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防暑清热饮是由广藿香、白茅根、菊花、薄荷、枸杞等药材配伍而成的中药复方制剂。方中广藿香为君药，白茅根、菊花为臣药，薄荷为佐药，枸杞为使药，诸药合用，具有芳香化湿、清热解毒、解渴生津之功效[1]。课题组前期已采用紫外分光光度法对防暑清热饮中总多糖和总黄酮进行质量控制[2]。为了更为全面地控制防暑清热饮的质量，本实验参考现有文献[3-16]，采取RP-HPLC法同时测定方中多个活性成分含量，现报道如下。
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高效液相色谱仪（AngiLent 1200型，DAD检测器，美国安捷伦科技有限公司），分析天平（AUX220，日本岛津公司）。防暑清热饮（批号：20200120，202002101，202002102，规格：100 ml/瓶，第九〇九医院药剂科），绿原酸对照品（批号：110753-200413）、3，5-O-二咖啡酰奎宁酸（批号：111782-201807）、蒙花苷（批号：111528-201710）和广藿香酮（批号：111822-201904）均购自中国食品药品检定研究院，木犀草素-7-O-β-D-葡糖苷（批号：GZDD-0115，贵州迪大生物科技有限责任公司），甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂为分析纯，水为纯化水。
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色谱柱ZORBAX-SB-C18 (250 mm ×4.6 mm，5 μm)，流动相为0.2%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱0~30 min，88%~82%A；30~45 min，82%~78%A；45~65 min，78%~35%A；65~75 min，35%A；75~78 min，35%~30%A；78~80 min，30%~88%A；80~82 min，88%A；流速为1.0 ml/min，检测波长为327 nm，柱温为30 ℃，进样量20 μl，理论塔板数按3，5-O-二咖啡酰奎宁酸计算应不低于8 000。
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分别精密称定绿原酸、木犀草素-7-O-β-D-葡糖苷、3，5-O-二咖啡酰奎宁酸对照品适量，置于同一10 ml容量瓶中，加甲醇溶解并定量稀释成每1 ml中含绿原酸2.15 mg、木犀草素-7-O-β-D-葡糖苷1.05 mg、3，5-O-二咖啡酰奎宁酸3.00 mg。分别精密称定蒙花苷和广藿香酮对照品适量置于同一25 ml容量瓶中，加甲醇溶解并定量稀释成每1 ml中含蒙花苷0.21 mg和广藿香酮0.05 mg，作为对照品储备液。精密量取各对照品储备液5 ml，置同一25 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得混合对照品母液。
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精密量取防暑清热饮5 ml，置10 ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。
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按处方量制备不含广藿香、白茅根、菊花和薄荷的阴性样品，按“2.2.2”项下供试品方法制备阴性对照溶液。
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分别取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液，按“2.1”项下色谱条件下进样，记录色谱图。结果阴性溶液无干扰，方法专属性良好，见图1。
图 1 防暑清热饮HPLC图
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分别精密吸取对照品母液按比例稀释，在上述色谱条件下，分别进样20 μl，以质量浓度X（μg/ml）为横坐标、峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线，得线性回归方程，见表1。
表 1 回归方程及线性范围
化合物名称 回归方程 r 线性范围（μg/ml） 绿原酸 Y=13.496X-63.194 0.999 9 43.00~430.00 木犀草素-7-O-β-D-葡糖苷 Y=19.707X-169.310 0.999 7 21.00~210.00 3，5-O-二咖啡酰奎宁酸 Y=4.659X-0.895 0.999 7 60.00~600.00 蒙花苷 Y=6.5862X+6.154 0.999 6 4.20~42.00 广藿香酮 Y=11.788X+2.109 0.999 6 1.02~10.20 -
取混合对照品溶液，连续进样6次，记录色谱峰面积，绿原酸、木犀草素-7-O-β-D-葡糖苷、3，5-O-二咖啡酰奎宁酸、蒙花苷、广藿香酮峰面积的RSD分别为0.29%、0.30%、0.32%、0.45%、0.45%，表明仪器精密度良好。
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按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液6份（批号：20200120），并按“2.1”项下色谱条件进行含量测定。结果显示，防暑清热饮中绿原酸、木犀草素-7-O-β-D-葡糖苷、3，5-O-二咖啡酰奎宁酸、蒙花苷、广藿香酮峰面积的RSD分别为0.56%、0.68%、0.70%、0.94%、1.75%，表明方法重复性良好。
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将供试品溶液在室温下放置，分别于0、2、4、8、12、24 h进样20 μl，记录色谱峰面积，结果显示，防暑清热饮中绿原酸、木犀草素-7-O-β-D-葡糖苷、3，5-O-二咖啡酰奎宁酸、蒙花苷、广藿香酮峰面积的RSD分别为0.64%、1.16%、0.71%、0.59%、1.36%，结果表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
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精密量取已知含量的防暑清热饮2.5 ml，共6份，置10 ml容量瓶中，再分别精密加入对照品适量，加水稀释至刻度，按“2.1”项下色谱条件操作，进样20 μl，记录峰面积，测定其含量，计算平均加样回收率，结果见表2。
表 2 防暑清热饮加样回收率试验结果(n=6)
成分 样品含量（m/μg） 加入量（m/μg） 测得量（m/μg） 回收率（%） 平均回收率（%） RSD（%） 绿原酸 369.44 376.00 745.10 99.91 102.03 1.63 369.44 376.00 748.25 100.75 369.44 376.00 756.12 102.84 369.44 376.00 749.80 101.16 369.44 376.00 764.27 105.01 369.44 376.00 754.89 102.51 木犀草素-7-O-β-D-葡糖苷 209.79 210.00 425.37 102.65 102.38 1.51 209.79 210.00 428.48 104.14 209.79 210.00 425.15 102.55 209.79 210.00 419.79 100.00 209.79 210.00 428.48 104.14 209.79 210.00 421.50 100.81 3，5-O-二咖啡酰奎宁酸 452.68 484.00 939.25 100.53 102.39 1.23 452.68 484.00 947.23 102.18 452.68 484.00 956.31 104.06 452.68 484.00 942.56 101.22 452.68 484.00 949.64 102.68 452.68 484.00 954.57 103.70 蒙花苷 42.88 42.00 85.58 101.67 103.14 1.87 42.88 42.00 85.42 101.30 42.88 42.00 87.42 106.05 42.88 42.00 87.13 105.37 42.88 42.00 85.42 101.30 42.88 42.00 86.21 103.16 广藿香酮 7.91 8.20 16.10 99.86 104.01 2.33 7.91 8.20 16.40 103.52 7.91 8.20 16.56 105.47 7.91 8.20 16.43 103.89 7.91 8.20 16.76 107.91 7.91 8.20 16.39 103.40 -
取3个批号的防暑清热饮样品（批号：20200120，202002101，202002102），各3份，按“2.2.2”项下方法制备防暑清热饮供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件操作，进样20 μl，记录峰面积，计算含量，结果见表3。
表 3 3批防暑清热饮含量测定结果（n=3, μg/ml）
批号 绿原酸 木犀草素-7-O-β-D-葡糖苷 3，5-O-二咖啡酰奎宁酸 蒙花苷 广藿香酮 20200120 147.97±0.73 83.61±0.53 181.99±0.15 17.26±0.48 3.16±0.30 202002101 142.35±0.15 75.19±1.07 162.42±0.16 14.16±0.86 1.74±0.54 202002102 163.00±0.06 80.24±0.88 215.19±0.04 17.63±0.78 2.09±2.38 -
现代药理学研究表明广藿香酮具有抗菌、抗炎、抗氧化、杀虫以及抑制肿瘤细胞的生长等多种生物活性；绿原酸、3，5-O-二咖啡酰奎宁酸属于苯丙素类化合物，具有解热镇痛、抗氧化作用；木犀草素-7-O-D-葡糖苷和蒙花苷属于黄酮类化合物，具有免疫调节、抗氧化、抗炎、抑菌抗病毒等作用。对单味药材进行分析，广藿香中含有广藿香酮；菊花、广藿香、白茅根和薄荷均含有绿原酸；菊花中含有3，5-O-二咖啡酰奎宁酸；菊花和薄荷中含有蒙花苷。中药复方制剂成分复杂，在保证达到检测要求的条件下，综合考虑选择绿原酸、木犀草素-7-O-β-D-葡糖苷、3，5-O-二咖啡酰奎宁酸、蒙花苷、广藿香酮作为液相色谱法检测的指标性成分[17-21]。
本实验分别考察了甲醇-0.1%磷酸、甲醇-0.2%磷酸、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.2%磷酸4个洗脱溶剂系统作为流动相，结果发现乙腈-0.2%磷酸作为流动相色谱峰时，峰形和分离效果较好，梯度洗脱比等度洗脱分离更好。由于本品为水溶性溶液，被测活性成分极性相对较大，故使流动相起始和结束比例保持一致，即乙腈-0.2%磷酸（12∶88），以确保所测成分在正确的保留时间出峰。
在190~400 nm范围内进行全波长扫描，广藿香酮、3，5-O-二咖啡酰奎宁酸、蒙花苷、绿原酸和木犀草素-7-O-β-D-葡糖苷最大吸收波长分别为308、327、330、325和348 nm，综合考虑选择327 nm作为检测波长。
本实验供试品溶液制备简便，由于本品为液体制剂，用水稀释后直接进样，在该色谱条件下无干扰，故考虑稀释后直接进样。
本实验建立的含量测定方法简便、准确、灵敏，可作为防暑清热饮的质控方法，因不同批次有效成分含量相差较大，考虑可能是药材受产地或采收季节的影响，也可能是该制剂提取工艺稳定性的问题，还需进一步考察，后续需要经过多批次测定以确定质控标准。
Simultaneous determination of five active components in Fangshu Qingre mixture by RP-HPLC
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摘要:
目的 建立RP-HPLC法同时测定防暑清热饮中绿原酸、木犀草素-7-O-β-D-葡糖苷、3，5-O-二咖啡酰奎宁酸、蒙花苷和广藿香酮含量的方法。 方法 采用ZORBAX-SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)，以0.2%磷酸溶液（A）-乙腈（B）梯度洗脱，流速为1.0 ml/min，检测波长为327 nm，柱温为30 ℃。 结果 绿原酸、木犀草素-7-O-β-D-葡糖苷、3，5-O-二咖啡酰奎宁酸、蒙花苷和广藿香酮线性关系良好（r≥0.999 6），平均加样回收率（RSD）分别为102.03%（1.63%）、102.38%（1.51%）、102.39%（1.23%）、103.14%（1.87%）和104.01%（2.33%）。 结论 本实验建立的测定方法简单、准确、重复性好，能够有效控制该制剂的质量。 -
关键词:
- 防暑清热饮 /
- 绿原酸 /
- 木犀草素-7-O-β-D-葡糖苷 /
- 3，5-O-二咖啡酰奎宁酸 /
- 蒙花苷 /
- 广藿香酮 /
- 高效液相色谱法
Abstract:Objective To establish a method for simultaneous determination of chlorogenic acid, luteolin-7-O-β-D-glucoside,3,5-dicaffeoylquinic acid, linarin and pogostone in Fangshu Qingre mixture by RP-HPLC. Methods ZORBAX-SB-C18 column(4.6 mm×250 mm, 5 μm) was used as the chromatographic column.The mobile phase was 0.2% formic acid water solution(A) and acetonitrile solution (B)with a gradient elution mode. The flow rate was 1.0 ml/min.The detective wavelength was 327 nm. The column temperature was 30 ℃. Results There were good linear relationships in the determination of chlorogenic acid, luteolin-7-O-β-D-glucoside, 3,5-dicaffeoylquinic acid, linarin and pogostone (r≥0.999 6), with the average recovery rate of 102.03%(1.63%), 102.38%(1.51%), 102.39%(1.23%), 103.14%(1.87%) and 104.01%(2.33%). Conclusion The method was simple and stable with a good reproducibility, which could be used as a quality control method for active compotents in Fangshu Qingre mixture. -
Key words:
- Fangshu Qingre mixture /
- chlorogenic acid /
- luteolin-7-O-β-D-glucoside /
- 3,5-dicaffeoylquinic acid /
- linarin /
- pogostone /
- HPLC
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RRx-001是一种源于航空工业的肿瘤免疫治疗药物[1]，其化学结构中含有溴代乙酰和双硝基氮杂环丁基团，目前处于III期临床试验[2]。RRx-001作为单一药物、放疗增敏剂或免疫增敏剂[3]，用于细胞肺癌[4]、转移性结直肠癌[5]、卵巢癌[6]和胶质母细胞瘤[7]等肿瘤的治疗，显示出良好的疗效和安全性。研究发现，RRx-001具有多种作用机制，如靶向CD47-SIRPα信号通路，使肿瘤相关巨噬细胞复极化，由抗炎症M2表型转为促炎症M1表型[8]；使肿瘤血管正常化，增加化疗药物渗透，产生代谢产物RONS，导致肿瘤细胞坏死[9]；通过表观遗传抑制活性激活抑癌基因[10]等。作为靶向CD47的小分子药物，RRx-001在临床试验中未发现CD47抗体药物常见的嗜血综合征，表现出优于抗体大分子药物的安全性[11]。但RRx-001也存在明显的输注部位反应，因而临床需要采用特殊的注射器材，通过血液共同输注方式给药。
RRx-001结构中的溴代乙酰基为共价结合片段，也是其产生活性的药效基团[1]。为进一步探讨RRx-001的构效关系，本文拟采用骨架跃迁的药物设计策略，以不同的共价结合片段代替溴代乙酰基，分析其对抗肿瘤活性的影响，从而为后续基于RRx-001骨架的药物设计研究提供借鉴（图1）。
1. 仪器及试剂
实验所用试剂分别采购自泰坦、毕得、乐研等公司，各类试剂均为市售分析纯或化学纯。核磁共振仪采用的是德国Bruke的600、400和300 MHz型，采用TMS作为内标，DMSO-d6、CDCl3或D2O等为溶剂。耦合常数（J）和化学位移（δ）单位分别用Hz和ppm来表示。高分辨质谱为德国Bruke micrOTOF
10257 ，抗肿瘤活性测试所用仪器为Biotek Synergy H2多功能酶标仪。薄层色谱（TLC）使用的硅胶板为GF254（中国青岛海洋化学），柱层析使用的是200~300目硅胶（中国青岛海洋化学）。2. 实验方法
2.1 关键中间体3, 3-二硝基氮杂环丁烷（7）的合成
2.1.1 3-叔丁基-5-羟甲基-5-硝基-四氢-1, 3-噁嗪（1）的合成[12]
将多聚甲醛（24.1 g，0.8 mol）加入250 ml三颈烧瓶中，然后加入0.16 %氢氧化钠水溶液（40 ml），升温至40 ℃。缓慢滴加硝基甲烷（10.6 ml，0.2 mol），滴加结束后升温至60 ℃，滴加叔丁胺（21.2 ml，0.2 mol），滴加结束后继续反应10 min。反应液冷却至室温后过滤，水洗，干燥得38.8 g白色固体1，收率89.4 %，mp：136.1~138.2 ℃。1H NMR（400 MHz, DMSO-d6）δ：5.35（t, J=5.8 Hz, 1 H），4.42（t, J=10.0 Hz, 2 H），3.81（d, J=7.9 Hz, 1 H），3.63–3.51（m, 4 H），2.59（d, J=12.3 Hz, 1 H），0.95（s, 9 H）。
2.1.2 2-叔丁胺基甲基-2-硝基-1, 3-丙二醇盐酸盐（2）的合成[12]
两颈烧瓶中依次加入500 ml无水乙醇、12 ml浓盐酸和化合物1（20.0 g，0.09 mol），加热回流反应6 h。反应结束后，减压蒸去溶剂，加入异丙醇搅拌0.5 h，过滤，洗涤，干燥得17.0 g白色晶体2，收率78.2 %，mp：175.5~178.3 ℃。1H NMR（400 MHz, D2O）δ：4.12（d, J=12.5 Hz, 2 H）, 3.88（d, J=12.5 Hz, 2 H）, 3.76（s, 2H）, 1.36（s, 9 H）。
2.1.3 1-叔丁基-3-羟甲基-3-硝基氮杂环丁烷盐酸盐（3）的合成[12]
在氮气保护下，将化合物2（5.0 g，0.02 mol）加入到250 ml三颈烧瓶中，分别加入50 ml无水四氢呋喃和偶氮二甲酸二异丙酯（5.6 g，0.03 mol），升温至60 ℃。然后，将溶有三苯基磷（7.4 g，0.03 mol）的四氢呋喃溶液（15 ml）滴加到反应液中，滴加结束后继续反应5 h。反应液冷却至室温后过滤，洗涤，干燥得3.9 g白色固体3，收率86.6 %，mp：165.3~174.0 ℃。1H NMR（400 MHz, D2O）δ：4.74（s, 2 H）, 4.43（s, 2 H）, 4.16（s, 2 H）, 1.26（s, 9 H）。
2.1.4 1-叔丁基-3,3-二硝基氮杂环丁烷（4）的合成[12]
将化合物3（7.0 g，0.03 mol）和氢氧化钠水溶液（4.3 g，90 ml H2O）加入到250 ml两颈烧瓶中，室温搅拌2 h，冰浴冷却到10 ℃以下后，滴加亚硝酸钠（8.6 g，0.12 mol）、K3Fe（CN）6（1.0 g，0.003 mol）和水（5 ml）配成的溶液。控制反应温度为10~15 ℃下，分批次加入过硫酸钠（10.3 g，0.04 mol），然后升温至室温，反应过夜。反应液用20 ml二氯甲烷萃取3次，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压蒸去溶剂得5.5 g黄色液体4，收率88.1 %。1H NMR（400 MHz, CDCl3）δ：4.12（s, 4 H）, 1.05（s, 9 H）。
2.1.5 N-乙酰基-3,3-二硝基氮杂环丁烷（5）的合成[12]
25 ml两颈烧瓶中依次加入化合物4（5.0 g，0.03 mol）、醋酸酐（9.8 ml，0.11 mol）和三氟硼酸乙醚溶液（0.5 ml，3.88 mmol），加热至120 ℃，回流反应12 h。减压蒸去溶剂，柱层析纯化（二氯甲烷 : 甲醇=100 : 1）得2.8 g淡黄色固体5，收率60.0 %，mp：110.1~113.9 ℃。1H NMR（600 MHz, CDCl3）δ：4.98（s, 2 H）, 4.82（s, 2 H）, 2.02（s, 3 H）。
2.1.6 3, 3-二硝基氮杂环丁烷盐酸盐（6）的合成[13]
将化合物5（1.0 g，5.29 mmol）加入到50 ml单颈烧瓶，然后加入6.3 ml 的5 %盐酸溶液，回流反应4 h。反应液冷却至室温，过滤，滤液减压蒸去溶剂得0.6 g黄色固体6，收率58.2 %，mp：150.3~155. 2 ℃。1H NMR（600 MHz, DMSO-d6）δ：4.98（s, 4 H）, 3.42（s, 2 H）。
2.1.7 3, 3-二硝基氮杂环丁烷（7）的合成[13]
将化合物6（0.6 g，3.16 mmol）和15 ml水加入到50 ml两颈烧瓶中，升温至40 ℃，再滴加5 %碳酸氢钠溶液至pH为8。反应液用10 ml二氯甲烷萃取3次，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸去溶剂得0.4 g黄色油状液体7，收率84.7 %。1H NMR（600 MHz, CDCl3）δ：4.51（s, 4 H）, 2.20（s, 1 H）。
2.2 RRx-001衍生物（ZM528-ZM531）的合成
将关键中间体3, 3-二硝基氮杂环丁烷7（74.0 mg，0.50 mmol）加入到25 ml单颈烧瓶后，分别加入干燥的二氯甲烷（4 ml）和碳酸氢钠（42.0 mg，0.50 mmol），冰浴冷却至0 ℃后，滴加各种酰氯或磺酰氯（0.55 mmol），完全反应后减压蒸去溶剂，柱层析纯化（二氯甲烷 : 甲醇=100 : 1）得化合物ZM528~ZM531。
ZM528，白色固体，83 mg，收率61.3%。1H NMR（300 MHz, CDCl3） δ: 6.46（dd, J=16.9, 1.2 Hz, 1 H）, 6.16（dd, J=16.9, 10.4 Hz, 1 H）, 5.88（dd, J=10.4, 1.2 Hz, 1 H）, 4.96（s, 4 H）. HRMS（ESI, positive）m/z calcd for C5H7N3O5 [M + H]+:
202.0464 ; found 202.0458。ZM529，白色固体，77 mg，收率60.2%。1H NMR（300 MHz, DMSO-d6）δ: 7.47（s, 2 H）, 4.77（s, 4 H）. HRMS（ESI, positive）m/z calcd for C3H6N4O6S [M + H]+:
226.0008 ; found 226.0013。ZM530，白色固体，54 mg，收率50.1%。1H NMR（600 MHz, CDCl3）δ: 5.63–5.61（m, 1 H）, 5.45（s, 1 H）, 4.93（s, 4 H）, 1.97（dd, J=1.6, 1.1 Hz, 3 H）。HRMS（ESI, positive）m/z calcd for C7H9N3O5 [M + H]+:
216.0620 ; found 216.0615。ZM531，淡黄色固体，81 mg，收率69.6%。1H NMR（600 MHz, CDCl3）δ: 6.58（dd, J=16.5, 9.8 Hz, 1 H）, 6.46（d, J=16.6 Hz, 1 H）, 6.27（d, J=9.8 Hz, 1 H）, 4.75（s, 4 H）。
2.3 体外抗肿瘤活性测试
选用人结肠癌细胞HCT-116和人非小细胞肺癌细胞A549，于海军军医大学药物化学教研室冻存和传代。96孔板边缘每孔加入100 μl的PBS溶液防止边缘效应，内部每孔加入浓度为7×104个/ml的细胞悬液100 μl，置于37 ℃、5%二氧化碳培养箱内。24 h后，弃去96孔板内培养液，每孔分别加入100 μl受试化合物样品液和对照品液，设三复孔。将96孔板置于37 ℃、5%二氧化碳培养箱中培养72 h。实验采用CCK-8法[14-16]。在基础培养基中加入10 % CCK-8试剂制成混合液，弃去96孔板内旧培养基，加入混合液，100 μl/孔，将96孔板置于37 ℃、5 %二氧化碳培养箱中孵育2~4 h。使用酶标仪于450 nm波长处测定荧光OD值。细胞生长抑制率IC%=（空白对照孔OD值-给药孔OD值）/空白对照孔OD值×100%。根据各个浓度的IC%值，用GraphPad软件进行线性回归，算出各受试化合物抑制细胞生长50%的药物浓度，即IC50。
3. 结果与讨论
3.1 化学合成
参考文献[12-13]设计了关键中间体3, 3-二硝基氮杂环丁烷的合成路线，合成路线见图2。以多聚甲醛和硝基甲烷为起始原料，通过环合、开环、Mistunobu、反向Henrry、脱叔丁基/乙酰化、脱乙酰基、碱化等7步反应合成出关键中间体7，总收率为14.9 %。其中，反向Henrry反应对催化剂的用量和反应温度较为敏感，经过反应条件优化，反应温度为10~15 ℃时，亚硝酸钠和K3Fe（CN）6的用量分别为化合物3的4倍和10%时，该步反应收率达88.1%，相比原有路线提升了6.3%。
将关键中间体7与各种酰氯或磺酰氯在三乙胺和碳酸氢钠催化下发生酰胺化反应，以较高收率合成得到目标化合物ZM528~ZM531（图3）。
3.2 体外抗肿瘤活性研究
采用CCK-8法测定目标化合物对肿瘤细胞株HCT-116和A549的体外抗肿瘤活性，以多柔比星（DOX）和RRx-001为阳性对照药，结果见表1。从表中可以看出，4个化合物均能保持一定的抗肿瘤活性，但相比RRx-001，均出现明显下降，其中丙烯酰基类化合物ZM528活性最高，对HCT-116和A549的IC50分别为（6.0±2.7）和（5.1±4.8）μmol/L。当丙烯酰基的2位引入甲基后活性明显下降，以磺酰基代替酰基后，活性也呈现下降趋势。以磺酰胺基代替丙烯酰基后，对HCT-116和A549肿瘤细胞株的活性分别下降了6.4和5.4倍，但当以磺酰基代替磺酰胺基后活性基本保持。以上研究结果初步表明，RRx-001的溴代乙酰基对抗肿瘤活性影响较大，以其他共价结合片段代替后活性出现明显下降。
表 1 RRx-001衍生物体外抗肿瘤活性
化合物IC50（μmol/L） HCT-116细胞株 A549细胞株 RRx-001 0.94±0.7 <0.2 ZM528 6.0±2.7 5.1±4.8 ZM529 38.1±19.7 27.3±10.4 ZM530 >50 14.4±3.0 ZM531 34.5±13.5 36.3±5.3 DOX <0.2 <0.2 4. 结论
采用骨架跃迁药物设计策略，设计合成出4个RRx-001衍生物。体外抗肿瘤活性研究发现，所有新化合物对HCT-116和A549细胞株的抑制活性均显示出明显的下降，但能保持一定的抗肿瘤活性，其中丙烯酰基类化合物ZM528活性最高，对两种肿瘤细胞株的IC50分别为（6.0±2.7）和（5.1±4.8） μmol/L，其原因可能是RRx-001的共价结合片段为溴乙酰基，结合活性高于其他共价结合片段。初步构效关系显示，氮杂环丁烷的氨基上溴代乙酰基取代后活性最高，丙烯酰基取代活性次之。研究结果和初步构效关系为以RRx-001为骨架的新型靶向CD47药物的进一步优化设计研究提供了理论指导。
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图 1 防暑清热饮HPLC图
A.混合对照品溶液；B.供试品溶液；C.阴性对照溶液1.绿原酸；2.木犀草素-7-O-β-D-葡糖苷；3. 3，5-O-二咖啡酰奎宁酸；4.蒙花苷；5.广藿香酮
表 1 回归方程及线性范围
化合物名称 回归方程 r 线性范围（μg/ml） 绿原酸 Y=13.496X-63.194 0.999 9 43.00~430.00 木犀草素-7-O-β-D-葡糖苷 Y=19.707X-169.310 0.999 7 21.00~210.00 3，5-O-二咖啡酰奎宁酸 Y=4.659X-0.895 0.999 7 60.00~600.00 蒙花苷 Y=6.5862X+6.154 0.999 6 4.20~42.00 广藿香酮 Y=11.788X+2.109 0.999 6 1.02~10.20 
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表 2 防暑清热饮加样回收率试验结果(n=6)
成分 样品含量（m/μg） 加入量（m/μg） 测得量（m/μg） 回收率（%） 平均回收率（%） RSD（%） 绿原酸 369.44 376.00 745.10 99.91 102.03 1.63 369.44 376.00 748.25 100.75 369.44 376.00 756.12 102.84 369.44 376.00 749.80 101.16 369.44 376.00 764.27 105.01 369.44 376.00 754.89 102.51 木犀草素-7-O-β-D-葡糖苷 209.79 210.00 425.37 102.65 102.38 1.51 209.79 210.00 428.48 104.14 209.79 210.00 425.15 102.55 209.79 210.00 419.79 100.00 209.79 210.00 428.48 104.14 209.79 210.00 421.50 100.81 3，5-O-二咖啡酰奎宁酸 452.68 484.00 939.25 100.53 102.39 1.23 452.68 484.00 947.23 102.18 452.68 484.00 956.31 104.06 452.68 484.00 942.56 101.22 452.68 484.00 949.64 102.68 452.68 484.00 954.57 103.70 蒙花苷 42.88 42.00 85.58 101.67 103.14 1.87 42.88 42.00 85.42 101.30 42.88 42.00 87.42 106.05 42.88 42.00 87.13 105.37 42.88 42.00 85.42 101.30 42.88 42.00 86.21 103.16 广藿香酮 7.91 8.20 16.10 99.86 104.01 2.33 7.91 8.20 16.40 103.52 7.91 8.20 16.56 105.47 7.91 8.20 16.43 103.89 7.91 8.20 16.76 107.91 7.91 8.20 16.39 103.40
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表 3 3批防暑清热饮含量测定结果（n=3, μg/ml）
批号 绿原酸 木犀草素-7-O-β-D-葡糖苷 3，5-O-二咖啡酰奎宁酸 蒙花苷 广藿香酮 20200120 147.97±0.73 83.61±0.53 181.99±0.15 17.26±0.48 3.16±0.30 202002101 142.35±0.15 75.19±1.07 162.42±0.16 14.16±0.86 1.74±0.54 202002102 163.00±0.06 80.24±0.88 215.19±0.04 17.63±0.78 2.09±2.38
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