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随着唑类抗真菌药物的长期广泛使用，真菌耐药的问题更加凸显[1]。目前，临床上从患者体内分离出的真菌以念珠菌为主，而其中白念珠菌占比40%以上[2]。然而，抗真菌药物极为有限，迫切需要研发新的抗真菌药物。
近年来，靶向于真菌线粒体的药物是抗真菌药物研究的重要方向，如正在开展临床研究的F901318、聚酮类化合物Ilicicolin-H等 [3-4]。课题组前期在靶向线粒体的药物研究中发现，亲脂性吡啶鎓盐可以破坏白念珠菌的线粒体功能，发挥抗真菌作用，其中带正电荷的吡啶鎓结构是其抗真菌活性的关键[5-6]。为了进一步筛选通过阳离子靶向线粒体的新骨架类型的化合物，我们从国外ChemDiv化合物库，筛选了具有吡啶鎓结构的化合物，考察其抗真菌活性。其中N1~N9是已知化合物，但此前并未有该类化合物应用于抗真菌领域的相关报道。本文通过研究其体外抗真菌效果，探讨其作为抗真菌先导化合物。
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洁净工作台[HPeafe-1200LC(A2)上海力申科学仪器有限公司]；振荡培养箱（HZ-2111K-B江苏太仓市实验设备厂）；微量加样器（Biohit）；小型冷冻离心机（HitachiCT15RE）；蒸汽灭菌锅（KG-SX500 KAGOSHIMA SELSAKUSYO，Japan）；多功能酶标仪（TECAN Infinite M200）；倒置相差显微镜（Amersham Pharmacia AMG EVOS×1）；紫外分光光度计（Amersham Biosciences Μltrospec10）。
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白念珠菌标准菌株SC5314由美国Georgetown大学William A Fonzi教授赠送，临床分离的10株氟康唑耐药的白念珠菌（103、538、876、311、911、849、100、32、1010）、隐球菌2株、光滑念珠菌1株、热带念珠菌1株、近平滑念珠菌1株、克柔念珠菌1株，来自海军军医大学附属长征医院、长海医院皮肤科并经生化和形态学鉴定，N1-N9化合物购自ChemDiv，Inc，二甲基亚砜（DMSO）购自博光生物试剂有限公司，酵母提取物、甘露醇、营养肉汤购自BD公司，蛋白胨、葡萄糖、琼脂购自上海生工生物技术有限公司，RPMI1640购自Gibco公司，氟康唑购自阿拉丁试剂有限公司。
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将保存在SDA固体培养皿的白念珠菌单克隆菌株转接到1 ml YEPD培养基，30 ℃、200 r/min，培养过夜，使真菌菌株处于指数生长平台期。①洗菌：将活化好的菌株转移到1.5 ml离心管中，用无菌PBS缓冲液洗3次，再用1 ml PBS重悬。②调节浓度：用RPMI 1640稀释菌液至终浓度为（1～5）×103 CFU/ml。③制备药敏实验板：取96孔板，第1列加入100 μl RPMI 1640液体培养基做空白对照；第12列加入100 μl上述菌液做阳性对照；第2～11列采用倍比稀释的方法制成不同梯度的加药处理菌液，于30 ℃恒温培养过夜，用酶标仪在λ=630 nm测吸光度（A630）值，使A值下降80%以上的对应的药物浓度为MIC80值[7]。
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在N系列化合物中筛选活性较强的化合物N2进行进一步的抗真菌谱测定。菌株活化、菌液浓度调节、药敏反应板制备、测定A值(600 nm)值同上，更换实验室常用的菌株，测定化合物N2对多种真菌的作用，重复上述实验步骤进行实验。
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稀释菌液至1×106 CFU/ml，均匀涂布于2个SDA固体培养基上并在2块培养基上分别放置5片小圆纸片。取一块培养基，在5片纸片上分别滴加0、0.25、0.5、1、2 μg N2化合物，另一块按相同方式滴加等量氟康唑。于恒温箱中30 ℃培养24 h后观察并记录2块培养皿上的抑菌圈大小及形态。
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生长曲线测定：菌株活化、洗菌步骤同前所述，用YPD培养基稀释菌液至1×106 CFU /ml（A630=0.01）。取3支摇菌管加入相同起始菌液量，并对各管进行加药处理，使3支摇菌管中N2浓度分别为0、2、4 μg/ml。30 ℃、200 r/min振荡培养。分别在0、3、6、9、12、24 h测定各管菌液的A值(630 nm)。以A值(630 nm)值对时间做时间-生长曲线[8]。
杀菌曲线测定：菌株活化、洗菌步骤同前所述，用RPMI 1640培养基稀释菌液至1×103 CFU /ml。取4支摇菌管，各加入1 ml菌液和一定浓度的N2化合物，使4支摇菌管的药物浓度分别为0、2、4、8 μg/ml。30 ℃、200 r/min振荡培养。分别在0、3、6、9、12、24 h取100 μl菌液，用无菌PBS以10倍浓度梯度稀释，各取100 μl涂于SDA固体培养基表面，30 ℃静置培养24 h～48 h后统计培养基内的菌落克隆数。以lgCFU/ml对时间做时间-杀菌曲线[9]。
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N2化合物对于白念珠菌菌丝形成诱导影响：过夜活化的白念珠菌SC5314分别用Spider培养液和RPMI 1640培养液稀释至菌浓度为5×105 CFU/ml，分别加药使N2终浓度为0.5、0.25、0.125 μg/ml。空白对照加入同体积的DMSO，充分混匀，转移至12孔板中，37 ℃，静置培养3 h，倒置显微镜观察菌丝形态。
XTT法测定N2化合物抗生物被膜形成实验：活化白念珠菌SC5314，离心后去除培养基，用无菌PBS洗菌3次，然后用RPMI 1640液体培养基稀释菌液至1×106 CFU/ml。取TC处理的96孔板制备反应板，37 ℃恒温培养培养30 min，使细胞沉降黏附在孔板底面。然后吸弃上清，用PBS缓冲液洗涤3次。在处理完成的96孔板第一列加入RPMI 1640培养基，第12列加入菌液，第2~11列每2列为一组，分别加入一定量的N2化合物使其浓度为32、16、8、4、2 μg/ml。将96孔板置于恒温培养箱中37 ℃静置培养24 h，随后吸弃上清液并用PBS洗涤3次。之后每孔加入200 μl XTT/Menadione溶液，37 ℃避光孵育3 h。每孔吸取100 μl 上层液体并转移到另一块96孔板对应的位置，用酶标仪测定各孔A值(490 nm)[10-11]。
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为进一步明确N2化合物对白念珠菌细胞壁和细胞膜的影响，研究设置了2组白念珠菌。一组用2 μg/ml的N2化合物处理，另一组不进行加药处理，作为对照。处理16 h后用2%的戊二醛固定，随后采用透射电镜详细观察2组白念珠菌的形态结构。
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在RPMI 1640培养液中，采用临床分离的氟康唑耐药白念珠菌103和538（氟康唑单用时，MIC80>32 μg/ml），考察N系列化合物的抗真菌活性。通过对N系列化合物9种衍生物的体外抗真菌活性研究发现，N系列化合物中N2、N6和N8单用对白念珠菌均有一定的抗真菌活性，而N2化合物的MIC最低，为0.5 μg/ml和1 μg/ml，抗真菌作用显著，这些结果表明吡啶鎓类化合物具有体外抗真菌活性，后续可以通过结构改造进一步获得活性更高的类似物开展深入研究。结果见表1。
表 1 N系列化合物对氟康唑耐药白念珠菌103和538的MIC80值
化合物 结构式 白念珠菌103 MIC80 (μg/ml） 白念珠菌538 MIC80 (μg/ml) N1 
>16 >16 N2 
0.5 1 N3 
>16 16 N4 
>16 >16 N5 
>16 >16 N6 
8 8 N7 
>16 >16 N8 
16 8 N9 
>16 >16 -
通过对N1-N9化合物的初步筛选，发现N2的抗真菌活性最强。因此，我们选定N2进行了抗真菌谱的考察。为探究临床常见致病真菌对N2化合物的敏感性，选用国际标准菌C. albicans SC 5314以及9种氟康唑耐药的白念珠菌（C. albicans 876、C. albicans 311、C. albicans 538、C. albicans 103、C. albicans 911、C. albicans 849、C. albicans 100、C. albicans 32、C. albicans 1010）、隐球菌（Cryptococcus H99、Cryptococcus 32609）、光滑念珠菌C. glabrata 537、热带念珠菌C. tropicalist 293、近平滑念珠菌C. parapsilosis 22019、克柔念珠菌C. krusei 463，用微量液基稀释法测定了这些菌株对应的MIC80值。通过不同菌株对应的MIC80值可以发现，N2化合物对这些临床上常见的致病真菌均起到了明显的抑制作用，结果见表2，这些结果表明吡啶鎓类化合物N2具有广谱的抗真菌活性，对于临床常见的具有致病性的酵母菌均有较强的体外抗真菌活性。
表 2 N2化合物处理后菌株对应MIC80值
菌株名称 N2 MIC80（μg/ml） C. albicans SC5314 0.5 C. albicans 876 1.0 C. albicans 311 0.5 C. albicans 538 1.0 C. albicans 103 0.5 C. albicans 911 0.5 C. albicans 849 1.0 C. albicans 100 1.0 C. albicans 32 0.5 C. albicans 1010 1.0 Cryptococcus H99 1.0 Cryptococcus 30609 2.0 C. glabrata 537 0.5 C. tropicalis 293 0.5 C. parapsilosis 22019 0.5 C. krusei 463 2.0 -
通过纸片扩散法，我们以氟康唑为对照探究了N2化合物的抑菌效果。结果显示，相同剂量下，N2化合物和氟康唑均可在培养皿上形成圆形抑菌圈，直径随药量增加而增大。N2化合物处理组抑菌圈内无散在菌落，边界清晰，在培养皿上形成的抑菌圈直径明显大于氟康唑处理组。据此，我们可以认为N2化合物体外抑菌效果优于氟康唑。N2化合物处理组内部无克隆生长提示N2化合物可能具有一定的杀菌能力而不仅仅是抑制作用，结果如图1。
图 1 纸片扩散法抑菌实验单位（m/μg）
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为了进一步考察N2对白念珠菌的抑制作用，测定了N2抑制白念珠菌的时间-生长曲线。A值(600 nm)反映了白念珠菌的生长情况，通过不同时间点的测定发现，浓度为2 μg/ml时，N2对白念珠菌的生长增殖有明显的抑制作用（P<0.05），白念珠菌在12 h内，A值(600 nm)的值几乎没有升高，而在24 h时，A值(600 nm)的值仍显著低于未加药组。当N2的浓度增加至4 μg/ml时，白念珠菌在24 h内几乎不能增殖，A值(600 nm)与起始的测定值相当，结果如图2。上述结果表明，化合物N2具有明显的抑制真菌增殖的作用。
图 2 生长曲线
为明确化合物N2是否有杀菌功效，我们使用N2化合物处理白念珠菌后，进行涂板培养。测定了0、3、6、9、12、24 h培养基内存活的菌落数。通过测定N2化合物浓度为0、2、4、8 μg/ml时对应的时间-杀菌曲线，发现N2浓度为8 μg/ml时，可以显著降低培养基中白念珠菌的数量，显示出明显的杀菌活性。当N2浓度为2 μg/ml时，白念珠菌3 h时数量减少，而后续数量会增加，提示2 μg/ml 的N2基本不能杀灭培养基中的白念珠菌，结果如图3。上述结果表明，白念珠菌在低浓度时发挥抑菌活性，而当浓度升高时，展现出杀菌活性。
图 3 杀菌曲线
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酵母态向菌丝态的转换是白念珠菌在体内发生侵袭的重要过程。为了考察N2对白念珠菌菌丝形成的抑制作用，我们采用了不同的菌丝诱导模型考察化合物N2对白念珠菌菌丝形成的作用。结果显示，37 ℃条件下，无论在菌丝诱导培养基YPD+FBS%或RPMI 1640培养基中，当N2的浓度高于1 μg/ml时，白念珠菌基本维持在酵母态，菌丝形成被完全抑制，结果如图4。同时，化合物N2的菌丝抑制的浓度与表2中检测的MIC80值相当，这一结果表明，化合物N2在1 μg/ml以上的浓度时，可以同时抑制菌丝形成和白念珠菌增殖。
图 4 N2处理后白念珠菌菌丝形态
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采用XTT法考察了化合物N2对白念珠菌被膜形成的抑制作用。结果显示，在RPMI 1640培养基中，4 μg/ml和8 μg/ml的N2可以抑制约50%的被膜形成，而当浓度继续升高至16 μg/ml或32 μg/ml时，N2对被膜的抑制率到达70%左右，结果如图5。上述结果表明化合物N2可以显著抑制白念珠菌的被膜形成，后续的结构改造和深入研究可以为抗被膜形成药物的研发提供新的方向。
图 5 N2抑制白念珠菌的生物被膜形成
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通过对比N2化合物处理组和对照组白念珠菌的电镜照片，结果如图6，我们发现：N2处理后，白念珠菌的表面绒毛状明显增厚，细胞壁分布不均，细胞膜内层变薄，由此推断可能是几丁质和β-1，3-葡聚糖变少。因此，N2化合物可能主要通过损伤白念珠菌细胞膜和细胞壁发挥杀真菌作用。
图 6 白念珠菌透射电镜照片
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近年来，随着免疫抑制剂的广泛使用、手术介入和免疫缺陷患者的增多，系统性真菌感染的发病率逐年攀升。但抗真菌药物的研发进展缓慢，现有的几类抗真菌药物在长期使用后也逐渐出现了耐药性。为解决临床真菌感染的问题，研发新的抗真菌药物意义重大。本课题组长期致力于抗真菌化合物的筛选和机制研究，前期在基于破坏真菌线粒体功能的研究中发现，亲脂性吡啶鎓盐具有较好的线粒体靶向性和抗真菌活性，因此课题组拓展了化合物的结构类型，本研究中考察了亲脂性吡啶鎓盐的作用。通过体外MIC测定和抗菌谱筛选发现了3个具有抗真菌活性的化合物N2、N6和N8，其中N2结构中含有2个叔丁基的苯环结构，N6含有一个长饱和碳链，均增加了吡啶鎓盐的亲脂性，这些亲脂性基团可能有利于增强吡啶鎓盐的抗真菌活性。后续可以根据上述结构，开展进一步的结构改造。研究前期通过体外筛选结果表明，N2化合物具有体外抗真菌活性较高和抗真菌谱广泛的特点，对包括部分氟康唑耐药菌在内的临床常见致病念珠菌和隐球菌均有一定的抑制作用。尤其是对临床上造成感染问题最为严重的白念珠菌，N2化合物展现出较强的抗菌效果，能够高效地抑制和杀伤白念珠菌。而杀真菌药物是近年来研究的重要方向，通过杀菌活性将体内的念珠菌彻底清除，可以减少念珠菌感染的复发问题，缩短真菌感染的治疗周期。
本研究有望为抗真菌药物研发提供新的思路，但目前涉及的机制研究尚不深入，后续将基于吡啶鎓盐的线粒体靶向性，考察其对线粒体的形态、膜电位、线粒体DNA和线粒体能量代谢的影响，进一步明确该类化合物的作用机制，为后续的结构改造和靶点研究提供理论支撑。
Investigation on the antifungal activity of pyranium derivatives N2
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摘要:
目的 研究N2系列化合物的抗真菌作用。 方法 利用微量液基稀释法考察化合物N2系列化合物的体外抗真菌活性；在菌丝和被膜诱导条件下考察N2化合物对白念珠菌菌丝和被膜形成的抑制效果。 结果 N2化合物对临床常见条件致病真菌白念珠菌有明显抗真菌活性； N2化合物可以明显抑制白念珠菌菌丝生长和被膜的形成；N2化合物可以通过损伤白念珠菌细胞膜和细胞壁发挥杀菌作用。 结论 N2化合物具有较为广泛的抗真菌谱，能起到明显的体外抗真菌效果，对真菌菌丝和生物被膜的形成均有明显的抑制作用，可以认为N2化合物具有抗真菌潜力，可作为先导化合物，指导进一步改造。筛选获得了具有抗真菌活性的N2化合物，为抗真菌药物研发和解决真菌耐药问题提供新思路。 Abstract:Objective To study the antifungal activity of N2 derivatives. Methods The anti-fungal activity of N2 compounds was investigated by micro-liquid dilution. Then the activity of N2 compounds on hyphal and biofilm formation was investigated. Results N2 compounds had significant antifungal activity against Candida albicans. It also expressed actively inhibitory effect on hyphal and biofilm formation. The mechanism of its fungicidal function was to damage the structure of candida albicans’ cell membrane and cell wall. Conclusion The results showed that N2 had obvious antifungal activity against Candida albicans., which provided a new idea for the development of antifungal drugs and the solution of antifungal drugs resistance. -
Key words:
- N2 compound /
- antifungal activity /
- Candida albicans /
- hyphae formation
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0. 前言
糖尿病已经成为世界范围内的公共卫生问题。根据国际糖尿病联盟（IDF）2021年最新数据，糖尿病已成为影响全球5.37亿人的健康负担，预计到2045年，这一数字将增加到7.83亿[1]。糖尿病肾病（DN）是糖尿病最重要的微血管并发症之一，是指由糖尿病所致的慢性肾脏疾病。目前，DN的标准药物治疗方法是肾素血管紧张素醛固酮系统（RAS）的抑制剂，包括血管紧张素转化酶抑制剂（ACEI）和血管紧张素II受体阻滞剂(ARB)[2]。ACEI和ARB在减缓DN的进展中发挥了重要作用，它们可以降低尿蛋白水平，降低血压，减缓DN进展。但是，长期使用RAS抑制剂会带来很多副作用，如高钾血症、低血压、降低肾小球滤过率和肾血流量[3]。因此，迫切需要其他可用于阻止DN进展的药物。
DN的发病机制复杂，病因和发病机制目前尚不明确，以往的研究成果提示代谢紊乱、炎性反应机制、氧化应激、血流动力学改变、细胞因子、遗传因素及自噬等多种因素导致DN的发生与发展。近期研究表明，炎症似乎是DN的主要发病机制，调节炎症可作为治疗DN新的方向和热点。炎症与DN的发生和发展之间的关系涉及复杂的分子网络和过程，主要是促炎途径增强。其中，比较重要的促炎分子和途径包括：趋化因子，如CCL2、CX3CL1和CCL5；黏附分子，如细胞间黏附分子1（ICAM1），血管细胞黏附蛋白1（VCAM-1）和血管黏附蛋白1（VAP-1）；转录因子，如核因子κB（NF-κB），核因子红血球2相关因子2（Nrf2）；Janus激酶（JAK）信号转导和转录激活因子（STAT）通路。因此，本综述重点阐述这些促炎分子在DN中的作用和相应靶向药物的研究进展[4]，并简单介绍对DN具有抗炎作用的糖尿病新型药物。
1. 对DN具有抗炎作用的潜在新药
1.1 趋化因子靶向抑制剂
趋化因子及其受体在细胞迁移的募集中起关键作用。根据它们的N端半胱氨酸基序，可将它们大致分为4个亚家族（CC、C、CXC和CX3C家族）[5]。趋化因子根据功能可被定义为“稳态”趋化因子和“炎症”趋化因子。稳态趋化因子是组成型分泌的，主要参与淋巴细胞的运输。炎症趋化因子与促炎机制相关，诱导白细胞募集到受损组织[6]。趋化因子与DN密切相关。当暴露于DN的炎性环境中，间充质干细胞可以通过释放趋化因子来调节局部和全身性先天性和适应性免疫反应[7]。
最重要的CC趋化因子家族是CCL2，也称为巨噬细胞趋化因子1（MCP-1），它对细胞迁移、增殖和分化具有直接的信号传导作用。同时，CCL2还可以反映DN中肾小管损伤和肾脏炎症水平[8]。CCL2和趋化因子受体2（CCR2）结合，驱动T细胞和巨噬细胞向肾脏的募集，促进DN发生与发展[9]，抑制CCR2-CCL2轴可以改善该疾病，提示抑制CCR2-CCL2轴可作为肾脏炎性疾病治疗的新策略。CCL2抑制剂丹参聚乙二醇似乎是治疗DN的最有前途的抗炎药物[10]。在II期临床试验中，丹参聚乙二醇可以改善尿白蛋白肌酐比（UACR）和糖化血红蛋白（HbA1c）。重要的是，在停止治疗的4周和8周后，其对蛋白尿和血糖控制的有益作用仍然保持，表明阻断CCL2-CCR2信号具有持续的益处[11]。
1.2 黏附分子抑制剂
内皮黏附分子ICAM1、VCAM-1和VAP-1的表达在DN患者中明显增加，并且与疾病严重程度关系紧密[12]。由于这些分子在白细胞与内皮的黏附中起着重要作用，抑制这些分子可能会干扰白细胞的转运，从而减轻DN的炎症。
ICAM1是一种细胞表面糖蛋白，在免疫系统的内皮细胞和白细胞中表达。有实验发现，与非糖尿病大鼠相比，链脲佐菌素（STZ）诱导的大鼠血清和尿中ICAM1水平升高，且ICAM1的升高与尿白蛋白排泄率的升高相平行[13]。此外，还有证据表明，ICAM1在T2DM db/db小鼠的肾小球和肾小管上皮细胞中也呈现过表达[14]，其机制可能是在患有高血糖症的糖尿病患者中，细胞核中ICAM1基因的转录增加，内皮细胞表面ICAM1基因的表达上调。ICAM1与LFA-1的结合活性增加，血液中更多的淋巴细胞转移到肾小球和肾单位的肾小管周围毛细血管中，从而发生肾小球和肾小管的损伤，引起尿液中蛋白质排泄率的增加。
VCAM1也称CD106，是在多种病理条件下（包括动脉粥样硬化和DN）活化的内皮中表达的跨膜糖蛋白。VCAM1与α4β1整合素结合，后者在淋巴细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞上表达。随着血清中VCAM1水平的升高，肾脏滤过功能下降，尿白蛋白排泄水平也逐渐升高[15]。有实验发现患有2型糖尿病的患者血清中VCAM-1的水平显著升高，且与蛋白尿的程度密切相关[16]。这一发现也在其他2型糖尿病患者得到证实，其中VCAM-1的基线水平不仅与蛋白尿相关，而且与死亡风险增加也相关[15]。
炎症还可以诱导VAP-1的过表达[17]。除了促进内皮细胞与白细胞之间的相互作用外，VAP-1还可以触发其他内皮黏附分子的合成，如ICAM-1和E-选择素，并通过过氧化氢的生成激活炎症信号通路，包括MAPK和NF-κB通路[18]。ALBUM的II期临床试验采用随机、双盲、安慰剂对照的方法，将125名参与者被随机分配接受VAP-1抑制剂ASP8232（n=64）或安慰剂（n=61），给药12周。结果发现，ASP8232对DN有良好的疗效，具体表现为DN患者的蛋白尿减少、肾小球滤过率（GFR）下降减缓[19]。
1.3 转录因子靶向抑制剂
由于转录因子可以激活炎症通路，因此抑制转录因子治疗DN是另一种新的抗炎方法。几种转录因子，例如上游刺激因子1、2，激活蛋白1，NF-κB，cAMP-反应元件结合蛋白，活化的T细胞核因子和刺激蛋白1可在高血糖环境中被激活。这些转录因子与炎症和细胞外基质产量有关[20]。在这些转录因子中，NF-κB在DN的发病机理中最为重要。在DN疾病中，蛋白尿本身是NF-κB的重要激活剂，并且是肾小管细胞重要的炎症刺激[21]。NF-κB结合在DN发病机制中起关键作用的几个基因的启动子区域，例如编码TGF-β1，AKR1B1（醛酮还原酶家族1、成员B1），CCL2和ICAM1[22]。噻唑烷二酮类[23]，1,25-二羟基维生素D3[24]，小檗碱[25]和全反式维甲酸[26]等多种药物抑制NF-κB活化，可改善DN，提示NF-κB可作为DN的治疗靶标。
Nrf2可调节谷胱甘肽S-转移酶、谷胱甘肽过氧化物酶和血红素加氧酶-1等多种抗氧化酶的表达。在STZ建立了1型糖尿病大鼠模型中，给予绣球香豆素苷治疗3个月发现，糖尿病大鼠的血尿素氮和血清肌酐含量以及尿白蛋白排泄明显减少，而肌酐清除率明显增加，同时，显著下降的ROS产生，增加Nrf2的mRNA水平[27]。在STZ诱导的DN小鼠中，Nrf2-/-小鼠ROS的产生增加，且UACR明显高于野生型小鼠[28]。说明Nrf2可以通过抗氧化作用保护STZ所致的肾损伤。
甲基巴多索隆是一种有效的NF-κB抑制剂和Nrf2激活剂，是一种抗氧化的炎症调节剂。有关于甲基巴多索隆II期临床试验显示，在治疗DN过程中，与安慰剂组相比，治疗组在52周时持续增加GFR，且具有良好的效果[29]。然而，在III期临床试验中，给予2型糖尿病患者和4期慢性肾脏疾病的患者甲基巴多索隆治疗时，患者的GFR估计值显著增加，但由于心血管原因死亡的出现，该研究被迫终止了[30]。值得思考的是，是否可以通过调节剂量、对甲基巴多索隆化学结构进行改造，从而获得安全可靠的药物？
1.4 JAK-STAT抑制剂
JAK-STAT通路的激活与DN的发病机制有关[31]。有研究发现，DN患者的肾小球和肾小管间质区域中的多种JAK和STAT同工型（JAK1、JAK2、JAK3、STAT1、STAT3），在表达水平上均高于对照组。在早期DN和肾功能正常的患者中，各种JAK和STAT同工型均出现强烈的肾小球过度表达。然而，在进行性DN且肾功能下降的患者中，肾小球JAK和STAT mRNA表达大多恢复正常，而肾小管间质表达显著增加。同时，与无肾脏疾病的患者相比，进行性肾脏疾病患者的近端肾小管细胞中JAK2蛋白的表达较高，甚至与少数患有其他肾小球疾病的患者相比也是如此。JAK2蛋白还在肾小球细胞，包括足细胞中表达。这种表达方式表明，DN中JAK2表达的变化反映了内在肾细胞而非浸润性炎症细胞的变化[32]。研究发现，足细胞JAK2的过表达对正常小鼠中几乎没有变化，但是在糖尿病小鼠中，JAK2导致DN的肾小球功能和病理特征显著增加，包括蛋白尿、肾小球系膜扩张、足细胞密度降低、肾小球硬化和肾小球基底膜增厚。通过口服JAK1和JAK2抑制剂治疗2周，这些功能却得到了显著改善[33]。
对T2DM和eGFR25～70 ml/（min·1.73 m）患者进行II期临床试验结果表明，即使在DN疾病的晚期，口服JAK1和JAK2的选择性抑制剂巴利替尼，在24周的研究期间减少了患者的蛋白尿，表明JAK1和JAK2抑制剂在治疗DN方面具有潜在的治疗作用[34]。此外，尿CXCL10和CCL2以及TNFR1和TNFR2等炎症生物标志物的水平也随着巴利替尼的治疗而降低，提示巴利替尼通过抗炎作用对肾具有保护作用。
虽然临床前期和早期临床数据令人鼓舞，但巴利替尼或其他JAK抑制剂是否会在肾功能丧失和ESRD的发展以及其他并发症方面对DN的进展显示出积极的影响还尚不确定。另外，长期服用JAK抑制剂治疗DN是否安全？因为这些试剂被开发用于治疗自身免疫性疾病以及骨髓增生异常综合征，如果长期治疗可能致使许多DN患者贫血症状加重。
2. 新型抗糖尿病药物对DN的抗炎作用
2.1 SGLT2抑制剂
钠/葡萄糖协同转运蛋白2(SGLT2)抑制剂为新型的口服降糖药，达格列净、卡格列净和恩格列净是SGLT2抑制剂的药物，可用于降低高血糖症和帮助控制血糖。它们还可用于治疗轻度肾功能不全，并具有多种有益作用，例如降低体质量和降低血压[35]。SGLT2抑制剂的药动学特性有优异的口服生物利用度和相当长的消除半衰期，允许每天一次给药，较短的蓄积指数，无活性代谢产物，肾脏排泄不受限制[36]。
此外，SGLT2抑制剂可以改善β细胞功能，可能是减少葡萄糖毒性的作用所致[37-38]。有实验研究表明SGLT2抑制剂对肾脏组织也有抗炎作用。例如，恩格列净可降低糖尿病秋田小鼠IL-6、CCL2和NF-κB的肾表达[39]。同样，在培养的肾小管细胞中，恩格列净可降低了高糖诱导的TLR4、NF-κB和IL-6的过表达[35]。达格列净不仅减少尿蛋白的产生，而且还能降低db/db小鼠肾组织中炎症(CCL2和NF-κB)和氧化应激(NOX2和NOX4)的标志物水平[40]。有交叉临床试验，采用前瞻性、随机、双盲、安慰剂对照的方法，将33名2型糖尿病患者进行分组，评估SGLT2 抑制剂达格列净对肾小球标志物（IgG-IgG4和IgG-白蛋白）、肾小管标志物（尿液KIM-1、NGAL和LFABP）和炎症标志物的影响（尿MCP-1和IL-6），以便更深入地了解肾脏保护作用。经过达格列净治疗6周后显示，患者的尿中蛋白降低。同时，与安慰剂相比，达格列净使IgG和IgG4的清除率分别降低了28.4%和34.6%，使尿KIM-1排泄减少22.6%，但没有改变尿中NGAL的排泄量，使尿IL-6排泄减少23.5%，尿MCP-1排泄减少14.1%。结果提示，SGLT2抑制剂达格列净可能通过抗炎的作用保护DN患者的肾脏[41]。
2.2 GLP-1受体激动剂
胰高血糖素样肽1（GLP-1）受体激动剂（GLP-1RAs）是一种抗糖尿病药。迄今为止，已经批准上述6种GLP-1RA用于治疗2型糖尿病患者，并且所有这些药物均通过皮下注射给药[42]。基于药动学特征，可将GLP1受体激动剂的药物分为两个不同的组：短效激动剂（每日两次口服：艾塞那肽，利西拉肽）和长效激动剂（每周一次注射：杜拉鲁肽、利拉鲁肽、司马鲁肽、阿必鲁肽）[42-43]。
有分析表明，在降低糖化血红蛋白方面，长效激动剂比短效激动剂更为成功[44-45]。在STZ诱导的DN大鼠中，GLP1受体激动剂艾塞那肽的肾保护作用与其降糖作用无关[46]。在该模型中，给予艾塞那肽可降低细胞间黏附分子在肾脏组织中的表达和抑制NF-κB的激活。同样，用艾塞那肽治疗降低了糖尿病db/db小鼠肾小球浸润炎症细胞的水平。艾塞那肽能够改善DN与转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体-α(PPARα)的肾脏表达增加有关。这些实验都解释了GLP1受体激动剂的抗炎作用，因为PPARα调节参与了炎症的基因的表达(例如编码NF-κB、PAI-1和ICAM-1的基因)[47-48]。
3. 结论
预计在未来几十年中，随着肥胖人口数量的增加，全球糖尿病的负担将急剧增加。DN是糖尿病最重要的微血管并发症之一，它会大大增加心血管疾病的发病率和病死率[49]。目前，预防或减缓DN进展的疗法有广泛应用，然而这些疗法提供的保护还远远不够。我们还需要寻找治疗DN的新靶标和策略。针对DN的新疗法集中于调节炎症通路，控制DN的功能和结构异常。主要包括针对一些转录因子、促炎性细胞因子、趋化因子及其受体、黏附分子、JAK/STAT 通路以及Nrf2调节的抗氧化的化合物在临床前研究中显示出显著的功效。一些初期的临床试验（例如，巴利替尼、甲基巴多索隆）也在DN患者中取得了可喜的结果。同时，SGLT2抑制剂和GLP-1受体激动剂的临床试验也对DN患者产生了有益的影响。这无疑为通过调节炎症治疗DN的动物实验和临床试验带来理论指导和希冀。因此，在未来针对特定分子标记的抗炎目标可能是DN的有前途的治疗策略。
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表 1 N系列化合物对氟康唑耐药白念珠菌103和538的MIC80值
化合物 结构式 白念珠菌103 MIC80 (μg/ml） 白念珠菌538 MIC80 (μg/ml) N1 >16 >16 N2 0.5 1 N3 >16 16 N4 >16 >16 N5 >16 >16 N6 8 8 N7 >16 >16 N8 16 8 N9 >16 >16 
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表 2 N2化合物处理后菌株对应MIC80值
菌株名称 N2 MIC80（μg/ml） C. albicans SC5314 0.5 C. albicans 876 1.0 C. albicans 311 0.5 C. albicans 538 1.0 C. albicans 103 0.5 C. albicans 911 0.5 C. albicans 849 1.0 C. albicans 100 1.0 C. albicans 32 0.5 C. albicans 1010 1.0 Cryptococcus H99 1.0 Cryptococcus 30609 2.0 C. glabrata 537 0.5 C. tropicalis 293 0.5 C. parapsilosis 22019 0.5 C. krusei 463 2.0
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