下载:
下载:
-
补体系统是人体重要的免疫防御系统之一，是由30多种广泛存在于血清、组织液和细胞膜表面的蛋白质组成的，具有精密调控机制的蛋白质反应系统，其主要通过3种途径激活：经典途径、旁路途径和甘露糖结合凝集素途径。补体系统正常激活，可在靶细胞上形成膜攻击复合物，导致靶细胞的溶解，补体的这一功能在机体的免疫系统中起重要的防御和免疫监视作用，对抵御外来微生物的入侵和维持机体平衡有重要的作用。然而该系统的过度激活将释放炎性过敏毒素C3a和C5a，具有化学诱导作用的C5a能趋化嗜中性粒细胞、中核细胞和嗜酸性粒细胞，这些细胞释放蛋白酶和具有趋化作用细胞因子，进一步聚集T、B淋巴细胞和其他炎性细胞，从而促进炎症反应的发生，引起系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、肾小球肾炎等[1-2]。近年来已有研究表明[3]，补体系统的激活是类风湿性关节炎中慢性滑膜炎的发病因素之一。因此，抑制补体系统的过度激活可能是治疗类风湿性关节炎的重要机制之一。
三色片为复旦大学附属中山医院的院内制剂，由雷公藤、黄芪和丹参三味药材按1∶1∶1的比例配伍组成，在临床上用于治疗类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、银屑病和湿疹等结缔组织疾病。我院临床医生在长期的医疗实践中总结出来的经验方，效果显著[4]。组方中雷公藤，性味辛寒，有大毒，归肝、肾经，具有清热解毒、活血化瘀、通络止痛、杀虫止痒等功效。现代研究表明，雷公藤内酯醇对大鼠脑皮质内注射β-淀粉酶后补体C1q和C3的表达有抑制作用，表明雷公藤对补体系统有抑制作用，目前临床上广泛用于治疗类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、银屑病和湿疹等结缔组织疾病[5]。组方中的黄芪用于脾肺气血或中气下陷之症、卫气虚所致表虚自汗、气虚血滞导致的肢体麻木、关节痹痛等症，可联合治疗类风湿性关节炎[6]。黄芪在治疗2型糖尿病大鼠的研究中发现其能降低补体C3的水平，表明其对补体系统具有一定的调节作用[7-8]。丹参是最常用的活血化瘀中药之一，具有祛瘀止痛，养血安神的功效，现代药理学研究表明其还具有保护肝脏的功能[9]，可拮抗雷公藤的肝毒性。本研究通过经典途径抗补体活性测定方法筛选出三色片醇提物的乙酸乙酯部位抗补体活性最佳，并采用UPLC-Q-TOF-MS法对该部位的化学成分进行结构表征，为三色片抗补体活性药效物质基础及治疗补体过度激活相关疾病提供科学依据。
-
Tripie TOF5600+型四级杆-飞行时间串联质谱仪，配备电喷雾电离源和CDS自动校正系统（美国Applied Biosystems公司）；Peak view2.2和Master view1.1数据处理系统（美国Applied Biosystems公司）；LC-30A超高效液相色谱仪，包括高压输液泵，自动进样器，柱温箱和在线脱气机（日本岛津公司）；KQ5200E型超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；甲醇、乙腈（色谱纯，德国Merck公司）；甲酸（色谱纯，美国Sigma-Aldrich公司）; 蒸馏水（娃哈哈集团）；三色片提取物由作者自制，现样品存放于复旦大学附属中山医院药剂科（SSP2018）；补体、溶血素（自制）；毛蕊异黄酮（批号：ST088101），雷公藤甲素（批号：ST020501），雷公藤内酯酮（批号：ST049901），丹参酮II A（ST014601）、黄芪甲苷（ST001601）（纯度≥ 98%，均购自上海斯丹德生物技术有限公司）。
-
雷公藤、黄芪和丹参三味药材按1∶1∶1配伍，其中，黄芪和丹参加6倍量的水浸泡2 h后，煎煮2次，第一次1.5 h，第二次加水4倍量煎煮1 h，煎液滤过，合并滤液并浓缩至相对密度为1.10～1.20（70 ℃），加入2倍量的乙醇，静置沉淀24 h，取上清液备用。雷公藤分别加4倍量的乙醇加热回流2次，每次1.5 h，合并提取液，滤过，加入上述备用药液，混匀，回收乙醇至无醇味，浓缩后即得三色片醇提物，经现有的质量标准检验为制备三色片制剂合格的提取物。精密称取三色片醇提物2.0 g，置于100 ml萃取瓶中，加25 ml蒸馏水溶解后，用等量的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，浓缩干燥后，放冷至室温，得到三色片醇提物的石油醚部位0.36 g，乙酸乙酯部位0.42 g，正丁醇部位0.56 g和水溶性部位。
-
取各极性部位样品2 mg溶于DMSO，采用BBS缓冲液稀释成不同浓度的样品，并加入临界浓度的补体（1∶80稀释的豚鼠血清），溶血素和2%绵羊红细胞（SRBC）。37 ℃水浴30 min，离心后取上清液在405 nm波长下测定吸光度（A）值。同时设置中药对照组（将等量的中药提取物加入BBS缓冲液中，用于测定中药本底A值）、补体组（取临界浓度的补体直接加入适量的BBS缓冲液、溶血素和2%SRBC，用于测定临界浓度补体所造成红细胞溶血的A值）和全溶血组（将2%SRBC加入水中使之全溶血，用于观察补体组是否达到或接近全溶血水平），并以肝素作为阳性对照组，计算溶血抑制率。以供试品浓度为横坐标（X），溶血抑制率为纵坐标（Y），计算CH50（经典途径50%抑制溶血所需供试品浓度）。溶血抑制率=1−（A中药−A中药对照）/A全溶血。
-
色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相0.1%甲酸和水溶液（A）−乙腈（B）；梯度洗脱：0～9 min，10%～23% B；9～13 min，23% B；13～28 min，23%～40% B；28～32 min，40%～50% B；32～37 min，50%～100% B；37～42 min，100% B；42～42.1 min，10%B；42.1～50 min，10% B；流速为0.25 ml/min，柱温为35 ℃；进样量为2 μl。
-
在正/负离子模式，离子源选择电喷雾离子化源（ESI）；使用m/z 50~1250扫描范围；碰撞能量35 eV，碰撞能量叠加（35±15）eV；喷雾电压5 500 V；雾化气温度550 ℃；去簇电压100 V；雾化气和辅助气均为50 psi；气帘气25 psi；数据采集时间50 min；采用母离子触发的子离子（TOF-MS-IDA-MS/MS）扫描方式；多重质量亏损和动态背景扣除为触发二级的条件，满足该条件进行二级扫描。
-
精密称取毛蕊异黄酮、雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、丹参酮Ⅱ A和黄芪甲苷对照品1.0 mg，加甲醇2 ml，溶解，摇匀，即得各对照品溶液。
-
取三色片醇提物的乙酸乙酯部位样品0.2 g，置于10 ml量瓶中，加入70%甲醇5 ml，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放冷至室温，70%甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
-
根据三色片中各药材化学成分研究文献，收集3种药材所含化合物成分的基本信息，包括化合物名称、分子式、精确分子量、准分子离子峰和碎片离子峰。通过精确分子量匹配，对照品的保留时间，二级谱所得到的离子碎片与文献报道进行比对，最终确定化合物的结构。
-
分别对三色片醇提物的石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位进行经典途径的抗补体活性测定，以肝素为对照品，结果发现乙酸乙酯部位的抗补体活性最好，其抗补体活性略低于肝素钠，其次是正丁醇部位，结果见表1。
表 1 三色片提取物不同部位抗补体活性测定
编号 研究对象 抗补体活性（CH50，μg/ml） 1 肝素 14.4±1.2 2 三色片-石油醚部位 − 3 三色片-乙酸乙酯部位 233.9±10.1 4 三色片-正丁醇部位 344.0±14.5 注：“—”表示该部位无抗补体活性。 -
精密吸取对照品溶液和供试品溶液2 μl，采用“2.1”项下的色谱与质谱条件对样品进行分析，通过正、负离子全扫描，获得正、负离子模式下的总离子流图，见图1。
图 1 三色片提取物UPLC-Q-TOF-MS正和负离子模式下的总离子流图
通过与对照品比对，分子离子峰质谱数据解析，与参考文献比对，共鉴定出三色片醇提物乙酸乙酯部位42个化合物，结果见表2。
表 2 三色片提取物中各成分主要碎片离子及谱峰归属
化合物
编号tR/min 分子式 理论值(m/z) 模式 实测值(m/z) 误差(×10−6) 碎片离子（m/z） 化合物名称 参考文献 1 3.54 C7H6O3 139.039 0 [M+H]+ 139.039 4 3.0 121.028 7 原儿茶醛 [10] 2 4.76 C21H27N3O3 370.212 5 [M+H]+ 370.214 3 4.8 249.124 6,160.112 6,95.013 3,166.086 6,100.076 2,91.054 8 南蛇藤糠酰胺碱 [11] 3 6.63 C22H22O10 447.128 6 [M+H]+ 447.130 4 4.2 285.077 5,270.053 5,253.050 8,225.055 6,137.023 5 毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷 [12] 4 7.04 C23H29N3O2 380.233 3 [M+H]+ 380.235 1 4.8 176.106 9,160.112 6,105.033 8,100.076 5 苯代南蛇碱 [11] 5 9.41 C9H10O5 197.045 6 [M-H]− 197.044 7 −4.2 179.038 3,135.044 3 丹参素 [10] 6 9.42 C9H8O4 179.035 0 [M-H]− 179.034 2 4.7 135.044 8 咖啡酸 [13] 7 11.16 C16H12O4 431.133 7 [M+H]+ 431.136 3 6.1 269.082 6,253.050 3,225.055 5,213.091 7,197.060 2,136.014 6,118.041 7 芒柄花苷 [12] 8 12.71 C16H12O5 285.075 8 [M+H]+ 285.077 4 5.7 270.053 4,253.050 3,225.055 3,137.023 5 毛蕊异黄酮* [12] 9 12.76 C17H16O5 301.107 1 [M+H]+ 301.109 0 6.4 167.070 8,152.047 3,147.043 2,105.034 0,123.043 3 astrapterocarpan [12] 10 13.06 C20H24O6 361.164 6 [M+H]+ 361.166 5 5.5 269.154 3,227.108 3,185.096 9,157.101 7,129.070 3,91.054 9 雷公藤甲素* [14-15] 11 13.92 C17H14O6 315.086 3 [M+H]+ 315.088 1 5.6 300.064 7,243.065 5,167.034 2 熊竹素 [16] 12 18.21 C18H12O7 341.065 6 [M+H]+ 341.066 9 3.9 295.060 7,277.050 9,249.056 0 丹酚酸G [17] 13 19.76 C26H20O10 491.098 4 [M-H]− 491.097 0 −2.9 311.054 9,293.044 6,267.064 6,135.044 7 丹酚酸C [18] 14 21.46 C16H12O4 269.080 8 [M+H]+ 269.082 7 4.1 253.015 3,237.052 6,225.055 5,213.092 3,136.015 9,118.041 7,197.060 2 芒柄花素 [12] 15 22.57 C36H45NO17 764.276 0 [M+H]+ 764.278 3 2.9 746.276 1,686.246 3,644.235 1,206.081 7,188.070 9,178.086 5 aquifoliunine E-Ⅲ [14] 16 23.45 C20H22O6 359.148 9 [M+H]+ 359.150 7 4.9 267.138 0，225.019 5，183.079 9,128.061 8,91.054 3 雷公藤内酯酮* [19] 17 24.01 C38H47NO19 822.281 5 [M+H]+ 822.284 1 3.2 804.275 8,204.066 2,176.071 4 alatusinnine [20] 18 25.01 C39H45NO19 832.265 9 [M+H]+ 832.269 0 3.8 804.273 3,194.081 9,176.071 2 hypoglaunine E [11] 19 26.14 C41H68O14 829.458 0 [M+COOH]− 829.460 7 3.3 783.457 9,621.404 3,489.357 2 黄芪甲苷* [14] 20 28.19 C38H47NO18 806.286 6 [M+H]+ 806.290 3 3.8 788.279 5,686.247 0,206.082 1, 178.086 5 雷公藤定宁 E [20] 21 28.65 C39H45NO18 816.271 0 [M+H]+ 816.273 9 3.6 798.261 9,756.250 9,206.081 3,178.086 1,160.075 2 1-去乙酰基雷公藤吉碱 [11] 22 28.70 C43H70O15 871.468 6 [M+COOH]− 871.470 8 2.5 825.470 2,765.448 2,489.356 8 黄芪皂苷Ⅱ [13] 23 29.09 C41H47NO20 874.276 4 [M+H]+ 874.278 5 2.3 856.269 2,846.282 9,828.272 3,674.245 1,204.065 6,176.070 7 雷公藤春碱 [11] 24 29.72 C38H47NO18 806.286 6 [M+H]+ 806.291 2 3.8 788.280 4,686.247 4,206.082 4 peritassine A [20] 25 30.24 C43H70O15 871.468 6 [M+COOH]− 871.470 3 2.5 825.464 1,765.440 5 异黄芪皂苷Ⅱ
（异构体1）[16] 26 30.89 C19H16O4 309.112 1 [M+H]+ 309.114 2 6.7 281.667 0,263.106 0,235.076 7 丹参醛 [21] 27 31.58 C43H70O15 871.468 6 [M+COOH]− 871.470 8 2.5 825.470 2,765.448 0 异黄芪皂苷Ⅱ
（异构体2）[13] 28 32.12 C21H20O4 337.143 4 [M+H]+ 337.142 5 −2.7 309.686 6 丹参新醌丁 [10] 29 32.16 C43H49NO19 884.297 2 [M+H]+ 884.299 7 2.8 856.304 5,674.246 0,204.663 0,176.071 2 雷公藤定碱 [14] 30 32.96 C45H72O16 913.479 1 [M+COOH]− 913.482 4 3.5 867.481 7,825.469 8,807.464 3,765.450 6 黄芪皂苷Ⅰ [16] 31 32.99 C41H47NO19 858.281 5 [M+H]+ 858.285 4 4.6 840.275 7,798.263 8,746.269 1,738.243 5,686.248 0,206.082 5,178.087 1 雷公藤晋碱 [20] 32 33.04 C38H47NO18 806.286 6 [M+H]+ 806.289 7 3.8 788.278 3,686.244 4,206.082 1,728.257 0 卫矛碱 [20] 33 33.70 C45H72O16 913.479 1 [M+COOH]− 913.484 7 3.8 867.478 5,825.283 5,807.458 4,765.432 6 异黄芪皂苷Ⅰ
（异构体1）[16] 34 34.60 C45H72O16 913.479 1 [M+COOH]− 913.483 3 3.8 867.477 8,825.282 1,807.456 4,765.443 2 异黄芪皂苷Ⅰ
（异构体2）[16] 35 34.92 C46H49NO22 968.281 9 [M+H]+ 968.286 3 4.5 856.677 0,838.257 4,684.228 8,204.065 6,178.070 8 雷公藤素B [20] 36 35.01 C43H49NO18 868.302 2 [M+H]+ 868.304 6 2.7 868.364 0,850.295 8,746.268 9,686.247 6,206.082 4,178.087 1 雷公藤次碱 [20] 37 35.02 C41H47NO17 826.291 7 [M+H]+ 826.295 1 4.2 808.285 3,748.264 0,206.082 2,178.086 8 tripterygiumine Ⅰ [20] 38 35.49 C19H20O3 297.148 5 [M+H]+ 297.145 0 4.8 251.144 0,279.139 3,254.054 9,268.110 5,282.126 3 隐丹参酮 [10,17] 39 35.70 C20H28O2 299.201 7 [M-H]− 299.199 6 −6.7 283.168 2,213.090 8,201.916 0, 雷酚萜 [22] 40 35.86 C48H51NO18 930.317 9 [M+H]+ 930.321 3 3.7 912.308 7,310.111 0,206.081 8,188.071 2,178.086 5,105.033 6 ebenifoline E-Ⅱ [20] 41 36.81 C19H18O3 295.132 9 [M+H]+ 295.134 9 4.0 277.124 3,249.127 5,266.095 3,262.097 7,280.109 9 丹参酮Ⅱ A* [10,18,23] 42 37.49 C19H22O2 283.169 3 [M+H]+ 283.169 3 0 265.098 1,240.032 2,223.106 7,195.095 8,181.101 1 丹参新酮 [17,21,24] 注：*表示与对照品鉴定的化合物。 -
在乙酸乙酯部位中共鉴定出6个黄酮类化合物，其中4个黄酮苷元和2个黄酮苷，苷元为黄酮、异黄酮和紫檀烷，该类化合物在正离子模式下具有较好的响应。二级质谱中黄酮苷元易发生中性丢失，形成[M+H-H2O]+、[M+H-CO]+、[M+H-CH3]+等碎片离子，如在化合物8的二级质谱中可见m/z 270.053 4和m/z 253.050 3，则为m/z 285.077 4分别脱去-CH3和CH3OH形成的[M+H-CH3]+和[M+H-CH3OH]+碎片离子峰，m/z 225.055 3是m/z 253.050 3脱去1分子的CO形成的碎片离子峰，通过对照品的保留时间和参考文献[12]质谱数据比对确定化合物8为毛蕊异黄酮，m/z 137.023 5的碎片离子峰为异黄酮母核C环发生RDA裂解所产生。黄酮苷类易脱去糖基形成较强的分子离子峰，如化合物3（m/z 447.130 4）的二级质谱脱去糖基形成m/z 285.077 5的分子离子峰，并与化合物8（m/z 285.077 4）的二级质谱图非常相似，说明化合物3和化合物8在结构上是相似的，但化合物3的分子量多了162（C6H10O5），通过数据库比对和参考文献[12]推测化合物3则为毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷。化合物9（m/z 301.109 0）通过数据库比对发现两种候选化合物分别为astrapterocarpan和astraisoflavan，二级质谱中主要碎片离子峰为C环裂解产生的含A环和B环片段的碎片离子，其中，m/z 167.070 8为含B环的碎片离子峰且为基峰，进一步脱甲基形成m/z 152.047 3，m/z 123.043 3为含A环的碎片离子峰，进一步脱水形成m/z 105.034 0，m/z 147.043 2为母离子m/z 301.109 0脱去B环形成的碎片离子峰，根据m/z 167.070 8的碎片离子峰为基峰和含有m/z 147.043 2的碎片离子峰这两个特征，结合参考文献[12]的质谱数据，推测该化合物为astrapterocarpan，其相关裂解途径见图2。
图 2 化合物astrapterocarpan的质谱裂解规律
-
在乙酸乙酯部位中鉴定出7个三萜皂苷类化合物，在负离子模式下均具有较好的响应，一级质谱中产生[M+COOH]−的准分子离子峰，二级质谱中产生较强的[M-H]-碎片离子峰和脱去糖基的较弱的分子离子峰。化合物19在负离子模式下产生的准分子离子峰为[M+COOH]−（m/z 829.458 0），二级质谱中产生m/z 783.457 9[M-H]−峰，脱去1分子六碳糖（C6H10O6）形成m/z 621.404 3的碎片离子峰，m/z 489.357 2则为m/z 621.404 3进一步脱去1分子五碳糖（C5H6O5）后形成的苷元碎片离子峰，推测其苷元为9,19-环阿尔廷烷，通过对照品的保留时间，参考文献[13]的离子碎片比对确定该化合物为黄芪甲苷。
-
三色片提取物中共鉴定出16个生物碱类化合物，均来自雷公藤药材，在正离子模式下具有较好的响应，一级质谱中产生[M+H]+的准分子离子峰，二级质谱发现该类型的化合物容易脱去H2O、CO和CH3COOH等中性小分子而产生碎片离子峰，多数生物碱含有吡啶二羧酸部位的碎片离子峰。如化合物23在正离子模式下产生m/z 874.278 5的准分子离子峰，二级质谱中产生脱去1分子CO的m/z 846.282 9的基峰，脱去1分子H2O的m/z 856.2692的碎片离子峰和脱去1分子HCOOH的m/z 828.272 3的碎片离子峰，m/z 674.245 1峰为m/z 846.2829脱去C5H4O3侧链和CH3COOH形成的碎片离子峰，m/z 204.065 6峰为大环开裂产生的吡啶二羧酸部分脱水产生的碎片离子，该离子进一步脱羧形成m/z 176.070 7的碎片离子，通过数据库和参考文献[11]质谱数据的比对，推测化合物23为雷公藤春碱。化合物31在正离子模式下产生m/z 858.285 4的准分子离子峰，二级质谱中产生脱去1分子H2O的m/z 840.275 7的碎片离子峰，准分子离子峰脱去1分子CH3COOH形成较强的m/z 798.263 8峰，在进一步脱去1分子CH3COOH形成738.243 5峰，准分子离子峰m/z 858.285 4脱去FuOH（C5H4O3）侧链形成的m/z 746.269 1的碎片离子峰，再进一步脱去1分子CH3COOH，形成m/z 686.248 0的碎片离子，m/z 206.082 5峰为大环开裂产生的吡啶二羧酸部分脱水产生的碎片离子，该离子进一步脱羧形成m/z 178.087 1的碎片离子，通过数据库和参考文献[20]质谱数据的比对，推测化合物31为雷公藤晋碱。雷公藤晋碱中吡啶二羧酸部分较雷公藤春碱中少一个羟基，故其易产生m/z 206.0825的碎片离子峰，并通过脱羧产生m/z 178.087 1峰。两种化合物的质谱图见图3。以雷公藤晋碱为例，解析此类化合物的裂解规律，见图4。因此得出吡啶二羧酸部分含有羟基的生物碱会产生m/z 204系列的特征碎片离子峰，不含羟基的生物碱则产生m/z 206系列的特征碎片离子峰。
图 3 雷公藤春碱和雷公藤晋碱质谱图
图 4 化合物雷公藤晋碱的质谱裂解规律
-
本研究共鉴定出8种萜类化合物，其中源于丹参药材中的5种萜类成分，丹参中的萜类化合物因其结构中主要含有羟基，羰基等取代基，所以质谱碰撞中主要丢失H2O，CO和-CH3等中性分子，产生一系列的碎片离子峰。化合物41在正离子模式下产生m/z 295.134 9的[M+H]+准分子离子峰，二级质谱中产生脱去1分子甲基形成的m/z 280.1099的碎片离子峰，在此基础上有丢失1分子水形成m/z 262.097 7峰，准分子离子峰脱去1分子H2O或脱去1个-CHO形成m/z 277.124 3峰或m/z 266.095 3峰，m/z 249.127 5峰是m/z 277.124 3脱去1分子H2O形成的碎片峰，通过对照品的保留时间和参考文献[10,18,23]数据比对，鉴定该化合物为丹参酮Ⅱ A，其质谱裂解规律见图5。
图 5 化合物丹参酮II A的质谱裂解规律
来源于雷公藤药材中的3种二萜类成分，该类化合物的二级质谱中出现一系列的脱水、脱CO和异丙基等碎片离子峰。化合物11在正离子模式下产生m/z 361.166 5的准分子离子峰，脱去2分子H2O和2分子CO形成m/z 269.154 3的碎片离子峰，m/z 227.108 3为m/z 269.154 3脱去1分子CH2CHCH3形成的碎片离子，其进一步脱1分子H2O和HCHO形成m/z 185.096 9的碎片离子，通过对照品比对和参考文献[14-15]的质谱数据，确定化合物10为雷公藤甲素。化合物18在正离子模式下产生m/z 359.148 9的准分子离子峰，脱去2分子H2O和2分子CO形成m/z 267.138 0的碎片离子峰，m/z 225.019 5为m/z 267.138 0脱去1分子CH2CHCH3形成的碎片离子，其进一步脱1分子H2O和HCHO形成m/z 183.0799的碎片离子，通过对照品比对和参考文献[19]的质谱数据，确定化合物16为雷公藤内酯酮。化合物39在负离子模式下产生m/z 299.199 6 的准分子离子峰，二级质谱中产生m/z 283.168 2的碎片离子, 提示为丢失1个-CH3后形成双键产生的碎片离子峰，A环发生RDA裂解产生m/z 213.090 8的碎片离子峰，通过数据库比对和参考文献[22]的质谱数据，推测化合物39为雷酚萜。
-
在正负离子模式下共鉴定出乙酸乙酯部位中5种酚酸类成分，均来自于丹参药材，参考文献[18]报道的丹参中酚酸类成分的裂解规律发现，酚酸类化合物主要含有羰基、羧基和羟基，所以在质谱碰撞中易丢失CO、H2O和CO2的中性碎片；丹参素和咖啡酸作为基本母核而其他的水溶性酚酸类化合物大多数为这两者的聚合或缩合产物，主要为缩酚酸类的成分，在质谱碰撞中易丢失[M-H-180]−和[M-H-198]−中性碎片；含有羧基的单体化合物在负离子模式下会产生135[C8H7O2]−和179[C9H7O4]−的特征性碎片。化合物5中，在负离子模式下产生m/z 197.044 7的[M-H]−准分子离子峰，二级质谱进一步产生丢失1分子H2O和1分子CO2，形成的m/z 179.038 3和m/z 135.044 3的碎片离子峰，推测出结构中含有羧基，结合其精确分子量和参考文献[10]质谱数据，推测该化合物为丹参素。化合物12中，负离子模式下产生m/z 491.097 0的[M-H]−准分子离子峰，二级质谱中产生m/z 311.054 9和m/z 293.044 6的碎片离子峰，分别为[M-H-180]−和[M-H-198]−, m/z 267.064 6峰为m/z 311.054 9脱去1分子CO2所产生，根据m/z 135.044 7峰推测结构中含有羧基，结合其精确分子量和参考文献[18]质谱数据的比较，推测该化合物为丹酚酸C。化合物1中，正离子模式下给出m/z 139.039 4的[M+H]+准分子离子峰，脱去1分子H2O形成m/z 121.028 7的碎片离子峰，通过数据库比对和参考文献[10]，推测该化合物1为原儿茶醛。化合物13中，在正离子模式下产生m/z 341.066 9的[M+H]+准分子离子峰，脱去1分子CO2形成m/z 295.060 7的碎片离子峰，m/z 277.050 9和m/z 249.056 0的碎片离子峰是m/z 295.060 7峰分别脱去1分子H2O和1分子CO2形成的，通过数据库比对和参考文献[17]质谱数据，推测该化合物为丹酚酸G。
-
本实验流动相考察了乙腈-水系统和甲醇-水系统，结果乙腈-水系统中化合物的分离度较好，加入甲酸可以改善峰形，有助于化合物的离子化，提高质谱的响应，最终选择乙腈-0.1%甲酸水系统作为本次研究的流动相。
-
据以往文献中三色片各化学成分的研究报道，收集各药材的主要化学成分的精确分子量，碎片离子峰等信息，建立相应的化学成分数据库。通过数据库比对，对照品保留时间及参考文献中质谱数据鉴定三色片醇提物乙酸乙酯部位的化学成分。本研究共鉴定出42个化合物，其中5个是通过对照品鉴定得出，对无对照品的化合物，通过质谱的裂解特征及参考文献进行结构表征，对同分异构体应结合其在液相色谱中化合物的保留时间及质谱行为，综合对其定性鉴别。
三色片醇提物的乙酸乙酯部位具有较强的抗补体活性，本研究采用UPLC-Q-TOF-MS法对其中的化学成分进行结构表征，结果发现该部位主要含有生物碱类，萜类，黄酮和酚酸类等化学成分。其中以来源于雷公藤药材中极性中等的生物碱类成分含量较多，这与三色片提取物的制备工艺有关，三色片中雷公藤药材采用乙醇加热回流提取的方式，而黄芪和丹参药材采用水提取醇沉淀的方式。此外，先前的研究发现广藿香中的黄酮和萜类化合物对旁路途径的补体激活具有明显的抑制作用，紫花地丁中的生物碱类成分对旁路途径也有抑制作用（AP50=0.22~0.50 g/L）, 牡丹皮和毛七公的抗补体活性成分研究中发现酚羟基决定抗补体活性的存在与否，没食子酰基可改善抗补体活性，甲基则对抗补体活性不利[25-27]。通过本次研究对三色片醇提物的乙酸乙酯部位的化学成分进行了初步表征，为阐明三色片的药效物质基础提供参考依据。研究的不足之处在于，仍有部分化学成分尚未定性鉴定，含量较高的单体成分未进行体外抗补体活性的测定，未来将通过中药化学的方法获得含量较高的单体成分，并进行结构鉴定和抗补体活性测定。
Study on components with anti-complement activity from ethanol extract of Sanse tablets by UPLC-Q-TOF-MS/MS
-
摘要:
目的 分析三色片醇提物抗补体活性部分的化学成分，为阐明其药效物质基础提供参考依据。 方法 通过经典抗补体途径对不同极性部位的三色片醇提物进行活性测定，确定其具有抗补体活性的部位，采用超高效液相色谱-电喷雾电离-四级杆-飞行时间质谱联用(UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS)法对活性部位进行成分分析。通过与对照品的保留时间，精确分子量和参考文献中质谱裂解碎片比对，对其中的化学成分进行鉴定。 结果 三色片醇提物的乙酸乙酯部位具有较强的抗补体活性，应用质谱分析，鉴定出42个化合物，化合物的类型包括：生物碱类16个，萜类15个，黄酮6个和酚酸类5个。 结论 通过对三色片中抗补体活性部位化学成分特征的分析，为阐明其药效物质基础提供一定的科学依据，有助于院内中药复方制剂的二次开发。 -
关键词:
- 三色片 /
- 抗补体活性 /
- UPLC-Q-TOF-MS/MS /
- 化学成分
Abstract:Objective To analyze the chemical components in the ethanol extract of Sanse tablets with anti-complement activity, and to provide scientific basis for its therapeutic effects. Methods The classical anti-complement pathway was used to compare the activity of different portions of Sanse tablet alcohol extract, and to identify the fraction with anti-complement activity. The chemical composition in active fraction was analyzed by UPLC-Q-TOF-MS/MS. The chemical components were identified by comparing the retention time, exact molecular weight and mass spectrum information with the standard chemicals. Results The ethyl acetate fraction of the Sanse tablet ethanol extract had the best anti-complement activity. 42 chemicals were identified, including 16 alkaloids, 15 terpenoids, 6 flavonoids and 5 phenolic acids. Conclusion The characterization of the chemical components in the anti-complement active fraction of Sanse tablets provides a scientific basis for the therapeutic effects of Sanse tablets, which will help the future development of the compound preparations of Chinese medicine in our hospital. -
Key words:
- Sanse tablets /
- anti-complement activity /
- UPLC-Q-TOF-MS/MS /
- chemical components
-
流感是一种严重的上呼吸道病毒感染，由于其高毒力和突变率，该病毒仍然是对公众健康的主要威胁。据美国疾病控制与预防中心和世界卫生组织估计，每年有多达65 万人死于季节性流感引起的呼吸道疾病[1]。传统中医药预防和治疗流感病毒导致的感染（如呼吸道肺炎和支气管炎）已成为中国临床上常规治疗策略，发挥了独特的医疗优势[2,3]。
感冒安颗粒是由金银花、连翘、板蓝根、拳参、桑叶、紫苏和荆芥等七味中药制成的复方制剂，临床应用30 多年，具有疏散风邪，解表退热功能，其预防和治疗呼吸道感染的作用已得到很好的临床验证，特别是在病毒感染初期的治疗效果尤其显著，但药效物质基础并不清楚。目前，建立了TLC法对方中的板蓝根和连翘两味药材进行特征鉴别；同时对方中各药味的共有成分绿原酸和齐墩果酸也建立了TLC鉴别方法。在含量限度方面，则建立了制剂中连翘酯苷A的HPLC法。尽管这些获批的标准已用于制剂常规质量控制，但尚需进一步进行质量评价，以期更客观、准确地反映感冒安颗粒的临床疗效。
由于中药复方复杂的化学成分，它的药理作用是通过多靶点、多途径而实现的。流感病毒感染的病理生理过程主要是病毒的直接作用和宿主免疫反应损伤（如细胞因子风暴所致的炎性损伤和ROS导致的氧化应激损伤）的结果[2,4]。为了研究感冒安颗粒临床效果的药效物质基础，我们对组方各药味的化学成分进行了文献追踪，发现方中药味含有多种黄酮类成分，如异槲皮苷、芦丁、木樨草素及木樨草苷等[5-9]。而黄酮类成分对流感病毒的作用越来越受到关注[10,11]。异槲皮苷抑制流感病毒A和B的复制，与抗病毒药amantadine或者oseltamivir合用可抑制它们导致的耐药病毒出现[12]。槲皮素与流感病毒A H1N1（A/PR/8/34）的神经酰胺酶的结合与zanamivir相当，体内研究也证实了其抗流感病毒能力，可作为抗甲型H1N1流感的有效先导化合物[13]。Zima研究认为木犀草素及其同源物是强效流感核酸内切酶抑制剂，揭示黄酮类化合物的抗流感作用[14]。鉴于此，本研究在总黄酮含量测定的基础上[15]，采用HPLC-MS/MS方法建立5 种黄酮类成分的定量方法，不仅为制剂质量评价提供方法学，也为进一步研究感冒安颗粒防治流感病毒引起的呼吸道感染机制奠定物质基础。
1. 仪器与试药
1.1 仪器
Agilent Technologies
6410 Triple Quad LC/MS仪，配以Triple Quad B.02.01（B2043.12）数据处理软件（美国安捷伦公司）；XS205DU电子天平（瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司）；DL-720A超声波清洗器（上海之信仪器有限公司）。1.2 试药
感冒安颗粒（本院院内制剂，批号110418、110704、111025、111121、111130、111221、120131、120201、120207、120214）；芦丁对照品（中国食品药品检定研究院，供UV法测定，含量以92.5 %计，批号：100080-200707）；金丝桃苷对照品（中国食品药品检定研究院，供含量测定用，含量以93.9 %计，批号：111521-201004）；木犀草素对照品（中国食品药品检定研究院，供含量测定用，批号：111520-200504）；槲皮素对照品（中国食品药品检定研究院，供含量测定用，批号：100081-200406）；异槲皮苷对照品（成都曼斯特生物制品有限公司，纯度>99.0 %，批号：MUST-10021901）；甲醇为色谱纯；甲酸为分析纯；水为蒸馏水。
2. 方法与结果
2.1 溶液制备
2.1.1 对照品溶液制备
分别取芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素和木犀草素对照品各适量，用甲醇溶解，摇匀，各配制成500 μg/ml的对照品贮备液。分别精密量取5种对照品贮备液适量，稀释成浓度如下：分别含芦丁0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00 μg/ml，金丝桃苷0.002、0.008、0.020、0.032、0.044、0.056、0.080 μg/ml，异槲皮苷0.03、0.10、0.25、0.45、0.65、0.95、2.00 μg/ml，槲皮素0.02、0.10、0.20、0.30、0.40、0.60、0.70 μg/ml，木犀草素0.012、0.026、0.040、0.054、0.082、0.096、0.200 μg/ml的混合对照品溶液。
2.1.2 供试品溶液制备
按已优化的黄酮提取方法进行[15]。取样品约0.5 g，精密称定，置量瓶中，加70 %甲醇35 ml，超声提取30 min，放冷，过滤，滤液加70 %甲醇溶液定容至50 ml，摇匀，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，即得。
2.2 色谱-质谱条件
色谱条件：采用Kromasil C 18（4.6 mm×150 mm，5 μm，100 Å）色谱柱；甲醇（A）- 0.1 %甲酸（B）作为流动相，按0～20 min，35 % A；20～40 min，45 % A梯度洗脱。
质谱条件：电喷雾负离子化（ESI−）源：毛细管电压 3.0 kV；气体温度 350 ℃，气体流速 10 L/min，雾化气压 35 psi。多反应模式（MRM）监测。5种黄酮检测的离子对：芦丁m/z 609.1→300.1、金丝桃苷和异槲皮苷m/z 463.0→300.1、槲皮素m/z 301.0→151.0、木犀草素m/z 285.0→132.9。
2.3 方法学考察
2.3.1 检测限和定量限
采用上述色谱条件，每个待测化合物对照品用70%甲醇溶液进行系列稀释，分别以信噪比（S/N）等于3和10确定各自的检测限和定量限。结果见表1。
表 1 5种黄酮成分的线性方程、相关系数、线性范围、检测限和定量限黄酮化合物 线性方程 相关系数
r线性范围
（ng/ml）检测限
（ng/ml）定量限
（ng/ml）芦丁 Y=24 527X–162.17 0.999 7 250~8 000 0.025 0.50 金丝桃苷 Y=34 123X– 1.7381 0.999 1 2~80 0.005 0.01 异槲皮苷 Y=29 935X+1 597.80 0.999 1 30 ~2 000 0.02 0.50 槲皮素 Y=19 667X+370.71 0.999 2 20~700 0.02 0.10 木犀草素 Y=33 076X–177.98 0.999 7 12~200 0.005 0.01 2.3.2 线性范围考察
精密量取“2.1.1”项下配制的5 种黄酮成分的对照品混合溶液，照“2.2”项下进样测定，记录各待测组分的峰面积积分值。横坐标为黄酮成分质量浓度（X，ng/ml），纵坐标为峰面积（Y），进行线性回归，计算回归方程和相关系数。结果见表1，表明5 种黄酮成分在各自浓度范围内呈良好的线性关系。
2.3.3 精密度试验
精密吸取供试品溶液（批号
120131 ），照“2.2”项下操作，进样，连续测定5 次和连续测定5 d，记录各待测组分的峰面积积分值，计算日内、日间RSD。结果显示，芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素和木犀草素的日内精密度RSD分别为1.09 %、1.42 %、1.69 %、0.86 %、1.27 %（n=5），日间精密度RSD分别为1.85 %、1.76 %、1.43 %、2.01 %、1.90 %（n=5），表明仪器精密度良好。2.3.4 重复性试验
取同一批号样品（批号
120131 ）5 份，各0.5 g，精密称定，照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，照“2.2”项下操作，进样，测定峰面积积分值，并进行含量测定。结果显示，芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素和木犀草素的含量分别为260.16、1.84、19.76、13.39、3.73 μg/g（n=5），RSD分别为1.51 %、1.73 %、0.90 %、1.44 %、1.68 %（n=5），表明方法的重复性良好。2.3.5 加样回收率试验
取已知含量的样品（批号120131）9 份，每份约0.5 g，精密称定，各精密加入对照品贮备液适量，使已知样品中加入的相当对照品量分别含芦丁140.00 μg、金丝桃苷0.90 μg、异槲皮苷10.00 μg、槲皮素7.00 μg、木犀草素1.90 μg的各对照品贮备液，按“2.1.2”项下的方法制备供试品溶液，照“2.2”项下操作，进样，测定峰面积积分值，计算加样回收率。结果显示，芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素和木犀草素的平均加样回收率分别为：102.06%、101.60%、100.63%、102.81%、101.80%（n=9），RSD分别为1.56%、1.93%、0.67%、2.07%、1.84%（n=9）。
2.3.6 样品含量测定
取10 个批号的感冒安颗粒，分别按“2.1.2”项下的方法制备供试品溶液，照“2.2”项下操作，进样，测定峰面积积分值，计算含量，结果见表2。
表 2 不同批号感冒安颗粒含量测定结果（$\bar x $ ±s, n=3）批号 芦丁 金丝桃苷 异槲皮苷 槲皮素 木犀草素 含量（μg/g） RSD（%） 含量（μg/g） RSD（%） 含量（μg/g） RSD（%） 含量（μg/g） RSD（%） 含量（μg/g） RSD（%） 110418 479.83±1.99 0.41 0.855±0.004 0.49 20.54±0.25 1.23 14.83±0.05 0.31 3.46±0.06 1.70 110704 198.98±3.01 1.52 0.596±0.006 1.05 11.79±0.20 1.68 15.31±0.13 0.86 4.51±0.01 0.19 111025 32.23±0.26 0.83 0.993±0.012 1.26 13.31±0.00 0.02 6.53±0.04 0.55 5.15±0.08 1.58 111121 69.18±1.03 1.51 0.499±0.006 1.26 13.36±0.21 1.56 8.04±0.14 1.69 5.65±0.07 1.19 111130 67.53±0.27 0.40 0.533±0.008 1.57 13.36±0.21 1.54 7.48±0.12 1.62 5.42±0.06 1.15 111221 275.38±3.61 1.31 0.291±0.002 0.73 11.44±0.02 0.21 15.74±0.02 0.14 6.51±0.02 0.24 120131 264.55±0.51 0.19 1.825±0.012 0.68 20.29±0.04 0.17 13.66±0.02 1.52 3.78±0.01 0.26 120201 239.19±1.55 0.65 0.593±0.010 1.76 18.95±0.06 0.33 18.41±0.21 1.16 3.86±0.03 0.81 120207 109.20±2.14 1.97 0.503±0.004 0.83 18.00±0.21 1.16 6.72±0.08 1.22 4.21±0.02 0.37 120214 108.93±0.59 0.54 0.461±0.002 0.45 17.67±0.10 0.01 6.32±0.08 1.19 4.73±0.01 0.11 3. 讨论
3.1 MS/MS条件的优化
为了获得良好的MS结果，优化了检测的离子模式、碎裂电压、碰撞能量等参数，以获得高灵敏度的分子离子和碎片离子。结果显示，ESI采用负离子模式可使待测的黄酮成分有更高的灵敏度。对照品混合液经产物离子扫描显示，芦丁的主要碎片为m/z：300.1、271.0；金丝桃苷和异槲皮苷的主要碎片为m/z：300.1、270.8；槲皮素的主要碎片为m/z：178.6、151.0、120.9、106.9；木犀草素的主要碎片为m/z：150.9、132.9、106.8。依据定量碎片离子选择原则，从远离母离子、裂解方式稳定、碎片离子有足够的丰度等方面进行考察，最终选择的碎裂电压、碰撞能量和定量离子如表3所示。由于金丝桃苷和异槲皮苷是结构异构体，它们有相同分子离子峰[M-H]− m/z 463，MS/MS图谱中有相同的产物离子峰m/z 300，这两个化合物通过比较两者在HPLC中的保留时间进行定位。
表 3 5种黄酮化合物的质谱检测参数黄酮化合物 母离子 产物离子 碰撞电压
（U/ V）碰撞能量
（U/ eV）芦丁 609.1 300.1 190 38 金丝桃苷 463.0 300.1 170 25 异槲皮苷 463.0 300.1 170 25 槲皮素 301.0 151.0 130 19 木犀草素 285.0 132.9 150 37 3.2 定量方法学验证
采用已优化的测定条件，感冒安颗粒中5 种黄酮类成分通过与各自标准对照品的保留时间和MS谱图的比较得以鉴别和确认，结果见图1。由于金丝桃苷、异槲皮苷和芦丁均是以槲皮素为苷元，结合不同的糖而形成，金丝桃苷与异槲皮苷还具有相同的分子量，它们的保留时间非常相近。采用HPLC-UV或二极管阵列检测的方法专属性不强，待测成分间相互干扰，很难保证测定结果的准确性。而本研究采用MS/MS-MRM模式测定，实现了准确定量的目的。
图 1 感冒安颗粒提取液5 种黄酮成分的MRM色谱图A. 芦丁的MRM色谱图；B.金丝桃苷、异槲皮素的MRM色谱图；C.槲皮素的MRM色谱图；D.木犀草素的MRM色谱图；1.芦丁；2. 金丝桃苷；3.异槲皮苷；4.槲皮素；5.木犀草素3.3 结果分析
本研究采用经优化的超声提取法提取感冒安颗粒中黄酮成分，用所建立的LC-MS/MS方法测定了10 个批号样品，结果显示，每批样品中均为芦丁含量最高，金丝桃苷含量最低；批间样品同种黄酮成分含量存在差异。为了保证感冒安颗粒质量的稳定性，临床疗效的一致性，对其中的主要黄酮成分可以考虑设定最低限度要求。感冒安颗粒是经传统水提醇沉工艺制得的稠膏制粒而成，我们以往的研究表明，制剂中含有大量的酸性成分[16]，工艺提取过程中的高温、偏低的pH值可能导致金丝桃苷、异槲皮苷、芦丁等苷类黄酮化合物发生水解反应。本研究将3种黄酮苷对照品及生产工艺获得的稠膏经2 % HCl溶液在80 ℃水浴加热处理30 min，进行HPLC-MS/MS分析，处理后的稠膏样品中金丝桃苷和芦丁含量降低，异槲皮苷和槲皮素含量增加；在3种黄酮苷对照品水解液中，均有槲皮素产生；除此之外，芦丁对照品溶液水解还出现了异槲皮苷。由此可以推测，感冒安颗粒的制备工艺可能导致黄酮类成分的水解和转化。
本研究采用HPLC-MS/MS同时测定了感冒安颗粒中5 种黄酮类成分的含量，所建立方法的专属性、灵敏度、精密度和准确性均已得到确证，达到了同时测定多种结构相似的黄酮类成分的目的，为其质量标准的建立提供了方法学依据。我们的研究已经证明感冒安颗粒中含有多种酚酸类成分[17]，本研究又测定了其中的黄酮类成分。这些成分可能共同作用于流感病毒在宿主内复制的多环节，或者改善流感病毒对机体的炎性损伤，降低炎性细胞因子表达，改善氧化应激损伤，提高机体的免疫力等，充分发挥其多途径和多靶点作用优势，为其预防和治疗流感病毒所致呼吸道感染性疾病奠定物质基础。
-
表 1 三色片提取物不同部位抗补体活性测定
编号 研究对象 抗补体活性（CH50，μg/ml） 1 肝素 14.4±1.2 2 三色片-石油醚部位 − 3 三色片-乙酸乙酯部位 233.9±10.1 4 三色片-正丁醇部位 344.0±14.5 注：“—”表示该部位无抗补体活性。 
下载: 导出CSV
表 2 三色片提取物中各成分主要碎片离子及谱峰归属
化合物
编号tR/min 分子式 理论值(m/z) 模式 实测值(m/z) 误差(×10−6) 碎片离子（m/z） 化合物名称 参考文献 1 3.54 C7H6O3 139.039 0 [M+H]+ 139.039 4 3.0 121.028 7 原儿茶醛 [10] 2 4.76 C21H27N3O3 370.212 5 [M+H]+ 370.214 3 4.8 249.124 6,160.112 6,95.013 3,166.086 6,100.076 2,91.054 8 南蛇藤糠酰胺碱 [11] 3 6.63 C22H22O10 447.128 6 [M+H]+ 447.130 4 4.2 285.077 5,270.053 5,253.050 8,225.055 6,137.023 5 毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷 [12] 4 7.04 C23H29N3O2 380.233 3 [M+H]+ 380.235 1 4.8 176.106 9,160.112 6,105.033 8,100.076 5 苯代南蛇碱 [11] 5 9.41 C9H10O5 197.045 6 [M-H]− 197.044 7 −4.2 179.038 3,135.044 3 丹参素 [10] 6 9.42 C9H8O4 179.035 0 [M-H]− 179.034 2 4.7 135.044 8 咖啡酸 [13] 7 11.16 C16H12O4 431.133 7 [M+H]+ 431.136 3 6.1 269.082 6,253.050 3,225.055 5,213.091 7,197.060 2,136.014 6,118.041 7 芒柄花苷 [12] 8 12.71 C16H12O5 285.075 8 [M+H]+ 285.077 4 5.7 270.053 4,253.050 3,225.055 3,137.023 5 毛蕊异黄酮* [12] 9 12.76 C17H16O5 301.107 1 [M+H]+ 301.109 0 6.4 167.070 8,152.047 3,147.043 2,105.034 0,123.043 3 astrapterocarpan [12] 10 13.06 C20H24O6 361.164 6 [M+H]+ 361.166 5 5.5 269.154 3,227.108 3,185.096 9,157.101 7,129.070 3,91.054 9 雷公藤甲素* [14-15] 11 13.92 C17H14O6 315.086 3 [M+H]+ 315.088 1 5.6 300.064 7,243.065 5,167.034 2 熊竹素 [16] 12 18.21 C18H12O7 341.065 6 [M+H]+ 341.066 9 3.9 295.060 7,277.050 9,249.056 0 丹酚酸G [17] 13 19.76 C26H20O10 491.098 4 [M-H]− 491.097 0 −2.9 311.054 9,293.044 6,267.064 6,135.044 7 丹酚酸C [18] 14 21.46 C16H12O4 269.080 8 [M+H]+ 269.082 7 4.1 253.015 3,237.052 6,225.055 5,213.092 3,136.015 9,118.041 7,197.060 2 芒柄花素 [12] 15 22.57 C36H45NO17 764.276 0 [M+H]+ 764.278 3 2.9 746.276 1,686.246 3,644.235 1,206.081 7,188.070 9,178.086 5 aquifoliunine E-Ⅲ [14] 16 23.45 C20H22O6 359.148 9 [M+H]+ 359.150 7 4.9 267.138 0，225.019 5，183.079 9,128.061 8,91.054 3 雷公藤内酯酮* [19] 17 24.01 C38H47NO19 822.281 5 [M+H]+ 822.284 1 3.2 804.275 8,204.066 2,176.071 4 alatusinnine [20] 18 25.01 C39H45NO19 832.265 9 [M+H]+ 832.269 0 3.8 804.273 3,194.081 9,176.071 2 hypoglaunine E [11] 19 26.14 C41H68O14 829.458 0 [M+COOH]− 829.460 7 3.3 783.457 9,621.404 3,489.357 2 黄芪甲苷* [14] 20 28.19 C38H47NO18 806.286 6 [M+H]+ 806.290 3 3.8 788.279 5,686.247 0,206.082 1, 178.086 5 雷公藤定宁 E [20] 21 28.65 C39H45NO18 816.271 0 [M+H]+ 816.273 9 3.6 798.261 9,756.250 9,206.081 3,178.086 1,160.075 2 1-去乙酰基雷公藤吉碱 [11] 22 28.70 C43H70O15 871.468 6 [M+COOH]− 871.470 8 2.5 825.470 2,765.448 2,489.356 8 黄芪皂苷Ⅱ [13] 23 29.09 C41H47NO20 874.276 4 [M+H]+ 874.278 5 2.3 856.269 2,846.282 9,828.272 3,674.245 1,204.065 6,176.070 7 雷公藤春碱 [11] 24 29.72 C38H47NO18 806.286 6 [M+H]+ 806.291 2 3.8 788.280 4,686.247 4,206.082 4 peritassine A [20] 25 30.24 C43H70O15 871.468 6 [M+COOH]− 871.470 3 2.5 825.464 1,765.440 5 异黄芪皂苷Ⅱ
（异构体1）[16] 26 30.89 C19H16O4 309.112 1 [M+H]+ 309.114 2 6.7 281.667 0,263.106 0,235.076 7 丹参醛 [21] 27 31.58 C43H70O15 871.468 6 [M+COOH]− 871.470 8 2.5 825.470 2,765.448 0 异黄芪皂苷Ⅱ
（异构体2）[13] 28 32.12 C21H20O4 337.143 4 [M+H]+ 337.142 5 −2.7 309.686 6 丹参新醌丁 [10] 29 32.16 C43H49NO19 884.297 2 [M+H]+ 884.299 7 2.8 856.304 5,674.246 0,204.663 0,176.071 2 雷公藤定碱 [14] 30 32.96 C45H72O16 913.479 1 [M+COOH]− 913.482 4 3.5 867.481 7,825.469 8,807.464 3,765.450 6 黄芪皂苷Ⅰ [16] 31 32.99 C41H47NO19 858.281 5 [M+H]+ 858.285 4 4.6 840.275 7,798.263 8,746.269 1,738.243 5,686.248 0,206.082 5,178.087 1 雷公藤晋碱 [20] 32 33.04 C38H47NO18 806.286 6 [M+H]+ 806.289 7 3.8 788.278 3,686.244 4,206.082 1,728.257 0 卫矛碱 [20] 33 33.70 C45H72O16 913.479 1 [M+COOH]− 913.484 7 3.8 867.478 5,825.283 5,807.458 4,765.432 6 异黄芪皂苷Ⅰ
（异构体1）[16] 34 34.60 C45H72O16 913.479 1 [M+COOH]− 913.483 3 3.8 867.477 8,825.282 1,807.456 4,765.443 2 异黄芪皂苷Ⅰ
（异构体2）[16] 35 34.92 C46H49NO22 968.281 9 [M+H]+ 968.286 3 4.5 856.677 0,838.257 4,684.228 8,204.065 6,178.070 8 雷公藤素B [20] 36 35.01 C43H49NO18 868.302 2 [M+H]+ 868.304 6 2.7 868.364 0,850.295 8,746.268 9,686.247 6,206.082 4,178.087 1 雷公藤次碱 [20] 37 35.02 C41H47NO17 826.291 7 [M+H]+ 826.295 1 4.2 808.285 3,748.264 0,206.082 2,178.086 8 tripterygiumine Ⅰ [20] 38 35.49 C19H20O3 297.148 5 [M+H]+ 297.145 0 4.8 251.144 0,279.139 3,254.054 9,268.110 5,282.126 3 隐丹参酮 [10,17] 39 35.70 C20H28O2 299.201 7 [M-H]− 299.199 6 −6.7 283.168 2,213.090 8,201.916 0, 雷酚萜 [22] 40 35.86 C48H51NO18 930.317 9 [M+H]+ 930.321 3 3.7 912.308 7,310.111 0,206.081 8,188.071 2,178.086 5,105.033 6 ebenifoline E-Ⅱ [20] 41 36.81 C19H18O3 295.132 9 [M+H]+ 295.134 9 4.0 277.124 3,249.127 5,266.095 3,262.097 7,280.109 9 丹参酮Ⅱ A* [10,18,23] 42 37.49 C19H22O2 283.169 3 [M+H]+ 283.169 3 0 265.098 1,240.032 2,223.106 7,195.095 8,181.101 1 丹参新酮 [17,21,24] 注：*表示与对照品鉴定的化合物。
下载: 导出CSV
-
[1] QIN Y, WEN Q, CAO J, et al. Flavonol glycosides and other phenolic compounds from Viola tianshanica and their anti-complement activities[J]. Pharm Biol,2016,54(7):1140-1147. [2] BALLANTI E, PERRICONE C, DI MUZIO G, et al. Role of the complement system in rheumatoid arthritis and psoriatic arthritis: relationship with anti-TNF inhibitors[J]. Autoimmun Rev,2011,10(10):617-623. doi: 10.1016/j.autrev.2011.04.012 [3] GANOVA P, GYURKOVSKA V, BELENSKA-TODOROVA L, et al. Functional complement activity is decisive for the development of chronic synovitis, osteophyte formation and processes of cell senescence in zymosan-induced arthritis[J]. Immunol Lett,2017,190:213-220. doi: 10.1016/j.imlet.2017.08.023 [4] 金岚, 吴惠俐, 秦万章. 三色片治疗80例系统性红斑狼疮临床观察[C]//第四次全国雷公藤学术会议论文集. 上海, 2004: 439-440. [5] 吕诚, 胡小令, 杨宝林, 等. 雷公藤内酯醇对大鼠大脑皮质内注射β-淀粉样蛋白后补体C1q和C3表达的影响[J]. 中国老年学杂志, 2011, 31(5):800-803. doi: 10.3969/j.issn.1005-9202.2011.05.031 [6] XU T, FENG G, ZHAO B, et al. A non-target urinary and serum metabolomics strategy reveals therapeutical mechanism of Radix Astragali on adjuvant-induced arthritis rats[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2017,1048:94-101. doi: 10.1016/j.jchromb.2017.01.040 [7] 杨耀芳, 钱巍, 金蕾. 2型糖尿病大鼠应用土鳖虫与黄芪对体液免疫及补体的影响[J]. 中国免疫学杂志, 2010, 26(12):1091-1095. doi: 10.3969/j.issn.1000-484X.2010.12.008 [8] 雷心雨, 黄怡婷, 朱翠玲, 等. 黄芪总皂苷配伍雷公藤多苷抗炎镇痛作用[J]. 中药与临床, 2015, 6(6):29-31. [9] JIANG W Y, JEON B H, KIM Y C, et al. PF2401-SF, standardized fraction of Salvia miltiorrhiza shows anti-inflammatory activity in macrophages and acute arthritis in vivo[J]. Int Immunopharmacol,2013,16(2):160-164. doi: 10.1016/j.intimp.2013.03.028 [10] 陈嘉慧, 张雅心, 刘孟华, 等. 基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技术的丹参水提液全成分分析[J]. 广东药科大学学报, 2020, 36(1):1-9. [11] 刘建群, 罗素花, 张锐, 等. 基于UPLC-Q-TOF MS研究煨制对雷公藤化学成分的影响[J]. 质谱学报, 2018, 39(5):573-582. doi: 10.7538/zpxb.2017.0188 [12] ZHANG X, XIAO H B, XUE X Y, et al. Simultaneous characterization of isoflavonoids and astragalosides in two Astragalus species by high-performance liquid chromatography coupled with atmospheric pressure chemical ionization tandem mass spectrometry[J]. J Sep Sci,2007,30(13):2059-2069. doi: 10.1002/jssc.200700014 [13] 孙宁宁, 张可佳, 耿婉丽, 等. 基于UPLC-Q-TOF-MS的加参片提取物化学成分分析[J]. 中草药, 2018, 49(2):293-304. doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2018.02.006 [14] ZHANG D, QU L, WANG Z, et al. Identification of the chemical components and metabolites of tripterygium glycoside tablets in mice by HPLC-Q/TOF MS[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2019,1125:121721. doi: 10.1016/j.jchromb.2019.121721 [15] 张璟, 陈蒙蒙, 蒲时, 等. 雷公藤中雷公藤甲素、雷公藤吉碱和次碱的高效液相色谱-电喷雾串联质谱分析方法[J]. 农药学学报, 2018, 20(2):197-203. [16] 于泓, 胡青, 孙健, 等. 基于超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱技术的黄芪注射液中化学成分分析[J]. 世界中医药, 2019, 14(4):809-817. doi: 10.3969/j.issn.1673-7202.2019.04.005 [17] 颜晓静, 郑博文, 张毅达, 等. UPLC-Q-TOF/MS分析孟河医派特色猪心血丹参炮制前后化学成分的变化[J]. 中国实验方剂学杂志, 2019, 25(9):109-116. [18] 杨娜, 黄玮, 单兰兰, 等. UPLC-Q-TOF/MS结合数据后处理快速分类及鉴定丹参成分[J]. 时珍国医国药, 2019, 30(10):2408-2412. [19] 刘建群, 舒积成, 张锐, 等. 雷公藤二萜内酯的电喷雾及电子轰击质谱裂解规律研究[J]. 中药材, 2013, 36(5):759-764. [20] 李明炀, 侯继芹, 韦丹丹, 等. HPLC-QTOF-MS法鉴别雷公藤多苷工艺残渣中的化学成分[J]. 中国药科大学学报, 2015, 46(6):689-695. doi: 10.11665/j.issn.1000-5048.20150609 [21] 吴鹏, 李慧芬, 张学兰, 等. HPLC-TOF/MS分析丹参酒炙前后化学成分的变化[J]. 中国实验方剂学杂志, 2016, 22(11):6-9. [22] SU P, CHENG Q Q, WANG X J, et al. Characterization of eight terpenoids from tissue cultures of the Chinese herbal plant, Tripterygium wilfordii, by high-performance liquid chromatography coupled with electrospray ionization tandem mass spectrometry[J]. Biomed Chromatogr,2014,28(9):1183-1192. doi: 10.1002/bmc.3140 [23] 张驰, 张彩娟, 邱敏懿, 等. 丹参多化学成分的UPLC-LTQ Orbitrap MS快速表征解析[J]. 中医药学报, 2018, 46(3):14-21. [24] YANG S T, WU X, RUI W, et al. UPLC/Q-TOF-MS analysis for identification of hydrophilic phenolics and lipophilic diterpenoids from Radix salviae miltiorrhizae[J]. Acta Chromatogr,2015,27(4):711-728. doi: 10.1556/AChrom.27.2015.4.9 [25] 阮姝楠, 卢燕, 陈道峰. 广藿香的抗补体活性成分[J]. 中国中药杂志, 2013, 38(13):2129-2135. [26] 杜冬生, 程志红, 陈道峰. 紫花地丁中的抗补体生物碱类成分研究[J]. 中国中药杂志, 2017, 42(24):4794-4800. [27] 宋伟华. 丹皮和毛七公的抗补体活性成分研究[D]. 上海: 复旦大学, 2013. -
点击查看大图
计量
- 文章访问数: 6030
- HTML全文浏览量: 2700
- PDF下载量: 28
- 被引次数: 0
