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全身过表达人METRNL基因小鼠模型的构建与验证

王雪莲 郑斯莉 李志勇 罗亨宇 缪朝玉

王雪莲, 郑斯莉, 李志勇, 罗亨宇, 缪朝玉. 全身过表达人METRNL基因小鼠模型的构建与验证[J]. 药学实践与服务, 2024, 42(5): 198-202, 222. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202311014
引用本文: 王雪莲, 郑斯莉, 李志勇, 罗亨宇, 缪朝玉. 全身过表达人METRNL基因小鼠模型的构建与验证[J]. 药学实践与服务, 2024, 42(5): 198-202, 222. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202311014
WANG Xuelian, ZHENG Sili, LI Zhiyong, LUO Hengyu, MIAO Chaoyu. Construction and validation of a mouse model with systemic overexpression of human METRNL gene[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2024, 42(5): 198-202, 222. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202311014
Citation: WANG Xuelian, ZHENG Sili, LI Zhiyong, LUO Hengyu, MIAO Chaoyu. Construction and validation of a mouse model with systemic overexpression of human METRNL gene[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2024, 42(5): 198-202, 222. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202311014

全身过表达人METRNL基因小鼠模型的构建与验证

doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202311014
基金项目: 国家自然科学基金重点项目(82030110,82330117);国家自然科学基金青年科学基金项目(82104165);上海市青年科技英才扬帆计划(21YF1457600)
详细信息
    作者简介:

    王雪莲,硕士研究生,研究方向:心脑血管药理学,Tel:19822717670,Email:649459125@qq.com

    通讯作者: 缪朝玉,教授,博士生导师,研究方向:心脑血管药理学,Email:cymiao@smmu.edu.cn
  • 中图分类号: [文章编号] 2097-2024(2024)00-0000-00 [DOI] 10.12206 /j.issn.2097-2024.202311014

Construction and validation of a mouse model with systemic overexpression of human METRNL gene

  • 摘要:   目的  构建全身过表达人METRNL基因的小鼠模型(R26-L-METRNL+/-小鼠)。  方法  基于Cre-loxP系统利用Dppa3-Cre小鼠和实验室前期构建的人METRNL基因条件性过表达(R26-LSL-METRNL+/-)小鼠进行交配繁殖,得到目标R26-L-METRNL+/-小鼠。将该目标小鼠进行基因型鉴定,收集其血液及心、肝、脾、肺、肾、脑、白色脂肪和肌肉组织,利用实时荧光定量PCR技术、蛋白免疫印迹实验和血清酶联免疫吸附实验,考察人METRNL基因在小鼠的表达情况。  结果  R26-L-METRNL+/- 小鼠的人METRNL在组织mRNA水平、组织蛋白水平和血液蛋白浓度方面都有显著表达,远高于野生对照组小鼠。  结论  R26-L-METRNL+/-小鼠模型构建成功。
  • 图  1  全身过表达人METRNL基因小鼠的构建策略

    图  2  全身过表达人METRNL基因小鼠的培育流程

    图  3  DNA电泳条带图

    图  4  R26-L-METRNL+/-小鼠各组织的METRNL mRNA相对表达量(n=5~6,$ \bar x \pm s $

    图  5  R26-L-METRNL+/-小鼠各组织的METRNL 蛋白表达情况

    A.心脏组织;B.肝组织;C.脾组织;D.肺组织;E.肾组织;F.肌肉组织 (n=3,$ \bar x \pm s $)*P<0.05,**P<0.01,与 R26-WT组比较。

    图  6  R26-L-METRNL+/-小鼠及其对照小鼠的血清METRNL蛋白水平(n=5,$ \bar x \pm s $

    A.“METRNL浓度-吸光度”标准曲线(R2=0.992 9);B.R26-L-METRNL +/-小鼠血清METRNL浓度 *** P <0.001,与 R26-WT 组比较。

    表  1  PCR扩增实验中的引物序列

    基因名称上游引物(5’→3’)下游引物(5’→3’)
    R26-WTTCAGATTCTTTTATAGGGGACACATAAAGGCCACTCAATGCTCACTAA
    R26-L-METRNLAAAGTCCCGGAAAGGAGCTGGAGGCTCCATCCAGCAAGTT
    R26-StopGGGCAACGTGCTGGTTATTGACTTGCCCCTTGCTCCATAC
    内参基因TGGGTTGGGTGTCTGTTTCATTGTGATCCACCTGTCTCTGCCTTCC
    Dppa-CreTGGGTTGGGTGTCTGTTTCATTGTGACCTTGCATTCCTTTGGCGAGAG
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    表  2  实时荧光定量PCR实验中的引物序列

    基因名称上游引物(5′→3′)下游引物(5′→3′)
    METRNLACCAGCGACTTCGTAATTCACCAGCTCCACGTCATGGGTG
    小鼠 Gapdh GTATGACTCCACTCACGGCAAAGGTCTCGCTCCTGGAAGATG
    下载: 导出CSV
  • [1] LI Z Y, ZHENG S L, WANG P, et al. Subfatin is a novel adipokine and unlike Meteorin in adipose and brain expression[J]. CNS Neurosci Ther, 2014, 20(4):344-354. doi:  10.1111/cns.12219
    [2] LI Z Y, SONG J, ZHENG S L, et al. Adipocyte metrnl antagonizes insulin resistance through PPARγ signaling[J]. Diabetes, 2015, 64(12):4011-4022. doi:  10.2337/db15-0274
    [3] LI Z Y, FAN M B, ZHANG S L, et al. Intestinal Metrnl released into the gut lumen acts as a local regulator for gut antimicrobial peptides[J]. Acta Pharmacol Sin, 2016, 37(11):1458-1466. doi:  10.1038/aps.2016.70
    [4] ZHANG S L, LI Z Y, WANG D S, et al. Aggravated ulcerative colitis caused by intestinal Metrnl deficiency is associated with reduced autophagy in epithelial cells[J]. Acta Pharmacol Sin, 2020, 41(6):763-770. doi:  10.1038/s41401-019-0343-4
    [5] XU T Y, QING S L, ZHAO J X, et al. Metrnl deficiency retards skin wound healing in mice by inhibiting AKT/eNOS signaling and angiogenesis[J]. Acta Pharmacol Sin, 2023, 44(9):1790-1800. doi:  10.1038/s41401-023-01090-x
    [6] HONG C, WANG Z, ZHENG S L, et al. Metrnl regulates cognitive dysfunction and hippocampal BDNF levels in D-galactose-induced aging mice[J]. Acta Pharmacol Sin, 2023, 44(4):741-751. doi:  10.1038/s41401-022-01009-y
    [7] ZHENG S L, LI Z Y, SONG J, et al. Endothelial METRNL determines circulating METRNL level and maintains endothelial function against atherosclerosis[J]. Acta Pharm Sin B, 2023, 13(4):1568-1587. doi:  10.1016/j.apsb.2022.12.008
    [8] AMANO Y, NONAKA Y, TAKEDA R, et al. Effects of electrical stimulation-induced resistance exercise training on white and brown adipose tissues and plasma meteorin-like concentration in rats[J]. Physiol Rep, 2020, 8(16):e14540.
    [9] RAO R R, LONG J Z, WHITE J P, et al. Meteorin-like is a hormone that regulates immune-adipose interactions to increase beige fat thermogenesis[J]. Cell, 2014, 157(6):1279-1291. doi:  10.1016/j.cell.2014.03.065
    [10] USHACH I, ARREVILLAGA-BONI G, HELLER G N, et al. Meteorin-like/meteorin-β is a novel immunoregulatory cytokine associated with inflammation[J]. J Immunol, 2018, 201(12):3669-3676. doi:  10.4049/jimmunol.1800435
    [11] JUNG T W, LEE S H, KIM H C, et al. METRNL attenuates lipid-induced inflammation and insulin resistance via AMPK or PPARδ-dependent pathways in skeletal muscle of mice[J]. Exp Mol Med, 2018, 50(9):1-11.
    [12] REBOLL M R, KLEDE S, TAFT M H, et al. Meteorin-like promotes heart repair through endothelial KIT receptor tyrosine kinase[J]. Science, 2022, 376(6599):1343-1347. doi:  10.1126/science.abn3027
    [13] LU Q B, DING Y, LIU Y, et al. Metrnl ameliorates diabetic cardiomyopathy via inactivation of cGAS/STING signaling dependent on LKB1/AMPK/ULK1-mediated autophagy[J]. J Adv Res, 2023, 51:161-179. doi:  10.1016/j.jare.2022.10.014
  • [1] 陈炳辰, 佟达丰, 万苗, 闫飞虎, 姚建忠.  UPLC-MS/MS法测定小鼠血浆中紫杉醇脂肪酸酯前药及其药代动力学研究 . 药学实践与服务, 2024, 42(8): 341-345. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202404082
    [2] 丁华敏, 郭羽晨, 秦春霞, 宋志兵, 孙莉莉.  消风止痒颗粒通过降低白三烯水平对小鼠特应性皮炎急性瘙痒的治疗作用研究 . 药学实践与服务, 2024, 42(5): 211-216. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202306031
    [3] 姚瑞阳, 于海征, 李耀盺, 张磊.  丹参FBXL 基因家族的鉴定和表达模式分析 . 药学实践与服务, 2024, 42(11): 461-470. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202407034
    [4] 王鹏, 陈顺, 赵逸, 高守红, 王志鹏.  卡培他滨致小鼠手足综合征模型的建立及评价 . 药学实践与服务, 2024, 42(9): 385-388, 398. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202308045
    [5] 李想, 陆鸿远, 张明玉, 高欢, 姚东, 许子华.  米格列醇激活UCP1介导棕色脂肪对冷暴露小鼠损伤的研究 . 药学实践与服务, 2024, 42(): 1-6. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202404005
    [6] 景凯, 杨慈荣, 张圳, 臧艺蓓, 刘霞.  黄芪甲苷衍生物治疗慢性心力衰竭小鼠的药效评价及作用机制研究 . 药学实践与服务, 2024, 42(5): 190-197. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202310004
    [7] 张修平, 田家盛, 王道鑫, 李佳鑫, 王品, 缪朝玉.  MT-1207对小鼠血糖、血脂和动脉粥样硬化的作用 . 药学实践与服务, 2024, 42(11): 487-494. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202306011
    [8] 李清, 郭宜银, 陈颖, 瞿发林, 董文燊, 戈煜.  夜宁胶囊对小鼠镇静催眠作用及其机制的研究 . 药学实践与服务, 2024, 42(8): 346-349. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202211047
    [9] 刘汝雄, 杨万镇, 涂杰, 盛春泉.  铁死亡调控蛋白GPX4的小分子抑制剂研究进展 . 药学实践与服务, 2024, 42(9): 375-378. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202312075
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出版历程
  • 收稿日期:  2023-11-08
  • 录用日期:  2024-03-12
  • 修回日期:  2024-02-17
  • 网络出版日期:  2024-05-22
  • 刊出日期:  2024-05-25

全身过表达人METRNL基因小鼠模型的构建与验证

doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202311014
    基金项目:  国家自然科学基金重点项目(82030110,82330117);国家自然科学基金青年科学基金项目(82104165);上海市青年科技英才扬帆计划(21YF1457600)
    作者简介:

    王雪莲,硕士研究生,研究方向:心脑血管药理学,Tel:19822717670,Email:649459125@qq.com

    通讯作者: 缪朝玉,教授,博士生导师,研究方向:心脑血管药理学,Email:cymiao@smmu.edu.cn
  • 中图分类号: [文章编号] 2097-2024(2024)00-0000-00 [DOI] 10.12206 /j.issn.2097-2024.202311014

摘要:   目的  构建全身过表达人METRNL基因的小鼠模型(R26-L-METRNL+/-小鼠)。  方法  基于Cre-loxP系统利用Dppa3-Cre小鼠和实验室前期构建的人METRNL基因条件性过表达(R26-LSL-METRNL+/-)小鼠进行交配繁殖,得到目标R26-L-METRNL+/-小鼠。将该目标小鼠进行基因型鉴定,收集其血液及心、肝、脾、肺、肾、脑、白色脂肪和肌肉组织,利用实时荧光定量PCR技术、蛋白免疫印迹实验和血清酶联免疫吸附实验,考察人METRNL基因在小鼠的表达情况。  结果  R26-L-METRNL+/- 小鼠的人METRNL在组织mRNA水平、组织蛋白水平和血液蛋白浓度方面都有显著表达,远高于野生对照组小鼠。  结论  R26-L-METRNL+/-小鼠模型构建成功。

English Abstract

王雪莲, 郑斯莉, 李志勇, 罗亨宇, 缪朝玉. 全身过表达人METRNL基因小鼠模型的构建与验证[J]. 药学实践与服务, 2024, 42(5): 198-202, 222. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202311014
引用本文: 王雪莲, 郑斯莉, 李志勇, 罗亨宇, 缪朝玉. 全身过表达人METRNL基因小鼠模型的构建与验证[J]. 药学实践与服务, 2024, 42(5): 198-202, 222. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202311014
WANG Xuelian, ZHENG Sili, LI Zhiyong, LUO Hengyu, MIAO Chaoyu. Construction and validation of a mouse model with systemic overexpression of human METRNL gene[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2024, 42(5): 198-202, 222. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202311014
Citation: WANG Xuelian, ZHENG Sili, LI Zhiyong, LUO Hengyu, MIAO Chaoyu. Construction and validation of a mouse model with systemic overexpression of human METRNL gene[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2024, 42(5): 198-202, 222. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202311014
  • METRNL(Meteorin-like)是一个新发现的分泌蛋白,为神经营养调节因子Meteorin的同源蛋白。2014年,本实验室首次报道METRNL是一个新的脂肪因子,由于其在皮下白色脂肪组织中表达很丰富,故也称为Subfatin[1]。10年来,我们对METRNL的功能进行了多方面的探索,并不断扩展METRNL的研究工具与平台。我们的研究已发现,该蛋白参与调节机体多种病理生理过程,比如:脂肪细胞METRNL可促进白色脂肪分化、脂质代谢并抑制脂肪炎症,从而抵抗高脂饮食诱导的胰岛素抵抗[2];肠上皮细胞METRNL参与调节肠道抗菌肽的平衡[3],且肠道METRNL缺乏会加重溃疡性结肠炎[4];此外,METRNL促进小鼠皮肤创伤愈合[5],并能对抗D-半乳糖诱导的衰老小鼠的认知功能障碍[6]。最近,我们新报道了血液METRNL的主要分泌来源是血管内皮细胞,并发现内皮细胞METRNL对维持血管内皮正常功能和对抗动脉粥样硬化具有重要作用[7]。在这些研究中,我们构建METRNL基因的全身性和各种组织特异性的敲除小鼠,以及多种双基因敲除小鼠,并在体外细胞实验中充分利用METRNL重组蛋白探索相关治疗学意义。除了本实验室,全球其他多个实验室也展开了对METRNL的功能探索,并发现METRNL在能量代谢[8-9]、炎症[10-11]、心脏疾病[12-13]等多种病理生理过程中发挥积极作用。

    尽管目前有很多关于METRNL的研究结果提示,该蛋白具有非常好的临床治疗潜力,但有关整体METRNL治疗学探索不多,尤其是长期治疗研究几乎没有。主要原因之一是市场METRNL重组蛋白价格昂贵,而且我们前期研究结果发现:对C57BL/6J 小鼠单次静脉注射1.75 µg METRNL重组蛋白后,血清METRNL在15 min后急剧升高(226 ng/ml),接着在4 h内迅速下降约90%。虽然在注射后24 h仍明显高于基础水平,但此时血中METRNL浓度已下降约97%[2]。因此,以重组蛋白给药方式在动物整体水平研究METRNL的治疗学作用,尤其是长期治疗学作用将产生巨大经济成本。另一方面,对于一些已经体现METRNL治疗潜力的疾病(如动脉粥样硬化),疾病发展缓慢,短期给予METRNL重组蛋白很难起到治疗作用。

    因此,本研究旨在构建一株长期稳定高表达METRNL的小鼠作为METRNL的治疗学研究工具,并对该小鼠高表达METRNL的情况进行验证。

    • 鼠尾DNA提取试剂盒(CW2094S)购自北京康伟试剂生物科技有限公司;5 × PrimeScript RT Master Mix(Takara 公司);小鼠Tubulin抗体( AT819,碧云天公司);通用型RNA提取试剂盒Ⅱ(AG21022,艾瑞克生物科技);Human Meteorin-like/METRNL DuoSet ELISA试剂盒(DY7867-05,R&D system公司);山羊抗兔 IgG(ab175471)、山羊抗小鼠 IgG(ab216772)、抗METRNL抗体(ab235775)购自Abcam公司。

      LightCycler96实时荧光定量PCR仪(Roche公司);TP600PCR仪(Takara公司);5200S化学发光分析系统(Tanon公司)。

    • METRNL基因条件性过表达(R26-LSL-METRNL+/-)小鼠为实验室前期构建所得。SPF级8周龄 C57BL/6J 小鼠和Dppa-Cre小鼠购自上海南方模式生物技术有限公司。

      所有实验小鼠均饲养在独立通气笼盒(IVC)系统中,温度(24±2)℃,相对湿度为40%~60%,饲养期间笼盒内保持清洁,小鼠在笼内自由活动、进食及饮水,动物房内照明系统为自动控制(12 h照明、12 h黑暗)。动物实验标准均依照国家《实验动物护理使用卫生指南》,并经过海军军医大学医学研究伦理委员会批准指导。

    • 将剪刀消毒后剪取小鼠尾尖约3 mm,剪碎,按照DNA提取试剂盒的说明书方法提取DNA之后,对目的基因进行PCR扩增,各引物序列见表1

      表 1  PCR扩增实验中的引物序列

      基因名称上游引物(5’→3’)下游引物(5’→3’)
      R26-WTTCAGATTCTTTTATAGGGGACACATAAAGGCCACTCAATGCTCACTAA
      R26-L-METRNLAAAGTCCCGGAAAGGAGCTGGAGGCTCCATCCAGCAAGTT
      R26-StopGGGCAACGTGCTGGTTATTGACTTGCCCCTTGCTCCATAC
      内参基因TGGGTTGGGTGTCTGTTTCATTGTGATCCACCTGTCTCTGCCTTCC
      Dppa-CreTGGGTTGGGTGTCTGTTTCATTGTGACCTTGCATTCCTTTGGCGAGAG

      将PCR产物进行1.2% 琼脂糖凝胶电泳,上样量为每孔6 μl,电泳条件为100 V,30 min,结束后进行拍照、分析。

    • 将小鼠称重后,腹腔注射1%戊巴比妥钠溶液(100 mg/kg),待小鼠处于深度麻醉后,打开其胸腔,自上下腔静脉汇合处缓慢抽取血液,并转移至1.5 ml EP管静置于室温。迅速剪取小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑、白色脂肪和肌肉组织,放入组织冻存管扔进液氮速冻,待取材结束后及时转入−80 ℃超低温冰箱储存。血液于室温静置2 h后离心:4 ℃,3000×g,15 min,分离血清,储存至−80 ℃超低温冰箱。

    • 使用RNA提取试剂盒提取组织RNA,将得到的RNA进行浓度测定与吸光度测定后进行逆转录,得到cDNA用于实时荧光定量PCR实验,各引物序列见表2

      表 2  实时荧光定量PCR实验中的引物序列

      基因名称上游引物(5′→3′)下游引物(5′→3′)
      METRNLACCAGCGACTTCGTAATTCACCAGCTCCACGTCATGGGTG
      小鼠 Gapdh GTATGACTCCACTCACGGCAAAGGTCTCGCTCCTGGAAGATG
    • 取适量组织至2 ml高速离心管,加入蛋白裂解液后,使用高通量匀浆仪匀浆240 s。取出高速离心管,离心:12000 × g,20 min。将上清液转移至另一干净1.5 ml EP管中,进行蛋白浓度测定,剩余样品加入5 × 蛋白上样缓冲液,97 ℃变性10 min得到蛋白样品。

      使用10% SDS-PAGE凝胶进行电泳,电泳条件为:150 V,60 min。使用PVDF膜进行转膜,转膜条件为100 V,60 min。

      转膜结束后,使用快速封闭液封闭15 min,之后使用1×TBST缓冲液洗膜,5 min × 3次。加入一抗(1∶1000稀释)4 ℃孵育过夜。次日去除一抗孵育液,使用1 × TBST缓冲液洗膜,5 min × 3次。加入二抗孵育液(1∶2 000稀释)常温孵育1 h,用1 × TBST缓冲液洗去二抗,5 min × 4次,结束后即可进行扫膜。

    • 使用酶联免疫吸附实验试剂盒(DY7867-05)测定小鼠血清中的METRNL水平,具体操作按照试剂盒说明书进行。

    • 实验数据使用GraphPad Prism 8.0进行统计分析。两组间的比较使用双尾t检验,P<0.05视为差异有统计学意义。

    • 本研究基于前期构建好的人METRNL基因条件性过表达小鼠(简称为R26-LSL-METRNL+/-小鼠)和Cre-LoxP技术,最终获得全身过表达人METRNL基因小鼠(简称为R26-L-METRNL+/-小鼠),具体构建策略如图1所示。

      图  1  全身过表达人METRNL基因小鼠的构建策略

      R26-LSL-METRNL+/-小鼠是前期通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建而成,即在其中一个Rosa26基因位点定点插入了CAG-LoxP-Stop-LoxP-METRNL-3XFlag-Wpre-pA表达框,且该表达框的终止密码子Stop两侧插有同向LoxP位点,可基于Cre-loxP系统在Cre酶的作用下,将LoxP位点之间的序列切除,只留下一个LoxP位点,最终达到人METRNL基因过表达的目的。在该小鼠的名称“R26-LSL-METRNL+/-”中,“+”表示有外源基因表达框的插入,“-”表示无外源基因表达框插入。

      Dppa3-Cre小鼠是由Dppa3基因启动子介导Cre重组酶在全身表达的工具鼠,将R26-LSL-METRNL+/-小鼠和Dppa3-Cre小鼠杂交,可获得R26-L-METRNL+/-小鼠,具体繁殖方法如图2所示。其中,野生对照小鼠简写为R26-WT,表示在Rosa26位点没有外源人METRNL基因表达框的插入。

      图  2  全身过表达人METRNL基因小鼠的培育流程

      在繁殖过程中进行基因型鉴定时,需确认外源人METRNL基因表达框、终止密码子StopDppa-Cre基因的存在情况。采用相应基因上下游引物分别进行鼠尾基因型鉴定,外源性表达框阳性条带为699 bp,对应野生型序列条带为996 bp,终止密码子Stop阳性条带为408 bp,Cre基因阳性条带为100 bp。如图3所示,泳道1为R26-LSL-METRNL+/-小鼠,泳道2为R26-L-METRNL+/-小鼠,泳道3为R26-WT小鼠,泳道4为R26-L-METRNL+/-Cre小鼠,泳道5为R26-WT;Cre小鼠。

      图  3  DNA电泳条带图

    • 为验证R26-L-METRNL+/-小鼠是否存在人METRNL基因过表达,本研究首先利用实时荧光定量PCR技术检测了该小鼠各组织中人METRNL mRNA的表达情况。如图4所示,以 R26-WT 小鼠白色脂肪的人 METRNL mRNA表达量为1,肝、脾、肺、肾、白色脂肪和脑组织的相对表达量分别为94 008.6、618.1、88 537.3、68 897.9、32 386.3和24 816.5。该结果说明,R26-L-METRNL+/-小鼠在组织mRNA水平上实现了人METRNL基因过表达。

      图  4  R26-L-METRNL+/-小鼠各组织的METRNL mRNA相对表达量(n=5~6,$ \bar x \pm s $

    • 接着,本研究提取各组织的蛋白,使用蛋白免疫印迹实验方法验证R26-L-METRNL+/-小鼠各组织中人METRNL蛋白表达情况。在该实验中,所用METRNL抗体可同时抗人和小鼠的METRNL蛋白。如图5所示,METRNL蛋白在R26-L-METRNL+/-小鼠的心、肝、脾、肺和肌肉组织中的含量明显高于R26-WT小鼠,而在肾组织中METRNL抗体的结合效果不佳,且并未发现两组小鼠肾METRNL蛋白存在明显差异。该结果提示,R26-L-METRNL+/-小鼠在组织蛋白水平上实现了人METRNL基因过表达。

      图  5  R26-L-METRNL+/-小鼠各组织的METRNL 蛋白表达情况

    • 由于METRNL为分泌性蛋白,本研究最后使用ELISA方法测定R26-L-METRNL+/-小鼠及其对照小鼠血清中人METRNL蛋白水平。如图6所示,可成功检测到R26-L-METRNL+/-小鼠血液中的人METRNL,浓度在1 100.3~1 579.3 pg/ml,而在R26-WT小鼠血液中检测不到人METRNL。该结果说明,R26-L-METRNL+/-小鼠的血液中存在大量人METRNL蛋白,提示R26-L-METRNL+/-小鼠实现了人METRNL基因过表达。

      图  6  R26-L-METRNL+/-小鼠及其对照小鼠的血清METRNL蛋白水平(n=5,$ \bar x \pm s $

    • 本研究利用Dppa-Cre小鼠和实验室前期构建的R26-LSL-METRNL+/-小鼠进行杂交繁殖,最终获得R26-L-METRNL+/-小鼠。该小鼠与R26-LSL-METRNL+/-小鼠都在Rosa26基因位点含有外源性基因表达框,不同的是在R26-L-METRNL+/-小鼠外源表达框中的终止密码子Stop被Cre酶成功切除,因此R26-L-METRNL+/-小鼠可实现全身细胞过表达人METRNL

        本研究从mRNA水平、组织蛋白水平和血清蛋白水平考察了R26-L-METRNL+/-小鼠过表达METRNL的情况。由于该小鼠插入的外源METRNL基因是人METRNL基因,因此在进行实时荧光定量PCR实验时,使用的是人METRNL引物和小鼠Gapdh引物。类似地,在ELISA实验中,使用的是检测人METRNL的试剂盒。由于没有特异性抗人的METRNL抗体,因此在蛋白免疫印迹实验中使用的是可同时抗人和小鼠的METRNL抗体,而内参使用的是抗鼠的Tubulin抗体。本研究结果显示,R26-L-METRNL+/-小鼠的各组织存在人METRNL mRNA高表达,虽然各组织的表达量有所波动,但都比R26-L-WT小鼠的表达量高几千倍甚至是数十万倍。蛋白免疫印迹实验结果显示,在R26-L-METRNL+/-小鼠的心、肝、脾、肺、肌肉组织存在明显升高的METRNL蛋白水平,但该实验中检测的METRNL蛋白量升高倍数不多,可能与使用的METRNL抗体可以同时抗人和小鼠的METRNL有关。另外,我们也注意到两组小鼠肾组织的METRNL蛋白水平并没有明显差异,并且两组条带都非常微弱,为确证实验结果,我们进行了重复实验,得出相同结果。经过分析可能是因为该METRNL抗体对肾组织蛋白的亲和力不是很高,导致检测出的蛋白绝对量都太低而使两组之间很难出现差异。在血清水平,本研究结果提示R26-L-METRNL+/-小鼠的血液中存在大量人METRNL蛋白,而R26-L-WT小鼠血中检测不到该蛋白,说明R26-L-METRNL+/-小鼠成功过表达人METRNL,并可以成功分泌至血液中。同时,该实验提示,本研究所使用的人METRNL ELISA试剂盒特异性比较好,可以清晰区别人和鼠来源的METRNL蛋白。

      在小鼠培育过程当中,尚未发现R26-L-METRNL+/-小鼠和同窝对照WT小鼠在体重、形态等方面有何差异。根据图2中R26-L-METRNL+/-小鼠的培育方式,采用R26-L-METRNL+/-小鼠与C57BL/6J 小鼠杂交进行扩大繁殖和保种,基于孟德尔遗传定律,后代鼠中R26-L-METRNL+/-小鼠理论得率为50%,但实际中,我们发现该小鼠的得率仅为15%左右,远低于理论值。这一现象非常有趣,因为此前本实验室构建过多种基因工程动物模型,均没有发现类似偏离孟德尔遗传定律的现象,而这一现象是否与METRNL蛋白的全身性过表达有关,值得我们进一步研究。

参考文献 (13)

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