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陈香露白露片的处方由陈皮、甘草、川木香、大黄、石菖蒲五味中药和碳酸镁、氧化镁、次硝酸铋、碳酸氢钠4种化学药组成[1]。方中陈皮行脾胃之气[2,3]，为君药，主要活性成分为橙皮苷、川陈皮素、橘皮素，与甘草配伍，健脾祛湿[4]；甘草苷、甘草酸铵为甘草的主要活性成分；川木香具行气止痛之效[5]，广泛用于腹痛，食欲不振等，木香烃内酯、去氢木香内酯为其主要活性成分。加之碳酸氢钠等碱性药物中和胃酸[6]，共成健胃和中、理气止痛功效。
陈香露白露片目前执行的质量标准为《卫生部药品标准WS3-B-1553-93》，该标准仅设置了化学药成分的质量控制参数，难以全面反映产品质量，存在较大的安全风险。为实现陈香露白露片内在质量的有效控制，本实验构建了同步测定陈香露白露片中甘草苷、甘草酸铵、橙皮苷、橘皮素、川陈皮素、木香烃内酯、去氢木香内酯等7种特征活性成分含量的HPLC方法。该研究不仅为提高该制剂质量提供了有效、可靠的分析方法，同时对药品安全风险评估的有效实施也具有重要的研究意义。
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1260高效液相色谱仪（安捷伦公司），配置DAD检测器；XS105DU电子天平、ME 204E电子天平（梅特勒-托利多公司）；KQ-300DE数控超声仪（昆山超声仪器有限公司）。
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对照品甘草苷（批号：111610-201908，含量95.0%）、甘草酸铵（批号：110731-202021，含量96.2%）、橙皮苷（批号：110721-202019，含量95.3%）、川陈皮素（批号：112055-202001，含量99.6%）、橘皮素（批号：112054-202001，含量99.8%）、木香烃内酯（批号：111524-201911，含量99.9%）、去氢木香内酯（批号：111525-201912，含量99.5%）均购于中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈（色谱纯，赛默飞公司）；其余试剂均为分析纯（购于国药集团化学试剂有限公司）；实验用水为娃哈哈纯净水。16批陈香露白露片样品来自3个生产厂家：广西圣特药业有限公司（企业1），批号201207（S1）、190202（S2）、200506（S3）、210106（S4）、210107（S5）、210110（S6）、201102（S7）；贵州百灵企业集团制药有限责任公司（企业2），批号20191211（S8）、20210105（S9）、20210111（S10）、20201212（S11）、20201001（S12）；四川康福来药业集团（企业3），批号200902（S13）、200901（S14）、201202（S15）、200601（S16），以上样品规格均为每片重0.3 g。
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采用ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相A为甲醇，流动相B为0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱（0~8 min，15% A；8~35 min，15% A→50% A；35~50 min，50% A；50~65 min，50% A→80% A；65~66 min，80% A→15% A；66~75 min，15% A），流速1.0 ml/min，柱温35 ℃，进样量10 μl，检测波长237 nm（0~15 min，检测甘草苷）、283 nm（15~25 min，检测橙皮苷）、237 nm（25~34 min，检测甘草酸铵）、330 nm（34~45 min，检测川陈皮素、橘皮素）、237 nm（45~75 min，检测去氢木香内酯、木香烃内酯）。
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取甘草苷、橙皮苷、甘草酸铵、川陈皮素、橘皮素、木香烃内酯、去氢木香内酯对照品适量，精密称定，用50%甲醇配制成浓度分别为55.72、1108、307.2、56.25、18.75、26.01、58.95 μg/ml的混合对照溶液。
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取陈香露白露片样品，研细，精密称取约1 g，置于锥形瓶中，精密加入25 ml 50%甲醇，超声30 min（功率250 W，频率33 kHz），放冷，精密称定，用50%甲醇补充损失的重量，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
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分别按陈香露白露片处方中各药比例制备缺陈皮、甘草、川木香的阴性样品，并按“2.2.2”项下方法制成缺陈皮、甘草、川木香的阴性供试品溶液。
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对照品溶液、供试品溶液及缺陈皮、甘草、川木香的阴性供试品溶液按“2.1”项下色谱条件进行测定分析。结果如图1所示，甘草苷、甘草酸铵、橙皮苷、川陈皮素、橘皮素、木香烃内酯、去氢木香内酯等7种成分与相邻峰分离良好，分离度均大于1.5；阴性样品中其他成分色谱峰均未对7种成分产生干扰，表明该分析方法专属性良好。
图 1 陈香露白露片HPLC色谱图
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精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液0.10、0.50、1.00、2.00、3.00、5.00 ml置于5 ml容量瓶中，用50%甲醇稀释，制备6个浓度的对照品溶液。按“2.1”项下色谱条件进行测定，并绘制标准曲线，其中横坐标为对照品的浓度（X，μg/ml），纵坐标为峰面积（Y）。7种成分线性范围、线性回归方程与相关系数见表1。结果显示，7种成分分别在各自浓度范围内线性关系良好。
表 1 7种成分的线性范围、线性回归方程与相关系数
成分 线性范围（μg/ml） 回归方程 r 甘草苷 1.110~55.72 Y=17125X+155.53 0.9992 橙皮苷 22.15~1108 Y =5784.3X+7.1165 0.9995 甘草酸铵 6.140~307.2 Y =15716X+375.13 0.9999 川陈皮素 1.130~56.25 Y =21135X+32.117 0.9997 橘皮素 0.3700~18.75 Y =20148X+72.316 0.9982 木香烃内酯 0.5200~26.01 Y=21432X+4.1189 0.9991 去氢木香内酯 1.180~58.95 Y=15235X-135.15 0.9999 -
取“2.2.1”项下对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件重复测定6次。结果显示甘草苷、甘草酸铵、橙皮苷、川陈皮素、橘皮素、木香烃内酯、去氢木香内酯峰面积6次测定结果的RSD分别为0.37%、0.38%、0.39%、0.42%、0.48%、0.75%、0.67%，表明该仪器精密度良好。
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按“2.2.2”项下方法平行制备6份陈香露白露片（批号：20210105）供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定。结果显示甘草苷、甘草酸铵、橙皮苷、川陈皮素、橘皮素、木香烃内酯、去氢木香内酯的含量依次分别为1.158、4.002、10.68、0.0633、0.1477、0.1323、0.2927 mg/g，其RSD分别为0.62%、0.65%、0.64%、1.05%、1.62%、0.87%、1.28%，表明该方法重复性良好。
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取同一供试品溶液（批号：20210105），放置 0、4、8、12、16、20、24 h后，按“2.1”项下色谱条件进行测定。结果显示甘草苷、甘草酸铵、橙皮苷、川陈皮素、橘皮素、木香烃内酯、去氢木香内酯峰面积的RSD依次分别为0.54%、0.68%、0.72%、1.02%、0.85%、1.60%、1.32%，表明该供试品溶液在24 h内具有良好的稳定性。
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取已知含量的陈香露白露片（批号：20210111）9份，每份约0.5 g，精密称定，基于样品中7种成分的含量分别按低、中、高3种浓度水平加入对照品溶液（每个浓度各3份），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件进行测定，结果显示7种成分的回收率分别为98.71%、98.12%、98.44%、98.22%、99.17%、99.18%、97.93%，RSD分别为0.16%、0.67%、0.57%、0.62%、0.48%、0.56%、0.58%，表明该方法准确性高。
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取16批陈香露白露片样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，并在“2.1”项下色谱条件测定样品。外标法计算16批次样品中7种成分的含量，结果见表2。结果显示16批样品中甘草苷、甘草酸铵、橙皮苷、川陈皮素、橘皮素、木香烃内酯、去氢木香内酯的含量分别为0.1250~1.174、2.354~7.426、1.822~27.21、0.0370~1.399、0.0723~0.4433、0.0140~0.1990、0.2207~1.407 mg/g。
表 2 16 批样品中7种成分含量测定结果（mg/g，n=2）
批号 甘草苷 橙皮苷 甘草酸铵 川陈皮素 橘皮素 木香烃内酯 去氢木香内酯 201207 0.5967 1.822 2.354 0.0847 0.1840 0.1990 0.9440 190202 0.6090 3.513 3.413 1.399 0.2773 0.0487 1.407 200506 1.053 9.611 3.643 0.351 0.0723 0.0140 0.4123 210106 0.6203 3.634 2.682 0.0433 0.0930 0.0673 0.2647 210107 0.6433 3.855 2.761 0.0480 0.2883 0.0460 0.2207 210110 0.2047 3.034 2.689 0.3313 0.1237 0.0993 0.2907 201102 0.6677 5.209 2.613 0.1530 0.2897 0.0417 0.4200 20191211 1.107 6.832 3.724 0.4360 0.0843 0.0180 0.2243 20210105 1.158 10.68 4.002 0.0633 0.1477 0.1323 0.2927 20210111 1.174 9.624 3.971 0.0370 0.0830 0.1857 0.8773 20201212 1.085 9.204 3.860 0.0993 0.2333 0.1890 0.4257 20201001 1.055 10.333 3.682 0.8917 0.1937 0.1023 1.293 200902 0.747 8.085 2.947 0.9430 0.2137 0.0870 1.326 200901 0.8807 27.21 3.080 1.044 0.2270 0.1263 0.5503 201202 0.5473 5.573 2.584 1.144 0.2437 0.1280 0.3333 200601 0.1250 5.374 7.426 0.0883 0.4433 0.0650 0.3890 -
本实验色谱条件参考《中华人民共和国药典》（2020年版）一部，237 nm为甘草苷、甘草酸铵的检测波长[7]，225 nm为木香烃内酯、去氢木香内酯的检测波长[7]，对两个检测波长均进行了待测成分响应值及专属性的考察，结果显示各成分在237 nm波长处响应值均较高且与杂质峰分离良好，故最终选择237 nm作为甘草苷、甘草酸铵、木香烃内酯、去氢木香内酯等4种成分的检测波长。而橙皮苷、川陈皮素、橘皮素均参考药典上的检测波长[7]。陈香露白露片中所含成分复杂，等度洗脱很难将7个化学成分同时分离，故采用梯度洗脱。
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利用SPSS软件以16批陈香露白露片中7种有效成分含量作为变量进行聚类分析。结果如图2所示，16批样品以度量值11为阈值，聚分为2大 类，其中一大类主要为企业2和3的样品，另一大类主要为企业1的样品。结果表明由于企业缺少对该品种中重要指标成分的含量控制，导致产品在不同企业，以及相同企业不同批次之间质量差异较大。
图 2 16批样品测定结果聚类分析图
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由表2得知，16批陈香露白露片7种主要成分含量差异较大。其中，橙皮苷含量差异主要表现在不同生产企业之间，主要原因可能是各生产企业使用了不同产地、不同采收期、不同生长年限的原药材导致的差异。而去氢木香内酯含量差异主要表现在同一生产企业的不同批次之间，其原因可能是药材养护措施不当、生产工艺控制参数不合理导致挥发性成分去氢木香内酯损失产生的差异。基于上述研究，建议生产企业加强对陈皮、甘草、川木香等原药材中关键活性成分的质量控制，建立高于《中华人民共和国药典》的内控标准，严格按批准的处方和生产工艺进行投料与生产，进一步提高陈香露白露片的质量一致性，从而实现其疗效的稳定性和有效性。
Simultaneous determination of seven constituents in Chenxiang Lubailu tablet by HPLC
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摘要:
目的 构建同步测定陈香露白露片中甘草苷、甘草酸铵、橙皮苷、川陈皮素、橘皮素、木香烃内酯和去氢木香内酯含量的HPLC法。 方法 采用ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为甲醇-0.1%磷酸溶液，梯度洗脱，流速1.0 ml/min，柱温35 ℃，检测波长237 nm（检测甘草苷、甘草酸铵、木香烃内酯、去氢木香内酯）、283 nm（检测橙皮苷）、330 nm（检测川陈皮素、橘皮素），进样量10 μl，对采集的16批次样品进行7种成分的含量检测。 结果 甘草苷、橙皮苷、甘草酸铵、川陈皮素、橘皮素、木香烃内酯、去氢木香内酯的线性范围分别为1.110~55.72（r=0.9992）、22.15~1108（r=0.9995）、6.140~307.2（r=0.9995）、1.130~56.25（r=0.9997）、0.3700~18.75（r=0.9982）、0.5200~26.01（r=0.9991）、1.180~58.95（r=0.9999）μg/ml。回收率（n=9）分别为98.71%、98.12%、98.44%、98.22%、99.17%、99.18%、97.93%，RSD分别为0.16%、0.67%、0.57 %、0.62%、0.48%、0.56%、0.58%。16批样品中甘草苷、甘草酸铵、橙皮苷、川陈皮素、橘皮素、木香烃内酯、去氢木香内酯的含量分别为0.1250~1.174、2.354~7.426、1.822~27.21、0.0370~1.399、0.0723~0.4433、0.0140~0.1990、0.2207~1.407 mg/g。 结论 该方法准确性高、重复性好、耐用性强，可用于陈香露白露片的质量控制和评价。 Abstract:Objective To establish the method for the simultaneous determination of liquiritin, ammonium glycyrrhizinate, hesperidin, nobiletin;tangeretin;costunolide, dehydrocostuslactone in Chenxiang Lubailu tablet by HPLC. Methods ZORBAX Eclipse XDB-C18 chromatographic column (4.6 mm×250 mm, 5 μm) was used. The mobile phase was methanol-0.1% phosphoric acid solution. Gradient elution with flow rate of 1.0 ml/min was used. Column temperature was 35 ℃. Detection wavelength for liquiritin, ammonium, tangeretin, and costunolide was at 237 nm. Detection wavelength for glycyrrhizinate was at 283 nm. Detection wavelength for hesperidin and nobiletin was at 330 nm. Injection volume was 10 μl. 16 batches of samples were tested. Results The linear ranges for the detection of liquiritin, ammonium, glycyrrhizinate, hesperidin, nobiletin, tangeretin, and costunolide were 1.110 - 55.72 (r=0.9992), 22.15 - 1108 (r=0.9999), 6.140 - 307.2 (r=0.9995), 1.130 - 56.25 (r=0.9997), 0.3700 - 18.75 (r=0.9982), 0.5200 - 26.01 (r=0.9991), and 1.180 - 58.95 (r=0.9999) μg/ml respectively. The average recoveries were 98.71%, 98.12%, 98.44%, 98.22%, 99.17%, 99.18%, and 97.93%, and the RSDs were 0.16%, 0.67%, 0.57%, 0.62%, 0.48%, 0.56%, and 0.58% respectively. The contents of the seven components in 16 batches of samples were 0.1250 - 1.174, 2.354 - 7.426, 1.822 - 27.21, 0.0370 - 1.399, 0.0723 - 0.4433, 0.0140 - 0.1990, and 0.2207 - 1.407 mg/g respectively. Conclusion The method is accurate, reproducible and durable, which could be used to the quality control and evaluation of Chenxiang Lubailu tablet. -
Key words:
- HPLC /
- Chenxiang Lubailu tablet /
- liquiritin /
- ammonium glycyrrhizinate /
- hesperidin /
- nobiletin /
- tangeretin /
- costunolide /
- dehydrocostuslactone
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山莨菪碱是托品酸和有机碱形成的酯类，结构与阿托品和东莨菪碱相类似，在托品基的6位碳原子上有不对称的羟基，是一种天然的莨菪烷类生物碱[1-3]。山莨菪碱属于非选择性的毒蕈碱受体阻断剂，能够阻断M1和M5受体亚型。因此，山莨菪碱有一系列相似于阿托品的药理作用[4]，如抑制唾液分泌、抑制胃酸和汗液分泌、抑制胃肠蠕动及膀胱收缩，其他还包括散瞳、扩张支气管等[5]，适用于胃或肠道的绞痛、急性微循环障碍及有机磷酸中毒等临床病症[4，6]。但单独使用山莨菪碱用药剂量大，故常出现口干、面红、视近物模糊、心跳加快、排尿困难等阿托品样副作用，因此极大限制了其在临床上的广泛应用。近年来，随着对山莨菪碱注射液及其衍生物药理作用的深入研究，发现其胆碱能抗炎通路对慢性炎症如风湿性关节炎、溃疡性结肠炎等慢性疾病具有较好的药效作用[4]。但这些疾病的疗程较长，如何降低或消除山莨菪碱在治疗过程中的阿托品样副作用是临床现实问题。
新斯的明是胆碱酯酶抑制剂，进入机体后，通过可逆性抑制胆碱酯酶活性，使乙酰胆碱不能水解，从而提高体内受体部位的乙酰胆碱浓度，加强和延长乙酰胆碱的作用，呈现出全部胆碱能神经兴奋的效应[4]。将毒蕈碱受体阻断剂和胆碱酯酶抑制剂这两类药物以适当的比例联合使用（即复方山莨菪碱）来协同激活胆碱能抗炎通路，增强其抗炎效果并降低其副作用的治疗方案，有望为临床治疗类风湿性关节炎提供新的治疗方案[4]。
前期的研究结果显示：通过将盐酸消旋山莨菪碱与甲硫酸新斯的明组合制备而成的复方山莨菪碱注射液不仅对类风湿关节炎具有良好的抗炎效果，还可明显降低山莨菪碱的阿托品样不良反应。但目前国内外未见有关复方山莨菪碱注射液遗传毒性安全性评价方面的研究报道。为提高临床用药的安全性，本实验采用鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验（Ames试验）、体外培养CHO细胞染色体畸变试验和ICR小鼠骨髓微核试验方法评价其是否具有遗传毒性，为进一步的临床研究提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 受试物及溶媒对照
受试物为复方山莨菪碱注射液,两种成分的化学分子结构式详见图1和图2（无色澄明溶液，批号20101222；规格：5 ml中含盐酸消旋山莨菪碱1 g与甲硫酸新斯的明2 mg；由海军军医大学药学系提供）。溶媒对照为氯化钠注射液（无色透明液体，批号110714K2，安徽丰原药业股份有限公司）。
1.2 菌株及细胞
组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌（S.typhimurium）TA1535、TA102、 TA100、TA98和TA97 5个菌株，由复旦大学公共卫生学院环境卫生教研室赠予，储存于液氮中。实验前进行菌株鉴定，均符合规定标准。CHO细胞由国家上海新药安全评价研究中心赠予。
1.3 大鼠肝微粒体酶S9
购自美国MOLTOX公司（批号分别为2765和2715，有效期至：2013-05-17和2012-02-12），保存于−80 ℃冰箱。
1.4 动物
选用60只SPF级的ICR小鼠，雌雄各半（上海市西普尔-必凯动物有限公司，合格证号2008001616722）。检疫期为3 d，每日观察动物的外观、粪便和摄食等情况并记录。自购入日起的当日和检疫结束当日共两次称量所有动物的体重（检疫结束时的体重：雌鼠21.24～23.74 g; 雄鼠21.32～23.72 g），且根据该体重将雌、雄小鼠分别按随机区组法分组，共分为6组，每组10只。
1.5 试验方法
按《药物遗传毒性研究技术指导原则》等[8-9]的设计要求，选用标准试验组合中的细菌回复突变试验 [10]，体外染色体畸变试验[11]和体内微核试验[12]来全面评价复方山莨菪碱注射液的遗传毒性。
1.5.1 细菌回复突变试验[13-17]
应用组氨酸缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌TA1535、TA102、TA100、TA98和TA97共5种菌株进行测试。对不受溶解度或细胞毒性限制的受试物最高浓度应达到5 mg/皿 [10]，故设复方山莨菪碱注射液（以5 ml中含盐酸消旋山莨菪碱1 g与甲硫酸新斯的明2 mg为计）总剂量为0.5、5、50、500、5 000 μg/皿共5组，此外还有对照组，包括空白对照、溶媒对照和阳性对照。按标准的平板掺入法操作，细菌在有或没有S9代谢活化系统（-S9组在每个平皿的试验体系中加入0.5 ml的磷酸缓冲液，+S9组在每个平皿的试验体系中加入0.5 ml的S9混合液）的平行条件下，将相应浓度的受试物溶液、溶媒对照品（氯化钠注射液）或阳性对照品溶液分别加入到无菌的试管中（表1和表2）0.1 ml，每个组别均设3个平行。以上所有物质与顶层琼脂混匀后，迅速铺浇到底层琼脂平板上，待其凝固后倒置培养48~72 h，通过肉眼或显微镜仔细观察各剂量组的菌苔是否正常，区分受试物沉淀与白色菌落，判断是否有由受试物导致的明显抑菌现象，接着采用手工计数的方法记录每皿中全部回复突变的菌落数量，统计3个平行皿的均值和标准差，与溶媒对照组进行比较。按上述操作再验证一次。
表 1 复方山莨菪碱注射液的第1次Ames试验结果(个/皿，$\bar x $ ±s，n=3)剂量组
(μg/皿)TA97 TA98 TA100 TA102 TA1535 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 5 000 76.7±4.2 76.3±3.2 46.3±2.3 38.3±6.8 96.3±10.5 112.7±17.0 123.0±2.6 170.7±38.3 15.3±5.0 33.3±9.5 500 69.3±8.3 112.0±12.2 46.0±1.7 45.7±9.7 97.3±11.4 115.3±17.9 187.0±53.8 166.7±41.6 28.3±4.5 30.7±2.1 50.0 74.7±1.2 83.7±14.8 36.7±7.0 39.3±12.8 85.3±3.0 132.7±20.0 183.3±5.7 159.0±36.8 31.3±8.1 30.0±10.5 5.0 76.7±12.3 64.7±11.0 40.7±12.2 36.3±13.6 138.7±47.4 137.7±15.9 158.3±17.4 155.0±32.6 25.3±3.2 27.3±8.3 0.5 63.0±5.2 74.0±20.3 42.7±12.8 36.3±11.9 138.0±45.4 119.3±10.3 176.0±44.2 170.7±40.0 23.3±1.2 29.3±5.7 空白对照 90.7±29.5 78.7±2.3 35.0±4.4 41.3±8.1 119.3±14.0 125.3±9.2 201.3±21.4 192.0±20.8 27.3±6.8 28.0±3.6 溶媒对照 72.0±12.0 72.0±11.1 35.3±2.3 37.0±2.0 121.3±9.0 123.3±9.4 167.3±18.6 210.0±25.0 32.3±6.6 30.0±2.0 阳性对照 653.3±83.3 583.3±28.9 714.0±53.0 625.3±162.0 802.7±140.9 651.0±64.5 1093.3±122.2 1026.7±83.2 622.7±189.9 752.0±44.5 阳性对照品：-S9组TA97、TA98敌克松（50 μg/皿），TA100、TA102 甲基磺酸甲酯（1 μg皿）；TA1535 4-硝基喹啉-N-氧化物（0.5 μg/皿)+S9组TA97、TA98、TA100 2-AF（10 μg/皿）；TA102 1,8-二羟基蒽醌（50 μg/皿）；TA1535环磷酰胺（50 μg/皿） 表 2 复方山莨菪碱注射液的第2次Ames试验结果(个/皿，$\bar x $ ±s，n=3)剂量组
(μg/皿)TA97 TA98 TA100 TA102 TA1535 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 5 000 65.0±23.4 64.7±15.7 17.0±3.5 25.7±1.5 74.3±1.0 89.0±4.4 108.3±6.6 102.7±19.2 18.3±2.1 16.0±3.5 500 73.0±6.1 69.0±12.1 22.0±6.9 20.3±2.9 82.3±24.4 97.7±7.8 162.0±45.4 169.3±31.0 20.0±4.6 19.0±5.6 50.0 74.0±26.4 78.3±7.1 20.0±6.2 24.3±7.5 82.3±29.4 88.0±8.2 188.3±4.5 157.0±37.6 22.0±5.3 20.0±3.6 5.0 60.7±16.8 58.0±8.0 24.0±3.0 21.3±3.9 92.0±45.2 89.7±10.0 162.7±51.0 161.0±35.0 22.7±9.8 21.0±3.6 0.5 56.7±8.1 68.7±11.8 21.0±6.0 19.0±1.7 104.0±31.2 97.7±7.6 143.0±56.2 157.3±41.0 20.0±2.6 24.0±2.0 空白对照 80.7±7.0 76.7±2.1 25.3±2.5 22.3±6.8 110.0±10.0 102.7±30.6 221.3±34.0 151.0±36.8 17.3±3.0 15.0±5.2 溶媒对照 85.7±7.6 84.0±7.0 24.0±5.2 21.3±3.0 111.3±21.9 92.3±7.4 169.3±18.0 155.0±32.4 30.3±9.3 23.3±5.0 阳性对照 660.0±66.8 581.0±157.0 564.0±65.8 618.7±112.1 565.3±65.2 657.3±115.7 1064.0±24.0 1044±26.2 552.0±78.0 597.0±89.3 阳性对照品：-S9组TA97、TA98敌克松（50 μg/皿），TA100、TA102 甲基磺酸甲酯（1 μg皿）；TA1535 4-硝基喹啉-N-氧化物（0.5 μg/皿)+S9组TA97、TA98、TA100 2-AF（10 μg/皿）；TA102 1,8-二羟基蒽醌（50 μg/皿）；TA1535环磷酰胺（50 μg/皿） 1.5.2 体外染色体畸变试验[13-17]
采用体外培养的CHO细胞在有或没有S9代谢活化系统的平行条件下进行测试。预试验最高浓度设定为5 mg/ml，再按等比级数设计若干个浓度。正式试验的最高浓度产生的细胞毒性应约为50% [11]。故根据预试验测定IC50（50 %细胞生长抑制浓度）为235.0 μg/ml，因此一共设3个剂量组，依次为58.75、117.5和235.0 μg/ml，另设阳性对照组（-S9组为0.5 μg/ ml丝裂霉素C溶液，+S9组为60 μg/ ml环磷酰胺溶液）和溶媒对照组（氯化钠注射液），每个组别均设2个平行。-S9/4 h组和+S9/4 h组：受试物作用细胞4 h后弃全部培养基，用PBS洗涤后重新添加新的10 ml 1640完全培养基，放入培养箱中继续培养至24 h后收集细胞；-S9/24 h组：受试物作用细胞24 h后收集细胞。终止培养前4 h加入20 μg/ml秋水仙碱，目的是使大部分细胞的有丝分裂停止在中期相，所有细胞依次经过0.75% KCl低渗、固定（甲醇∶冰乙酸=3∶1）、涂片和Gimsa染色处理，在显微镜下选择染色体数目完整且分散良好的中期分裂相染色体作为观察对象，观察染色体数量和结构的改变。分别记录各组含有结构畸变染色体的细胞数和畸变类型（表3），计算每组的染色体畸变率。
表 3 复方山莨菪碱注射液对体外培养CHO细胞的染色体畸变试验结果剂量组(μg/ml) 观察细胞数
（个）各类染色体畸变数 畸变细
胞数/个畸变率
（%）断裂 断片 双着丝粒 三辐体 四辐体 碎片或微小体 环状 -S9/24 h 溶媒对照组 200 0 0 2 0 0 0 0 2 1.0 58.75 200 0 0 0 0 0 0 0 0 0 117.5 200 0 0 0 0 0 0 0 0 0 235.0 200 2 0 0 0 0 0 0 2 1.0 阳性对照组 100 25 2 0 3 0 4 0 21 21.0* -S9/4 h 58.75 200 1 0 0 0 0 0 0 1 0.5 117.5 200 1 0 0 0 0 0 0 1 0.5 235.0 200 2 0 0 0 0 0 0 2 1.0 +S9/4 h 溶媒对照组 200 0 0 0 0 0 1 0 1 0.5 58.75 200 2 0 0 0 0 0 0 2 1.0 117.5 200 1 0 0 0 0 0 0 1 0.5 235.0 200 1 0 1 0 0 0 0 2 1.0 阳性对照组 100 15 1 0 1 1 8 0 20 20.0* *P<0.05，与溶媒对照组比较。 1.5.3 体内微核试验[13-17]
采取与临床拟用途径一致的给药方式[12]，对ICR小鼠采用单次经尾静脉注射的给药方式。根据受试物急性毒性的试验结果：半数致死量LD50为60.4 mg/kg。本次试验的最高剂量为1/2 的LD50，最高剂量之下的其他剂量保持剂量间距为2～3倍[12]。故共设3个剂量组（分别为7.5、15.0和30.0 mg/kg），及溶媒对照组（氯化钠注射液，给药方式与受试物组相同）和阳性对照组（剂量为40 mg/kg的环磷酰胺溶液，临用时用氯化钠注射液配制成4.0 mg/ml的环磷酰胺溶液，给药方式为单次腹腔注射），给药容积均为10 ml/kg。因此，总共有六组，其中的高剂量组有两组，分别在药物作用24 h和48 h后处死，除高剂量48 h组外，其他组均在药物作用24 h后处死。取小鼠两侧大腿股骨制备骨髓涂片，每只小鼠制2张骨髓片，自然干燥后染色。所有动物均镜检约1 000个嗜多染红细胞（PCE），计数含微核的PCE数（MNPCE），统计微核发生率，在记录200个PCE的同时计数观察到的所有正染红细胞（NCE）的数量（表4），通过PCE/NCE值来评价受试物是否具有骨髓毒性。
表 4 复方山莨菪碱注射液对ICR小鼠骨髓微核试验结果剂量组
(mg/kg)动物数
（只）雄鼠 雌鼠 观察PCE数（个） PCE/ (PCE +NCE) 微核率（$\bar x $±s, ‰） 观察PCE数（个） PCE/(PCE +NCE) 微核率（$\bar x $±s, ‰） 溶媒对照组 5 10 125 1.00±0.15 0.40±0.22 10 364 1.03±0.16 0.30±0.27 7.5 5 10 079 1.33±0.16 0.60±0.22 10 085 0.98±0.19 0.40±0.41 15.0 5 10 019 1.33±0.38 2.00±0.35 10 086 1.56±0.11 2.38±1.07 30.0（24 h采样） 5 9 879 1.37±0.30 2.12±1.07 10 131 1.34±0.12 2.07±1.08 30.0（48 h采样） 5 9 340 1.44±0.30 1.38±1.31 9 642 1.45±0.22 1.45±0.94 阳性对照组 5 10 192 0.78±0.10 17.62±10.40* 10 673 0.85±0.09 26.31±4.34* *P<0.05，与溶媒对照组比较。 1.6 判定标准
细菌回复突变试验的结果判定是将各剂量组的受试物与溶媒对照组的回复突变菌落数进行比较，如果某个组别的回复突变菌落数是溶媒对照组突变菌落数的2倍及以上，且可重复性，并在剂量范围内存在着剂量-反应关系，则判断为阳性；体外染色体畸变试验和体内微核试验的结果，也是与溶媒对照组进行比较，均采用卡方检验，检验标准以P<0.05为有统计学差异。
2. 结果
2.1 细菌回复突变试验
所有平皿经均未见杂菌污染，可观察到目标菌苔的正常生长。所有菌株的自发回复突变菌落数和阳性物诱发的回复突变菌落数都在历史对照数据库的范围内，且阳性对照组与空白对照组相比回复突变菌落数是显著增加的，该结果提示整个试验系统符合要求[13-17]。最高浓度已达到5 mg/皿时，未观察到复方山莨菪碱注射液的抑菌现象。两种平行条件下，即有或没有S9代谢活化系统中，各剂量组的受试物所诱发的回复突变菌落数均与自发的回复突变菌落数接近，未见明显的剂量-反应关系。两次结果见表1和表2。
2.2 体外染色体畸变试验
经显微镜观察，阳性对照组能显著诱发细胞染色体的畸变，与溶媒对照组相比差异均有统计学意义（P<0.05），验证了该系统的有效性[13-17]；复方山莨菪碱注射液各剂量组的CHO细胞染色体畸变率与溶媒对照组相比差异均无统计学意义（P>0.05），结果见表3。
2.3 体内微核试验
各剂量组小鼠在给药后未见异常，且未出现动物死亡。雌、雄小鼠在给予阳性对照品后，其骨髓嗜多染红细胞的微核发生率与溶媒对照组相比均有统计学意义（P<0.05），提示试验系统符合要求[13-17]。复方山莨菪碱注射液各剂量组的雌、雄小鼠骨髓PCE/(PCE+NCE) > 50%，即受试物对骨髓无抑制作用，各剂量组微核率与溶媒对照组相比均无统计学意义（P>0.05）。结果见表4。
3. 讨论
作为单药，山莨菪碱与甲硫酸新斯的明均已进行过完整的遗传毒性评价，且皆为阴性。但既往研究表明，药物联合作用可改变单药的致突变性。用TA98、TA100和TA102菌株对顺铂和卡铂与新斯的明、博莱霉素、5-氟尿嘧啶和长春新碱联合用药的遗传毒性进行评价，发现药物之间的相互作用会产生抗致突变性作用，联合用药时的致突变性比单药要低[18]。复方山莨菪碱是由盐酸消旋山莨菪碱与甲硫酸新斯的明按照500:1的比例组成的复方注射剂，为考察其是否会产生与单药不同的遗传毒性，本研究按照《药物遗传毒性研究技术指导原则》[8]推荐的组合方法，分别从体外到体内，从微生物、离体细胞和整体动物水平上对复方山莨菪碱注射液的遗传毒性进行了评价，该试验组合能检测染色体畸变、基因突变等多个遗传学终点[8-9]。Ames试验表明复方山莨菪碱注射液在0.5、5、50、500、5 000 μg/皿受试剂量下，两种平行条件下，即有或没有S9代谢活化系统时，与溶媒对照组的突变菌落数进行比较，各剂量组所诱发的回复突变菌落数均和其相近。CA试验结果表明58.75、117.5和235.0 μg/ml 3个剂量的受试物，所有剂量在两种平行的系统条件下（即有或没有S9代谢活化系统时）对CHO细胞的染色体无明显的畸变影响。MNT试验设的7.5、15.0和30.0 mg/kg 3个剂量，对ICR小鼠骨髓的微核诱发率均无统计学意义（P>0.05）。以上结果显示，在本实验条件下,复方山莨菪碱注射液对鼠伤寒沙门氏菌无致突变性，对哺乳动物培养细胞染色体无致畸变作用，对ICR小鼠骨髓嗜多染红细胞无诱发微核的效应；此也提示复方山莨菪碱注射液在受试条件下对人体不具有潜在致癌性和遗传毒性。
综上可知，在本实验条件下结果提示复方山莨菪碱注射液不具有遗传毒性和潜在致癌性，与单方相关的文献报道结论基本相符，本研究结果为该药的临床安全性评价提供了前期科学依据。
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图 1 陈香露白露片HPLC色谱图
1.甘草苷; 2.橙皮苷; 3.甘草酸铵; 4.川陈皮素; 5.橘皮素; 6.木香烃内酯; 7.去氢木香内酯; A.混合对照品; B.供试品; C.缺川木香阴性样品; D.缺甘草阴性样品; E.缺陈皮阴性样品
表 1 7种成分的线性范围、线性回归方程与相关系数
成分 线性范围（μg/ml） 回归方程 r 甘草苷 1.110~55.72 Y=17125X+155.53 0.9992 橙皮苷 22.15~1108 Y =5784.3X+7.1165 0.9995 甘草酸铵 6.140~307.2 Y =15716X+375.13 0.9999 川陈皮素 1.130~56.25 Y =21135X+32.117 0.9997 橘皮素 0.3700~18.75 Y =20148X+72.316 0.9982 木香烃内酯 0.5200~26.01 Y=21432X+4.1189 0.9991 去氢木香内酯 1.180~58.95 Y=15235X-135.15 0.9999 
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表 2 16 批样品中7种成分含量测定结果（mg/g，n=2）
批号 甘草苷 橙皮苷 甘草酸铵 川陈皮素 橘皮素 木香烃内酯 去氢木香内酯 201207 0.5967 1.822 2.354 0.0847 0.1840 0.1990 0.9440 190202 0.6090 3.513 3.413 1.399 0.2773 0.0487 1.407 200506 1.053 9.611 3.643 0.351 0.0723 0.0140 0.4123 210106 0.6203 3.634 2.682 0.0433 0.0930 0.0673 0.2647 210107 0.6433 3.855 2.761 0.0480 0.2883 0.0460 0.2207 210110 0.2047 3.034 2.689 0.3313 0.1237 0.0993 0.2907 201102 0.6677 5.209 2.613 0.1530 0.2897 0.0417 0.4200 20191211 1.107 6.832 3.724 0.4360 0.0843 0.0180 0.2243 20210105 1.158 10.68 4.002 0.0633 0.1477 0.1323 0.2927 20210111 1.174 9.624 3.971 0.0370 0.0830 0.1857 0.8773 20201212 1.085 9.204 3.860 0.0993 0.2333 0.1890 0.4257 20201001 1.055 10.333 3.682 0.8917 0.1937 0.1023 1.293 200902 0.747 8.085 2.947 0.9430 0.2137 0.0870 1.326 200901 0.8807 27.21 3.080 1.044 0.2270 0.1263 0.5503 201202 0.5473 5.573 2.584 1.144 0.2437 0.1280 0.3333 200601 0.1250 5.374 7.426 0.0883 0.4433 0.0650 0.3890
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