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舒痔洗液是惠州市中医医院肛肠科主任医师根据中医理论为指导化裁组方获得的经验方，已经在临床应用近10年，获得了很好的临床疗效与口碑。广东处于岭南之地，患者多为脾虚体质，脾虚易生湿，故根据岭南本地的气候特性，惠州市中医医院肛肠科专家自拟“舒痔洗液”方，以清热祛湿止痛类药物为主组成复方，方中重用蒲公英清热解毒、利湿通淋，为君药，辅以黄柏、虎杖助清泄下焦湿热，散瘀止痛；生地黄清热凉血、清血分热，两者相合，共成清热凉血，解毒利湿之效。秦艽、苦参祛风除湿止痛；冰片清热止痛，诸药合用，药证相合，共奏清热祛湿、消肿止痛之效，为治疗混合痔之良方。
由于方中药材较多、成分复杂多样，饮片的来源产地、采收时间、炮制等都会影响方中的化学成分从而影响成型制剂的质量，并且制剂的生产过程涉及提取、浓缩、纯化、成型等多个工艺单元，检验和测定其中的指标性成分以确保标准化生产，可以减少制剂批间质量差异。为了较为全面地确认方中化学成分的种类和数量以确保制剂的质量相对一致，使用指纹图谱这种灵敏性、专一性和整体性强的质量控制方法来对舒痔洗液的质量进行控制[1]。指纹图谱的分析方法目前以色谱法[2-3]最为常用，一般首选HPLC法，对含生物碱、蒽醌、黄酮、有机酸、酚类、木脂素等成分的中药均可采用，为制剂的指纹图谱评价及其质量控制提供足够的信息。
因此，本研究采用HPLC法建立舒痔洗液的指纹图谱，并测定方中槐果碱、马钱苷酸、绿原酸、龙胆苦苷、咖啡酸、黄柏碱、虎杖苷、菊苣酸、大黄素-8-O-葡萄糖的含量，从定性和定量两方面控制该方的质量，同时使用化学模式分析方法评价不同批次舒痔洗液的质量，为该方后续的制剂研究提供质量标准参考依据。
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LC-2030 Plus高效液相色谱仪（日本岛津公司）；SHZ-Ⅱ型循环水真空泵（上海亚荣生化仪器厂），RE-52A旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂），TC-15套式恒温器（海宁市新华医疗器械厂），PT-104/35S型电子分析天平（福州华志科学仪器有限公司），G-060S型超声波清洗机（深圳市歌能炉制造厂），HH-6型数显恒温水浴锅（常州智博瑞仪器制造有限公司），Direct-DSUV/超纯水一体化系统[默克化工技术（上海）有限公司]。
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舒痔洗液中各单味饮片的来源信息见表1，基于药材收集进度、道地药材产区、质量特性、方便生产4个方面选择不同产地和批次的饮片，各饮片经广州中医药大学惠州医院（惠州中医医院）陈国珍主任中药师鉴定均为真品，且符合2020年版《中国药典》相关项下规定；以从源头上减少因药材变异带来的批间差异，为后续舒痔洗液指纹图谱的建立提供可靠、均一的样品。槐果碱（批号：AFCB1310）、马钱苷酸（批号：AZEB1908）、绿原酸（批号：AFDE1405）、龙胆苦苷（批号：AZ22011365）、黄柏碱（批号：AFBH0801）、咖啡酸（批号：AFCC1051）、虎杖苷（批号：AFBL0754）、菊苣酸（批号：AFCF1203）、大黄素-8-O-葡萄糖苷（批号：AZDC1309）购自成都埃法生物科技有限公司，纯度皆为98%。色谱级磷酸（批号：C15207458）、色谱级冰乙酸（批号：C16081186）、色谱级异丙醇（批号：C14851872）购自麦克林科技股份有限公司，色谱级甲酸（批号：E2431181）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，色谱级乙腈（批号：JA144730）、色谱级甲醇（批号：I1338907416）购自默克科技股份有限公司，甲醇（批号：
20231113 ）购自广东光华科技有限公司，超纯水，实验室制备的舒痔洗液（批次：25051501 ，25051502 ，25052003 ，25052704 ，25051505 ，25052706 ，25052607 ，25052608 ，25052009 ，25052610 ，依次编号为S1-S10；25121601 ，25121602 ，25122203 ，25122204 ，25091805 ，25122206 ，依次编号为S11-S16，S11-S16批次所使用饮片为S1批次使用的饮片）。表 1 10批舒痔洗液中各单味饮片的来源信息
编号 蒲公英 虎杖 苦参 地黄 黄柏 秦艽 冰片 产地 批号 产地 批号 产地 批号 产地 批号 产地 批号 产地 批号 产地 批号 S1 安徽 230202 湖北 221201 广西 221201 河南 230301 四川 221102 内蒙古 230301 福建 230614 S2 江苏 2411001 湖北 240401 辽宁 240701 河南 2409044 四川 202406505-2 四川 241101 福建 240409 S3 甘肃 202407501-4 湖北 240201 广西 240601 河南 240701 四川 2412050 内蒙古 240901 福建 230614 S4 甘肃 2408001 湖北 240701 陕西 C22056101 河南 2407300582 四川 221102 内蒙古 230301 福建 240409 S5 江苏 2409001 湖北 240901 辽宁 240901 河南 240601 四川 202406505-2 四川 241101 福建 230614 S6 江苏 202404532-1 湖北 240601 辽宁 250101 河南 2406140072 贵州 C24012601 四川 240501 福建 230614 S7 甘肃 2408001 湖北 230502 辽宁 240801 山西 20240301 四川 221102 四川 241101 福建 230614 S8 江苏 202406524-2 浙江 C23031301 辽宁 240901 山西 20241201 四川 2412050 云南 C24006001 福建 240409 S9 江苏 2503001 湖北 241201 辽宁 241101 河南 2412024 四川 2411002 四川 240501 福建 240409 S10 甘肃 C24019201 湖北 240901 辽宁 240801 河南 C23031905 四川 2412050 内蒙古 230301 福建 240409 -
色谱柱为Shim-pack GIST C18（150 mm×4.6 mm, 5 μm）色谱柱；流动相为0.2%磷酸水（A）和乙腈（B），洗脱梯度为1~3 min，5 %~6 %B；3~20 min，6 %~12 %B；20~30 min，12 %~15 %B；30~40 min，15 %~20 %B；40~50 min，20 %~25 %B；50~60 min，25 %~30 %B；60~70 min，30 %~5 %B；70~80 min，5 %B；检测波长为210 nm；流速为0.6 ml/min；柱温为30℃；进样量为10 μl。
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精密吸取舒痔洗液2 ml于10 ml的量瓶中，加甲醇适量，超声（功率360 W，频率40 kHz）10 min，放冷后定容至刻度，混匀，6 500 r/min离心10 min，取上清液过0.22 μm的微孔滤膜，取续滤液即得。
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分别精密称取槐果碱、马钱苷酸、绿原酸、龙胆苦苷、咖啡酸、黄柏碱、虎杖苷、菊苣酸、大黄素-8-O-葡萄糖苷对照品适量，加甲醇制成浓度分别为289.30、508.23、253.82、880.24、68.40、92.51、202.66、239.90、148.76 μg/ml的混合对照品溶液。
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取蒲公英、虎杖、苦参、地黄、黄柏、秦艽单味饮片处方量，按处方工艺制备方法，分别制成该处方的单味药样品，并按照“2.2.1”项下供试品溶液制备方法制成蒲公英、虎杖、苦参、地黄、黄柏、秦艽单味对照药材溶液。
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按照舒痔洗液处方工艺制备方法取表1 S9批药材制备蒲公英、虎杖、苦参、黄柏、秦艽的阴性样品，并按“2.2.1”项下供试品溶液制备方法制成蒲公英、虎杖、苦参、黄柏、秦艽阴性溶液，即得。
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选取在各批次样品中稳定存在，保留时间和峰面积大小适中，且与相邻色谱峰之间有较好分离度的色谱峰龙胆苦苷（12号峰）作为参照峰，其分离度>1.50，拖尾因子在0.95~1.05范围内。
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吸取供试品溶液（S9），按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，计算得到各共有峰相对保留时间RSD值均小于0.15 %（n=6），相对峰面积RSD值均小于1.67 %（n=6），表明所用仪器和实验方法精密度良好。
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吸取供试品溶液（S9），分别于0、2、4、8、12、24 h，按“2.1”项下色谱条件测定，结果各共有峰相对保留时间RSD值均小于0.09 %（n=6），相对峰面积RSD值均小于2.87 %（n=6），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
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分别精密吸取2 ml舒痔洗液样品（S9）6份，按“2.2.1”项下方法制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，各共有峰相对保留时间RSD值均小于0.13 %（n=6），相对峰面积RSD值均小于1.91 %（n=6），表明建立的方法重复性良好。
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精密吸取2 ml16批舒痔洗液样品（S1-S16），按“2.2.1”项下方法制备，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，得到16批舒痔洗液样品的液相色谱图，再导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版）进行拟合，以S1为参照图谱，时间窗宽度设为0.1，采用中位数法，经多点校正和Mark匹配模式进行比较[4-5]，建立16批舒痔洗液样品的HPLC叠加图谱（S1-S16）及对照图谱（R），共标记25个共有峰，见图1。16批样品与对照图谱相似度评价结果见表2，16批舒痔洗液样品相似度良好，表明在定性方面各批次样品特征峰稳定。
图 1 16批舒痔洗液样品的 HPLC指纹图谱（S1-S16）和对照指纹图谱（R）
表 2 16批舒痔洗液指纹图谱相似度评价结果
编号 相似度 编号 相似度 S1 0.992 S9 0.983 S2 0.986 S10 0.967 S3 0.989 S11 0.994 S4 0.985 S12 0.991 S5 0.976 S13 0.989 S6 0.980 S14 0.991 S7 0.987 S15 0.987 S8 0.983 S16 0.988 -
分别取“2.2”项下的供试品溶液、混合对照品溶液、单味对照药材溶液和甲醇溶剂空白溶液按照“2.1”项下色谱条件进行测定。通过比较各色谱图的各色谱峰的相对保留时间，确定了舒痔洗液中25个共有峰在相关药材中的归属，结果见图2。1、5、8、9、11、13、20号峰归属于蒲公英，2、19、21、22、24、25号峰归属于虎杖，2、3、4、6、8、19、21、23号峰归属于苦参，11、14、15、16、17、18号峰归属于黄柏，1、16号峰归属于地黄，1、7、8、10、12号峰归属于秦艽。通过供试品溶液、混合对照品溶液保留时间及其色谱图对比，结合蒲公英单味对照药材确定11号峰为绿原酸，13号峰为咖啡酸，20号峰为菊苣酸；结合虎杖单味对照药材确定19号峰为虎杖苷，25号峰为大黄素-8-O-葡萄糖苷；结合苦参单味对照药材确定4号峰为槐果碱；结合黄柏单味对照药材确定11号峰为绿原酸，14号峰为黄柏碱；结合秦艽单味对照药材确定7号峰为马钱苷酸，12号峰为龙胆苦苷。
图 2 舒痔洗液单味药材 HPLC 图
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以16批舒痔洗液25个共有峰的峰面积为变量，经SPSS27.0软件采用ward法进行聚类分析，结果见图3。d=10时，16批样品可聚为两类，S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10为一类，S1、S11、S12、S13、S14、S15、S16为一类。
图 3 聚类分析图
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以16批舒痔洗液25个共有峰的峰面积为变量，运用SIMCA 14. 1软件进行分析，得到PCA得分图（图4）。结果16批舒痔洗液样品可分为2类，与聚类分析结果基本一致。同时采用SPSS27.0软件进行主成分分析，得到5个主成分，其累计方差贡献率为89.70%（表3），表明这5个主成分因子可代表舒痔洗液的25个共有峰的基本特征与绝大部分信息。成分载荷矩阵（表4）反映5个主成分与25个共有峰原始变量的相关系数，载荷的绝对值越大，对主成分的贡献越大，越能反映相应峰的信息。其中，峰3、4（槐果碱），7（马钱苷酸），9、13（咖啡酸），14（黄柏碱），15、16、18、20（菊苣酸），21，22，24载荷绝对值在0.799~0.974范围内，对主成分1贡献较大；峰11（绿原酸）载荷绝对值为0.930，对主成分2贡献较大；峰2载荷绝对值为0.741，对主成分3贡献较大；峰8载荷绝对值为0.659，对主成分4贡献较大；峰25（大黄素8-O-葡萄糖苷）载荷绝对值为0.529，对主成分5贡献较大；表明样品质量差异性由多个主成分共同影响，可推测槐果碱、马钱苷酸、黄柏碱、绿原酸、咖啡酸、菊苣酸、大黄素8-O-葡萄糖苷等7个已指认出的成分对样品品质有明显的影响，可为舒痔洗液质量评价选用含量测定成分提供参考依据。
图 4 16批舒痔洗液样品的PCA得分图
表 3 16批舒痔洗液样品指纹图谱PCA特征值及方差贡献率
成分 特征值 方差贡献率（%） 累积方差贡献率（%） 1 14.780 59.121 59.121 2 3.297 13.188 72.309 3 1.866 7.466 79.774 4 1.461 5.843 85.617 5 1.021 4.085 89.702 表 4 16批舒痔洗液样品指纹图谱共有峰PCA成分载荷矩阵
共有峰 成分1 成分2 成分3 成分4 成分5 峰1 −0.740 −0.048 0.018 0.372 0.335 峰2 0.203 0.333 −0.741 −0.042 0.442 峰3 0.883 −0.361 −0.069 −0.061 −0.209 峰4（槐果碱） 0.938 0.206 −0.010 0.059 −0.085 峰5 0.169 0.547 0.568 −0.209 −0.018 峰6 0.854 −0.309 −0.351 0.146 −0.115 峰7（马钱苷酸） 0.890 0.082 −0.184 0.136 −0.132 峰8 0.501 0.302 0.349 0.659 −0.163 峰9 0.799 0.353 0.327 −0.127 −0.062 峰10 0.720 −0.323 −0.446 −0.022 −0.047 峰11（绿原酸） 0.190 0.930 −0.146 −0.055 0.186 峰12（龙胆苦苷） 0.777 0.066 −0.343 0.449 −0.121 峰13（咖啡酸） 0.963 0.027 −0.019 −0.061 −0.110 峰14（黄柏碱） 0.823 0.219 0.051 −0.323 0.102 峰15 0.875 0.250 −0.025 0.093 0.040 峰16 0.816 0.488 0.028 −0.001 0.133 峰17 0.750 0.514 −0.079 −0.134 −0.057 峰18 0.833 −0.435 0.161 −0.009 −0.106 峰19（虎杖苷） 0.735 −0.419 0.278 0.021 0.272 峰20（菊苣酸） 0.970 −0.070 0.064 −0.117 0.032 峰21 0.910 −0.302 0.114 0.027 −0.027 峰22 0.886 −0.169 0.203 0.001 0.265 峰23 0.530 −0.492 0.039 −0.496 0.262 峰24 0.974 0.061 −0.060 −0.031 −0.002 峰25（大黄素-8-O−葡萄糖苷） 0.564 −0.268 0.297 0.421 0.529 -
将25个共有峰峰面积导入SIMCA14.1中进行正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）。结果显示，评价OPLS-DA的3个指标：模型拟合参数R2X=0.704，R2Y=0.985，模型预测参数Q2 =0.968，均>0.5，表明此模型稳定、预测能力较强。对该模型进行200次置换检验，见图5；R2在Y轴的截距为0.402，Q2在轴的截距为-0.553，且Q2为负值，表明该模型不存在过拟合，模型验证有效，认为该结果可用于舒痔洗液样品的判别分析。采用VIP法，筛选出舒痔洗液的差异标志物（VIP>1且误差线不超过原点），见图6；共找到14个标志性成分（图中红色部分），VIP值由大到小依次是：24号峰>20号峰（菊苣酸）>13号峰（咖啡酸）>3号峰>21号峰>4号峰（槐果碱）>6号峰>7号峰（马钱苷酸）>22号峰>18号峰>15号峰>16号峰>9号峰>14号峰（黄柏碱），VIP值越大，成分对样品分类贡献越大。结果显示，16批样品分类情况与CA、PCA一致，且VIP值大于1的14个标志性成分与主成分分析中主成分1得出的代表峰高度重合。根据峰归属情况，发现这些差异峰为各药材的特征峰和主要贡献峰，其中峰9、13（咖啡酸）、20（菊苣酸）归属于蒲公英；峰21、22、24归属于虎杖；峰3、4（槐果碱）、6归属于苦参；峰14（黄柏碱）、15、16、18归属于黄柏；峰7（马钱苷酸）归属于秦艽，提示在后续研究和产品生产中应重点控制蒲公英、虎杖、苦参、秦艽、黄柏药材质量。
图 5 16批舒痔洗液OPLS-DA的200次置换检验图
图 6 16批舒痔洗液中25个共有峰的VIP 值
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取“2.2”项下的供试品溶液、混合对照品溶液、甲醇溶剂空白溶液和阴性样品溶液，按“2.1”项下液相色谱条件进样测定，结果见图7，210 nm检测波长下，空白溶剂基线平整无干扰峰，供试品色谱显示目标成分峰槐果碱、马钱苷酸、绿原酸、龙胆苦苷、咖啡酸、黄柏碱、虎杖苷、菊苣酸、大黄素-8-O-葡萄糖，对照品色谱与供试品色谱目标成分峰出峰时间相同，也无其他色谱峰干扰，阴性对照色谱中目标成分峰相同出峰时间无其他色谱峰干扰，表明该方法专属性较好。
图 7 舒痔洗液专属性试验HPLC图（210 nm）
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取“2.2”项下混合对照品溶液，分别精密吸取0.25、0.5、1、2、4、6、10 ml溶液于10 ml量瓶，用甲醇稀释定容成系列质量浓度的溶液，按 “2.1”项下色谱条件进样测定，以对照品实际进样量（μg/ml）为横坐标（X）、峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归分析，结果见表5。
表 5 舒痔洗液中各成分线性关系考察结果
成分 回归方程 r 线性范围（μg/ml） 槐果碱 Y=23 577.0X+24 061.0 0.999 6 7.23~289.30 马钱苷酸 Y=5 801.7X+9 179.3 0.999 4 12.71~508.23 绿原酸 Y=33 600.0X -10 113.0 0.999 6 6.35~253.82 龙胆苦苷 Y=17 506.0X +21 040.0 0.999 6 22.01~880.24 咖啡酸 Y=55 006.0X+9 904.5 0.999 5 1.71~68.40 黄柏碱 Y=157 814.0X+122 147.0 0.999 1 2.31~92.51 虎杖苷 Y=50 437.0X+10 036.0 0.999 5 5.07~202.66 菊苣酸 Y =44 553.0X - 423 360.0 0.999 1 6.00~239.90 大黄素-8-O-葡萄糖苷 Y=55 075.0X+32 963.0 0.999 4 3.72~148.76 -
精密吸取“2.2.2”项下混合对照品溶液稀释，在“2.1”项下色谱条件连续进样6次，9个成分峰面积RSD值为0.18%、0.32%、0.49%、0.34%、0.70%、0.39%、0.36%、0.33%、0.42%（n=6），表明该仪器精密度良好。
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分别精密吸取2 ml舒痔洗液样品（S9）6份，按 “2.2.1”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1” 项下色谱条件进样测定，9个成分平均含量分别为400.66、971.54、423.27、1 764.98、100.18、144.25、382.03、237.44、339.87 μg/ml，RSD值为0.64%、0.46%、0.65%、0.62%、1.34%、0.60%、0.90%、1.12%、1.21%（n=6），表明该方法重复性良好。
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精密吸取2 ml舒痔洗液样品（S9），按 “2.2.1”项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h，按“2.1”项下色谱条件进样测定，9个成分峰面积RSD值为1.00%、0.40%、0.87%、0.84%、1.57%、0.86%、0.79%、1.04%、1.47%（n=6），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
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精密称定对照品，按“2.2.2溶液制备”项下方法制备混合对照品溶液，单独精密称定菊苣酸对照品，加入甲醇溶解定容得菊苣酸对照品溶液；分别精密吸取1 ml舒痔洗液样品（S9）6份，分别加入以上相应的混合对照品溶液和菊苣酸对照品溶液；按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，“2.1”项下色谱条件进样测定，槐果碱、马钱苷酸、绿原酸、龙胆苦苷、咖啡酸、黄柏碱、虎杖苷、菊苣酸、大黄素-8-O-葡萄糖苷的平均加样回收率分别为103.34%、96.44%、102.31%、99.28%、104.39%、101.85%、97.97%、97.52%、100.80%，RSD值为2.75%、2.96%、2.78%、2.66%、2.75%、2.54%、2.71%、2.25%、2.88%（n=6）。结果符合2020版《中国药典》中RSD值≤3%、回收率在90%~108%的相关规定。
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分别精密吸取2 ml 16批舒痔洗液样品（样品S1~S16），按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项下色谱条件进样测定，结果见表6。
表 6 舒痔洗液各组分含量测定结果（μg/ml）
编号 槐果碱 马钱苷酸 绿原酸 龙胆苦苷 咖啡酸 黄柏碱 虎杖苷 菊苣酸 大黄素-8-O-葡萄糖苷 S1 520.27 1 392.01 438.65 1 856.07 179.86 150.37 423.91 701.20 317.27 S2 366.37 1 044.18 469.46 1 652.94 116.32 131.16 342.27 349.98 195.85 S3 382.81 1 044.20 457.76 1 650.74 95.12 134.29 365.48 358.92 305.83 S4 316.59 1 010.88 355.51 1 545.37 114.03 88.52 406.99 385.37 256.04 S5 426.91 1 292.14 578.20 1 724.79 123.56 123.76 254.43 334.47 262.65 S6 415.31 1 266.76 455.50 1 817.66 110.30 80.85 278.39 308.18 216.93 S7 387.99 1 109.04 382.03 1 730.48 101.78 91.42 473.30 430.08 328.64 S8 401.24 1 071.85 533.09 1 622.31 104.74 125.05 479.63 468.19 331.55 S9 403.00 976.59 427.92 1 783.56 102.09 100.54 389.73 301.61 329.72 S10 347.11 1 236.64 467.10 1 908.73 93.93 76.81 372.11 312.89 292.16 S11 490.66 1 279.25 429.66 1 810.72 156.85 137.95 529.86 675.38 329.24 S12 488.68 1 272.44 427.70 1 804.23 156.92 136.73 528.55 675.16 336.72 S13 483.75 1 263.80 424.51 1 790.32 155.30 136.01 525.65 670.63 338.85 S14 539.87 1 390.25 477.22 1 925.86 180.56 149.37 490.54 679.45 318.04 S15 546.00 1 407.60 484.27 1 942.61 183.99 151.27 496.65 695.45 332.65 S16 536.06 1 386.51 476.90 1 911.16 181.76 148.95 489.35 687.23 336.02 -
对舒痔洗液色谱条件的测定波长、色谱柱、流动相及流速进行系统考察[6-7]。大多数成分在波长210 nm下吸收值较大，且分离效果及峰形好，阴性对照无干扰；故选择波长210 nm进行测定。色谱柱对比考察Waters T3柱（250 mm×4.6 mm, 2.5 μm）、Agilent ZORBAX SB-C18柱（250 mm×4.6 mm, 5 μm）与Shim-pack GIST C18柱（150 mm×4.6 mm, 5 μm），Agilent色谱柱色谱峰最少，Waters色谱柱虽色谱峰数目多，但杂峰较多且多数色谱峰的分离度、拖尾因子均差于岛津色谱柱，岛津色谱柱虽色谱峰数略少，但吸收较强的色谱峰分离度、拖尾因子均符合检测要求，最终选择Shim-pack GIST C18柱（150 mm×4.6 mm, 5 μm）为分析色谱柱。流动相分别考察0.1%甲酸水-乙腈、0.1%冰乙酸水-乙腈、0.1%磷酸水-甲醇、0.1%磷酸水-乙腈和0.2%磷酸水-乙腈体系，0.1%甲酸水-乙腈和0.1%冰乙酸水-乙腈体系下谱图基线漂移不稳且局部起伏；0.1%磷酸水-甲醇体系下色谱峰数目最少；0.2%磷酸水-乙腈较0.1%磷酸水-乙腈色谱峰数目更多、分离效果更好；因此选择0.2%磷酸水-乙腈为流动相。流速依次考察1.0、0.8、0.6 ml/min，流速过快时，槐果碱与2、3号峰，龙胆苦苷与咖啡酸不能分离，0.6 ml/min时各待测成分无阴性干扰，且分离度、拖尾因子均在合格范围内，故确定0.6 ml/min为检测流速。
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本研究综合运用指纹图谱、CA、PCA、OPLS-DA以及多指标成分含量测定方法，对16批舒痔洗液开展系统质量评价。16批样品指纹图谱、化学模式分析、多指标成分含量测定分析结果具有一致性，各结果相互印证，表明使用以上研究方法对16批样品进行质量评价较为可靠。采用HPLC建立舒痔洗液的指纹图谱，在210 nm下共匹配出25个共有峰，其中指认了9个化学成分。16批样品的相似度均大于0.96，说明各批次样品间所含成分种类差异不明显。
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进一步基于指纹图谱共有峰峰面积进行化学模式分析，3种化学模式分析方法结果具有一致性。PCA共提取5个主成分，累计方差贡献率达89.70%，可全面反映样品质量特征，进一步佐证了16批舒痔洗液批次间成分含量具有差异。OPLS-DA筛选出VIP值大于1的批次间差异标志物菊苣酸、咖啡酸、马钱苷酸、槐果碱、黄柏碱主要来源于蒲公英、黄柏、苦参、秦艽4种药材，提示应重点关注上述药材的质量。
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通过PCA分析和OPLS-DA分析结合VIP值大于1进行筛选，确定了菊苣酸、咖啡酸、马钱苷酸、槐果碱、黄柏碱5个关键指标性成分，提示其可能是导致批次间质量波动的潜在关键差异质量标志物，因此5个关键指标性成分可作为舒痔洗液的部分含量测定分析指标。根据《中国药典》各药材含量测定项和组方“君臣佐使”原则，虎杖苷和龙胆苦苷分别可为臣药虎杖和佐药秦艽的含量测定指标性成分。已有研究显示，虎杖煎液和虎杖苷抗炎、减轻组织水肿、镇痛、改善微循环等药理作用在防治混合痔和混合痔术后并发症作用明显[8-11]。秦艽中环烯醚萜类成分包括龙胆苦苷具有抗炎的药理作用，可抑制炎症介质[12-13]。同时，绿原酸作为黄柏特征性酚酸类成分也有强大的抗炎作用，能调节炎症介质和炎症相关的信号通路，也能直接杀灭或抑制肛周常见致病菌，阻断感染性炎症的恶性循环[14]。大黄素-8-O-葡萄糖是虎杖饮片主要的活性成分之一，有一定的抗炎活性[15]。鉴于上述成分的药理作用及其在方剂中的整体性，本研究增加虎杖苷、龙胆苦苷、绿原酸和大黄素-8-O-葡萄糖4个成分作为其余含量测定指标性成分。
在HPLC指纹图谱和化学计量学基础上兼顾中药组方“君臣佐使”原则和药材各成分药理作用与舒痔洗液适应症的关联性，选择君药蒲公英中菊苣酸、咖啡酸，臣药虎杖中虎杖苷、大黄素-8-O-葡萄糖苷，黄柏中黄柏碱、绿原酸以及苦参中槐果碱，以及佐药秦艽中龙胆苦苷、马钱苷酸进行含量测定，16批舒痔洗液间9个成分的含量差异较显著。含量结果显示，S15、S11、S1、S14、S12、S13和S16批次中9个成分含量相对其他批次均较高，与CA分析结果一致。通过分别计算这9个成分与其对应成分总含量平均值的偏差率得知，菊苣酸、咖啡酸、黄柏碱、虎杖苷、槐果碱、马钱苷酸偏差最大，可能与生产工艺或蒲公英、虎杖、黄柏、苦参、秦艽药材质量有关；以上含量偏差率较大的成分和所属药材与PCA、OPLS-DA分析筛选的指标性成分和所属药材一致。
16批舒痔洗液呈现显著聚类现象和化学成分含量差异，客观地反映各批次样品在关键成分上的差异性表现，表明原药材质量可能是影响产品批次间各成分含量差异的主要因素。同一批次的药材制备的不同批次产品（S15、S11、S1、S14、S12、S13和S16）各关键性成分含量有差异，表明制备生产、实验操作过程等可能对产品有影响。总的来说，16批舒痔洗液质量差异可能源于多方面因素：生产厂家、产地、采收季节、炮制方法与储存条件不同会使原药材质量产生差异；制备工艺中煎煮、浓缩、纯化等环节参数不稳定也会影响产品质量；此外人为操作不规范可能会引起误差；环境温湿度变化可能会导致有效成分分解。因此，在后续工作中应固定药材来源和产地，优化并标准化生产工艺，加强产品稳定性研究，同时结合指纹图谱、化学计量学与含量测定等现代质量控制技术，构建完善的质量控制体系，确保舒痔洗液质量稳定可控。
综上所述，本研究建立了指纹图谱和9个成分的含量测定方法，通过化学模式识别挖掘指纹图谱中的数据信息，可有效评价舒痔洗液整体质量情况，为舒痔洗液的质量控制以及后续的制剂开发提供参考依据。此外，指纹图谱研究指认了部分可能影响舒痔洗液质量差异的关键成分，还有一些影响舒痔洗液质量的色谱峰（24号峰、3号峰、21号峰、6号峰、22号峰、18号峰、15号峰、16号峰、9号峰）未被指认出，后续将通过LC-MS进一步检测，为舒痔洗液质量控制提供更完整、科学的依据。
Quality evaluation and 9 components determination of Shuzhi Lotion based on HPLC fingerprint and chemometrics
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摘要:
目的 控制舒痔洗液整体质量，提升质量标准。 方法 采用HPLC法建立16批样品的色谱图并使用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》对其进行相似度评价。使用SPSS 27. 0软件和SIMCA 14. 1软件对16批色谱图峰面积进行化学模式分析，筛选指标性成分，并采用HPLC法测定样品中指标性成分的含量，对16批舒痔洗液进行质量差异性评价。 结果 16批样品与对照图谱的相似度为0.967~0.994；标定25个共有峰，指认出9个色谱峰。聚类分析与主成分分析均可将16批样品分为2类；主成分分析得到5个主成分，累计方差贡献率为89.70%；正交偏最小二乘-判别分析筛选出5个指标性成分，分别为菊苣酸、咖啡酸、马钱苷酸、槐果碱、黄柏碱。建立舒痔洗液9个指标性成分含量的测定方法，精密度、重复性、稳定性试验的RSD值均小于3%，加样回收率在96.44%～104.39%范围内，RSD值均小于2.96%。16批样品中槐果碱、马钱苷酸、绿原酸、龙胆苦苷、咖啡酸、黄柏碱、虎杖苷、菊苣酸、大黄素-8-O-葡萄糖的含量分别为316.59～546.00、976.59～1 407.60、355.51～578.20、1 545.37～1 943.61、93.93～183.99、76.81～151.27、254.43～529.86、301.61～701.20、195.85～338.85μg/ml。 结论 该研究中所建方法结果准确，稳定可靠，可全面有效评价舒痔洗液质量。 Abstract:Objective To control the overall quality and improve the quality standard of Shuzhi Lotion. Methods The chromatograms of 16 batches of samples were established by HPLC. The similarity evaluation of HPLC fingerprints for 16 batches of Shuzhi Lotion was performed by the Similarity Evaluation System of Chromatographic Fingerprint of Traditional Chinese Medicine （2012 edition）. SPSS27.0 and SIMCA14.1 data analysis software were used to perform the chemical pattern recognition to screen the key components. The content of key components was determined by HPLC to evaluate the quality difference of different batches of Shuzhi Lotion. Results The similarity between 16 batches of samples and the control map ranged from 0.967-0.994. 25 common peaks were calibrated, and 9 chromatographic peaks were identified. Both cluster analysis and principal component analysis could classify 16 batches of samples into two categories; five principal components were obtained by principal component analysis, and their cumulative variance contribution rate was 89.70%;five index components were screened by orthogonal partial least squares discriminant analysis （OPLS-DA）, which were sophocarpine, loganic acid, caffeic acid, phellodendrine, chicoric acid. A method for the determination of 9 index components in Shuzhi Lotion was established. RSDs of precision, repeatability and stability tests were less than 3%. The recoveries were in the range of 96.44%-104.39%, and the RSD values were less than 2.96%. The contents of sophocarpine, loganic acid, chlorogenic acid, gentiopicroside, caffeic acid, phellodendrine, polydatin, chicoric acid and emodin-8-O-glucose were 316.59-546.00、976.59-1 407.60、355.51-578.20、1 545.37-1 943.61、93.93-183.99、76.81-151.27、254.43-529.86、301.61-701.20、195.85-338.85 μg/ml, respectively. Conclusion The method established in this study was accurate, stable and reliable, which could comprehensively and effectively evaluate the quality of Shuzhi Lotion. -
Key words:
- Shuzhi Lotion /
- HPLC fingerprint /
- content determination /
- chicoric acid /
- polydatin /
- sophocarpine
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图 2 舒痔洗液单味药材 HPLC 图
4.槐果碱；7.马钱苷酸；11.绿原酸；12.龙胆苦苷；13.咖啡酸；14.黄柏碱；19.虎杖苷；20.菊苣酸；25.大黄素-8-O-葡萄糖苷；A.供试品溶液；B.蒲公英单味对照药材溶液；C.虎杖单味对照药材溶液；D.苦参单味对照药材溶液；E.地黄单味对照药材溶液；F.黄柏单味对照药材溶液；G.秦艽单味对照药材溶液；H.混合对照品溶液；I.空白溶液
图 7 舒痔洗液专属性试验HPLC图（210 nm）
4.槐果碱；7.马钱苷酸；11.绿原酸；12.龙胆苦苷；13.咖啡酸；14.黄柏碱；19虎杖苷；20.菊苣酸；25.大黄素-8-O-葡萄糖苷；A：空白溶液；B：混合对照品；C：蒲公英阴性供试品溶液；D：虎杖阴性供试品溶液；E：苦参阴性供试品溶液；G：黄柏阴性供试品溶液；H：秦艽阴性供试品溶液；I：舒痔洗液供试品
表 1 10批舒痔洗液中各单味饮片的来源信息
编号 蒲公英 虎杖 苦参 地黄 黄柏 秦艽 冰片 产地 批号 产地 批号 产地 批号 产地 批号 产地 批号 产地 批号 产地 批号 S1 安徽 230202 湖北 221201 广西 221201 河南 230301 四川 221102 内蒙古 230301 福建 230614 S2 江苏 2411001 湖北 240401 辽宁 240701 河南 2409044 四川 202406505-2 四川 241101 福建 240409 S3 甘肃 202407501-4 湖北 240201 广西 240601 河南 240701 四川 2412050 内蒙古 240901 福建 230614 S4 甘肃 2408001 湖北 240701 陕西 C22056101 河南 2407300582 四川 221102 内蒙古 230301 福建 240409 S5 江苏 2409001 湖北 240901 辽宁 240901 河南 240601 四川 202406505-2 四川 241101 福建 230614 S6 江苏 202404532-1 湖北 240601 辽宁 250101 河南 2406140072 贵州 C24012601 四川 240501 福建 230614 S7 甘肃 2408001 湖北 230502 辽宁 240801 山西 20240301 四川 221102 四川 241101 福建 230614 S8 江苏 202406524-2 浙江 C23031301 辽宁 240901 山西 20241201 四川 2412050 云南 C24006001 福建 240409 S9 江苏 2503001 湖北 241201 辽宁 241101 河南 2412024 四川 2411002 四川 240501 福建 240409 S10 甘肃 C24019201 湖北 240901 辽宁 240801 河南 C23031905 四川 2412050 内蒙古 230301 福建 240409 
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表 2 16批舒痔洗液指纹图谱相似度评价结果
编号 相似度 编号 相似度 S1 0.992 S9 0.983 S2 0.986 S10 0.967 S3 0.989 S11 0.994 S4 0.985 S12 0.991 S5 0.976 S13 0.989 S6 0.980 S14 0.991 S7 0.987 S15 0.987 S8 0.983 S16 0.988
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表 3 16批舒痔洗液样品指纹图谱PCA特征值及方差贡献率
成分 特征值 方差贡献率（%） 累积方差贡献率（%） 1 14.780 59.121 59.121 2 3.297 13.188 72.309 3 1.866 7.466 79.774 4 1.461 5.843 85.617 5 1.021 4.085 89.702
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表 4 16批舒痔洗液样品指纹图谱共有峰PCA成分载荷矩阵
共有峰 成分1 成分2 成分3 成分4 成分5 峰1 −0.740 −0.048 0.018 0.372 0.335 峰2 0.203 0.333 −0.741 −0.042 0.442 峰3 0.883 −0.361 −0.069 −0.061 −0.209 峰4（槐果碱） 0.938 0.206 −0.010 0.059 −0.085 峰5 0.169 0.547 0.568 −0.209 −0.018 峰6 0.854 −0.309 −0.351 0.146 −0.115 峰7（马钱苷酸） 0.890 0.082 −0.184 0.136 −0.132 峰8 0.501 0.302 0.349 0.659 −0.163 峰9 0.799 0.353 0.327 −0.127 −0.062 峰10 0.720 −0.323 −0.446 −0.022 −0.047 峰11（绿原酸） 0.190 0.930 −0.146 −0.055 0.186 峰12（龙胆苦苷） 0.777 0.066 −0.343 0.449 −0.121 峰13（咖啡酸） 0.963 0.027 −0.019 −0.061 −0.110 峰14（黄柏碱） 0.823 0.219 0.051 −0.323 0.102 峰15 0.875 0.250 −0.025 0.093 0.040 峰16 0.816 0.488 0.028 −0.001 0.133 峰17 0.750 0.514 −0.079 −0.134 −0.057 峰18 0.833 −0.435 0.161 −0.009 −0.106 峰19（虎杖苷） 0.735 −0.419 0.278 0.021 0.272 峰20（菊苣酸） 0.970 −0.070 0.064 −0.117 0.032 峰21 0.910 −0.302 0.114 0.027 −0.027 峰22 0.886 −0.169 0.203 0.001 0.265 峰23 0.530 −0.492 0.039 −0.496 0.262 峰24 0.974 0.061 −0.060 −0.031 −0.002 峰25（大黄素-8-O−葡萄糖苷） 0.564 −0.268 0.297 0.421 0.529
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表 5 舒痔洗液中各成分线性关系考察结果
成分 回归方程 r 线性范围（μg/ml） 槐果碱 Y=23 577.0X+24 061.0 0.999 6 7.23~289.30 马钱苷酸 Y=5 801.7X+9 179.3 0.999 4 12.71~508.23 绿原酸 Y=33 600.0X -10 113.0 0.999 6 6.35~253.82 龙胆苦苷 Y=17 506.0X +21 040.0 0.999 6 22.01~880.24 咖啡酸 Y=55 006.0X+9 904.5 0.999 5 1.71~68.40 黄柏碱 Y=157 814.0X+122 147.0 0.999 1 2.31~92.51 虎杖苷 Y=50 437.0X+10 036.0 0.999 5 5.07~202.66 菊苣酸 Y =44 553.0X - 423 360.0 0.999 1 6.00~239.90 大黄素-8-O-葡萄糖苷 Y=55 075.0X+32 963.0 0.999 4 3.72~148.76
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表 6 舒痔洗液各组分含量测定结果（μg/ml）
编号 槐果碱 马钱苷酸 绿原酸 龙胆苦苷 咖啡酸 黄柏碱 虎杖苷 菊苣酸 大黄素-8-O-葡萄糖苷 S1 520.27 1 392.01 438.65 1 856.07 179.86 150.37 423.91 701.20 317.27 S2 366.37 1 044.18 469.46 1 652.94 116.32 131.16 342.27 349.98 195.85 S3 382.81 1 044.20 457.76 1 650.74 95.12 134.29 365.48 358.92 305.83 S4 316.59 1 010.88 355.51 1 545.37 114.03 88.52 406.99 385.37 256.04 S5 426.91 1 292.14 578.20 1 724.79 123.56 123.76 254.43 334.47 262.65 S6 415.31 1 266.76 455.50 1 817.66 110.30 80.85 278.39 308.18 216.93 S7 387.99 1 109.04 382.03 1 730.48 101.78 91.42 473.30 430.08 328.64 S8 401.24 1 071.85 533.09 1 622.31 104.74 125.05 479.63 468.19 331.55 S9 403.00 976.59 427.92 1 783.56 102.09 100.54 389.73 301.61 329.72 S10 347.11 1 236.64 467.10 1 908.73 93.93 76.81 372.11 312.89 292.16 S11 490.66 1 279.25 429.66 1 810.72 156.85 137.95 529.86 675.38 329.24 S12 488.68 1 272.44 427.70 1 804.23 156.92 136.73 528.55 675.16 336.72 S13 483.75 1 263.80 424.51 1 790.32 155.30 136.01 525.65 670.63 338.85 S14 539.87 1 390.25 477.22 1 925.86 180.56 149.37 490.54 679.45 318.04 S15 546.00 1 407.60 484.27 1 942.61 183.99 151.27 496.65 695.45 332.65 S16 536.06 1 386.51 476.90 1 911.16 181.76 148.95 489.35 687.23 336.02
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