM的进展[15-16] 。VEGFA可促进新生血管形成并使血管通透性增加，陈晓莉等[17]研究表明，内异症组血清和腹腔液VEGF水平明显高于对照组，且重度患者腹腔液中VEGF水平高于轻度患者，VEGF在EMT患者血管生成中起促进性作用,在血清与腹腔液中的高表达与疾病发生发展相关。尉伟东等[18]发现CASP3蛋白在异位内膜和在位内膜中的评分明显低于正常对照组，caspase-3的水平下降提示内膜细胞活性下降，促使子宫内膜细胞自发性凋亡增加以及凋亡信号敏感性增强，诱导或加重EM。
利用KEGG数据库，找到了七味活血化瘀药共有EM相关通路19条，涉及性激素、炎症、细胞凋亡以及血管生成等方面。所有通路中，炎症通路达到36%。其中PI3K-Akt、IL-17、TNF三条信号通路是靶点富集最多的通路，提示活血化瘀药主要通过抗炎作用来对EM起治疗作用。与正常女性相比，EM患者的子宫内膜在位和异位内膜细胞的PI3K表达增加，AKT磷酸化水平升高，证实PI3K/AKT信号通路可影响EM进展[19]。EM是一种雌激素依赖性疾病，呈现出慢性炎症反应，多种炎性因子参与其病理过程，包括NF-κB、TNF-α、IL-1、IL-17等[20]。许丽华等[21]通过实验发现，EM患者血清及腹腔液中TNF-α水平显著高于对照组。EM患者Ⅲ和Ⅳ期血清和腹腔液中TNF-α水平均高于Ⅰ和Ⅱ期，证实了TNF-α与子宫内膜异位症的发生发展密切相关,有助于子宫内膜异位症的诊断。IL-1家族在EM发生发展中作用显著，与正常女性相比，EM患者静脉血中IL-1β浓度显著增高。不仅仅是IL-1β，研究显示，IL-1β前体蛋白（proIL-1β）也可以加重炎症反应，EM患者腹腔液中IL-1β、proIL-1β水平均高于健康女性。IL-1家族细胞因子的损伤，导致EM患者腹腔免疫机制的紊乱，局部以及全身IL-1β、IL-18调控机制的缺陷，使得内膜组织的侵袭性以及生长性大幅增加，从而导致EM[22-24]。炎症相关通路的高富集也与之前网络图中TNF、IL-6等炎性相关靶点的高度值相对应，进一步强调了活血化瘀药物通过抗炎作用治疗EM的作用机制。细胞凋亡是一种独特的程序性细胞死亡，细胞的有效清除而不会引起炎症反应，EM特征为异位内膜细胞凋亡率下降。与健康女性子宫内膜相比，EM异位内膜抗凋亡因子表达增加，促凋亡因子表达减少，证实了细胞凋亡在EM的发病中确有作用，并和炎症反应存在一定关联[25]。EM发生发展过程中亦伴随着血管生成增多以及局部病灶周期性出血，EM患者异位内膜血管内皮生长因子(VEGF)表达量增高，抗血管生成因子(sFlt-1)表达量下降，证实VEGF信号通路、血小板激活通路均参与此过程，与前面靶点分析也形成呼应[26-27] 。脑源性神经营养因子是各种慢性疾病中慢性疼痛形成和维持的调节因子，EM伴有疼痛的患者血清和腹膜液中神经营养因子浓度明显高于无疼痛EM患者[28]。利用KEGG通路分析，可以发现活血化瘀药对于炎症、凋亡、疼痛、血管生成等相关通路均具备调控作用，进一步强调了临床上活血化瘀药对于EM的治疗价值。
综上所述，活血化瘀中药可通过多靶点、多通路协同作用方式对EM进行治疗，体现了中医药治疗疾病特色。上述七味中药中，桃仁、泽兰对于EM的作用低于其余活血化瘀药，而红花、益母草在EM治疗体系中，EM相关靶点高于其余中药，可能会起到更好的疗效，在临床上可尝试推广使用。本研究从网络药理学角度出发，根据活血化瘀中药有效成分和作用靶点，在一定程度上对活血化瘀中药治疗EM进行了机制的解析，为指导临床用药提供了一定的依据。但本研究仅仅基于TCMSP数据库，利用计算机软件从理论上对活血化瘀中药治疗EM作用机制做了探析，还需要通过实验和临床实践来进一步证实，而且还需要扩大活血化瘀药物探究范围，结合临床实际，深入剖析活血化瘀药共同点与差异之处。
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表 1 右美托咪定在人血浆中的精密度和准确度(n=5)
浓度(ng/ml) 日内 日间 实测浓度（pg/ml） 精密度(%) 准确度(%) 实测浓度（pg/ml） 精密度(%) 准确度(%) 0.05 52.78±3.12 5.9 105.6 51.13±2.97 5.8 102.2 0.50 455.84±13.30 2.9 91.2 455.82±10.04 2.2 91.2 5.00 4939.46±33.17 0.7 98.8 4970.33±144.57 2.9 99.4 
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表 2 待测物基质效应和提取回收率(n=5)
待测物 浓度(ng/ml) 提取回收率(%) 基质效应(%) 右美托咪定 0.05 87.7±s7.1 95.6±6.1 0.50 90.5±5.4 94.3±8.3 5.00 93.1±4.2 91.2±7.9 内标 10.00 85.5±6.8 94.5±6.6
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表 3 患者静脉推注右美托咪定后的平均药动学参数
参数 对照组 阻塞性黄疸组 P值 cmax (ng/ml) 2.43±0.39 3.97±1.00 <0.01 tmax (t/min) 8.13±2.59 7.91±3.02 NS t1/2 (t/min) 146.72±82.28 135.10±49.92 NS CLz/F (ml∙min−1∙kg−1) 10.20±2.34 6.10±1.05 <0.001 AUC(0-t) (ng∙min∙ml−1) 77.70±15.15 139.16±40.59 <0.005 AUC(0-∞) (ng∙min∙ml−1) 101.94±19.68 169.58±36.62 <0.001 AUMC(0-∞)(ng∙min2∙ml−1) 19 068.07±12619.6 27 436.85±10 299.48 NS Vz(ml/kg) 2 072.09±904.67 1 199.87±454.79 <0.05 MRT(0-∞) (t/min) 172.4±86.81 159.96±60.01 NS 注：cmax：血峰浓度，tmax：达峰时间，t1/2：半衰期，CLz/F：清除率，AUC(0-t)：药时曲线面积(0-t)，AUC(0-∞)：药时曲线面积(0-∞)，AUMC(0-∞)：一阶药时曲线面积(0-∞)，Vz：表观分布容积，MRT(0-∞)：平均驻留时间。
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