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分泌蛋白在机体生理及疾病的生物学途径中起着不可或缺的作用，新分泌蛋白的发现与研究对疾病的诊断和治疗具有重要意义[1-4]。CRELD2是一种富含半胱氨酸的表皮生长因子样结构域，属于表皮细胞生长因子(EGF)超家族中与CRELD1同源的新型分泌蛋白。CRELD2基因最早因参与调节内质网应激被认识[5-9]，即参与内质网应激信号传导反应和未折叠蛋白反应[6, 9-10]；同时参与乙酰胆碱受体α4和β2亚基的细胞内转运[7]。在骨髓间充质干细胞中，CRELD2具有增强骨形态发生蛋白-9诱导的成骨和基质矿化的作用[11]，与软骨基质蛋白-3结合，在软骨发育中发挥基础性作用[12]。另外，CRELD2是PERK-ROCK通路中肿瘤相关成纤维细胞的旁分泌因子，参与肿瘤微环境的形成[13]；也有研究表明，CRELD2在肝脏代谢稳态的维持和调节中发挥重要作用[14]。此外，CRELD2具有作为诊断人工关节感染和术后急性肾损伤早期预测的生物标志物潜质[15-16]。因此，阐明CRELD2的组织表达情况及组织特异性，将有助于更有指向性地研究其生物学功能及其相关作用机制。
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SPF级10周龄C57BL/6小鼠，体重为(24.53±3.61) g，购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司。实验动物的饲养条件为具有IVC系统的动物房：人工照明时间12 h；温度为(23±2) ℃；相对湿度40%～60%；噪音<60 dB，动物自由饮食进水。本实验方案设计及实验操作均遵守“3R”（Reduction, Replace-ment, Refinement）原则等动物福利相关规定。
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75%乙醇、无水乙醇、甲醇、三氯甲烷、异丙醇、盐酸胍（国药集团）；吐温20（DC25BA00）； 5×PrimeScript RT Master Mix（AJ90851A）、DNA标记物（AJ50972A）、裂解液(Trizol)购自宝日医生物技术；小鼠-GAPDH-引物(上海生工）；BCA蛋白定量试剂盒、20×PBS缓冲液、20×TBS 缓冲液（碧云天）；抗体A：抗CRELD2 抗体（51148-T56，义翘神州）；抗体B：抗CRELD2 抗体（bs-8185R, 博奥森）；抗体C：鼠CRELD2 抗体（AF3686，R&D Systems）；蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、苯甲基磺酰氟(PMSF, 上海康成）；氨基丁三醇(Tris)、甘氨酸、30%聚丙烯酰胺溶液、Tris（pH6.8）、Tris（pH8.8）、四甲基乙二胺(TEMED)、过硫酸铵、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE, 上海博光）；SYBR green 反应混合物（默克生命科学）。
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7500荧光定量PCR仪（赛默飞）；离心管、EP管、组织冻存管；TP600 PCR仪（宝日医生物技术）；Wonbio-48P高通量组织研磨仪（上海万柏）；Tanon5200化学发光图像分析系统（上海天能）；恒温振荡器（上海鼎国）；漩涡混合仪（大连竞迈）；Fresco21冷冻高速离心机（赛默飞）；超微量分光光度计（GE Healthcare，默克）；VE-60蛋白电泳槽（天能）；NC膜（D105872，沃特曼）；STS-3脱色摇床（琪特仪器）。
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在NCBI数据库中查找CRELD2基因序列，根据引物设计原则（GC占比：40%～60%；引物长度：15～30 bp；Tm：58～62 ℃；上下游引物的Tm差值<2；扩增片段长度：60～150 bp）应用PrimerBank与Primer-Blast数据库，设计得到CRELD2基因的引物序列，引物设计完成后由上海生工合成。之后通过PCR扩增曲线与溶解曲线对于引物的特异性与扩增效率进行评价，获得CRELD2基因特异性引物序列。
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⑴肝、胃、肺等组织通用型RNA提取方法：小鼠称重麻醉后取仰卧位固定，取适量肝、胃、肺等组织（针对不同动物个体，于各组织器官同一位置进行取材）置研磨管中，加入1 ml Trizol Reagent及钢珠，充分混匀后使用高通量组织研磨仪研磨（60 Hz，30 s，5次）至无块状组织；高速冷冻离心机离心（4 ℃，12000 r/min，15 min）后取上层红色液体，室温静置；加入200 μl氯仿，用小型涡旋仪剧烈震荡15 s，室温静置10 min自然分层；离心（4 ℃，12000 r/min，15 min）后溶液为三层（上层无色透明为RNA、中层白色为DNA、下层为裂解液和蛋白质混合物），取上层加入等体积的异丙醇混匀后室温静置10 min；离心（4 ℃，12000 r/min，15 min），弃上清得白色RNA沉淀；加入1 ml 75％乙醇重悬RNA沉淀；离心（4 ℃，7500 r/min，15 min），弃上清得RNA沉淀，静置挥发去除乙醇，加入适量DEPC水溶解RNA沉淀，使用超微量分光光度计检测RNA浓度及纯度，调整RNA终浓度（范围：400～500 ng/ μl）以便于逆转录，样品于−80 ℃保存。
⑵胰腺组织特异性RNA提取方法：小鼠称重麻醉后，迅速轻柔地分离出胰腺组织（减少胰酶的自身消化），放入装有液氮的研钵中研磨成粉后装入EP管，加入1 ml Trizol混匀。按照Trizol法步骤继续操作得到RNA沉淀，对其中残留的RNA酶进行清除（3～4次）：加入原体积1/2的6 mol/L盐酸胍（含β-巯基乙醇）使沉淀溶解，按照1∶15加入1 mol/L冰乙酸与无水乙醇的混合溶液，于−20 ℃静置15 min，之后离心（4 ℃，12000 r/min，15 min）得到RNA沉淀，经75%乙醇洗涤晾干后溶于DEPC水，即获得胰腺组织总RNA。
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cDNA的稳定性较RNA好，不易降解，为保证逆转录效率，选择纯度良好的RNA（A260 nm/280 nm：1.8～2.0）配制逆转录10 μl体系（5×Primer Script RT Master Mix：2 μl；RNA：500 ng/浓度；RNase free H2O加至10 μl），得到稳定的cDNA。
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使用获得的各组织cDNA样品配制20 μl体系（SYBR Green Master：10 μl；CRELD2基因引物：1 μl；cDNA：2 μl；ddH2O：7 μl），通过检测SYBR荧光染料与DNA双链非特异性结合的荧光信号强度，结合内参基因（GAPDH）的荧光信号强度获得各组织中CRELD2的相对含量，各样品均设置双复孔检测，PCR程序如图1。
图 1 实时荧光定量PCR程序
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分别取适量小鼠的肝、胰腺、胃、肺等组织（针对不同动物个体，于各组织器官同一位置进行取材）置研磨管中，加入400 μl冷的蛋白裂解液，使用高通量组织研磨仪研磨（60 Hz×30 s×5次）至无块状；冰上孵育30 min后离心（12000 r/min，15 min，4 ℃）获得上清即为蛋白样品。除用于双金鸡纳酸测定法(Bicinchoninic Acid Assay，BCA)定量所需量，向其余样品中加入其体积1/4的5×上样缓冲液后混匀，放置在恒温器（97 ℃）上变性10 min，自然冷却后获得总蛋白样品。
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从未变性的各总蛋白样品中各取10 μl，使用碧云天Bradford蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白浓度测定：按需根据步骤配制蛋白标准品及BCA工作液，在96孔板中加入梯度稀释后的蛋白标准品，每孔定量至20 μl；同时设置样品检测孔：取各待测蛋白样品1 μl分别加入到 96孔板中定量至20 μl；各孔中均加入200 μl BCA工作液，37 ℃孵育30 min后使用Infinite M200多功能酶标仪检测在570 nm波长下的吸光度值，计算获得蛋白样品的浓度。
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⑴制胶：根据CRELD2的分子量及预实验结果选定分离胶浓度为12 %，按成分比例表配制分离胶加入制胶槽的玻璃板之间，用适量异丙醇去除气泡并保持胶面平整至其完全凝固；之后配制积层胶：待各成分混匀加入制胶槽的玻璃板之间，插入梳子待其自然凝固加样电泳。
⑵加样及电泳：将胶板与电泳电极连接好装入电泳槽内，加1×电泳缓冲液，依顺序将蛋白样品与Marker加入梳孔中（加样量：20～50 μg）。电泳的电压设置：80 V，30 min，之后120 V继续电泳至分离胶中Marker分离完全即停止电泳。
⑶电转膜：选用NC膜并裁剪至合适大小，采用湿转法，电转在冰水混合物的环境中进行，条件设置为：100 V，1 h。
⑷封闭：使用脱脂奶粉对NC膜进行封闭（室温摇床上封闭3 h，也可4℃过夜），封闭结束后用1×PBS洗膜（5 min，3次）。
⑸抗体孵育：根据各抗体的稀释比例配制抗体溶液，于孵育盒中对NC膜进行一抗孵育（室温，摇床3～4 h；或 4 ℃静置过夜）。孵育结束后用1×PBST洗膜（5 min，6次），之后进行孵育二抗（室温静置1 h）。
⑹成像分析：1×PBST洗膜（5 min，3次）后，使用Tanon5200化学发光图像分析系统成像并分析结果。
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本实验数据均采用（Mean±SEM）的方式作图；两组之间比较时，满足方差齐性和正态分布的连续型计量资料数据采用t检验进行比较；仅方差不齐时采用Satterthwaite近似t检验；若两者均不满足则采用秩和检验。使用SPSS 11.0对数据进行统计分析，当P<0.05时，差异具有统计学意义。分析结果用GraphPad Prism 8.0软件作图。
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根据对溶解曲线及扩增曲线的筛选标准：①在相同温度条件下，扩增曲线拟合度一致性好且曲线的定点斜率较大；②溶解曲线拟合度一致性好且其溶解温度稳定，溶解曲线的峰值高，表明引物能够较好地与扩增片段解链并完成结合扩增[17]，我们使用3种候选引物序列（表1）分别扩增了同一肝脏组织来源的CRELD2 cDNA样品，结果如图2。扩增曲线拟合度一致性排序：引物2>引物3>引物1；溶解曲线峰值：引物1与引物3较引物2低。因此，引物2序列被用于本实验研究。
表 1 CRELD2基因候选引物序列
CRELD2 引物 序列(5' to 3') 上游引物1 ACTTTGAGTGCAACCAACTCTT 下游引物1 CCGCTGCAATAGCCGTTTC 上游引物2 GCCAGGAAGAATTTCGGTGG 下游引物2 CATGATCTCCAGAAGCCGGAT 上游引物3 TTGCAGAGGAACGAGACCCA 下游引物3 GCCGTTGACATTCTCACAGTA 
图 2 CRELD2基因候选引物的扩增曲线与溶解曲线
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选用CRELD2-引物 2通过RT-PCR对小鼠的肝、胰腺、胃、肺组织中的CRELD2 mRNA水平进行测定，并以小鼠GAPDH特异性引物作为内参对照，比较各组织中CRELD2 mRNA的相对表达水平，结果如图3所示：在肝、胰腺、胃、肺组织中均可检测到CRELD2的基因表达；且CRELD2在不同组织中的表达水平有差异（以胰腺组织为基准，对其余各组织中的相对表达量进行标化），组织间相对表达量为：胰腺>胃>肝>肺，提示在4种组织中以胰腺中的表达水平最高、肺中表达水平最低。需要注意的是，无论是组织通用型RNA提取法还是胰腺组织特异性RNA提取法，胰腺中的表达水平在4种组织中均居首位（结果未显示），实验结果图3采用的是后一提取方法。
图 3 RT-PCR检测不同组织中CRELD2 mRNA的水平
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为确保WB检测小鼠各组织中CRELD2蛋白的表达水平的结果准确可靠，我们从市面上可购买到的抗CRELD2抗体中，根据其产品说明标注的应用范围选择了3种适用于WB的不同品牌抗体，按照各自的使用说明对同批次的组织蛋白样品进行WB测定，结果如图4：抗体A在非目的条带所在位置出现条带，存在双条带；抗体B出现非特异性条带，且与抗体A或C相比，其目的条带普遍较淡；与抗体A或B相比，抗体C目的条带较清晰、无杂带。考虑到不同品牌抗体的使用条件各异，所以不同抗体的产品说明虽然在应用范围上有重合，但仍有各自较为适用的应用范围。根据本实验的操作条件与抗体WB条带结果，抗体C被用于进一步的蛋白水平检测。
图 4 不同抗体检测CRELD2蛋白表达效果图
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由WB检测小鼠各组织中CRELD2蛋白的表达水平，如图5所示：对于肝、胰腺、胃、肺等不同组织来源的蛋白样品，均可见CRELD2蛋白条带且其灰度值之间存在差异，相对表达量由高至低分别为：胰腺>肝>胃>肺。由此可见，CRELD2蛋白在胰腺、肝、胃、肺4种组织中均有表达，且在4种组织中表达水平不同，以胰腺表达水平最高、肺的表达水平最低。
图 5 不同组织中CRELD2蛋白的表达水平
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在获得小鼠胰腺、肝、肺、胃4种组织样本的基础上，对于同种组织样品进行同批次提取总蛋白及总RNA，对同批次样品进行RT-PCR及WB测定CRELD2的表达情况，如上述结果显示（图3、图5）：在基因与蛋白质水平，CRELD2在小鼠胰腺、肝、肺、胃4种组织中均有表达，且无论在基因还是蛋白质水平，4种组织中胰腺组织中的表达量最高、肺组织中表达水平最低；但4种组织中，CRELD2的基因和蛋白质水平并不完全一致，如RT-PCR结果显示，在胃组织中CRELD2基因的相对表达量高于肝脏组织，而WB结果显示，肝脏组织中CRELD2蛋白的相对表达量高于胃组织，对于个别组织间的相对表达量排序在不同水平上有差异，但整体趋势保持一致。因此，无论在基因还是蛋白质水平，CRELD2在小鼠各组织中均有表达，但在不同表达水平上各组织中CRELD2的相对表达量略有不同。
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CRELD2与CRELD1共同构成CRELD蛋白家族，是EGF超家族的新成员[5]。目前CRELD2相关研究主要围绕内质网应激展开，研究方向尚不集中，而与之同源的CRELD1现已明确与心脏房室间隔缺损密切相关[18-19]。本研究通过不同方法在基因及蛋白质水平探究CRELD2在各组织中的表达水平，对CRELD2的组织特异性研究具有重要意义。
准确有效地阐明靶标蛋白在基因和蛋白水平的表达情况是生物学研究的重要内容，不同的检测方法具有各自的特点，通常采取多种方法综合验证以获得目的基因及蛋白质在不同类型组织或细胞中的确切表达情况[20-21]。在本实验中，在基因表达水平，我们针对CRELD2基因设计并筛选出用于扩增的引物序列；在蛋白表达水平，结合预选的蛋白条带结果选出了可用于WB的适用性抗体。本实验所需抗体主要用于WB测定，采取的验证与比较的方式比较单一，因此对于抗体综合效果的验证结果仅供参考。此外，我们改进优化了胰腺组织总RNA提取的方法，胰腺组织所处解剖学位置特殊且富含RNA酶，对其总RNA提取存在着取材困难、组织易自身消化、RNA易降解等问题。有研究报道可通过胰腺组织原位灌注RNA酶抑制剂来获得高质量的RNA，但操作困难且成本较高[22-23]，由此我们做出了改进：①取材迅速结合液氮冷冻研磨，可减少冻融及胰酶对胰腺组织的自身消化；②增加Trizol用量，有效抑制RNA酶的活性；③使用盐酸胍（含β-巯基乙醇）溶解RNA沉淀并清除其中残留的RNA酶，减少降解，由此分离获得较高质量的胰腺组织总RNA。
本实验通过RT-PCR及WB，在基因及蛋白水平检测了CRELD2在各组织器官中的表达水平，旨在综合不同方法的优势明确各组织中的表达情况，有指向性地研究CRELD2的生物学功能。由结果可见，采用上述2种方法探究CRELD2在不同组织中的表达水平是可行的，其相对表达量在组织间的差异整体趋势相符，可作为相互验证的依据以提高准确度。同时，我们也发现个别组织间的相对表达量排序在基因与蛋白质的不同水平上不完全平行，但差异不影响整体趋势的一致性，考虑CRELD2在个别组织中可能存在转录后的修饰与调节，由此造成差异。同时，后续将通过免疫组织化学、免疫荧光及酶联免疫吸附试验等方法阐明CRELD2在具体细胞内亚结构中的定位以及在其他水平上各组织中的表达情况，更好地为CRELD2生物学功能研究奠定基础。
Expression of CRELD2 in mouse tissues
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摘要:
目的 通过不同方法在基因及蛋白质水平探究CRELD2在小鼠各组织中的表达水平，为研究CRELD2在各组织中的生物学功能提供依据。 方法 通过实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）及蛋白质印迹法（Western Blot，WB）测定C57BL/6J小鼠的肝、胰腺、胃、肺等组织中CRELD2 mRNA与CRELD2蛋白的含量，实现在不同水平上探究CRELD2在各组织中的表达情况。 结果 RT-PCR及WB测定结果显示，CRELD2在小鼠的肝、胰腺、胃、肺组织中均有表达，表达量在各组织间存在差异；基因水平的相对表达量排序为：胰腺>胃>肝>肺；蛋白水平的相对表达量排序为：胰腺>肝>胃>肺。检测结果表明CRELD2在各组织中普遍存在，但组织间相对表达量的排序并不完全一致，推测与转录调控相关。 结论 CRELD2在小鼠的肝、胰腺、胃、肺组织中均有表达，且相对表达量在基因与蛋白质水平不完全平行。 Abstract:Objective To explore the expression of CRELD2 at the gene and protein levels of mouse tissues, and to provide a reference for studying the biological function of CRELD2 in various tissues. Methods The expression level of CRELD2 in the liver, pancreas, stomach, and lung of C57BL/6J mice was determined by real-time PCR and Western Blot. Results RT-PCR and WB showed that CRELD2 was expressed in mouse liver, pancreas, stomach, and lung. The relative expression levels of CRELD2 from high to low were pancreas, stomach, liver, and lung at the gene level, and pancreas, liver, stomach, and lung at protein level respectively. The result suggested that the relative expression levels of the CRELD2 gene and protein in different tissues were not completely consistent, suggesting that it is related to transcriptional regulation. Conclusion CRELD2 is expressed in mouse liver, pancreas, stomach, and lung, and the relative expression levels of CRELD2 are not completely parallel at the gene and protein level. -
Key words:
- CRELD2 /
- tissue specificity /
- secreted protein.
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随着医疗改革的深入，针对药品与医用耗材的“两票制”“零加成”“集中带量采购”等新医改政策的施行，医院的运营环境发生了很大的变化。如何提升临床医疗服务内涵与质量、控制医疗成本，成为目前公立医院工作调整的重点。当前一些大医院已经普遍地导入了供应-加工-配送(supply processing distribution mode, SPD)的供应链模式，对于降低医院药品和医用耗材采购成本、减轻院内配送负担、降低医院库存资金占用、提升药品和医用耗材精细化管理水平，发挥了积极的作用[1-2]。由于外部SPD服务商介入院内服务和管理，影响了传统的医院药品和医用耗材管理体系[3]。
本研究通过对实施SPD供应链前后，医院药品和耗材的20项主要管理职能的履行效率和管理实施成效的变化进行调研、打分、评估，并进行统计分析，以期评估SPD供应链实施后对医院各项职能的影响，从而提出可能的解决策略和建议。
1. 医院药品和耗材管理导入SPD供应链模式的动因与成效分析
传统的药品和耗材管理模式，由医院根据自己业务需要自行采购、储存保管和配送到临床，往往存在着技术手段落后、信息化水平较低、成本控制困难等问题。主管科室忙于应对数量众多的供应商的订单、收发货、院内配送、结算等烦琐工作，在加强药品、耗材精细化管理和采用系统科学的方法持续降低耗材成本方面的工作力量较为薄弱[4-5]。为改善传统管理模式带来的一系列问题，提升医院管理效率，降低医院运营成本，许多医院尝试导入SPD供应链管理模式[6-7]。目前，较为成熟的SPD供应链管理模式，是SPD供应链的商业公司在医院的指导下，站在医院的立场，链接医院与上游厂商，实施整合的采购管理与服务[8]；在院内运营中，对科室请领与物资发放等核心业务流程、信息系统、仓储设施设备、临床及手术室的智能存取设施等，实施改进和优化；通过医院管理信息系统、物资管理系统、SPD管理系统的互联互通，实现从采购到临床使用的全程可追溯[9]。
2. 调研方法与数据结果
本研究对上海地区实施药品和医用耗材SPD模式的9家三级医院和大型专科医院进行调研分析，根据申康医疗发展中心公布的各家医院医疗数据，采用调查问卷的形式，对医院药品和耗材管理过程中涉及的20项主要管理职能的履行效率和实施成效进行打分，取平均值，然后进行统计分析，评估实施SPD供应链后，各家医院各项管理职能的变化。结果如表1所示。
表 1 医院药品和医用耗材管理职能的履行和能力变化管理职能 传统模式 SPD模式 资源投入
变化管理能力变化 新产品准入 医院负责流程管理，并负责寻源、供应商谈判工作 医院负责院内流程管理；SPD运营商参与寻源，并与医院确认的供应商进行价格谈判 减少 强化 供应商评估 医院定期对供应商服务态度、送货及时性和耗材价格进行评估 医院对SPD服务商进行评估，SPD服务商对供应商进行评估 持平 强化 医保类药品和耗材价格谈判 医院根据阳光平台红黄线监控对耗材价格进行降价谈判 医院主导或指导下SPD服务商实施 减少 强化 药品和医用耗材临床试验的管理 根据使用科室或部门的使用申请，药剂和耗材管理部门组织实施 医院负责临床应用前试用的流程管理，SPD服务商提供药品、耗材和发放试用，收集试用情况反馈 减少 强化 日常采购订单处理 医院负责处理日常采购订单的记录 医院物资系统与SPD服务商系统对接，基于临床申领需求，SPD服务商负责日常采购订单操作 减少 强化 资质证照管理 医院负责供应商及产品资证证照的收集、存档、效期管理 SPD服务商根据GSP管理要求，对资质证照管理，设备科监管 减少 强化 耗材验收管理 医院依据GSP及医院管理要求，对产品进行验收 SPD服务商进行验收入库，院内SPD人员对送达医院的产品进行二次验收 减少 强化 药品和医用耗材进货查验记录管理 药剂和耗材管理部门负责 SPD服务商管理进货查验记录，现场存档，医院监管和定期检查 减少 强化 院内一级库管理 医院负责一级库的库存和出入库作业管理 SPD服务商负责一级库库存和作业管理；医院不承担库存资金占用 减少 强化 临床二级库管理 临床科室负责二级库的库存管理和数据统计，医院监管 临床科室负责二级库产品出入库管理；SPD服务商负责二级库库存效期和退换货管理 减少 强化 院内配送 医院管理院内一级库发放药品、耗材，药剂科和设备科组织人员配送至科室或临床来一级库领取 SPD服务商负责向临床科室实施定期和临时配送，参与临床二级库货物整理上架 减少 强化 发票对账 医院管理供应商的发票对账和结算工作 医院对SPD服务商提供的发票和系统出库数据、院内配送单据进行核查对账 减少 强化 阳光平台数据管理 医院管理供应商在阳光平台的授权、议价和发票信息上传 医院授权并指导SPD服务商进行阳光平台发票上传操作，SPD服务商协助对阳光平台上传数据和院内收费数据进行对照分析 持平 强化 物资系统字典表维护 医院管理药品、物资系统字典表的新增和禁用，并确保产品与代码一一对应 SPD负责产品与物资系统字典表的对应关系核对，医院负责药品、物资系统字典表的维护操作 持平 强化 高值耗材介入追溯管理 耗材管理部门负责红十字会高值耗材追溯系统的维护、高值耗材的扫描和数据统计，临床负责高值耗材的盘点和出入库记录 医院加强高值耗材实际使用和数据分析管理；SPD服务商负责红十字会系统的扫描录入、高值耗材出库明细与病人已用耗材明细的核对 持平 强化 耗材临床库存差异和计费差错管理 设备科负责监督、检查 医院引入基于RFID的智能存储设备、实施药品和医用耗材计费标签扫码确费等，完善临床库存差异和计费差错的管理手段 增加 强化 临床不良反应事件管理 临床发现药品、耗材使用中的问题，上报至药品和耗材管理部门，医院进行事件调查、约谈供应商和厂家、提供解决方案和上报药监局 SPD服务商参与配合事件调查、约谈供应商和厂家、提供解决方案 持平 强化 应急物资管理 医院负责采购、存储和发放应急物资 医院强化应急物资的采购计划和临床发放管理，SPD服务商发挥其渠道优势和院外物流中心储备能力优势，参与应急物资供应管理 增加 强化 临床耗材申领预算审批和耗占比管理 医院基于系统数据分析来审核临床提交的月度/季度耗材预算，并制作每月/季度各科室药品、耗材占比分析报告 SPD服务商提供分析数据支持，不参与具体管理流程 增加 强化 药品和医用耗材超常使用预警 医院负责对超出常规使用的药品和医用耗材及时进行预警 SPD服务商不参与 增加 强化 上述20项管理职能中，有11项药剂科和设备科的履职精力和资源投入普遍减少，主要为药品、耗材的日常供应操作管理；有5项持平；在药品、耗材成本与预算管理、应急物资管理等4项职能上加大了精力投入，从“医院+SPD供应链的整体”来看，各项职能的管理能力均得以加强。调研发现，引入SPD供应链后，药品和耗材的采购和管理更多的聚焦于耗材成本精细化管控和耗材管理与临床服务标准的提升，大大节约了运营成本，提升了医院的运营效率。
3. SPD供应链实践过程中存在的典型问题分析
SPD模式下，医院药品和耗材原有的管理体系从组织、流程、信息系统，到服务评价和绩效考核，难以直接覆盖对新模式及服务商的管理，同时伴随实践的深入和医改的深化，一些问题会逐步暴露出来。
3.1 规章制度与流程体系未及时更新
在院内药品、耗材管理体系中引入SPD供应链这一新的参与者之后，医院引入了与SPD供应链配套的管理和作业流程，这些流程往往集中在以SPD供应链为作业主体的环节，一些医院并未及时修订完善原有的规章制度和流程。
3.2 院方与SPD供应链运营方的角色权限、责任定义不够清晰
典型的包括对于发生在院内流转环节的物权责任边界定义含糊，不仅包含院内各部门、科室的责任，也包含院方与SPD供应链运营方及其上游供应商直接的物权责任界定；在信息系统对接和日常作业中对信息安全和敏感数据缺乏完备的权限分配和保密细则约定。
3.3 面向SPD供应链药品、耗材供应的服务评估与绩效考核缺乏针对性
大多数案例中，院方对SPD服务商的考核管理尚未形成体系并清晰纳入药品、耗材主管部门的工作职责范围，也未建立与医院药品、耗材管理目标相对应的专门的SPD供应链服务评估与绩效考核体系。
3.4 对SPD供应链运营商的定位局限
从服务范围看，大多数项目将SPD供应链运营商局限在药品和医用耗材的供应，对于办公用品、小型设备等可共享流程和作业资源的领域还存在成本和效率挖潜空间。
从药品和耗材的品牌和渠道决策看，鉴于质量与服务的担忧等因素，院方普遍未向SPD供应链运营商放权，SPD供应链运营商往往停留在按照院方既定的品牌和渠道决策进行采购执行，很少能主动提供更低成本的替代方案。
4. 对策分析
4.1 通过SPD供应链模式导入完善医院药品和医用耗材内控体系
实施SPD供应链模式，是梳理和提升医院自身药品和医用耗材内控管理体系的一个契机[10-11]，做好此项工作需要注意5个要点：①管住人。在原有制度和流程中进行更新和修订，将SPD供应链运营商各岗位和人员纳入医院管理体系中，包括人员招聘、培训、考勤、考核、行为规范等，均需以SPD供应链运营商备案审批的方式纳入到院方的管理范围中。②管住事。需要针对SPD模式的服务解决方案，对医院原有制度和流程进行修订或增补，避免SPD供应链服务流程游离于医院内控体系之外。③管住风险与责任。在制度和流程体系再造中，对风险与责任（比如涉及合规及人财物的各类风险问题、产品质量责任、安全生产责任、物权责任、信息安全责任等）需要尽可能用细化的书面形式描述，对常见问题需要进行穷举式约定，并对实践中发生的无法沿用原有制度和流程进行责任判定和操作指引的问题进行及时更新增补[12]。④制度与流程先行。做好事前控制，这一点非常重要，对于已经实施SPD模式的医院，也要力求做到在引入新的服务方案时，比如新增某种针对手术室的服务方案，先行编制和颁布详细的制度和流程[13]，并开展培训。⑤及时更新。在内控体系中往往第一个文件就是“关于制度的制度” “关于流程的流程”，制度和流程的版本需要根据实际管理与作业的需求和变化进行及时更新，这一点在实践中极易被忽视。
4.2 建立完善的SPD供应链运营商的服务评估与绩效考核体系
对SPD供应链运营商的绩效考核，根本目的在于找到需要坚持的优点和需要改善的问题，参照医院耗材主管部门自身的工作目标，形成下一阶段SPD供应链运营商的工作目标和重点工作计划。医院对药品、耗材主管部门的考核指标与考核办法不能直接套用于SPD供应链运营商。建立SPD供应链运营商的服务评估与绩效考核体系需关注如下3个方面的内容：一是建立日常的检查与自查制度；二是建立量化指标体系，对产品供应、服务品质、数据准确性、成本控制等进行定期（半年度）评估；三是进行定期的（年度）服务满意度问卷调查，访谈调查对象应涵盖临床科室（产品供应、产品质量和人员服务）、安保部门（安全生产）、信息部门（信息安全、系统对接）、上游厂商等。
4.3 从发展的视野对SPD服务商进行新的定位
4.3.1 拓展SPD服务商的服务范围
对于经实践检验具备药品和耗材服务能力的SPD供应链运营商，院方可以逐步将小型医疗设备、后勤办公用品等纳入其服务范围，以进一步降低医院成本[14]。
4.3.2 进一步发挥SPD供应链运营商及SPD模式在降低药品、耗材成本中的作用
为充分发挥SPD供应链运营商在产品、渠道、采购规模方面的优势能力[15]，需要给予其在产品进院决策流程中的清晰目标、责任和对应的权力。可以将供货渠道从院方审批/审核制转变为备案制为起点，即院方决策确定产品品牌后由SPD供应链运营商确定价格最优的供货渠道，然后逐步要求SPD供应链运营商提供不同品牌的效价比/性价比分析，让其适度参与品牌选择决策。在未来疾病诊断相关分组(DRG)/DIP模式下，不同手术方案中耗材品牌和供货渠道/供货价格对医院收支影响程度更为显著，医院需要前瞻性地选择和培育具有优秀的渠道能力、价格谈判能力和具备一定的产品知识的SPD供应链运营商作为战略合作伙伴。
同时，要关注和主动寻找其他医疗机构实施联合带量采购的问题。国家层面的单品种带量采购谈判、医疗机构联合体或其他形式的联合带量采购、单家医院自身的耗材采购与成本优化，是共为一体的耗材降本组合拳。医院借助SPD供应链运营商实现从医疗机构联合体的层面搭建和完善医院药品和医用耗材管理体系的市场化运作模式，具有较高的可操作性。
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表 1 CRELD2基因候选引物序列
CRELD2 引物 序列(5' to 3') 上游引物1 ACTTTGAGTGCAACCAACTCTT 下游引物1 CCGCTGCAATAGCCGTTTC 上游引物2 GCCAGGAAGAATTTCGGTGG 下游引物2 CATGATCTCCAGAAGCCGGAT 上游引物3 TTGCAGAGGAACGAGACCCA 下游引物3 GCCGTTGACATTCTCACAGTA 
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