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右美托咪定是一种α-2肾上腺素受体激动剂，由于它对认知功能、血流动力学稳定性和呼吸的影响较小，已被广泛用作麻醉辅助剂用于抗焦虑、镇静、术后镇痛等[1-2]。在临床上，我们发现达到相同镇静效果，梗阻性黄疸患者使用右美托咪定的用量低于非黄疸者，故猜测梗阻性黄疸患者使用该药有可能影响其药动学特征。目前,在婴儿、儿童、成人以及在肥胖和低蛋白血症人群中已有右美托咪定的药动学报道[3-6]，而对梗阻性黄疸患者相关研究甚少。因此，本研究通过测定患者体内药物浓度，探讨梗阻性黄疸对右美托咪定药动学的影响。
目前已有多种分析方法用于测定血浆中的右美托咪定，包括高效液相色谱法、气相色谱-串联质谱法、高效液相色谱-串联质谱法[7-9]，但这些方法存在分析时间长、灵敏度低、回收率低等缺点。本研究建立一种快速、灵敏、稳定的超高效液相色谱-串联质谱法测定人血浆右美托咪定的浓度，为右美托咪定药动学研究提供一种可靠的分析方法。
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Agilent 1290 InfinityⅡ液相色谱仪、Agilent 6470三重四级杆质谱仪（Agilent Technologies，美国）；真空浓缩旋转仪、低温高速离心机（Thermo，德国）；XW 80A型涡旋混合器（医大仪器，上海）；Mettler AE240十万分之一电子天平（梅特勒-托利多，瑞士）；Millipore-Q超纯去离子水净化仪（Millipore，美国）。
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右美托咪定对照品（批号：100523-201301）、卡马西平对照品（批号：100142-201706）（中国食品药品检定研究院）；甲醇（色谱纯，美国Merck公司）；甲酸（色谱纯，SIGMA公司）；乙酸乙酯（分析纯，江苏强盛功能化学股份有限公司）。
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色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18 RRHD column (2.1 mm×50 mm, 1.8 μm)，甲醇-0.1%甲酸水 (75∶25)为流动相，流速0.2 ml/min，柱温：35 ℃，进样量2 μl，运行时间1.5 min。
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采用AJS ESI正离子模式，多反应离子监测模式(MRM)进行二级扫描；动态反应监测的离子对参数：右美托咪定201→95；卡马西平237→194。离子源参数设置：干燥气温度350 ℃；干燥气流速10 L/min；雾化器压力40 psi；鞘气温度400 ℃；鞘气流速11 L/min；毛细管电压4000 V；喷嘴电压500 V。右美托咪定保留时间为0.9 min，内标保留时间为1.1 min，色谱图如图1所示。
图 1 血浆中右美托咪定和内标卡马西平的色谱图
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精密称取右美托咪定对照品10.00 mg，置于10 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得质量浓度为1.00 mg/ml对照品储备液。再采用逐级稀释法配置质量浓度为0.01、0.05、0.1、0.5、1.00、5.00、10.00 ng/ml的系列对照品血浆溶液；随行质控样品中右美托咪定的低、中、高质量浓度分别为0.05、0.50、5.00 ng/ml。以上溶液量于4 ℃冰箱备用。
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取200 μl血浆样品于离心管中，加入20 μl内标溶液、20 μl NaOH (1 mol/L)溶液和1 ml乙酸乙酯-氯甲烷(4∶1, V/V)提取溶剂，涡旋60 s，4 ℃条件下3000×g离心10 min，取上清液800 μl加入离心管中，真空浓缩干燥，加入100 μl流动相溶液，涡旋30 s使残渣溶解，4 ℃条件下3000×g离心10 min，取上清液进样。
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按“2.3”和“2.4”项中的方法制备标准曲线，平行操作5份，按上述UPLC-MS/MS条件，连续进样分析，以对照品浓度 (X)为横坐标，右美托咪定的峰面积与内标的峰面积比值 (Y)为纵坐标，进行线性回归，得线性方程：Y=1.307 2X−0.015 6, r=0.999 8(r=0.999 9)，线性范围为0.01～10.00 ng/ml，以信噪比为5时（S/N=5)测得右美托咪定的最低定量限为10 pg/ml，以信噪比为3时（S/N=3)测得右美托咪定的最低检测限为5 pg/ml。
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按“2.3”和“2.4”项中的方法制备低、中、高3种浓度的质控样品，平行操作5份，连续3 d，计算实测浓度。如表1所示，精密度用相对标准偏差(RSD%)表示，结果日内精密度RSD%≤5.9%、日间精密度RSD%≤5.8%；准确度以相对回收率表示，实测浓度与理论加入浓度的比值即为相对回收率。结果表明日内、日间结果准确度范围在91.2%～105.6%。
表 1 右美托咪定在人血浆中的精密度和准确度(n=5)
浓度(ng/ml) 日内 日间 实测浓度（pg/ml） 精密度(%) 准确度(%) 实测浓度（pg/ml） 精密度(%) 准确度(%) 0.05 52.78±3.12 5.9 105.6 51.13±2.97 5.8 102.2 0.50 455.84±13.30 2.9 91.2 455.82±10.04 2.2 91.2 5.00 4939.46±33.17 0.7 98.8 4970.33±144.57 2.9 99.4 -
按“2.3”和“2.4”项中的方法制备低、中、高3种浓度含药血浆，平行操作5份，其待测物的峰面积作为Set 3；取空白人血浆按“2.4”项下处理，甲醇代替内标溶液，真空浓缩干燥后加入相应浓度对照品溶液使残渣溶解，使之浓度与Set 3的待测理论浓度一致，分别制备5份，其峰面积作为Set 2；将待测化合物标准溶液用甲醇稀释，使之与Set 3待测理论浓度一致，进样5次，其峰面积作为Set 1。基质效应为Set 2/Set 1，提取回收率计算公式为Set 3/Set 2，考察内标的基质效应和提取回收率操作步骤同上。低、中、高3种浓度待测物及内标提取回收率均在85.5%～93.1%之间，基质效应均在91.2%～95.6%之间，具体结果见表2。
表 2 待测物基质效应和提取回收率(n=5)
待测物 浓度(ng/ml) 提取回收率(%) 基质效应(%) 右美托咪定 0.05 87.7±s7.1 95.6±6.1 0.50 90.5±5.4 94.3±8.3 5.00 93.1±4.2 91.2±7.9 内标 10.00 85.5±6.8 94.5±6.6 -
按“2.3”和“2.4”项中的方法制备低、中、高3种浓度含药血浆，分别考察样品室温放置6 h后处理，样品前处理后室温放置24 h，3次冻融循环以及−80 ℃保存30 d的稳定性，按“1.9”项操作测定样品浓度，计平均值，并计算RSD%及相对偏差RE%，测定结果的RE范围为95.4%～103.5%，RSD均小于15%，表明样本稳定性良好。
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选取拟进行胆管手术的患者19名。根据术前血清总胆红素水平，分为黄疸组（n=11，平均年龄60.5岁，体重60.1 kg，身高159.8 cm）和对照组（n=8, 平均年龄60.5岁，体重60.1 kg，身高159.8 cm）。术前静脉输注右美托咪定（剂量为1.0 μg/kg），给药后使用含EDTA的采血管收集患者静脉血，采血时间点为0、0.5、1、2、3、5、10、12、15、20、30、40、60、90、120、180、240、300 min。血样经低温离心后，取其上清液于−80 ℃冰箱保存。待收集所有患者血浆后，使用本研究建立的UPLC-MS/MS法测定样品中右美托咪定的浓度。通过WinNonlin 7.0软件，非房室模型计算药动学参数，绘制平均血药浓度-时间曲线，如图2所示。使用SPSS 13.0软件，t-test分析比较两组数据的差异,结果见表3，与非黄疸组相比，梗阻性黄疸患者体内右美托咪定药动学参数cmax增加63.4%(P<0.01)，AUC(0−t)、AUC (0−∞)和Vz分别增加78.9%、66.4%、82.5%(P<0.005)，CLz降低42.1%(P<0.05)。结果显示，梗阻性黄疸患者体内右美托咪定消除减慢。
图 2 右美托咪定在患者体内的平均血药浓度-时间曲线
表 3 患者静脉推注右美托咪定后的平均药动学参数
参数 对照组 阻塞性黄疸组 P值 cmax (ng/ml) 2.43±0.39 3.97±1.00 <0.01 tmax (t/min) 8.13±2.59 7.91±3.02 NS t1/2 (t/min) 146.72±82.28 135.10±49.92 NS CLz/F (ml∙min−1∙kg−1) 10.20±2.34 6.10±1.05 <0.001 AUC(0-t) (ng∙min∙ml−1) 77.70±15.15 139.16±40.59 <0.005 AUC(0-∞) (ng∙min∙ml−1) 101.94±19.68 169.58±36.62 <0.001 AUMC(0-∞)(ng∙min2∙ml−1) 19 068.07±12619.6 27 436.85±10 299.48 NS Vz(ml/kg) 2 072.09±904.67 1 199.87±454.79 <0.05 MRT(0-∞) (t/min) 172.4±86.81 159.96±60.01 NS 注：cmax：血峰浓度，tmax：达峰时间，t1/2：半衰期，CLz/F：清除率，AUC(0-t)：药时曲线面积(0-t)，AUC(0-∞)：药时曲线面积(0-∞)，AUMC(0-∞)：一阶药时曲线面积(0-∞)，Vz：表观分布容积，MRT(0-∞)：平均驻留时间。 -
本文所建立的UPLC-MS/MS法快速、灵敏、稳定，能应用于右美托咪定血浆样品的高通量分析。右美托咪定主要在肝脏发生生物转化[10]，梗阻性黄疸可引起一定程度的肝功能异常（如药物代谢酶系统改变、胆管排泄功能受损、低蛋白血症）。根据总胆红素水平，将入组患者分为黄疸组（总胆红素水平>17.1 μmol/L）和非黄疸组（总胆红素水平<17.1 μmol/L）。本试验发现黄疸组患者右美托咪定的cmax、AUC(0−t)、AUC (0−∞)和Vz显著升高，CLz显著降低。结果提示，黄疸组与非黄疸组患者对右美托咪定药物处置存在差异，梗阻性黄疸可能会降低右美托咪定在患者体内的消除速度。该试验为右旋美托咪定在梗阻性黄疸患者中的临床使用剂量提供了一定的参考依据。
Effect of obstructive jaundice on pharmacokinetics of dexmedetomidine in vivo
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摘要:
目的 建立超高效液相色谱-串联质谱法测定人血浆右美托咪定的浓度，评价梗阻性黄疸对患者体内右美托咪定药动学参数的影响。 方法 样品经液-液萃取后测定，色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18，流动相为甲醇−0.1%甲酸水溶液，流速为0.2 ml/min，柱温为35 ℃，质谱检测采用动态多反应离子检测模式。 结果 人血浆中右美托咪定在0.01～10.00 ng/ml浓度范围内线性关系良好，日内和日间精密度均小于15.00%，提取回收率为85.5%～93.1%，基质效应为91.2%～95.6%，样品在分析期间稳定性良好。与对照组相比，梗阻性黄疸患者体内右美托咪定药动学参数cmax、AUC(0−t)、AUC(0−∞)和Vz分别增加63.4%、78.9%、66.4%、82.5%；CLz降低42.1%。 结论 该方法结果准确，灵敏度高，重现性好，适用于检测人血浆右美托咪定的浓度；梗阻性黄疸患者体内右美托咪定消除减慢。 -
关键词:
- 超高效液相色谱-串联质谱 /
- 梗阻性黄疸 /
- 右美托咪定 /
- 药动学
Abstract:Objective To establish a UPLC-MS/MS method for the determination of dexmedetomidine in human plasma and investigate the effect of obstructive jaundice on pharmacokinetics of dexmedetomidine in vivo. Methods Samples were obtained by liquid-liquid extraction. Agilent Eclipse Plus C18 column was used for chromatograph with methanol and 0.1% formic acid-water solution as mobile phase. Flow rate was 0.2 ml/min. The column temperature was 35 ℃, and the MS detection was selected in MRM mode. Results The calibration curves of dexmedetomidine showed good linearity in the ranges of 0.01−10.00 ng/ml. The results of intra and inter-day precisions were both within 15%. The recovery rate was 85.5%−93.1%. Matrix effect was 91.2%−95.6%. Samples remained stable during analysis. Compared with the control group, cmax、AUC(0−t)、AUC(0−∞) and Vz of dexmedetomidine in the patients with obstructive jaundice were increased by 63.4%, 78.9, 66.4%, 82.5%, respectively (P<0.01). CLz was decreased by 42.1%. Conclusion This method is accurate, sensitive and reproducible. It is suitable for dexmedetomidine assay in human plasma. The elimination rate of dexmedetomidine is slower in obstructive jaundice. -
Key words:
- UPLC-MS/MS /
- obstructive jaundice /
- dexmedetomidine /
- pharmacokinetics
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据国际癌症研究机构（IARC，https://www.iarc.who.int/）提供的数据显示，2020年女性乳腺癌现已成为全球最常见的癌症之一[1]。其中有15%～25%的乳腺肿瘤存在人类表皮生长因子受体2（HER2）过表达。HER2阳性的乳腺癌浸润性强、无病生存期短、预后差，对化疗敏感性差，且易复发[2]。曲妥珠单抗是一株靶向HER2的人源化单克隆抗体。虽然曲妥珠单抗单药对乳腺癌治疗起到了很好的改善的效果, 但其疗效还有所不足，如对HER2过表达的乳腺癌患者初次治疗有效率仅在30%左右[3]。EGCG是绿茶中主要的多酚[4]，有抑制肿瘤细胞生长、增殖、转移和血管生成，诱导细胞凋亡和增强抗肿瘤免疫等多种抗肿瘤作用[5-9]。据报道，EGCG在乳腺癌、胃癌、白血病、膀胱癌治疗中均显示有抗肿瘤作用[10-13]。本实验旨在探讨曲妥珠单抗与EGCG对HER2过表达细胞株是否具有协同增殖抑制作用，为HER2高表达乳腺癌的治疗提供新的思路。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 材料
EGCG（MedChemExpress公司），CCK-8检测试剂盒（美国bimake生物科技有限公司）；GAPDH一抗、AKT一抗、p-AKT一抗、MAPK一抗、p-MAPK一抗、EGFR一抗、p-EGFR一抗、HER2一抗、p-HER2一抗、抗兔IgG一抗、抗鼠IgG一抗、HRP抗体二抗（美国Cell Signaling Technology公司），凝胶过滤层析标准品（美国BIO-RAD公司），二抗Goat pAb to Human IgG（英国Abcam公司）。
1.1.2 细胞株
人乳腺癌细胞系BT474、SK-BR-3（购自中国科学院细胞库并保存于本实验室）。
1.1.3 仪器
AKTA Avant 25蛋白纯化仪、Imager 600超灵敏多功能成像仪（美国Cytiva公司）； Agilent 1200 series高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；Spark多功能酶标仪（瑞士TECAN）； Intellicyt® iQue3 高通量流式细胞仪（德国赛多利斯）。
1.2 方法
1.2.1 曲妥珠单抗的表达与纯化
用含有曲妥珠单抗重链和轻链表达载体的质粒共转染Expi293F细胞7 d后收集培养上清液，用Protein A亲和层析法进行纯化。SEC-HPLC对抗体的纯度进行检测，并用流式细胞术检测曲妥珠单抗抗体与HER2过表达细胞株SK-BR-3、BT474的结合活性。
1.2.2 流式细胞术
细胞按3×104个细胞/孔铺于V型底96孔板中，每孔30 μl。曲妥珠单抗按100 nmol/L的起始浓度，3倍比稀释，分成11个浓度梯度，末孔为PBS作为阴性对照，加入铺有细胞的96孔板中，每孔30 μl。曲妥珠单抗与细胞4℃共孵育1～2 h，用含0.1% BSA的PBS洗1遍，加入二抗Goat pAb to Human IgG，1∶200稀释，每孔30 μl，4℃孵育30 min。二抗孵育结束，用含0.1% BSA的PBS洗2遍，每孔加入30 μl 含0.1% BSA的PBS，用 Intellicyt® iQue3 高通量流式细胞仪进行检测。
1.2.3 细胞培养
采用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养SK-BR-3细胞，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养BT474细胞，培养条件为5% CO2，37℃。当细胞密度达到80%～90%时进行传代，每周2～3次。取对数生长期的细胞进行实验。
1.2.4 CCK8检测细胞增殖
将细胞按1×104个细胞/孔的数量接种于96孔板中，在37℃、5% CO2条件下培养24 h。每孔加入100 μl含设定浓度药物的培养基，培养48 h后，弃去孔内培养基，每孔加入100 μl含10%CCK8试剂的培养基，继续培养1～3 h，用酶标仪在450 nm测定光密度值（A），并计算细胞的增殖抑制率。增殖抑制率=（A对照−A实验）/（A对照−A背景）。联合给药组用CompuSyn软件计算CI值（药物联合指数），通过CI值的数值可以定量判断药物间相互作用的强度以及性质（CI>1为拮抗作用；CI=1为相加作用；CI<1为协同作用）。
1.2.5 Western blot检测
根据分组将细胞按5×105个细胞/孔的数量接种于6孔板培养24 h。弃去原培养基，加入含设定浓度药物的培养基继续培养24 h。采用细胞裂解液试剂盒提取各组细胞总蛋白，用BCA试剂盒测定蛋白浓度。按每泳道30 μg蛋白样品的上样量进行聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转移至PVDF膜。用5%脱脂奶粉在摇床上室温封闭1 h，加入一抗4 ℃孵育过夜，加入二抗室温孵育1 h。一抗、二抗均按照抗体使用说明书稀释。洗膜后，加ECL发光液，用超灵敏多功能成像仪进行显影，并用ImageJ软件对条带进行灰度值分析。目的蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/内参GAPDH灰度值 。
1.2.6 统计学方法
采用 GraphPad prism 8.0软件（Version X，USA）进行统计学分析和作图，用compuSyn软件计算联合指数。两组数据之间比较采用t检验，多组数据之间比较采用单因素方差分析（ANOVA）。P<0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 SEC-HPLC检测曲妥珠单抗的纯度
将表达纯化后的曲妥珠单抗用SEC-HPLC进行检测，结果显示曲妥珠单抗的纯度为100%，且分子量大小在150 kDa（1kDa=1×103）左右（图1）。
2.2 流式细胞术验证曲妥珠单抗与SK-BR-3、BT474的结合活性
采用流式细胞术测定曲妥珠单抗与HER2过表达乳腺癌细胞株SK-BR-3和BT474的结合活性。结果显示，曲妥珠单抗以浓度依赖性的方式结合SK-BR-3和BT474细胞，其中，曲妥珠单抗与SK-BR-3细胞株结合的EC50值为1.128 nmol/L，与BT474细胞株结合的EC50值为1.203 nmol/L，两者EC50值大约一致（图2）。
2.3 用CCK8法测定 EGCG 、曲妥珠单抗单独及联合对BT474的增殖抑制作用
采用CCK8法测定EGCG单药、曲妥珠单抗单药及两者联合对BT474的增殖抑制作用。图3A和图3B结果显示， EGCG和曲妥珠单抗对BT474细胞均显示出浓度依赖性的增殖抑制作用。图3C结果显示EGCG和曲妥珠单抗联合给药组的增殖抑制作用显著强于单药组。图3D结果显示EGCG在一定浓度范围内（45～200 μmol/L）与16.67 nmol/L 曲妥珠单抗联用时显示有协同抗肿瘤作用（CI<1）。
图 3 EGCG单药组、曲妥珠单抗单药组及两者联用组对BT474细胞增殖的影响注：A.EGCG对BT474细胞增殖的影响；B.曲妥珠单抗对BT474细胞增殖的影响；C.16.67 nmol/L曲妥珠单抗、16.67 nmol/L IgG 曲妥珠单抗同型对照、45 μmol/L EGCG、16.67 nmol/L曲妥珠单抗与45 μmol/L EGCG联用对BT474细胞增殖的影响；D.16.67 nmol/L曲妥珠单抗联合不同浓度EGCG对BT474细胞增殖的影响，计算联合指数（CI），Fa表示效应值；*P<0.05，****P<0.0001，与空白组比较；△△△△P<0.0001，与IgG组比较；####P<0.0001，与曲妥珠单抗组比较2.4 用CCK8法测定 EGCG 、曲妥珠单抗单独及联合对SK-BR-3细胞的增殖抑制作用
采用CCK8法测定EGCG单药、曲妥珠单抗单药及两者联合对SK-BR-3的增殖抑制作用。图4A和图4B结果显示，EGCG和曲妥珠单抗均对SK-BR-3细胞显示出浓度依赖性的增殖抑制作用。图4C结果显示，EGCG和曲妥珠单抗联合给药组的增殖抑制作用显著强于单药组。图4D结果显示，EGCG在一定浓度范围内（7.5～120 μmol/L）与16.67 nmol/L曲妥珠单抗联用时有协同抗肿瘤作用（CI<1）。
图 4 EGCG单药组、曲妥珠单抗单药组及两者联用组对SK-BR-3细胞增殖的影响注：A.EGCG对SK-BR-3细胞增殖的影响；B. 曲妥珠单抗对SK-BR-3细胞增殖的影响；C. 16.67 nmol/L 曲妥珠单抗、16.67 nmol/L IgG 曲妥珠单抗同型对照、15 μmol/L EGCG、16.67 nmol/L曲妥珠单抗与15 μmol/L EGCG联用对SK-BR-3细胞增殖的影响；D. 16.67 nmol/L曲妥珠单抗联合不同浓度EGCG对SK-BR-3细胞增殖的影响，计算联合指数（CI），Fa表示效应值；**P<0.01，***P<0.001，与空白组比较；△△△P<0.001，与IgG组比较；####P<0.0001，与曲妥珠单抗组比较2.5 Western blot法检测EGCG、曲妥珠单抗单用及二者联用对BT474细胞中EGFR、HER2、Akt、MAPK及其磷酸化蛋白表达的影响
图5A-F结果显示，EGCG单药、曲妥珠单抗单药及两者联用组均能显著降低BT474细胞中p-Akt、p-MAPK、p-EGFR的表达。图5G-H结果显示，曲妥珠单抗单药组能显著降低BT474细胞p-HER2的表达，EGCG单药组虽然无显著性差异（P>0.05），但对p-HER2的表达有一定抑制作用。与EGCG和曲妥珠单抗单药组相比，EGCG与曲妥珠单抗联用可进一步显著降低BT474细胞p-Akt、p-MAPK、p-EGFR、p-HER2蛋白的表达。
图 5 EGCG单药组、曲妥珠单抗单药组及两者联用组对BT474细胞中MAPK、Akt、EGFR、HER2及其磷酸化蛋白的表达的影响注：A. p-Akt、Akt的蛋白表达水平；B. p-Akt、Akt的相对蛋白表达量；C. p-MAPK、MAPK的蛋白表达水平；D. p-MAPK、MAPK的相对蛋白表达量；E. p-EGFR、EGFR的蛋白表达水平；F. p-EGFR、EGFR的相对蛋白表达量；G. p-HER2、HER2的蛋白表达水平；H. p-HER2、HER2的相对蛋白表达量；****P<0.0001，与对照组比较；##P<0.01、###P<0.001、 ####P<0.0001，与曲妥珠单抗组比较3. 讨论
ErbB-2(HER-2/neu)是一种分子量为1.85×105的穿膜受体络氨酸激酶，属于表皮生长因子受体家族[14]。该家族由4个紧密相关的络氨酸激酶（TK）受体组成：HER1(EGFR)、HER2、HER3和HER4。HER2主要是通过与家族中的其他成员形成同源或异源二聚体，激活下游的RAS/MAPK和磷脂酰肌醇-3/激酶（PI3K）/ATK信号通路，进而促进细胞增殖、迁移、血管生成以及抑制细胞的凋亡[15-16]。ERK/MAPK通路是参与细胞增殖控制的主要细胞内信号通路之一。 PI3K/ATK信号通路在控制Her-2/neu过表达细胞的生长和转化表型中起重要作用[17-18]。HER2过表达的癌症表现出较强的转移能力和浸润能力，对化疗敏感性差，且易复发。
曲妥珠单抗是一株靶向HER2的人源化单克隆抗体。1998年，被美国食品药品监督管理局（FDA）批准应用于治疗HER2阳性的转移性乳腺癌[19]。曲妥珠单抗可能通过下调HER2受体在细胞膜上的表达，阻断HER2和HER3形成异源二聚体从而抑制下游通路，导致细胞周期阻滞，以及抗体依赖的细胞介导的细胞毒性活性[20]等。虽然曲妥珠单抗单药治疗起到了一定的效果, 但大部分HER2过表达的乳腺癌患者对曲妥珠单抗治疗不产生反应，初次治疗有效率大约在30%, 即使对曲妥珠单抗产生反应的患者也有约50%会在1年内发生耐药。
茶多酚可以抑制多种与细胞增殖和肿瘤进展相关的酶活性。EGCG是茶多酚中的主要成分之一。研究显示，在人A431表皮样癌细胞中，EGCG可能通过阻断EGF与其受体的结合进而抑制EGFR活性[21]。EGCG能抑制结肠癌细胞中EGFR、HER2、HER3的激活，并抑制细胞生长[22]。
为了进一步提高HER2靶向治疗疗效，在本研究中我们探讨了曲妥珠单抗和EGCG在乳腺癌细胞的联合抗肿瘤作用。实验结果发现EGCG与曲妥珠单抗在一定浓度范围内可以协同抑制HER2过表达乳腺癌细胞的生长，提示临床治疗中如果利用EGCG和曲妥珠单抗联合治疗则需重点关注两者各自的剂量。可以先利用乳腺癌荷瘤小鼠模型对不同剂量的EGCG和曲妥珠单抗的联合抗肿瘤作用进行评价，并参考动物体内药效实验的结果进行EGCG和曲妥珠单抗联合用药临床试验的设计，通过临床试验的结果确定临床治疗时最佳的联合用药剂量。
本研究还对EGCG和曲妥珠单抗的联合抗肿瘤作用机制进行了阐明：与EGCG和曲妥珠单抗单药组相比，EGCG与曲妥珠单抗联用可进一步显著降低BT474细胞中p-EGFR、p-HER2和p-Akt、p-MAPK的表达，提示EGCG和曲妥珠单抗联用对HER2过表达乳腺癌细胞的协同增殖抑制活性可能与其显著增强的对Akt和MAPK信号通路的抑制作用有关。本研究为EGCG与曲妥珠单抗的联合应用提供了理论支持，并为HER2过表达乳腺癌的治疗提供新的思路。
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表 1 右美托咪定在人血浆中的精密度和准确度(n=5)
浓度(ng/ml) 日内 日间 实测浓度（pg/ml） 精密度(%) 准确度(%) 实测浓度（pg/ml） 精密度(%) 准确度(%) 0.05 52.78±3.12 5.9 105.6 51.13±2.97 5.8 102.2 0.50 455.84±13.30 2.9 91.2 455.82±10.04 2.2 91.2 5.00 4939.46±33.17 0.7 98.8 4970.33±144.57 2.9 99.4 
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表 2 待测物基质效应和提取回收率(n=5)
待测物 浓度(ng/ml) 提取回收率(%) 基质效应(%) 右美托咪定 0.05 87.7±s7.1 95.6±6.1 0.50 90.5±5.4 94.3±8.3 5.00 93.1±4.2 91.2±7.9 内标 10.00 85.5±6.8 94.5±6.6
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表 3 患者静脉推注右美托咪定后的平均药动学参数
参数 对照组 阻塞性黄疸组 P值 cmax (ng/ml) 2.43±0.39 3.97±1.00 <0.01 tmax (t/min) 8.13±2.59 7.91±3.02 NS t1/2 (t/min) 146.72±82.28 135.10±49.92 NS CLz/F (ml∙min−1∙kg−1) 10.20±2.34 6.10±1.05 <0.001 AUC(0-t) (ng∙min∙ml−1) 77.70±15.15 139.16±40.59 <0.005 AUC(0-∞) (ng∙min∙ml−1) 101.94±19.68 169.58±36.62 <0.001 AUMC(0-∞)(ng∙min2∙ml−1) 19 068.07±12619.6 27 436.85±10 299.48 NS Vz(ml/kg) 2 072.09±904.67 1 199.87±454.79 <0.05 MRT(0-∞) (t/min) 172.4±86.81 159.96±60.01 NS 注：cmax：血峰浓度，tmax：达峰时间，t1/2：半衰期，CLz/F：清除率，AUC(0-t)：药时曲线面积(0-t)，AUC(0-∞)：药时曲线面积(0-∞)，AUMC(0-∞)：一阶药时曲线面积(0-∞)，Vz：表观分布容积，MRT(0-∞)：平均驻留时间。
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