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组织蛋白酶K(CTSK) 属于半胱氨酸蛋白酶，是细胞内重要的溶酶体酶，在很多组织中有表达，如肺、脑、皮肤、骨骼和甲状腺等。CTSK在体内主要发挥降解骨胶原蛋白、弹性纤维蛋白、甲状腺球蛋白及细胞外基质的作用，与人类多种疾病密切相关，如肿瘤[1]、骨疾病、心血管疾病和肺纤维化等[2]。CTSK最早发现在破骨细胞特异性高表达，主要发挥降解骨基质中含量达95%的Ⅰ型胶原[2]。基于生物化学和结构分析研究发现CTSK与黏多糖（GAGs)可形成一种复合物，如硫酸软骨素(chondroitin-4-sulfate, C4S或CSA)，且只有这种复合物形成下才能更好发挥降解胶原作用[3]。
二至丸是治疗肾阴虚症的经典名方，由女贞子和墨旱莲组成，经考证出自明代吴曼辑所著的《扶寿精方》，收载于2020版《中国药典》，具补益肝肾，滋阴止血功效[4]。药理研究发现二至丸具有保肝降酶、增强免疫调节、改善血液系统功能、抗肿瘤、抗骨质疏松、抗衰老、抗氧化、抗变态反应性炎症和植物雌激素样等作用[5]。临床报道，二至丸常用于治疗骨质疏松[6-8]，药理发现二至丸显著降低去卵巢骨质疏松大鼠血清中CTSK水平[5]。我们前期研究发现墨旱莲的正丁醇提取部位和活性成分墨旱莲皂苷IX能显著抑制CTSK的胶原降解活性[9]。因此，二至丸很有可能存在抑制组织蛋白酶K的活性成分，故有可能从中筛选组织蛋白酶K抑制剂。本研究采用荧光偏振法考察CTSK与硫酸软骨素A(CSA)复合物形成活性，荧光光度法考察CTSK与合成荧光底物benzyloxycarbonyl-Phe-Arg-7-amido-4-methylcoumarin (Z-FR-MCA)结合活性，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳法考察CTSK降解生理底物胶原蛋白和明胶的活性，以期从二至丸不同提取部位和活性成分中筛查具有抑制CTSK活性的抑制剂，最终阐明二至丸抑制CTSK酶活性的物质基础。
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墨旱莲、酒女贞子药材购自上海华宇药业有限公司, 经海军军医大学生药学教研室韩婷教授鉴定墨旱莲为菊科植物鳢肠 Ecliptaprostrata L. 的干燥地上部分，女贞子为木犀科植物女贞Ligustrum lucidum Ait.的干燥成熟果实。其活性成分异毛蕊花糖苷、橄榄苦苷、蟛蜞菊内酯、熊果酸、齐暾果酸、蒙花苷、槲皮苷、木樨草苷、异去甲基蟛蜞菊内酯、松果菊苷、特女贞苷、红景天苷、女贞苷、女贞苷G13等24种标准品均购自成都瑞芬思生物科技有限公司。
Z-FR-MCA购自日本WAKO公司；E-64 (L-3-carboxy-trans-2-3-epoxypropionyl-leucylamido-(4guanidino)-butane)和硫酸软骨素A (CSA)购自美国Sigma公司；荧光标记硫酸软骨素A(CSA*)购自日本株式会社Cosmo Bio公司；人I型胶原蛋白(Human collagen I)购自美国Affymetrix公司，牛不溶性I型胶原蛋白(Bovine type I insoluble collagen) 购自生工生物工程(上海)公司。
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墨旱莲500 g，加入10倍量水(W/V)，煎煮2次，每次1 h，合并提取液，煎煮浓缩，冷冻干燥，粉碎得墨旱莲水提取物。酒女贞子按照2020版药典二至丸制备方法，粉碎过80目筛。将酒女贞子粉末500 g与墨旱莲水提取物粉末混匀，用10倍量正丁醇(W/V)回流提取2次，每次1 h，过滤，合并滤液，旋转蒸发浓缩后，冷冻干燥得正丁醇部位提取物。滤渣挥干，按照正丁醇方法依次分别用石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯溶液对滤渣进行萃取，冷冻干燥得到二至丸的正丁醇、石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯提取物。
研究报道二至丸的活性成分，主要包括墨旱莲三萜皂苷类和女贞子环烯醚萜苷类成分，及一些黄酮类、苯乙醇苷类等成分[10-12]。本研究30个成分中墨旱莲皂苷 (Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ) 和刺囊酸是由墨旱莲正丁醇部位经凝胶柱层析分离得到[9]，墨旱莲中蟛蜞菊内酯、异去甲基蟛蜞菊内酯、木樨草素、槲皮苷、木樨草苷和女贞子中异毛蕊花糖苷、橄榄苦苷、熊果酸、齐暾果酸、木樨草素、槲皮苷、木樨草苷、松果菊苷、特女贞苷、红景天苷、女贞苷、女贞苷G13、3-O-乙酰基齐墩果酸、19α-羟基熊果酸、大黄素甲醚、β-谷甾醇、3, 4-二羟基苯乙醇、对羟基苯乙醇等成分为购买标准品。
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二至丸不同提取部位和化合物用DMSO溶解分别配置40 mg/ml和10 mmol/L的储备溶液，并在分析之前用100 mmol/L醋酸钠缓冲液(pH5.5，包含2.5 mmol/L DTT和2.5 mmol/L EDTA) 分别稀释至浓度为25 µg/ml和 25 µmol/ml (DMSO低于１%)，加入黑色荧光96孔板，最终反应容量为0.2 ml。加入终浓度为5 nmol/L的CTSK孵育5 min，加入Z-FR-MCA底物(终浓度1 mmol/L)，孵育30 s，实时检测5 min荧光生成斜率(slope)值(发散光波长460 nm，吸收光波长355 nm)。所有测量均使用荧光仪Tecan spark（美国）在96孔板中进行，单孔体积为200 µl。实验设阴性对照组(无抑制剂)，阳性对照组(E-64，活性位点抑制剂)。计算公式：抑制率(%)= 100−(1−Vi /V0)。Vi和V0分别表示存在和不存在抑制剂情况下的荧光信号。
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将100 µg/ml不同部位或25 µmol/ml有效成分与200 nmol/L的CTSK在含有2.5 mmol/L DTT和EDTA的100 mmol/L醋酸钠缓冲液（pH 5.5）中，混匀放置5 min，然后添加20 nmol/L CSA*，混匀放置15 min，室温下实时检测5 min荧光生成斜率(slope)值(发散光波长485 nm，吸收光波长520 nm)，所有测量均使用荧光仪Tecan spark（美国）在黑色荧光96孔板中进行，总体积为100 µl。设置不使用抑制剂（阴性对照）和300 mmol/L NaCl（阳性对照）。CTSK和FP之间的关系使用抑制百分比进行分析，计算公式：抑制率(%)=100− [（100×（FPCTSK/抑制剂/CSA*−FP CSA*）/（FPCTSK/CSA*−FP CSA*）]其中，FPCTSK/抑制剂/CSA*和FPCTSK/CSA*分别是在存在和不存在抑制剂的情况下测定荧光信号。
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人I型胶原0.6 mg/ml溶解于100 mmol/L醋酸钠缓冲液(pH5.5，包含2.5 mmol/L DTT和2.5 mmol/L EDTA)中，依次加入CTSK (最终浓度400 nmol/L)、CSA (最终浓度200 nmol/L) 和400 μg/ml二至丸不同提取部位或不同浓度潜在抑制剂(100、80、60、40、20、10 μmol/L)，加入到含有I型胶原蛋白的缓冲液，单孔体积50 μl，混匀，28 ℃孵育4 h。取出后加入1μl的 100 μmol/L E64终止反应。采用10%的SDS-PAGE凝胶电泳分离，考马斯亮蓝染色20 min，用乙酸-甲醇(4∶1)脱色。I型胶原的α1条带的灰度用ImageJ 2软件进行定量分析。
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称取1 mg不溶性牛I型胶原蛋白置于1.5 ml EP管中，加入1 μmol/L CTSK酶和25 μmol/L潜在抑制剂于40 μl缓冲液中(100 mmol/L醋酸盐缓冲液，pH值5.5，含有2.5 mmol/L DTT和2.5 mmol/L EDTA)。采用Z-FR-MCA底物结合活性方法在T0 min测定CTSK活性，在37 ℃下孵育30 min后，检测T30 min时的CTSK活性。从中取出40 μl上清液，添加2.0 μl NaCl（最终300 mmol/L），然后再次检查CTSK活性，记录为T30salt min。计算公式：结合率(%)=[1−(T0 min−T30salt min)/(T0 min−T30 min)]×100%。
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用Discovery studio 2016软件中的libdock分子对接方法考察活性成分和组织蛋白酶K(1ATK) 蛋白进行刚性对接。利用LibDock得分作为表征化合物与活性位点结合的核心指标。LibDock得分分数越高，小分子与受体结合的活性越高。
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每组实验重复3次。采用SPSS软件经ANOVA方差分析检验，若有显著性差异(α=0.05)，再采用Student's t检验进行两组比较，以P<0.05为差异有统计学意义。
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本研究考察了DMSO浓度(10%、5%、2%和1%)对CTSK的Z-FR-MCA活性和CTSK/CSA*复合物形成活性高通量筛查方法，及SDS-PAGE胶原降解活性筛选方法的影响。结果发现，10%、5%、2%的DMSO显著抑制CTSK的Z-FR-MCA底物结合(图1A)和CTSK/CSA*复合物形成活性(图1B)。10%的DMSO显著抑制CTSK的胶原降解，1%和2%的DMSO对胶原降解无明显抑制作用。因此，本研究筛查二至丸的抑制CTSK活性方法将DMSO浓度控制在1%以下。
图 1 DMSO浓度对CTSK抑制剂筛查方法的影响
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对二至丸的不同提取部位(正丁醇、石油醚、乙酸乙酯和二氯甲烷) 进行了抑制CTSK活性筛选，其中Z-FR-MCA底物结合实验结果显示，二至丸的石油醚部位抑制作用明显，为96.3%，正丁醇、乙酸乙酯、二氯甲烷提取部位抑制率分别为26.1%、50.8%和43.5%（见图2A）。二至丸正丁醇、石油醚、乙酸乙酯和二氯甲烷提取部位提取物对CTSK/CSA*复合物形成的抑制率分别为99.6%、52.0%、94.8%和59.8%（见图2B），胶原降解活性结果显示二至丸的正丁醇部位抑制作用最明显，达到100%，石油醚提取部位抑制作用为58%，二氯甲烷和乙酸乙酯提取部位作用也不明显，分别为33.1%和6.7%（见图2C和2D）。
图 2 二至丸的不同部位提取物抑制CTSK活性作用
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本研究对30种二至丸中的活性成分进行了体外筛选，结果发现25 μmol/L的墨旱莲皂苷Ⅸ、异毛蕊花糖苷、蟛蜞菊内酯、木樨草素、槲皮素、松果菊苷、女贞苷、特女贞苷、3,4-二羟基苯乙醇和对羟基苯乙醇抑制CTSK/CSA*复合物形成的抑制率超过50%，表儿茶素没食子酸酯为51.2%。而在25 μmol/L时，仅有齐墩果酸、3-0-乙酰基齐墩果酸、19α-羟基熊果酸、3,4-二羟基苯乙醇、对羟基苯乙醇对CTSK与Z-FR-MCA结合活性有超过50%的抑制率，熊果酸为47.1%抑制率。采用libdock技术发现仅有3,4-二羟基苯乙醇和对羟基苯乙醇与CTSK活性位点对接有得分。因此，这些超过50%抑制率的二至丸活性成分被认为具有潜在抑制胶原降解活性。 针对以上12种活性成分，进行胶原降解抑制实验，结果显示在100 μmol/L时，墨旱莲皂苷Ⅸ，对胶原降解抑制率达70.3%，女贞苷53.2%，蟛蜞菊内酯达50.1%和表儿茶素没食子酸酯为60.2%。异毛蕊花糖苷、木樨草素、槲皮素、松果菊苷、特女贞苷、熊果酸、齐墩果酸、3-O-乙酰基齐墩果酸、19α-羟基熊果酸、3,4-二羟基苯乙醇、对羟基苯乙醇均显示无抑制胶原降解活性(表1)。
表 1 二至丸中化学成分抑制组织蛋白酶K活性筛选
化合物成分 英文名称 CTSK/CSA*
抑制率(%)ZFR-MCA
抑制率(%)Libdock
得分胶原降解
抑制率(%)来源 墨旱莲皂苷Ⅴ eclalbasaponin Ⅴ 0 0 / M 墨旱莲皂苷Ⅰ eclalbasaponin Ⅰ 0 0 / M 墨旱莲皂苷Ⅱ eclalbasaponin Ⅱ 0 0 / M 墨旱莲皂苷Ⅶ eclalbasaponin Ⅶ 11.3±1.3 0 / M 墨旱莲皂苷Ⅸ eclalbasaponinⅨ 88.6±9.2 0 / 70.3 M 红景天苷 Salidroside 27.8±3.1 0 / N 异毛蕊花糖苷 Isoacteoside 65.3±4.7 0 / / N 橄榄苦苷 Oleuroprin 35.9±2.4 0 / N 蟛蜞菊内酯 Wedelolactone 58.7±5.8 2.81 / 50.1 M 熊果酸 Ursolic Acid 0 59.7 / N 齐暾果酸 Oleanic acid 0 47.1 / N 刺囊酸 Echinocystic acid 0 0 / M 木樨草素 Luteolin 62.1±8.6 0 / M、N 蒙花苷 linarin 37.2±3.1 0 / M 槲皮素 quercitrin 68.5±5.9 0 / M、N 木樨草苷 galuteolin 33.2±3.7 0 / M、N 异去甲基蟛蜞菊内酯 Isowedelolactone 0 7.0 / M 松果菊苷 Echinacoside 55.9±6.5 9.7 / N 女贞苷 Nuezhenoside 51.2±4.7 0.10 / 53.2 N 特女贞苷 Specneuzhenide 58.6±6.4 17.9 / 49.7 N 女贞苷G13 Nuezhenoside G13 23.7±2.4 0.16 / N 3-O-乙酰基齐墩果酸 3-O-acetyl oleanolic acid 0 66.7 / N 19α-羟基熊果酸 19α-OH Ursolic Acid 0 53.2 / N 儿茶素 catechin 11.3 15.3 / M 表儿茶素 L-Epicatechin 12.7 18.7 / M 表儿茶素没食子酸酯 (-)-Epicatechin gallate 51.2±5.4 10.5 / 60.2 M 大黄素甲醚 Emodin monomethyl ether 19.8±1.7 0 / N β-谷甾醇 β- Sitosterol 0 0 / N 3’ 4-二羟基苯乙醇 3,4-dihydroxyphenethyl 70.3±8.4 83.2 76.4848 N 对羟基苯乙醇 p-hydroxyphenethyl 62.4±6.7 79.5 73.9225 N 注：M：墨旱莲；N：女贞子。 -
不溶性胶原、抑制剂和CTSK共培养15 min，通过检测培养液中剩余CTSK的Z-FR-MCA活性，来验证潜在CTSK抑制剂在体外抑制与CTSK的结合实验，结果显示100 μmol/L的墨旱莲皂苷IX（ES-IX）、表儿茶素没食子酸酯（EGCG）、女贞苷(NZG)和蟛蜞菊内酯(WED)抑制率分别为54.8%、64.1%、36.4%和51.4% (图3)。
图 3 4种潜在活性化合物抑制CTSK和胶原结合作用
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CTSK抑制剂的高通量筛选方法，多采用合成底物Z-FR-MCA结合活性来筛选，其原理是CTSK可裂解底物端FR-MCA基团, 释放游离的MCA 发色荧光基团, 通过抑制剂引起荧光信号变化差异来检测评价抑制剂活性。基于骨胶原降解需要CTSK与CSA结合发挥作用，采用荧光标记CSA*，形成CTSK/CSA*复合物，其原理为抑制剂与CTSK酶结合形成CTSK/抑制剂/CSA*复合物，导致荧光偏振信号差异，评价抑制剂与CTSK结合活性，可快速、灵敏和准确的判断化合物是否与CTSK存在相互作用。SDS-PAGE凝胶电泳法是常用蛋白质分类技术，将胶原蛋白及其降解产物按照分子量大小迁移，考马斯染色溶液染色，对α1胶原蛋白条带定量，计算胶原蛋白降解率。
二至丸的正丁醇提取部位抑制CTSK/CSA*复合物形成和胶原降解活性最强，超过95%，但对CTSK的Z-FR-MCA抑制率只有26%。Z-FR-MCA作为CTSK活性位点的合成底物，活性成分对Z-FR-MCA抑制率越高，证明对CTSK的活性位点抑制效率越高。基于Bromme教授提出的非活性位点抑制剂的概念[13]，活性成分具有显著的抑制胶原降解活性，但对活性位点Z-FR-MCA底物无抑制活性，可称为非活性位点 (exosite) 抑制剂。结果发现，二至丸的正丁醇提取部位可显著抑制胶原降解，而对Z-FR-MCA无显著影响，证明正丁醇提取部位可能存在抑制 CTSK胶原降解活性的活性成分, 而不影响CTSK 活性位点的生理活性。二至丸的正丁醇提取部位的化学成分主要为墨旱莲皂苷类成分和女贞子三萜酸类成分，其中墨旱莲皂苷Ⅸ（ES-Ⅸ）、表儿茶素没食子酸酯（EGCG）、女贞苷(NZS)和蟛蜞菊内酯(WED)可能是潜在的CTSK非活性位点抑制剂。熊果酸和齐墩果酸具有较强的Z-FR-MCA活性，表明可作用CTSK活性位点，而女贞子乙醇提取物、熊果酸、齐墩果酸和墨旱莲的蟛蜞菊内脂均报道显著抑制破骨细胞的骨吸收活性和CTSK的mRNA表达[14-15]，可能通过在细胞内直接作用CTSK酶，使其失去活性。
CTSK是抗骨质疏松药物研发的关键靶标，有报道，中草药尤其是补肾中药含有丰富的治疗骨质疏松的活性物质，但不清楚这些化合物是否能够抑制CTSK活性，或者特异性抑制胶原酶的活性。除了胶原降解活性，CTSK在甲状腺细胞中发挥降解甲状腺球蛋白，释放甲状腺激素[16]，在成纤维细胞中发挥降解纤维蛋白的功能[17]。二至丸中有抑制CTSK活性的化合物，可进一步考察其对甲状腺球蛋白降解和纤维蛋白降解的作用活性，为中医药开发CTSK抑制剂提供新的思路。
Study on material basis of cathepsin K targeted inhibitor in Erzhi Wan
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摘要:
目的 考察传统补肾经典名方二至丸中抑制组织蛋白酶K的活性部位和活性成分。 方法 采用高通量荧光方法筛选二至丸中正丁醇、二氯甲烷、乙酸乙酯和石油醚提取部位，以及二至丸主要活性成分对组织蛋白酶K(CTSK)与荧光合成底物Z-FR-MCA结合活性的抑制率，和对CTSK与硫酸软骨素A(CSA)复合物形成活性抑制率。进而考察二至丸不同提取部位和活性成分抑制CTSK生理底物I型胶原蛋白降解活性，并采用分子对接和底物结合实验验证潜在CTSK抑制剂。 结果 二至丸的正丁醇和石油醚提取部位对CTSK与CSA复合物形成抑制率超过90%，石油醚提取部位对CTSK与底物Z-FR-MCA结合抑制率超过90%，正丁醇提取部位对CTSK的胶原降解抑制率超过95%、石油醚提取部位为58.6%。30个有效成分中11个显示对CTSK与CSA复合物形成抑制率超过50%，有5个成分对CTSK与荧光底物Z-FR-MCA结合活性抑制率超过50%。最终筛选确定4个成分墨旱莲皂苷Ⅸ、表儿茶素没食子酸酯、女贞苷和蟛蜞菊内酯，对胶原降解抑制率超过50%，其中墨旱莲皂苷Ⅸ抑制胶原纤维与CTSK的结合率最高达60%，但均与CTSK活性位点分子对接不成功。 结论 二至丸中存在抑制组织蛋白酶K的活性物质，主要存在于正丁醇部位，但活性成分不是活性位点抑制剂，可能通过与其他位点结合，间接抑制CTSK与寡多糖结合，进而降低了CTSK的胶原降解活性。 Abstract:Objective To investigate the active ingredients and components that inhibiting cathepsin K activity in Erzhi Wan, a classic kidney-tonifying formula. Methods Then-butanol, dichloromethane, ethyl acetate and petroleum ether parts and 30 active components in Erzhi Wan were screened by established high throughput fluorescence methods of inhibit the binding activity of CTSK with Z-FR-MCA substrate, the formation of CTSK and chondroitin sulfate A (CSA) complex activity, and the activity of substrate type I collagen degradation by CTSK. Molecular docking and insoluble collagen substrate binding assays were applied to verify the potential CTSK inhibitors. Results The n-butanol and petroleum ether parts of Erzhi Wan inhibited the formation of CTSK and CSA* complex by more than 90%, the petroleum ether part inhibited the binding of CTSK to substrate Z-FR-MCA by more than 90%, the collagen degradation inhibition rate of CTSK in n-butanol part was more than 95% and that in petroleum ether part was 58.6%. Among the 30 active components, 11 showed that the inhibition rate of CTSK and CSA* complex formation was more than 50%, and 5 components with the inhibition rate of Z-FR-MCA binding activity more than 50%. Finally, there were four components including eclalbasaponin Ⅸ, (-)-epicatechin gallate, nuezhenoside and wedelolactone. The inhibition rate of collagen degradation was more than 50%. Eclipta saponin IX inhibited the binding rate between collagen fibers and CTSK, up to 60%, but all of them failed to dock with CTSK active site. Conclusion There are active components that inhibiting cathepsin K in Erzhi Wan, which mainly exists in the n-butanol ingredients, but the active components is not an active-site inhibitor. It might inhibit the binding of CTSK with oligosaccharides by binding to other sites of CTSK, and then reduce the collagen degradation activity of CTSK. -
Key words:
- Erzhi Wan /
- osteoporosis /
- cathepsin K /
- active fraction /
- potential inhibitor
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在我国，肺炎链球菌是引起中国婴幼儿和老年人发病和死亡的重要病因，是社区获得性肺炎（community-acquired pneumonia, CAP)、菌血症、儿童化脓性脑膜炎的常见病原菌[1]。2012年亚太地区病原体耐药监测网络数据显示，肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae, S.p)在亚洲地区总体多重耐药比例为59.3%，而在中国的多重耐药比例高达83.3%[2]，且部分地区肺炎链球菌耐药率呈逐年增长趋势[3-4]。
莫西沙星属第四代喹诺酮类抗菌药物，DNA拓扑异构酶抑制剂，抗菌谱广，对常见呼吸道病菌特别是肺炎链球菌抗菌作用强大，2016年中国成人CAP诊治指南推荐可选择莫西沙星等喹诺酮类药物作为初始经验性抗感染药物[5]。莫西沙星所有适应证口服给药的常规剂量均为400 mg/d。随着莫西沙星上市以来临床研究的深入，不良反应事件也有所增加[6]。本研究采用微透析方法获取肺炎大鼠肺组织间液中的游离药物浓度，旨在模拟莫西沙星在感染患者靶器官中的药动学变化，探究正常与感染状态下的靶器官药物分布的差异，分析链球菌感染状态下莫西沙星体内代谢动力学的变化。
1. 材料与方法
1.1 实验动物
取Wistar大鼠24只，雄性，SPF级，4~6周龄，其体质量为200~220g（上海斯莱克实验动物有限公司，合格证编号：2007000514232）。随机分为健康组及肺炎组各12只，两组大鼠体质量分别为（210.92±5.95）g和（208.58±5.33）g，无统计学差异（P>0.05）。实验前各组大鼠禁食12 h过夜，动物饲养遵从中华人民共和国实验动物使用协议。
1.2 实验设备与试剂
CMA402型微量泵、CMA820型微量收集器、血管探针、肺探针（瑞典 CMA公司）；ALC-V8S小动物呼吸机（上海奥尔科特生物科技有限公司）；安捷伦1100高效液相色谱仪，配有Chemstation工作站；XW-80型涡旋混合器（其林贝尔）；Thermo LEGEND Micro 17高速离心机（赛默飞）；METTLER AE240电子天平（梅特勒）。莫西沙星标准品（中国食品药品检定研究院，纯度>99%，批号1448606），莫西沙星片（拜耳医药保健有限公司，批号BJ13520）；甲醇（HPLC级，Burdick & Jackson公司），乙腈（HPLC级，Merck公司），甲酸（Fluka公司，瑞士）。
1.3 实验菌株
肺炎链球菌由第二军医大学附属长海医院微生物实验室提供，于接种前1 d接种于血琼脂平板，置于37 ℃ CO2培养箱中培养24 h，用无菌生理盐水稀释成含细菌浓度为0.6×108 cfu/ml的混悬液，备用。质控菌株为肺炎链球菌标准株（ATCC49619 上海宝米科生物科技有限公司提供）。
1.4 实验方法
1.4.1 动物处理
造模：采用气管穿刺法注入菌液建立肺炎大鼠模型。腹腔麻醉后，切开颈部皮肤暴露气管，经气管软骨环间穿刺，注入肺炎链球菌混悬液 0.2 ml（约0.12×108cfu/只），将大鼠直立位20 s，再使大鼠保持右侧卧位10 min，促使菌液充分流入右肺。于接种后第5~7天建立大鼠右侧肺炎模型。所有大鼠实验结束后行病理解剖及肺组织匀浆培养证实建模成功。
1.4.2 探针植入
取造模成功的肺炎大鼠麻醉后，固定于保温垫，在气管上段做一T型切口，插入气管导管，接小动物呼吸机辅助通气，频率75~80次/min，潮气量2.5 ml。于大鼠右侧胸壁做斜行切口，止血钳离断第5肋骨前肋，充分暴露右肺。用注射器针尖稍刺破右肺中叶脏层胸膜，将肺探针向肺门方向钝性植入肺组织，复位肺叶，固定探针并关闭胸腔。切开左侧股静脉，植入血管探针推送至下腔静脉固定。
1.5 莫西沙星药动学分析
1.5.1 给药及样本收集
取莫西沙星1片，刮去包衣后磨成细粉末状，加入0.5%羧甲基纤维素钠无菌注射用水溶解，制成混悬溶液，浓度为10 mg/ml。
两组大鼠分别通过灌胃给药的方式注入莫西沙星混悬液，给药剂量按4 ml/kg计算，5 s内注入完毕，立即开始收集血浆及肺组织透析样品。采用HPLC法分别测定前5 h的莫西沙星浓度。
1.5.2 HPLC法测定透析液中莫西沙星含量
(1)色谱条件 色谱柱：Agilent SB-C18 (250 mm×4.6 mm，5.0 µm)，流动相：乙腈: 0.1%甲酸水（25:75，V/V）；流速：1.0 ml/min，分析时间10 min，柱温：30 ℃，进样量：5 μl，检测波长295 nm。
(2)透析液处理 精密量取100 μl透析液样品，置1.5 ml塑料离心管中，加入200 μl甲醇，漩涡混合30 s后，12000 r/min离心10 min，取200 μl上清液于进样瓶中，进样5 μl进行HPLC分析。
(3)标准曲线与线性范围 取空白透析液100 μl，精密加入莫西沙星标准对照品溶液20 μl旋涡混匀，配成莫西沙星浓度分别为5.00、2.00、1.00、0.50、0.20、0.10及0.05 µg/ml标准含药肺透析液，除不加200μl醇外，其余按“透析液样品处理方法”项下操作，进样分析，记录色谱图，计算莫西沙星峰面积。莫西沙星以肺透析液中待测物浓度(X)为横坐标，莫西沙星峰面积(Y)为纵坐标，求得回归方程：
Y=14.273X+0.555，r=0.999
结果表明莫西沙星在0.05~5.00 µg/ml浓度范围内线性关系良好。
1.5.3 定量限与检测限
配制莫西沙星浓度为0.05 µg/ml的标准含药透析液5份，进行分析，依照当日标准曲线方程求得实测浓度为（0.051 ± 0.004）µg/ml，准确度90.8%~116.66%。结果表明莫西沙星在血浆中的定量下限为0.05 µg/ml，S/N>10，线性关系良好。经逐级稀释，按S/N>3测得莫西沙星在血浆中的检测限为0.015 µg/ml。
1.5.4 精密度试验
制备含莫西沙星的浓度分别为0.05、0.50、5.00 µg/ml的标准含药肺透析液（每个浓度做5份），按“肺透析液样品预处理方法”项下操作，进样分析，连续做3 d，计算日内和日间精密度。测得日内精密度RSD分别为6.6281%、2.6247%、2.8282%；日间精密度分别为2.3793%、1.0271%、2.4221%，均小于10%，符合精密度要求。
1.5.5 准确度试验
以相对回收率表示，按“标准曲线制备”项下制备含有莫西沙星浓度分别为0.05、0.50、5.00 µg/ml的标准含药肺透析液，按“肺透析液样品预处理方法”项下操作，进样分析，记录色谱峰面积，代入标准曲线方程，计算实测浓度与实际浓度的比值即为相对回收率。结果分别为105.21%、104.82%、106.45%，均在80%~120%范围内，且RSD<10%，符合要求。
1.5.6 稳定性试验
莫西沙星浓度分别为0.05、0.5、5.0 µg/ml的肺透析液样品各3份，分别进行室温、4 ℃及冻融稳定性考察，RSD均<10%。结果表明样品在上述条件下保持稳定。
1.6 数据分析
采用反向透析法测定探针回收率（Rdial），体内实际药物浓度（Cu）由所得透析液浓度（Cm）按公式计算，Cu=Cm/Rdial转化获得。采用Pksolver 2.0软件，以非房室模型计算以下药动学数据：曲线下面积（AUC）、平均滞留时间（MRT）、药物消除半衰期（t1/2）、药物峰浓度（Cmax）、药物在肺部的穿透率（PR=C肺/C血液）、药物的分布系数（AUC肺/AUC血液）。
采用SPSS 17.0版统计学软件分析，计量资料采用均值±标准差(
$\bar{x}\pm s$ )表示。药动学参数先经方差齐性分析，符合正态分布者，采用两样本t检验，P<0.05表示其差异有统计学意义。2. 实验结果
2.1 正常大鼠和肺炎大鼠肺组织药-时曲线
经灌胃给予莫西沙星后，正常大鼠及肺炎大鼠肺组织药物浓度迅速上升，约1 h达峰，随后两者同步下降。整个实验过程肺炎大鼠肺组织浓度均高于正常大鼠，肺炎大鼠肺组织Cmax约为正常大鼠的3.4倍。两组大鼠肺组织中莫西沙星的浓度-时间数据分布情况见图1。
2.2 正常大鼠和肺炎大鼠血浆药-时曲线
灌胃给予莫西沙星后，正常大鼠及肺炎大鼠血浆游离药物浓度明显上升，Cmax无明显差异，两组大鼠血浆中莫西沙星的血药浓度-时间数据分布情况见图2。
2.3 肺组织穿透率（PR）
计算各时间点在肺组织中的穿透率(PR值)，正常大鼠和肺炎大鼠肺组织穿透率最高分别为0.27和1.87；最低分别为0.16和0.89，平均值分别为0.18±0.10和1.26±0.32(P<0.05)，见图3。
2.4 主要药动学参数
大鼠灌胃莫西沙星后，正常大鼠及肺炎大鼠药动学参数采用非房室模型进行分析，结果见表1。
表 1 灌胃给予莫西沙星的正常大鼠与肺炎大鼠血浆和肺组织中的药动学参数参数 单位 血浆 肺组织 正常组 肺炎组 正常组 肺炎组 Lambda_z 1/h 0.2±0.13 0.32±0.01 0.4±0.15 0.21±0.06 t1/2 h 5.27±4.38 2.15±0.07 1.9±0.63 3.39±0.79 Tmax h 0.67±0.14 1±0 0.89±0.2 0.94±0.1 Cmax μg/ml 4.94±0.98 4.83±0.05 1.42±0.05 4.84±0.02## Tlag h 0±0 0±0 0±0 0±0 Clast_obs/Cmax 0.02±0.03 0.27±0.04## 0.18±0.09 0.33±0.01 AUC 0-t μg/ml·h 22.33±2.02 12.88±1.19# 3.06±1.07 13.16±0.53## AUC 0-inf_obs μg/ml·h 23.51±1.41 16.96±1.71 3.77±1.29 20.93±1.35 AUC0-t/0-inf_obs 0.95±0.08 0.76±0.01 0.81±0.09 0.63±0.07# AUMC 0-inf_obs μg/ml·h2 151.89±92.76 62.01±8.56 11.93±5.14 107.01±25.39# MRT 0-inf_obs h 6.41±3.77 3.65±0.14 3.17±0.77 5.07±0.92 Vz/F_obs (mg/kg)/(μg/ml) 13.51±10.9 7.76±0.97 33.98±20.28 9.74±1.72 CL/F_obs (mg/kg)/(μg/ml)·h 1.79±0.11 2.49±0.26# 12.02±3.9 2.01±0.13 #P<0.05，##P<0.01，与正常组比较 正常大鼠及肺炎大鼠肺组织Cmax分别为（1.42±0.05）μg/ml、（4.84±0.02）μg/ml（P<0.01），t1/2分别为（1.9±0.63）h、（3.39±0.79）h（P>0.05），一阶矩曲线下面积AUMC分别为（11.93±5.14）μg/ml·h2、（107.01±25.39）μg/ml·h2（P<0.05），AUC0-t分别为（3.06±1.07）μg/ml·h、（13.16±0.53）μg/ml·h（P<0.01）
2.5 血液中药动学和药效学(PK/PD)参数比较
结合相关报道的最低抑菌浓度(MIC)[7]及防耐药突变浓度(mutant prevention concentration，MPC)[8]值，将本实验结果Cmax和AUC0-∞与之相比，莫西沙星对肺炎链球菌的PK/PD参数见表2 [莫西沙星对肺炎链球菌的MIC90为0.125 mg/L；莫西沙星对肺炎链球菌的MPC90为2 mg/L]。
表 2 正常大鼠和肺炎大鼠体内莫西沙星的PK/PD参数比较PK/PD参数 血浆 肺组织 正常组 肺炎组 肺炎组/正常组 正常组 肺炎组 肺炎组/正常组 Cmax/MIC90 39.52 38.64 0.98 11.36 38.72 3.41 AUC0-∞/MIC90 188.08 135.68 0.72 30.16 167.44 5.54 Cmax/MPC90 2.47 2.42 0.98 0.71 2.42 3.41 AUC0-∞/MPC90 11.76 8.48 0.72 1.89 10.47 5.54 3. 讨论
我国的多中心研究结果显示，莫西沙星对肺炎链球菌的敏感度达99%，MIC90为0.125 mg/L[7]。莫西沙星和青霉素类、头孢菌素类、氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类抗菌药物均无交叉耐药性，口服生物利用度总计91%，可以被快速吸收并分布到血管外隙，稳态时表观分布容积可以达到21/kg。血浆蛋白结合率为45%，其在肺、窦及炎性损伤组织的药物浓度超过血药浓度。相关研究表明，口服莫西沙星400 mg后，在人肺组织[8]、微支气管镜肺泡灌洗液[9]、痰液[10]中的药时曲线与在血浆中的趋势相似，药物在以上样本中的浓度高于血浆，显示出良好组织穿透性，本研究的前期结果也得出相似的结论[11]。
莫西沙星为浓度依赖性抗菌药，抗生素后效应(PAE)较长，喹诺酮类治疗革兰阳性菌所需的AUC0-24h/MIC靶值为30～40。当PK/PD参数Cmax/MIC≥8～10和AUC0～24h/MIC≥125时可以明显减少氟喹诺酮类药物治疗革兰阴性杆菌、包括铜绿假单胞菌耐药菌出现的危险性[12]。本研究结果表明，莫西沙星在正常及肺炎链球菌感染大鼠血浆和肺组织的Cmax/MIC均远大于8～10，在肺炎大鼠的血浆及肺组织的AUC0-24h/MIC为135.68和167.44，正常大鼠血浆为188.08，远大于125。
耐药突变选择窗（MSW）是指防耐药突变浓度（MPC）与最低抑菌浓度（MIC）之间的浓度范围；当治疗药物浓度高于MPC时，在保证疗效的同时也能防止耐药突变；药物浓度如果在突变选择窗内，即使抑制了敏感菌生长，临床治疗可能成功，但还可能导致耐药突变。近年来在优化喹诺酮类给药方案的研究中，常需评价抗菌药物在耐药突变窗中的存在时间百分比和MPC值。TMSW<20%是预测防止出现耐药的有效参数，本研究药动学参数显示，莫西沙星在正常大鼠及肺炎大鼠的血浆和肺组织中的浓度基本保持在莫西沙星耐药突变选择窗之外。
药物常规剂量是在群体药动学结果和有限临床实践上建立的，大多数患者按照常规剂量会获得较好的临床疗效和安全性，但患者个体差异，生理病理状态都会对药动学参数产生一定影响。近年来，关于抗菌药物PK/PD的研究进展迅速，研究发现重症感染患者与健康人的PK/PD数据明显不同，例如万古霉素在重症感染患者群体分布相较正常人群快，患者存在高代谢和高循环动力状态，因而需要对治疗药物监测与给药方案的调整[13]。一项大样本临床研究表明莫西沙星最常见的药物不良反应为胃肠道症状，口服剂量400 mg/d，发生恶心、腹泻和头晕不良反应事件概率分别为7.1%、5.2%和2.6%[14]。国内也有莫西沙星不良反应的文献报道[15-16]，此外，莫西沙星的中枢神经系统潜在危险与其他喹诺酮类药物一致[17],因此老年人、中枢神经系统损伤的老年患者（如癫痫、明显动脉硬化）应当谨慎使用，必要时减量，但目前尚无莫西沙星剂量调整的相关依据。
机体发生感染后,病原菌释放内毒素和外毒素,诱发的全身炎症反应,大量的细胞因子炎性介质释放,引起机体内环境稳态失衡,血管内皮破坏和毛细血管通透性增加,导致体液向第三间隙渗漏迁移[18]，这一过程会使组织间分布的亲水性抗生素药物稀释，血浆和组织药物浓度下降，对亲脂性药物影响不大[19]。此外药物在体内以一定比例与血浆蛋白结合, 感染状态下血管通透性增加，蛋白向血管外间隙渗漏增加，以及肝脏合成减少，血浆白蛋白减低引起药物游离比例增多，这可能会增加组织内抗生素分布而增加抗感染效果，但同时可能增加药物的毒性作用[20]，莫西沙星是表观分布容积较高的脂溶性药物，在感染状态肺组织浓度较健康状态增高，可能与血管通透性增加，血浆蛋白结合率降低有关。
有研究表明喹诺酮类抗菌药物马波沙星在感染小鼠肺组织的药物浓度是血浆药物浓度的2~3倍[21]，多杀性巴氏杆菌感染显著增加了马波沙星的AUC、Cmax、MRT，这与本研究结论相似。肺炎模型大鼠与正常大鼠相比，莫西沙星在血浆中的浓度没有显著差异，而在肺炎大鼠肺组织中的浓度明显高于正常大鼠，最高为正常大鼠肺组织的3.4倍，这提示在肺炎链球菌感染的病理状态下，莫西沙星的肺组织穿透率升高。
莫西沙星在正常小鼠和肺炎链球菌感染小鼠的血浆和肺组织浓度均能够达到杀灭细菌并防止产生耐药性的要求。在感染状态下机体高敏、肝肾功能减退等病理因素可能增加莫西沙星不良反应的发生概率，而在肺炎病理状态下，莫西沙星肺组织AUC0-24h/MIC达到167.44，目前实验数据表明小鼠肺炎链球菌感染时莫西沙星肺组织浓度远高于健康状态，也远大于MIC和MPC，理论上有一定剂量调整的空间，其机制和具体方案还有待进一步实验研究，为优化特殊病人给药方案，调整药物剂量，减少药物不良反应提供可参考的数据。
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图 1 DMSO浓度对CTSK抑制剂筛查方法的影响
A. Z-FR-MCA活性；B.CTSK/CSA*复合物；C.胶原降解活性；*P<0.05, ***P<0.001，与不加DMSO组比较
表 1 二至丸中化学成分抑制组织蛋白酶K活性筛选
化合物成分 英文名称 CTSK/CSA*
抑制率(%)ZFR-MCA
抑制率(%)Libdock
得分胶原降解
抑制率(%)来源 墨旱莲皂苷Ⅴ eclalbasaponin Ⅴ 0 0 / M 墨旱莲皂苷Ⅰ eclalbasaponin Ⅰ 0 0 / M 墨旱莲皂苷Ⅱ eclalbasaponin Ⅱ 0 0 / M 墨旱莲皂苷Ⅶ eclalbasaponin Ⅶ 11.3±1.3 0 / M 墨旱莲皂苷Ⅸ eclalbasaponinⅨ 88.6±9.2 0 / 70.3 M 红景天苷 Salidroside 27.8±3.1 0 / N 异毛蕊花糖苷 Isoacteoside 65.3±4.7 0 / / N 橄榄苦苷 Oleuroprin 35.9±2.4 0 / N 蟛蜞菊内酯 Wedelolactone 58.7±5.8 2.81 / 50.1 M 熊果酸 Ursolic Acid 0 59.7 / N 齐暾果酸 Oleanic acid 0 47.1 / N 刺囊酸 Echinocystic acid 0 0 / M 木樨草素 Luteolin 62.1±8.6 0 / M、N 蒙花苷 linarin 37.2±3.1 0 / M 槲皮素 quercitrin 68.5±5.9 0 / M、N 木樨草苷 galuteolin 33.2±3.7 0 / M、N 异去甲基蟛蜞菊内酯 Isowedelolactone 0 7.0 / M 松果菊苷 Echinacoside 55.9±6.5 9.7 / N 女贞苷 Nuezhenoside 51.2±4.7 0.10 / 53.2 N 特女贞苷 Specneuzhenide 58.6±6.4 17.9 / 49.7 N 女贞苷G13 Nuezhenoside G13 23.7±2.4 0.16 / N 3-O-乙酰基齐墩果酸 3-O-acetyl oleanolic acid 0 66.7 / N 19α-羟基熊果酸 19α-OH Ursolic Acid 0 53.2 / N 儿茶素 catechin 11.3 15.3 / M 表儿茶素 L-Epicatechin 12.7 18.7 / M 表儿茶素没食子酸酯 (-)-Epicatechin gallate 51.2±5.4 10.5 / 60.2 M 大黄素甲醚 Emodin monomethyl ether 19.8±1.7 0 / N β-谷甾醇 β- Sitosterol 0 0 / N 3’ 4-二羟基苯乙醇 3,4-dihydroxyphenethyl 70.3±8.4 83.2 76.4848 N 对羟基苯乙醇 p-hydroxyphenethyl 62.4±6.7 79.5 73.9225 N 注：M：墨旱莲；N：女贞子。 
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