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泰山白首乌来源于为萝摩科（Asclepiadaceae）鹅绒藤属（Cynanchum Linn.）植物戟叶牛皮消Cynanchum bungei Decne. 的干燥块根，《本草备要》记载：“具有养血补血、补肝肾、强筋骨和润肠通便的作用”，也被誉为泰山四大名药之首[1-2]。研究表明，泰山白首乌的主要活性成分为苯乙酮和C21甾体皂苷[3-7]。泰山白首乌的主要药理活性有抗肿瘤、保肝、抗炎、抗菌、抗病毒、抗抑郁、降血糖 等[5-7]。
植物内生菌是一类广泛存在于宿主植物体内，且不引起宿主明显病症的真菌，是一类具有丰富多样性的微生物类群。植物内生菌通过“协同进化”作用，以促进宿主植物生长，增强抗逆性，促进药用植物中有效成分的积累[8-9]，植物内生菌已成为国内外学者的研究热点。顾晓洁等[10] 2018年报道了滨海白首乌块根中内生细菌的分离鉴定。Li等[11]从滨海白首乌中分离出的一株产红色素具有抗氧化作用的内生真菌Stemphylium lycopersici。Gu等[12]从滨海白首乌中分离得到的内生真菌Plectosphaerella cucumerina YCTA2Z1中分离鉴定得到13种化合物，分离得到与宿主滨海白首乌相同的次级代谢产物单体告达庭（caudatin）、白首乌二苯酮、cynandione B和 2',5'-二羟基苯乙酮[11-12]。但是，目前没有关于泰山白首乌内生真菌的传统分离纯化培养报道。同时，有研究表明，泰山白首乌的粗提物和单体化合物对多种肿瘤细胞株均具有显著活性[6]，目前已有从植物中分离得到具有抗肿瘤活性的内生真菌[13-14]的研究，但对泰山白首乌内生真菌的相关分离鉴定、活性成分及抗肿瘤等生物活性的研究还未开展。
本实验以泰山白首乌内生真菌为研究对象，通过传统分离培养法，将分离鉴定得到的泰山白首乌内生真菌进行液体发酵，并进行抗肿瘤活性菌株筛选。一方面探讨泰山白首乌内生真菌能否产生与宿主相似的次级代谢产物，另一方面为研发新的抗肿瘤活性药物提供科学依据。
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3个产地的健康泰山白首乌植株各5株，包含根、茎、叶。济南的泰山白首乌叶（JTY）、泰山白首乌茎（JTJ）、泰山白首乌根（JTG），均采自山东中医药大学长清校区植物园内（36°56′ N, 116°79′ E）；临沂的泰山白首乌叶（LTY）、泰山白首乌茎（LTJ）、泰山白首乌根（LTG），均采自临沂费县御华景宸农业生态园内（35°27′ N, 117°97′ E）；泰安的泰山白首乌叶（TTY）、泰山白首乌茎（TTJ）、泰山白首乌根（TTG），均采自泰山（35°78′ N, 117°45′ E）。植物样品经山东中医药大学中药鉴定教研室徐凌川教授鉴定为泰山白首乌C. bungei Decne.。采集的样品用无菌塑料袋包装，置于4 ℃冰箱保存备用，48 h内进行样品处理。
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T100™梯度PCR扩增仪（美国BIO-RAD伯乐T100梯度PCR仪）；电泳仪（上海天能科技有限公司）；凝胶成像仪（上海天能科技有限公司）；Qubit® 2.0荧光计（赛默飞Invitrogen）；SW-CJ-1D超净工作台（苏州净化设备有限公司）；E.Z.N.A.真菌DNA提取试剂盒（美国Omega Bio-Tek）；Taq DNA Polymerase（赛默飞Thermo）；Agencourt AMPure XP（Beckman）；2×Trans Taq High Fidelity (HiFi) PCR SuperMix I（北京全式金生物技术有限公司）；ddH2O（北京全式金生物技术有限公司）；琼脂糖（超纯）（北京天根生物科技有限公司）；50×TAE缓冲液（北京索莱宝科技有限公司Solarbio）；DNA Maker（日本TaKaRa）；Goldview核酸染料（10 000×）；6×Loading buffer（日本TaKaRa）；XD-101 CO2细胞培养箱（日本SANYO公司）；奥林巴斯IX51倒置荧光显微镜（日本奥林巴斯公司OLYMPUS）；ELX800光吸收酶标仪（美国BioTek）；细胞培养瓶（美国FALCON）；青、链霉素混合液（北京索莱宝科技有限公司）；PBS（北京索莱宝科技有限公司）；RPMI-1640（美国GIBCO）；DMEM（美国GIBCO）；L15（美国GIBCO）；FBS（美国ExCell Biology FBS500）；MTT（美国Amresco）；DMSO（溶解受试药品）（美国SIGMA D2650）；土豆（沃尔玛）；葡萄糖（源叶生物）；琼脂粉（源叶生物）；无水乙醇，分析纯（上海泰坦）；次氯酸钠（分析纯，国药集团）。
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人肝癌细胞HEPG2、人胃癌细胞HGC27、人结肠癌细胞HT-29、人宫颈癌细胞HELA（中国科学院上海细胞库）。
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表面消毒：将采集新鲜济南、临沂和泰安产的戟叶牛皮消的根、茎和叶用自来水冲洗干净，转移至超净台，进行“75%乙醇-2.5%次氯酸钠-75%乙醇”的3步表面消毒处理。处理过后继续用无菌水冲洗5遍，灭菌滤纸将表面水分吸干。
组织块培养：超净台中操作，用消毒的剪刀和镊子分别将根、茎与叶剪切成小的组织块（0.5 cm×0.5 cm），分别从3个部位中各随机挑取20个组织块，每组设置4～5个组织块，分组好的组织块置于含有青霉素（50 mg/L）马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）的平板中，于温度25 ℃，湿度80%的恒温恒湿培养箱中进行内生真菌菌丝的生长情况的定期观察。挑取尖端菌丝转移到新的PDA培养基中培养，至菌丝形态单一，即得到纯化的菌株[15-16]。根据内生真菌菌株的培养的形态特征初步划分为不同的形态型，拍照留存。根据菌株群落的培养特征，划分为不同的形态型，继续将分离纯化后的菌株接种至PDA固体试管斜面培养基上进行培养，4 ℃冰箱保存。
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观察培养的内生真菌菌落形态，对照《真菌鉴定手册》进行形态学特征鉴定。将“2.1.1”项下形态一致的泰山白首乌内生真菌菌株进行合并[16]，参考E.Z.N.A.真菌DNA提取试剂盒说明书提取菌株DNA。以提取的DNA为模板，采用真菌ITS通用引物TIS4（5’-TCC TCC GCT TTA TTG ATA TGC-3’）和ITS5（5’-GGA AGT AAA GTC GTA ACA AGG-3’）对菌株的r DNA-ITS区域进行PCR扩增。PCR反应体系：2×Trans Taq Fidelity(HiFi) PCR SuperMix 15 μl，Primer（10 μmol/L）各1 μl，Genomic DNA 10 ng；补充双蒸水至 30 μl。反应条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性40 s，52 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，35个循环，72 ℃延伸10 min。5 μl PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测。将合格的PCR扩增产物送上海生工生物有限公司进行测序。内生真菌菌株测序得到的ITS序列去除载体序列，利用NCBI数据库（http://www.ncbi.nlm. nih.gov）BLAST进行比对，根据所得分子鉴定结果并结合形态学特征确定菌株。
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按“2.1”项下方法分离得到的90个形态型泰山白首乌内生真菌菌株为供试菌株，PDA固体培养基中接种活化。待菌丝覆盖培养基表面时，用直径5 mm打孔器制备10个菌饼，放入装有100 ml的PDA培养基的锥形瓶中，每个菌种接种6瓶。接种后于25 °C、180 r/min 振荡培养7 d。发酵完成后，抽滤并收集发酵培养液，1∶1乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，减压浓缩，即得乙酸乙酯提取物[17]。干燥后于4 °C冰箱中避光保存。
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二甲基亚砜(DMSO)溶解乙酸乙酯粗提物后，用PBS分别稀释至0.001、0.01、0.1、1.0、10.0、100.0 μg/ml。采用MTT法测定样品抗肿瘤活性[17]。以人肝癌细胞HEPG2，人胃癌细胞HGC27，人结肠癌细胞HT-29，人宫颈癌细胞HELA为受试对象，阳性对照采用阿霉素。将细胞放置于含10% FBS、青霉素和链霉素各100 U/ml的DMEM细胞培养液中，于37 ℃、5% CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养，48 h换液传代。消化传代后显微镜下观察细胞的生长情况。取对数生长期的细胞，胰酶消化后，10%小牛血清的完全培养液洗涤、悬浮，将100 μl悬浮细胞液（2～4×104个/ml）接种于96孔板中，培养24 h。吸弃培养液，每孔加入100 μl含有不同药物的完全培养基(含10%小牛血清，1%双抗)，每种浓度设3个平行孔，设空白对照组，培养72 h后，每个孔加入5 mg/ml的 MTT 10 μl，培养4 h，吸弃培养液后加入100 μl DMSO，振荡至结晶完全溶解，用酶联免疫监测仪在波长为570 nm处测定A值，计算各浓度下的细胞抑制率，计算方法如下：
$$ \text{细胞抑制率}=1-\frac{\text{药敏孔相对}A\text{值}}{\text{阴性对照孔相对}A \text{值}} $$ 阴性对照孔相对A值=阴性对照孔绝对A值—空白对照孔绝对A值
药敏孔相对A值=药敏孔绝对A值—空白对照孔绝对A值
本研究采用SPSS 17.0通过机率单位加权回归法（Bliss法）计算IC50。
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将分离到的869株内生真菌，根据培养特征划分为90个形态型，对不同形态型菌株ITS基因与GenBank中的参考序列进行分子系统学分析，结果见表1，有结果可知，鉴定得到的内生真菌属于3门、12纲、14目、14科、18属和30种。
表 1 根据BLAST序列分离得到的泰山白首乌内生真菌
属名 基因库中接近种(登录号) 相似度 (%) 组织部位 菌株数 根 茎 叶 链格孢属 A. alternata (MH368103.1) 99 1 2 3 A. alternata (MH716004.1) 99 4 4 A. alternata (MG669159.1) 99 1 1 A. alternata(MK07593.1) 99 1 1 A. alternata (MK392122.1) 99 1 1 A. alternata(MK659949.1) 99 2 2 A. alternata(KY859403.1) 99 2 2 A.alternata (KJ739880.1) 99 2 2 1 5 A. alternata (KY859403.1) 99 1 1 A. alternata (LN835252.1) 99 1 1 2 A. alternata (EF504974.1) 78 1 1 A. arborescens (MK460794.1) 99 1 1 A. brassicicola(MF167294.1) 99 1 1 2 A. burnsii(KR604840.1) 100 1 1 Alternaria sp.(KC139509.1) 99 1 1 Alternaria sp.(KC110624.1) 99 1 1 Alternaria sp.(KC147581.1) 99 2 2 Alternaria sp.(KU556507.1) 99 1 1 A.tenuissima(MG602685.1) 99 3 3 6 A. tenuissima (MK675103.1) 99 2 2 子囊菌属 Ascomycota sp.(FJ999646.1) 99 1 1 曲霉菌属 A. terreus var.floccosus (KP987086.1) 99 1 1 小檗属 B. fortunei (MK850215.1) 1 1 葡萄座腔菌属 B. dothidea(HM156069.1) 1 1 B. dothidea(KF294012.1) 1 1 双极霉属 B. sorokiniana (HF934936.1) 1 1 B. micropus(LT837454.1) 82 1 1 生赤壳属 B. ochroleuca(EU273558.1) 1 1 棒孢属 C.cassiiola (MH569606.1) 1 1 炭疽菌属 C. acutatum(MG661733.1) 1 1 C. capsici (EF016299.1) 1 1 C. gloeosporioides (KM044004.1) 1 1 C. nymphaeae (MH863840.1) 1 1 间座壳属 D. phaseolorum (MF379339.1) 1 1 D. phaseolorum (KX866874.1) 1 1 Emmia E. lacerate(MF101401.1) 1 1 突脐蠕孢属 E. rostratum (MH746929.1) 1 1 2 E. rostratum (MH746928.1) 1 1 镰刀菌属 F. nematophilum (KF577906.1) 2 2 F. nematophilum (KX621959.1) 1 1 F. oxysporum(MK673882.1) 1 1 F. oxysporum (KM005080.1) 1 1 F. oxysporum (KY910845.1) 1 1 F. oxysporum(GU724513.1) 1 1 F. solani f. batatas (AF178407.1) 6 7 F. solani batatas (EU625405.1) 1 1 F. solani batatas (MK571197.1) 1 1 F. solani f. batatas (KM235740.1) 1 1 F. solani f. batatas (KJ676962.1) 98 1 1 F. solani f. batatas (KU382502.1) 98 2 2 Fusarium sp.(FJ008989.1) 1 1 Fusarium sp. (MH884151.1) 1 1 小丛壳属 G. cingulata (EF423544.1) 2 2 球座菌属 G. mangiferae(EU677803.1) 1 1 孢菌属 Pleosporaceae sp. (HQ832799.1) 1 1 腔菌属 Pleosporales sp. (APBSDSF25) 1 1 P. cablin(MK568502.1) 98 1 1 毛球腔菌属 Setosphaeria sp. (LT837842.1) 92 1 1 踝节菌属 T. purpureogenus (KU981069.1) 1 1 炭角菌属 Xylariaceae sp. (MG669156.1) 1 1 28 30 32 90 -
组织因素在影响内生真菌的多样性和分布规律发挥着重要的作用[18]，在属的水平上，其对泰山白首乌内生真菌的组成影响也较为显著，如图1所示。泰山白首乌根部内生真菌主要分布于8个属，其中，优势菌属为镰刀菌属Fusarium，占根中内生真菌的64.29%；泰山白首乌茎部内生真菌分布于9个属，优势菌属为链格孢属Alternaria，占茎中内生真菌的60%；泰山白首乌叶部内生真菌分布13个属，优势菌属为链格孢属Alternaria，占叶中内生真菌的56.25%；泰山白首乌内生真菌的叶丰度大于茎和根。3个不同的组织部位中，链格孢属Alternaria和炭疽菌属Colletotrichum为三者共有属，其他具有差异。结果表明，在不同组织部位中，泰山白首乌的内生真菌的分布差异显著。
图 1 泰山白首乌不同部位中内生真菌组成及占百分比（%，属）
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地理位置会影响内生真菌的多样性[19]。在90个形态型内生真菌菌株中，产地济南的泰山白首乌分离39个菌株，产地泰安分离得到26个菌株，产地临沂分离得到25个。如图2结果所示，3个产地的泰山白首乌优势菌属为链格孢属Alternaria和镰刀菌属Fusarium，产地济南的泰山白首乌内生真菌主要分布在12个属，优势菌属链格孢属占38.46%，镰刀菌属占28.21%；产地泰安的泰山白首乌内生真菌主要分布在5个属，优势菌属链格孢属占61.54%，镰刀菌属占26.92%；产地临沂的泰山白首乌内生真菌主要分布在11个属，优势菌属链格孢属占48.00%，镰刀菌属占32.00%。由此可知，产地对泰山白首乌内生真菌的群落组成和优势菌群均有影响，群落组成影响较大。
图 2 不同产地泰山白首乌内生真菌组成及所占百分比（%）
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MTT结果表明，有13株内生真菌菌株代谢产物对HEPG2、HGC27、HT-29、HeLa肿瘤细胞株表现抗肿瘤活性，占总数的14.4%。如表2所示，B. sorokinianaJTY6、A. alternate JTY10、A. brassicicola JTJ11、B. ochroleuca JTJ18、Xylariaceae sp. LTJ1、A. tenuissima LTJ2、C. acutatum LTJ3和A. alternata LTJ6抗肿瘤活性较明显。链格孢属Alternaria是泰山白首乌内生真菌中筛选出抗肿瘤活性菌株的优势菌属，其中，A. tenuissima LTJ2和A. alternata LTJ6的抗肿瘤活性尤其显著，能够显著抑制HEPG2、HGC27、HT-29和HeLa肿瘤细胞株。A. tenuissima LTJ2对HEPG2、HGC27、HT-29、HeLa 4种肿瘤细胞株的 IC50值分别为（2.21±0.61）、（3.11±0.46）、（8.25±1.11）、（3.85±0.60） μg /ml；A. alternata LTJ6为（1.58±0.38）、（1.46±0.39）、（3.63±1.23）、（6.24±0.49） μg /ml。以上结果表明，A. tenuissima LTJ2和A. alternata LTJ6是泰山白首乌具有显著抗肿瘤活性的内生真菌株，可以进一步研究其产生抗肿瘤活性的单体成分。
表 2 泰山白首乌内生菌菌株的抗肿瘤活性
菌株 抗肿瘤活性 (IC50, μg/ml) HGC27 HEPG2 HT-29 HELA JTY6 6.34±1.10 11.05±1.15 29.84±5.78 >40 JTY10 7.87±1.09 6.53±0.28 18.57±5.15 >40 JTJ11 9.92±1.13 6.59±0.56 5.94±0.88 21.37±5.99 JTJ18 2.61±0.35 3.20±0.42 3.55±0.30 9.96±2.38 LTJ1 1.69±0.32 2.96±0.24 13.23±1.66 7.41±1.47 LTJ2 2.21±0.61 3.11±0.46 8.25±1.11 3.85±0.60 LTJ3 5.34±0.89 5.10±1.21 13.01±1.63 5.87±1.36 LTJ6 1.58±0.38 1.46±0.39 3.63±1.23 6.24±0.49 JTJ13 21.76±0.68 >40 20.07±1.38 >40 LTJ5 21.43±0.35 33.43±1.31 >40 >40 LTJ10 21.34±0.65 29.81±0.32 >40 >40 TTY7 27.89±1.08 38.53±0.28 >40 >40 TTY18 18.25±0.24 >40 >40 31.41±1.49 阿霉素 0.022±0.003 0.034±0.01 0.030±0.003 0.039±0.006 -
泰山白首乌与“泰山黄精”、“泰山紫草”和“泰山四叶参”并称为泰山四大名药[2]，但因其自然繁殖率低等因素，导致资源匮乏，市场上供不应求。植物内生真菌与宿主长期协同进化，可以产生相同或相似的活性代谢产物[9]，通过对泰山白首乌内生真菌的深入研究将有效的缓解其资源匮乏，而内生真菌有可能成为开发泰山白首乌的新资源。
本研究表明泰山白首乌中内生真菌资源丰富，具有较丰富的多样性，泰山白首乌内生真菌的分布在不同组织部位差异显著，以丰度比较叶大于茎和根，具有明显的组织特异性，产地对泰山白首乌的优势菌群和群落组成有影响。除优势属、种外，分离得到的大豆疫霉、炭角菌和淡色赤壳菌等内生真菌菌株，也具有良好生物活性 [20-22]。
植物内生真菌能产生与宿主相同或相似的活性成分及生物活性，本研究首次报道了筛选得到的13株泰山白首乌内生真菌具有抗肿瘤活性，占总数的14.4%，其中，从叶中筛选到4株抗肿瘤活性菌株，茎中筛选得到9株抗肿瘤活性菌株，根中无，同时，A. tenuissima LTJ2和A. alternata LTJ6两种抗肿瘤活性尤其显著，值得深入研究。然而，泰山白首乌的药用部位为块根，由于内生真菌在植物组织中的定殖不同，导致在不同组织部位的分布存在差异，具体原因还需要进一步深入研究。另外，从产地上来看，不同产地所筛选得到的抗肿瘤活性菌株数量及品种不同，济南产泰山白首乌筛选到5株抗肿瘤活性菌株，临沂产泰山白首乌筛选到6株活性菌株，泰安产泰山白首乌筛选到2株活性菌株，综上，泰山白首乌中内生真菌的种群结构的抗肿瘤活性是否存在与产地相关，需要进一步深入研究，而已经分离得到的活性菌株的次生代谢产物及其作用机制的研究也是下一个重要目标。
Anti-tumor activities of endophytes from Cynanchum bungei Decne.
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摘要:
目的 分析白首乌内生真菌多样性及其种群结构分布规律，挖掘潜在的微生物资源及功能，为寻找新的抗肿瘤内生真菌提供理论基础。 方法 通过传统的内生菌分离法以及18sRNA高通量测序技术，对不同组织部位、不同物种和不同产地白首乌内生真菌群落组成进行多样性分析；采用 MTT 法检测泰山白首乌内生真菌的细胞毒活性。 结果 从泰山白首乌的根、茎、叶中共分离得到 90个形态的内生真菌，其中，镰刀菌属Fusarium和链格孢属Alternaria 为优势菌属;泰山白首乌根、茎、叶分别有8、9和13个属，链格孢属Alternaria和炭疽菌属Colletotrichum为共有属; 13株泰山白首乌内生真菌对HEPG2、HGC27、HT-29和HeLa肿瘤细胞株产生抗肿瘤活性，占总数的14.4%,极细链格孢菌A. tenuissima LTJ2和链格孢菌A. alternata LTJ6抗肿瘤活性显著。 结论 泰山白首乌内生真菌具有丰富的多样性，部分菌株具有显著的抗肿瘤活性，为寻找新的抗肿瘤药物提供了菌株资源。 Abstract:Objective To investigate the taxonomic structure and diversity of endophytic fungi from Cynanchum bungei Decne., explore the potential microbial resources and functions and provide the theoretical basis for new antitumor endophytic fungi. Methods The diversities of endophytic fungi community in different tissues, species and habitats were analyzed with traditional endophytic bacteria separation method and 18sRNA high-throughput sequencing technology. MTT assay was used to detect the cytotoxic activity of endophytic fungi from Radix Polygoni multiflori. Results 90 strains of endophytic fungi were isolated and identified from roots, stems, and leaves of C. bungei. Among them, Fusarium and Alternaria were the dominant genera. There were 8, 9 and 13 genera from roots, stems and leaves of C. bungei respectively. Among which Alternaria and Colletotrichum were the common genera in different tissues. Further studies showed that 13 endophytic fungi of C.bungei had good anti-tumor activity in vitro, accounting for 14.4% of the total genera. Among them, A. tenuissima LTJ2 and A. alternata LTJ6 had significant anti-tumor activity. Conclusion The endophytic fungi in Cynanchum bungei Decne. have rich diversity. Some strains have significant anti-tumor activity, which can be potential resources for the development of new antitumor agents. -
Key words:
- C. bungei /
- Alternaria /
- anti-tumor activity
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隐丹参酮（CTS）是中药丹参的有效成分之一，国内外研究证明CTS具有抗肿瘤、抗炎、神经保护、心血管保护、抗纤维化和调节代谢紊乱等药理特性，具有广阔的临床应用前景。抗肿瘤作用是近年来隐丹参酮药理活性研究的热点问题之一[1]。隐丹参酮对肺癌、肝胆癌、胃癌、食管癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、结直肠癌、骨肉瘤癌、黑色素瘤、横纹肌瘤、食管鳞状癌等多种恶性肿瘤表现出一定的抑制活性，其抗肿瘤机理包括抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭，诱导细胞凋亡，调节免疫以及抑制包括STAT3在内的多种信号通路[2-4]。由于CTS中等强度的药理活性和选择性，近年来研究人员对CTS进行了大量结构修饰，期望获得靶点明确且药理活性更强的CTS衍生物，从而开发并应用于临床治疗。本文就隐丹参酮及其衍生物在抗肿瘤方面的作用及其机制进行综述。
1. 隐丹参酮抗肿瘤作用
1.1 抑制肿瘤细胞增殖
癌细胞的主要特点是具有无限的增殖能力。研究表明，CTS可以抑制多种肿瘤细胞增殖，包括胰腺癌细胞BxPC-3、慢性髓性白血病细胞K562/ADR、胶质瘤细胞U87、人卵巢癌细胞Hey、前列腺癌细胞DU145、乳腺癌细胞MCF7、食管鳞状细胞癌ESCC等[5]。
1.2 诱导肿瘤细胞凋亡
细胞凋亡又称细胞程序性死亡，对于维持组织稳态和消除不需要或受损细胞起重要作用。研究发现，CTS可以诱导多种肿瘤细胞凋亡，包括骨髓瘤细胞U266、人结肠癌细胞系SW620 Ad300和HCT116、人胃癌细胞MKN-45、肝癌细胞Hepa1-6、非小细胞肺癌细胞A549 和H460 、黑色素瘤细胞A375、横纹肌肉瘤细胞Rh30等[6]。
1.3 抑制细胞迁移和侵袭
高侵袭性和转移是癌细胞恶性特征，转移是癌症死亡的主要原因。因此，抑制癌细胞转移能有效降低癌症死亡率。研究发现，CTS能够抑制卵巢癌细胞A2780的迁移和侵袭[7]。此外，CTS还可以抑制食管癌细胞EC109、膀胱癌细胞T24、人舌鳞癌细胞CAL27、小鼠结肠癌细胞CT26等多种肿瘤细胞的迁移和侵袭[5]。
1.4 调节机体免疫功能
隐丹参酮不仅能够直接抑制多种肿瘤细胞的生长，还可以诱导机体产生抗肿瘤免疫反应，从而间接发挥抗肿瘤效应。研究发现，隐丹参酮能够通过增加CD4+T细胞的细胞毒作用，抑制人非小细胞肺癌H446细胞和乳腺癌MCF7细胞的生长[8]。此外，隐丹参酮还可以通过诱导小鼠树突状细胞成熟，促进抗原提呈功能，进而诱导T细胞活化增殖，抑制Lewis肺癌细胞的增殖[9]。肿瘤相关巨噬细胞 （TAM) 是肿瘤组织中浸润的巨噬细胞，具有异质性，可分为M1和M2表型。M2表型的TAM能够促进肿瘤生长和转移，相反，M1表型则具有肿瘤抑制和促炎特性。研究发现，隐丹参酮和PD-L1联合治疗能够诱导巨噬细胞向M1极化，从而抑制小鼠肝癌Hepa1-6移植瘤的生长[10]。
1.5 逆转多重耐药
耐药是导致肿瘤复发和治疗失败的主要原因。研究表明，CTS能够逆转慢性骨髓性白血病细胞K562对伊马替尼的耐药性[11]，改善A549细胞对顺铂的耐药性[12]。此外，CTS还可以逆转P-糖蛋白（p-gp）过表达的结肠癌细胞SW620 Ad300对多柔比星和伊立替康的多重耐药[13]。
1.6 合并用药可增强不同抗癌药物的作用
除了具有以上活性之外，CTS还可以与其他不同抗癌药物或细胞因子协同发挥抗肿瘤作用。例如，CTS和紫杉醇的联合用药比单独用药更能有效诱导舌鳞状细胞癌CAL27和SCC-9细胞的凋亡[14]。新近研究发现，CTS与小剂量的抗PD-L1抗体合用对小鼠Lewis 肺癌的生长抑制作用明显优于CTS单独应用[9]。
1.7 自噬
自噬，即Ⅱ型程序性细胞死亡，作为凋亡之外的另一种可以杀死细胞的途径，是一种抑制癌细胞生长的新方法。研究显示，CTS可通过诱导结肠癌SW620 Ad300细胞和A549细胞自噬促进细胞死亡[15-16]。
2. 抗肿瘤作用机制
CTS抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭，诱导细胞凋亡，以及调节免疫等作用的机制十分广泛，涉及靶点STAT3、酪氨酸蛋白磷酸酶SHP2、DNA拓扑异构酶和信号通路磷酸酰肌醇3-激酶（PI3K）/丝氨酸/苏氨酸激酶Akt等。
2.1 调控STAT3信号通路
STAT3由Janus激酶（JAKs)激活，参与肿瘤增殖、凋亡、血管生成及免疫逃逸等。STAT3在大多数恶性肿瘤中被组成性激活，异常的STAT3信号传导是肿瘤恶性进展的重要过程。当705位酪氨酸残基磷酸化后，STAT3被激活，单体STAT3通过其SH2结构域形成二聚体，并从细胞质转移到细胞核中，调节其靶基因的表达，例如，上调cyclin D1、survivin、Mcl-1、MYC、BCL-XL表达，下调 p53表达，促进肿瘤细胞增殖和存活；上调MMP2/9、Twist1、Vimentin表达，促进肿瘤转移；上调TGF-β、IL-6/10、PD-1、PD-L1、VEGF表达，下调CD80/86、MHCII、TNF、IL-12、CCL5、CXCL10等表达，抑制肿瘤微环境免疫功能[17]。研究发现，CTS能够直接与STAT3的SH2结构域结合，特异性抑制STAT3 Tyr705的磷酸化，抑制STAT3二聚化[18-19]，相比之下，姜黄素还能抑制Jak2的表达[20]。在人胰腺癌BxPC-3细胞中，CTS能够抑制BxPC-3细胞的STAT3信号通路进而抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，达到抗肿瘤的作用[21]。另外，CTS作为p-STAT3抑制剂，能够有效阻断IL-6介导的STAT3活化，抑制肿瘤增殖，逆转BCR-ABL激酶非依赖性耐药途径[11]。此外，CTS和紫杉醇联合治疗能够有效地抑制舌鳞状癌TSCC细胞增殖和迁移，其作用机制同样与抑制STAT3信号通路相关[14]。沉默信息转录调控因子3（SIRT3）是一种蛋白质去乙酰化酶，参与癌症、心血管、神经系统等疾病的发展过程。研究发现CTS能够通过抑制STAT3/SIRT3 信号通路抑制人卵巢癌A2780 细胞增殖[22]。 上述研究表明，抑制STAT3信号通路对于CTS抗肿瘤至关重要，且CTS是一种特异性的STAT3抑制剂。
2.2 抑制蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2
含Src同源2结构域蛋白酪氨酸磷酸酶（SHP2）由基因PTPN11编码，PTPN11突变引起SHP2催化活性异常增加。研究发现，肺癌、结肠癌、黑色素瘤、神经母细胞瘤、肝癌和急性髓性白血病等病人均发现有PTPN11突变[23]。SHP2是一种非受体蛋白酪氨酸磷酸酶，参与Ras-Erk、PI3K-Akt、Jak-Stat和NF-κB多条信号通路传导，调控细胞的增殖、迁移和凋亡等过程[24]。研究证明，CTS能与SHP2直接结合，是一个混合型蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂，抑制SHP2 的IC50为22.50μmol/L，抑制SHP1的IC50为39.50μmol/L。用SHP2 siRNA敲减Hela细胞中SHP2后，CTS抑制Hela细胞生长的敏感性降低，提示SHP2是CTS的一个靶点，但是，CTS仍然可以进一步抑制SHP2敲减细胞生长，说明CTS还有其它作用靶点[25]。此外，有研究发现，CTS能够上调胶质瘤细胞 U87 SHP2蛋白酪氨酸磷酸酶活性，抑制STAT3 Tyr705的磷酸化，从而在体内外表现出抑制恶性胶质瘤活性[26]。
2.3 调控 topo 2a水平
DNA拓扑异构酶 （topos），包括DNA拓扑异构酶1（topo1）和DNA拓扑异构酶2（topo2），其中topo2因其在有丝分裂中的关键作用被认为是抗癌治疗的重要靶点[27]。研究表明，CTS能够显著降低前列腺癌PC3细胞中topo 2a的mRNA、蛋白和酶活性水平，并且在裸鼠异种移植模型中表现出良好的抗肿瘤作用[28]。
2.4 调控活性氧水平
活性氧与肿瘤的发展密切相关，其过度产生可诱导多种生物学效应，包括抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡和自噬等[29]。研究发现，CTS能够促进胃癌MKN-28 细胞ROS的累积，通过调控MAPK和AKT信号通路诱导G2/M周期阻滞[30]；通过ROS-线粒体途径，上调cleaved caspases-3、促凋亡蛋白Bax和下调抗凋亡蛋白Bcl-2，从而诱导黑色素瘤细胞凋亡[31]；诱导横纹肌肉瘤Rh30细胞ROS产生，激活JNK/p-38，抑制Erk1/2，导致细胞凋亡[32]；刺激SW620 Ad300细胞中的ROS产生，诱导p38 MAPK激活，导致NF-κB从细胞质转移到细胞核中，最终导致自噬发生[15]；刺激HepG2和MCF-7细胞产生ROS，激活内质网（ER）应激，增强不同抗癌药物或细胞因子（Fas/Apo-1、TNF-α、顺铂、依托泊苷或5-FU）诱导的细胞凋亡[33]。
2.5 调控雌、雄激素受体信号
雄激素受体（AR）和雌激素受体（ER）分别是治疗前列腺癌PCa和乳腺癌的主要靶点。研究发现CTS可以通过抑制AR二聚化有效抑制AR活性，从而抑制AR+ PCa细胞的生长[34]；在异种移植动物模型中，CTS可以有效抑制人前列腺癌CWR22Rv1细胞的生长和AR靶基因的表达[35]。此外，CTS还能够抑制乳腺癌细胞的生长，通过竞争性地结合ERα抑制E2诱导的ER转录活性和ER靶基因的表达[36]；同时，CTS可以有效地抑制体内异种移植瘤模型中ER信号，发挥抗肿瘤作用[37]。
2.6 PI3K/AKT信号通路
磷酸肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶（Akt）信号通路参与肿瘤的发生、生长、存活和转移。有研究发现CTS可抑制PI3K/AKT信号通路，增加caspase-3、caspase-9、PARP和Bax的表达，降低Bcl-2、survivin、细胞凋亡抑制蛋白的表达，诱导非小细胞肺癌细胞的凋亡[38-39]。酪氨酸激酶胰岛素生长因子1受体（IGF-1R）在肿瘤细胞的生长、分化和进展中起关键的作用。研究表明，CTS能够通过下调IGF-1R/PI3K/Akt信号通路抑制人肺癌细胞的增殖[40]。此外，有文献报导CTS可以通过调节PI3K/Akt/mTOR信号，抑制结肠癌CT26细胞的侵袭[41]。在裸鼠异种移植实验中，CTS能够显著抑制小鼠体内异种移植物的生长，其作用机制与抑制PI3K/AKT/NF-κB信号通路有关[42]。以上研究表明PI3K/AKT信号通路可能是CTS抗肿瘤的有效信号通路之一。
3. 隐丹参酮衍生物抗肿瘤活性
CTS虽然具有广谱的抗肿瘤活性，但是其药理作用中等，疏水性强且难吸收，口服生物利用度只有2.1%，这些缺点严重阻碍了其开发和应用[43]。近年来，针对CTS存在的问题，人们尝试对CTS进行结构改造，期望获得生物活性高、水溶性好的化合物。刘航[44]等基于CTS是一种STAT3抑制剂，通过对CTS及其骨架类似物进行修饰，设计合成了CTS衍生物62个，其中新化合物46个，通过报告基因法检测发现有27个新化合物对STAT3转录抑制效果优于CTS，IC50最低0.5976 μmol/L。Wang等基于STAT3的药物设计策略，设计合成了一种亲和力和抑制活性更强的新型CTS衍生物LYW-6，该化合物与STAT3结合解离常数Kd约为6.6μmol/L，能够显著抑制STAT3磷酸化、二聚化、核转位以及转录活性。在细胞水平上，LYW-6能选择性抑制高STAT3活性的结肠癌细胞增殖、迁移，促进凋亡，体内可抑制结肠癌的生长和转移，是一个具有开发前景的抗肿瘤活性化合物[45]。为了改善CTS的水溶性，Xu等合成了几种CTS的钠盐衍生物，结果发现这些衍生物比CTS更易溶解，同时保留了CTS的生物活性，其中钠盐衍生物PTS33可以有效地抑制二氢睾酮DHT诱导AR反式激活和PCa细胞生长[46]。
4. 结论
CTS具有广谱的抗肿瘤活性，该活性与抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭，诱导细胞凋亡，逆转耐药性，诱导自噬等作用相关。除直接作用于肿瘤细胞外，CTS还可以通过增强CD4+T细胞的细胞毒作用、诱导DC细胞成熟和促使巨噬细胞M1型极化，间接杀伤肿瘤细胞。分子机制研究表明，CTS可直接结合STAT3和SHP2，有效调节JAK/STAT3、NF-κB、PI3K/AKT和IGF-1R等信号通路发挥抗肿瘤作用。隐丹参酮特异性抑制STAT3信号通路，而不抑制STAT家族中的其他蛋白，是其一大特点。因为尽管其他天然产物也有抗肿瘤作用，但不是特异性STAT3抑制剂，例如姜黄素，是一种STAT抑制剂，但在治疗24 h后降低了STAT3的表达。虽然CTS表现出良好的药理活性，但水溶性差和生物利用度低等问题限制了其广泛应用。因此，基于靶点STAT3，以CTS作为先导化合物，设计并合成一系列CTS衍生物，有望开发出新型STAT3抑制剂用于癌症治疗。
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表 1 根据BLAST序列分离得到的泰山白首乌内生真菌
属名 基因库中接近种(登录号) 相似度 (%) 组织部位 菌株数 根 茎 叶 链格孢属 A. alternata (MH368103.1) 99 1 2 3 A. alternata (MH716004.1) 99 4 4 A. alternata (MG669159.1) 99 1 1 A. alternata(MK07593.1) 99 1 1 A. alternata (MK392122.1) 99 1 1 A. alternata(MK659949.1) 99 2 2 A. alternata(KY859403.1) 99 2 2 A.alternata (KJ739880.1) 99 2 2 1 5 A. alternata (KY859403.1) 99 1 1 A. alternata (LN835252.1) 99 1 1 2 A. alternata (EF504974.1) 78 1 1 A. arborescens (MK460794.1) 99 1 1 A. brassicicola(MF167294.1) 99 1 1 2 A. burnsii(KR604840.1) 100 1 1 Alternaria sp.(KC139509.1) 99 1 1 Alternaria sp.(KC110624.1) 99 1 1 Alternaria sp.(KC147581.1) 99 2 2 Alternaria sp.(KU556507.1) 99 1 1 A.tenuissima(MG602685.1) 99 3 3 6 A. tenuissima (MK675103.1) 99 2 2 子囊菌属 Ascomycota sp.(FJ999646.1) 99 1 1 曲霉菌属 A. terreus var.floccosus (KP987086.1) 99 1 1 小檗属 B. fortunei (MK850215.1) 1 1 葡萄座腔菌属 B. dothidea(HM156069.1) 1 1 B. dothidea(KF294012.1) 1 1 双极霉属 B. sorokiniana (HF934936.1) 1 1 B. micropus(LT837454.1) 82 1 1 生赤壳属 B. ochroleuca(EU273558.1) 1 1 棒孢属 C.cassiiola (MH569606.1) 1 1 炭疽菌属 C. acutatum(MG661733.1) 1 1 C. capsici (EF016299.1) 1 1 C. gloeosporioides (KM044004.1) 1 1 C. nymphaeae (MH863840.1) 1 1 间座壳属 D. phaseolorum (MF379339.1) 1 1 D. phaseolorum (KX866874.1) 1 1 Emmia E. lacerate(MF101401.1) 1 1 突脐蠕孢属 E. rostratum (MH746929.1) 1 1 2 E. rostratum (MH746928.1) 1 1 镰刀菌属 F. nematophilum (KF577906.1) 2 2 F. nematophilum (KX621959.1) 1 1 F. oxysporum(MK673882.1) 1 1 F. oxysporum (KM005080.1) 1 1 F. oxysporum (KY910845.1) 1 1 F. oxysporum(GU724513.1) 1 1 F. solani f. batatas (AF178407.1) 6 7 F. solani batatas (EU625405.1) 1 1 F. solani batatas (MK571197.1) 1 1 F. solani f. batatas (KM235740.1) 1 1 F. solani f. batatas (KJ676962.1) 98 1 1 F. solani f. batatas (KU382502.1) 98 2 2 Fusarium sp.(FJ008989.1) 1 1 Fusarium sp. (MH884151.1) 1 1 小丛壳属 G. cingulata (EF423544.1) 2 2 球座菌属 G. mangiferae(EU677803.1) 1 1 孢菌属 Pleosporaceae sp. (HQ832799.1) 1 1 腔菌属 Pleosporales sp. (APBSDSF25) 1 1 P. cablin(MK568502.1) 98 1 1 毛球腔菌属 Setosphaeria sp. (LT837842.1) 92 1 1 踝节菌属 T. purpureogenus (KU981069.1) 1 1 炭角菌属 Xylariaceae sp. (MG669156.1) 1 1 28 30 32 90 
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表 2 泰山白首乌内生菌菌株的抗肿瘤活性
菌株 抗肿瘤活性 (IC50, μg/ml) HGC27 HEPG2 HT-29 HELA JTY6 6.34±1.10 11.05±1.15 29.84±5.78 >40 JTY10 7.87±1.09 6.53±0.28 18.57±5.15 >40 JTJ11 9.92±1.13 6.59±0.56 5.94±0.88 21.37±5.99 JTJ18 2.61±0.35 3.20±0.42 3.55±0.30 9.96±2.38 LTJ1 1.69±0.32 2.96±0.24 13.23±1.66 7.41±1.47 LTJ2 2.21±0.61 3.11±0.46 8.25±1.11 3.85±0.60 LTJ3 5.34±0.89 5.10±1.21 13.01±1.63 5.87±1.36 LTJ6 1.58±0.38 1.46±0.39 3.63±1.23 6.24±0.49 JTJ13 21.76±0.68 >40 20.07±1.38 >40 LTJ5 21.43±0.35 33.43±1.31 >40 >40 LTJ10 21.34±0.65 29.81±0.32 >40 >40 TTY7 27.89±1.08 38.53±0.28 >40 >40 TTY18 18.25±0.24 >40 >40 31.41±1.49 阿霉素 0.022±0.003 0.034±0.01 0.030±0.003 0.039±0.006
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