Research progress of valproic acid genomics
-
摘要: 丙戊酸钠是临床常用广谱抗癫痫药物。该药治疗窗窄、代谢个体差异大，体内代谢受多种因素影响，其中，药物代谢酶的遗传多态性是影响该药代谢的重要因素。通过查阅相关文献，总结了基因组学对丙戊酸钠临床用药的影响，为丙戊酸钠临床个体化给药提供参考。Abstract: Valproic acid is a commonly used and broad-spectrum antiepileptic drug in clinical practice with a narrow therapeutic window. Valproic acid has a great individual difference in its metabolism which is influenced by many factors. The gene polymorphism of drug metabolic enzymes is one of the critical factors. Through consulting relevant articles, the affection of genomics and clinical treatment on valproic acid clinical application were reviewed in this paper, which provided a reference for clinical individualized treatment.
-
Key words:
- valproic acid /
- genomics /
- population pharmacokinetic /
- individual treatment
-
生脉注射液临床上常用于辅助治疗心肌梗塞、心源性休克、脓毒症和感染性休克。心肌梗塞引起组织产生大量氧自由基，直接损伤心肌细胞并触发细胞凋亡，免疫介导的炎症损伤会加大心梗范围和心梗损伤[1]。心源性休克激活的炎症反应可诱导产生大量NO，促进细胞凋亡[2]。脓毒血症是由细菌引起的全身性炎症，大量致炎因子破坏机体的免疫平衡，从而导致机体代谢紊乱[3]，严重者可能引起感染性休克。本研究特选择抗氧化及抗炎能力作为生物效应指标，考察生脉注射液质量与生物效应之间的相关性。
课题组前期对生脉注射液中11种成分[4]进行了指认并进行了定量，均符合药典标准。药理学实验表明，生脉注射液中人参皂苷、木质素和麦冬皂苷等多种化学成分均在细胞及动物模型上表现出良好的抗炎效果[5-8]，且临床研究表明其可以通过抗炎通路发挥对器官损伤的保护作用[9-10]。现今生物效应评价在中药材和中成药质量控制研究中有所应用[11-12]，2015版《中国药典》收录了生物活性测定法作为质量控制标准，如洋地黄生物测定法和黄体生成素生物测定法，说明通过生物效应控制药品质量是可行的。
抗炎和抗氧化损伤是生脉注射液产生药理作用的重要机制，但现今的质量标准仅对化学成分进行定性定量分析，不能全面体现其整体的药效活性，为此，本研究尝试通过评价其抗氧化能力以及抗炎活性，建立有效的生脉注射液生物学质量控制方法。
1. 材料
1.1 试剂与药品
二苯基苦基苯肼（DPPH，质量分数≥97%，含10%～20%苯，批号：PRPDE-JO，梯希爱（上海）化成工业发展有限公司）；水溶性维生素E (Trolox)、DMEM培养基和磷酸盐缓冲液(PBS)均购自北京Solarbio公司；胎牛血清（FBS，德国PAN Seratech公司）；N-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）、NO检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；无水乙醇（北京化工厂）；水（屈臣氏）。
9批次生脉注射液分别由5个不同厂家生产，样品详细情况见表1。
表 1 生脉注射液样品来源、批号及有效成分含量(μg/ml)[4]编号 生产厂家 批号 规格 人参皂苷Rb1 人参皂苷Re 人参皂苷Rg1 五味子醇甲 麦冬皂苷D S1 A 16120401005 10 ml/支 61.16 51.39 84.69 51.43 1.48 S2 B 160502 10 ml/支 101.69 55.61 88.99 73.09 3.42 S3 C 17071014 10 ml/支 56.99 44.87 80.42 36.78 1.68 S4 C 17040423 20 ml/支 63.12 44.51 81.54 39.63 1.28 S5 D 1704252 20 ml/支 77.15 62.10 86.11 29.05 3.62 S6 E 17091302 10 ml/支 85.52 57.74 88.45 33.55 1.40 S7 E 17092903 10 ml/支 80.43 41.52 86.36 37.30 1.33 S8 E 17061103 20 ml/支 74.88 61.06 80.00 35.18 1.72 S9 E 17053005 20 ml/支 79.97 48.54 80.34 44.83 1.59 1.2 主要仪器及设备
电子分析天平（AB265-S，梅托勒-托利多有限公司）；超声波清洗仪（B25-12DT，宁波新芝生物科技股份有限公司）；TS-2000A脱色摇床（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；96孔板、多功能连续波长酶标仪（InfiniteM1000，TECAN公司）；低速离心机（SC-3610，安徽中科中佳科学仪器有限公司）；二氧化碳培养箱（MCO-15AC，三洋电机株式会社）。
1.3 细胞培养
RAW264.7细胞为小鼠单核巨噬细胞，购于中国医学科学院基础医学研究所细胞中心。培养条件：完全培养基为含10%FBS的DMEM培养基，在37℃含5% CO2的培养箱中培养。每天换液，细胞生长达对数生长期时，传代（传代比例为1:6）并开展实验，实验用细胞控制在10代以内。
2. 方法与结果
2.1 DPPH法评价生脉注射液质量
2.1.1 实验过程
取96孔板，每孔依次加入100 μl初浓度2.0%的受试液、100 μl 0.5 mmol/L DPPH溶液，震荡均匀后避光反应20 min。
测定方法：每孔依次加入100 μl受试液和DPPH溶液，在摇床上振荡均匀，避光反应20 min后，用酶标仪测定波长在517 nm处的吸光度。
2.1.2 方法学考察
考察内容：①线性关系：分别吸取样品编号为S9的药液，用纯水定容得到浓度为8%的生脉注射液受试液。逐级稀释，测定其吸光度并计算该浓度下的平均吸光度。以终浓度为横坐标（X），平均吸光度为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得到的线性关系方程为Y=-0.2081X+1.2209（r=0.9996）（图1-A），表明生脉注射液具有较强的DPPH自由基清除能力且具有浓度依赖性，体积浓度和平均吸光度具有良好的线性关系，在0%~2.0%范围内线性关系良好。②精密度：取样品S9，配制得到浓度2.0%的受试液，设置平行复孔，按照“2.1.1”项下操作测定吸光度，计算其吸光度的RSD值为2.25%（见表2），表明该方法满足方法学精密度要求。③重复性：取样品S9，配制得到浓度2.0%的受试液，设置平行复孔，按照"2.1.1“项下操作测定吸光度，计算其平均吸光度的RSD值为2.21%（见表2），表明该方法满足方法学重复性要求。④稳定性：取样品S9，分别于0、4、8、24、48和72 h，配制得到浓度2.0%的受试液，设置平行复孔，按照“2.1.1”项下操作测定吸光度，计算其平均吸光度的RSD值为2.47%（见表3），表明该方法在72 h内稳定性良好。
图 1 生脉注射液抗氧化生物活性评价A. 生脉注射液对DPPH清除作用的标准曲线；B. Trolox对DPPH清除作用的标准曲线；C. 1.0%各批次生脉注射液相当于Trolox的量（mmol/L）表 2 1.0%生脉注射液对DPPH清除作用的精密度和重复性考察编号 精密度试验 重复性试验 吸光度 均值 RSD(%) 吸光度 均值 RSD(%) 1 1.063 4 1.087 9 2.25 1.138 9 1.135 6 2.22 2 1.115 6 1.175 6 3 1.098 3 1.135 7 4 1.114 3 1.096 7 5 1.064 9 1.129 2 6 1.070 9 1.137 7 表 3 1.0%生脉注射液对DPPH的清除作用的稳定性时间 吸光度 均值 RSD(%) 0 1.038 5 1.078 8 2.47 4 1.105 7 8 1.072 2 24 1.080 5 48 1.065 7 72 1.110 0 2.1.3 生脉注射液抗氧化生物活性的质量评价
精密称定Trolox，加入100 μl无水乙醇溶解，纯水定容，得到初浓度为15.46 mmol/L的Trolox溶液。将其逐级稀释，按照“2.1.1“项下操作测定并计算平均吸光度，以终浓度为横坐标（X），平均吸光度为纵坐标（Y），绘制标准曲线。得到的线性关系方程为Y=–0.0789X+1.1674（r=0.9951）（见图1-B），表明Trolox清除DPPH能力在作用浓度0.43~5.56 mmol/L范围内具有良好线性关系。
将9批次生脉注射液清除DPPH自由基的结果与Trolox比较，折算得到各批次生脉注射液相当于水溶性Trolox的作用浓度（见图1-C）。结果表明，终浓度1.0%的各批次生脉注射液清除自由基能力相对于Trolox作用浓度范围为1.2~1.9 mmol/L，在清除自由基即抗氧化能力方各批次不存在较大差异。
2.2 Griess试剂盒评价生脉注射液的抗炎活性
2.2.1 Griess试剂盒测定生脉注射液抑制NO释放能力
使用完全培养基配制为1.2%的生脉注射液样品溶液，及初浓度100μg/ml的LPS样品溶液。
取对数生长期的RAW264.7细胞，制备成2×106个/ml的细胞悬液，以每孔100 μl注入96孔板。培养24 h后，弃去培养基，每孔加入100 μl样品溶液和100 μl的LPS溶液，孵育24 h后吸取50 μl上清液，按照Griess试剂盒说明书操作，用酶标仪测定波长540 nm处的吸光度。
2.2.2 方法学考察
考察内容：①线性关系：精密吸取样品编号为S6的药液，用完全培养基制成浓度为4.0%的溶液。逐级稀释，测定吸光度并计算该浓度下的平均吸光度。以终浓度为横坐标（X），平均吸光度为纵坐标（Y），绘制标准曲线。得到线性方程为Y=–0.033ln(X)+0.243（r=0.9961）（见图2-A），表明生脉注射液具有良好的NO分泌抑制能力并具有浓度依赖性，终浓度和平均吸光度之间具有良好的线性关系，在0.2%~2.0%范围内线性关系良好。②精密度：取样品S6，配制得到浓度为1.2%的受试液，设置平行复孔，按照“2.1.1“项下操作测定吸光度，计算其吸光度的RSD值为1.71%（见表4），表明该法满足方法学精密度要求。③重复性：取样品S6，配制得到浓度为1.2%的受试液，设置平行复孔，按照“2.1.1“项下操作测定吸光度，计算其平均吸光度的RSD值为2.79%（见表4），表明该法满足方法学重复性要求。④稳定性：取样品S6，分别于0、4、8、24和48 h时，配制得到浓度1.2%的溶液，设置平行复孔，按照“2.1.1”项下操作测定吸光度，计算其平均吸光度的RSD值为2.66%（见表5），表明该方法在48 h内稳定性良好。
图 2 生脉注射液抗炎活性评价A. 生脉注射液对RAW264.7细胞分泌NO的标准曲线；B. L-NAME对RAW 264.7细胞分泌NO的标准曲线；C. 0.60%各批次生脉注射液相当于L-NAME的量（mmol/L）表 4 1.2%生脉注射液对LPS刺激264.7细胞分泌NO的精密度和重复性考察编号 精密度试验 重复性试验 吸光度 均值 RSD(%) 吸光度 均值 RSD(%) 1 0.276 0 0.272 9 1.71 0.272 9 0.285 0 2.79 2 0.272 3 0.281 1 3 0.265 0 0.289 0 4 0.276 1 0.291 6 5 0.275 0 0.290 6 表 5 1.2%生脉注射液对LPS刺激264.7细胞分泌NO的稳定性考察时间 吸光度 均值 RSD(%) 0 0.264 5 0.262 3 2.66 2 0.273 6 4 0.257 4 24 0.257 4 48 0.258 6 2.2.3 生脉注射液抗炎生物活性的质量评价
精密称定eNOS抑制剂L-NAME，逐级稀释，按照“2.1.1“项下操作，测定并计算平均吸光度，以终浓度为横坐标（X），平均吸光度为纵坐标（Y），绘制标准曲线。得到线性关系方程为Y=–0.052ln(X)+0.152（r=0.9957）（见图2-B），表明L-NAME抑制NO分泌能力在0.05~0.55 mmol/L范围内具有良好线性关系。
将9批次生脉注射液抑制NO分泌能力的结果与L-NAME比较，折算得到各批次生脉注射液相对于L-NAME的作用浓度（见图2-C）。
结果显示，除S2和S8样品外，终浓度0.6%的各批次生脉注射液对应的L-NAME浓度范围均在0.06~0.16 mmol/L范围内，表明在抑制NO分泌能力即抗炎能力方面S2和S8与其他样品存在较大差异。其中S2对应的L-NAME浓度远高于其他样品，其抗炎活性远高于其他样品组，推测这可能与化学成分含量差异有关，需要后续的实验加以证实。
3. 讨论
3.1 实验方法及阳性对照药的选择
测定抗氧化活性常用的方法有氧化自由基吸收能力（ORAC）、二苯基苦基苯肼（DPPH）法和总抗氧化能力检测（ABTS）法等，本实验首先采用DPPH法测定抗氧化能力，该方法操作简便，常用于体外评价化合物的抗氧化活性，其中Trolox和维生素C是常用的抗氧化剂对照药[13-14]，但相较之下，Trolox可通过清除自由基产生抗氧化机制，且具有剂量依赖性[15]，而维生素C稳定性较Trolox差，所以该方法选择了该药作为阳性对照。内皮型一氧化氮合酶（eNOS）诱导产生NO是NO产生的重要途径[16]，L-NAME作为eNOS抑制剂，选择其作为对照药可以更加直观地评价药物对细胞产生NO的抑制能力。
3.2 结果分析
参考2015版药典生物测定方法，该试验通过测定生脉注射液的抗炎和抗氧化能力，初步建立了生脉注射液的生物效应质量控制方法，该方法不仅能满足方法学要求，而且可以克服现行质量控制方法的局限性，还可以有效的评价中药复方制剂在治疗过程中产生的效应强度，实现“质-量-效”的有效结合[17]。
4. 展望
中药复方是一个组分复杂，不仅化学成分复杂，未知组分众多，而且其可能通过不同成分的配伍产生作用机制，即其药理机制不是单一化学成分能够阐明的，因此，仅对中药复方的化学成分进行评价难以对其成分及作用进行全面阐述。生物效应质量控制方法能对中药复方的整体组分药效进行把控，从药理活性方面评价中药复方质量，弥补现有质控方法的不足。在生物效应质控方法建立过程中，应注意以下问题：①质控方法应根据药效及药理机制研究选择合适的生物效应指标，充分反映该药的药理活性特征；②选择的对照药应具有足够的专属性、关联性和可测性，能够充分准确地反映药物的生物效应[18-20]。参考已有的生物质量控制研究[11，21]并对生脉注射液可能的药理活性进行筛选，对此进行考察。重点考察其方法学验证，结果显示该方法可行性高，方法学符合生物效应评价要求，可以反映生脉注射液的整体生物效应。但抗炎活性的测定实验要求较高的实验操作，且该方法对中药复方的整体生物活性进行测定，并未对可能产生药理活性的化学组分和含量进行探究和测定，可能产生药理活性的化学成分及作用机制尚不明确，值得后续的探讨。
-
[1] 张小伟. 新型抗癫痫药物的研究进展[J]. 临床合理用药杂志, 2017, 10(33):180-181 [2] 陈玲, 苗苗, 刘俊. 癫痫患者丙戊酸血清浓度监测及与临床疗效的关联性分析[J]. 中国医院用药评价与分析, 2015, 15(12):1613-1616 [3] SONG P G, LIU Y Z, YU X W, et al. Prevalence of epilepsy in China between 1990 and 2015: A systematic review and meta-analysis[J]. J Glob Health,2017,7(2):020706 [4] TOMSON T, BATTINO D, PERUCCA E. The remarkable story of valproic acid[J]. Lancet Neurol,2016,15(2):141 [5] 闫秋艳, 朱乐亭, 赵志刚, 等. 233例丙戊酸血药浓度监测结果分析[J]. 中国药师, 2018, 21(2):264-267 [6] 朱明媚, 景霞, 孙芳, 等. CYP2C9、CYP2A6基因多态性对丙戊酸钠血药浓度的影响[J]. 南京医科大学学报(自然科学版), 2017, 37(1):40-43, 47 [7] WANG W Z, WU J Z, LI S C, et al. Sodium valproate for epilepsy in rural China: an efficacy and safety assessment in primary care[J]. Epilepsy Res,2012,102(3):201-205 [8] 王灿, 马虹英, 王方杰, 等. 丙戊酸肝毒性的早期预警及预防研究状况[J]. 中国临床药理学杂志, 2015, 31(2):150-154 [9] KOUGA T, SHIMBO H, IAI M, et al. Effect of CYP2C19 polymorphisms on stiripentol administration in Japanese cases of Dravet syndrome[J]. Brain Dev,2015,37(2):243-249 [10] 沈建玲, 李惠英, 任丹阳, 等. 丙戊酸的相关代谢酶基因多态性研究进展[J]. 海峡药学, 2019, 31(4):100-103 [11] GHODKE-PURANIK Y, THORN C F, LAMBA J K, et al. Valproic acid pathway: pharmacokinetics and pharmacodynamics[J]. Pharmacogenet Genomics,2013,23(4):236-241 [12] 储小曼, 郭岑, 张丽芳. 丙戊酸的代谢特征与其肝毒性的相关性[J]. 中国医院药学杂志, 2013, 33(19):1611-1614 [13] DORADO P, LÓPEZ-TORRES E, PEÑAS-LLEDÓ E M, et al. Neurological toxicity after phenytoin infusion in a pediatric patient with epilepsy: influence of CYP2C9, CYP2C19 and ABCB1 genetic polymorphisms[J]. Pharmacogenomics J,2013,13(4):359-361 [14] SABIN O, TRIFA A P, BRUSTUREAN E, et al. Study of CYP2C9 and CYP2C19 polymorphisms in a Romanian epilepsy population[J]. Human Veterin Med,2013,5(3):77-81 [15] 韩瑞玲, 李艳, 吴薇. 癫痫患者CYP2C19基因多态性对丙戊酸钠血药浓度的影响[J]. 神经损伤与功能重建, 2015, 10(4):295-297 [16] 冯亚娟, 周建华, 刘科兰, 等. 丙戊酸代谢相关CYP2C19基因多态性在癫痫患儿体内的分布及治疗个体化研究[J]. 中国实用神经疾病杂志, 2015, 18(5):49-52 [17] TAN L, YU J T, SUN Y P, et al. The influence of cytochrome oxidase CYP2A6, CYP2B6, and CYP2C9 polymorphisms on the plasma concentrations of valproic acid in epileptic patients[J]. Clin Neurol Neurosurg,2010,112(4):320-323 [18] 谭喜莹, 张宇, 王淑云, 等. CYP2C9与CYP2C19基因多态性与癫痫患者丙戊酸血药浓度关系研究[J]. 药学与临床研究, 2011, 19(2):123-126 [19] 廖清船, 史菁菁, 张永, 等. 细胞色素P450酶2A6、2B6、2C9及2C19基因多态性对丙戊酸钠血药浓度的影响[J]. 中华神经科杂志, 2013, 46(2):82-86 [20] 孙妍萍, 谭兰, 宋敬卉. CYP2A6基因多态性对丙戊酸钠血药浓度的影响[J]. 中华神经科杂志, 2006, 39(11):745-747 [21] 谭兰, 郁金泰, 欧江荣, 等. 细胞色素P450等位基因多态性与丙戊酸钠血药浓度的相关性[J]. 临床神经病学杂志, 2009, 22(3):168-171 [22] 文志鹏, 肖坚, 陈小平. 丙戊酸的药物基因组学研究进展[J]. 中南药学, 2016, 14(5):526-531 [23] CHATZISTEFANIDIS D, GEORGIOU I, KYRITSIS A P, et al. Functional impact and prevalence of polymorphisms involved in the hepatic glucuronidation of valproic acid[J]. Pharmacogenomics,2012,13(9):1055-1071 [24] MEI S H, FENG W X, ZHU L T, et al. Effect of CYP2C19, UGT1A8, and UGT2B7 on valproic acid clearance in children with epilepsy: a population pharmacokinetic model[J]. Eur J Clin Pharmacol,2018,74(8):1029-1036 [25] 谭喜莹, 张小萍, 邱召娟. UGT1A6基因多态性与癫痫患者丙戊酸血药浓度相关性研究[J]. 药学与临床研究, 2014, 22(4):299-301 [26] GUO Y J, HU C, HE X J, et al. Effects of UGT1A6, UGT2B7, and CYP2C9 genotypes on plasma concentrations of valproic acid in Chinese children with epilepsy[J]. Drug Metab Pharmacokinet,2012,27(5):536-542 [27] INOUE K, SUZUKI E, YAZAWA R, et al. Influence of uridine diphosphate glucuronosyltransferase 2B7 -161C >T polymorphism on the concentration of valproic acid in pediatric epilepsy patients[J]. Ther Drug Monit,2014,36(3):406-409 [28] 孙银香, 卓文燕, 林虹, 等. UGT2B7 C802T和G211T基因多态性对癫痫患者丙戊酸代谢的影响[J]. 中国医院药学杂志, 2015, 35(3):216-219 [29] 马虹英, 张婷, 龚志成, 等. UGT2B7基因多态性对丙戊酸血药浓度的影响[J]. 中南大学学报(医学版), 2013, 38(8):766-772 [30] SURENDRADOSS J, CHANG T K, ABBOTT F S. Assessment of the role of in situ generated(E)-2, 4-diene-valproic acid in the toxicity of valproic acid and(E)-2-ene-valproic acid in sandwich-cultured rat hepatocytes[J]. Toxicol Appl Pharmacol,2012,264(3):413-422 [31] 谢新芳, 温燕, 高守红, 等. 丙戊酸钠及其代谢产物的体外肝毒性研究[J]. 药学实践杂志, 2017, 35(1):43-47, 53 [32] ZHAO M M, ZHANG T, LI G F, et al. Associations of CYP2C9 and CYP2A6 polymorphisms with the concentrations of valproate and its hepatotoxin metabolites and valproate-induced hepatotoxicity[J]. Basic Clin Pharmacol Toxicol,2017,121(2):138-143 [33] 李新林, 张媞, 周敬凯, 等. CYP2A6基因多态性对丙戊酸肝毒性的影响[C]//第四届全国治疗药物监测学术年会论文集. 长沙, 2014: 44. [34] JAFARIAN I, ESKANDARI M R, MASHAYEKHI V, et al. Toxicity of valproic acid in isolated rat liver mitochondria[J]. Toxicol Mech Methods,2013,23(8):617-623 [35] CHEN Z J, WANG X D, WANG H S, et al. Simultaneous determination of valproic acid and 2-propyl-4-pentenoic acid for the prediction of clinical adverse effects in Chinese patients with epilepsy[J]. Seizure,2012,21(2):110-117 [36] SARUWATARI J, DEGUCHI M, YOSHIMORI Y, et al. Superoxide dismutase 2 Val16Ala polymorphism is a risk factor for the valproic acid-related elevation of serum aminotransferases[J]. Epilepsy Res,2012,99(1-2):183-186 [37] 陈卓佳, 王雪丁, 王红胜, 等. ACSM 2A和CPT IA基因多态性与丙戊酸所致不良反应的相关性研究[C]. 第十届全国药物和化学异物代谢学术会议暨第三届国际 ISSX/CSSX 联合学术会议论文集, 2012: 232-233. [38] 王化明, 赖萍, 谢娟. 用NONMEM法建立癫痫患者丙戊酸群体药代动力学模型[J]. 今日药学, 2012, 22(1):1-6 [39] JIANG D C, BAI X R, ZHANG Q X, et al. Effects of CYP2C19 and CYP2C9 genotypes on pharmacokinetic variability of valproic acid in Chinese epileptic patients: nonlinear mixed-effect modeling[J]. Eur J Clin Pharmacol,2009,65(12):1187-1193 -
下载:
点击查看大图
计量
- 文章访问数: 5572
- HTML全文浏览量: 678
- PDF下载量: 2678
- 被引次数: 0
下载:
