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肾移植患者中19%～35%出现了肌肉骨骼疼痛，其中由钙调神经磷酸酶抑制剂（calcineurin inhibitors，CNIs）导致的一种双侧、对称性、难治性疼痛被称为钙调神经磷酸酶抑制剂致疼痛综合征（calcineurin inhibitor-induced pain syndrome，CIPS），最常累及双下肢。CIPS由Bouteiller等首次描述，并于1991年由Lucas等在肾移植患者中首次报道[1]，最终由Grotz等在2001年命名为CIPS[2]。近20年来，有关移植后疼痛综合征的报道不断出现，包括CIPS、无血管性坏死（AVN）以及反射性交感神经营养不良综合征（RSDS）等，其中CIPS越来越受到人们的关注。该综合征影响了1%～17%的肾、心脏、肺、肝脏、胰腺或骨髓移植患者[3]，且均报道与他克莫司或环孢素有关，移植受者中环孢素致CIPS的发生率为1.5%～14%，而他克莫司致CIPS的发生率为2.2%[4]。为了解肾移植受者中CIPS的临床特征及其治疗方法，本研究对目前已发表的病例报告进行了汇总和统计分析。
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通过检索PubMed和Google学术等获得可能相关的外文全文或摘要，检索关键词主要包括：calcineurin inhibitor-induced pain syndrome，post-transplant distal limb syndrome (PTDLS)，symmetric bone pain syndrome (SBPS)，CIPS in chronic kidney disease (CKD)，CIPS in chronic kidney disease stage 5 transplantation (CKD5T)。通过检索中国知网、万方、维普等获取相关的中文全文或摘要，检索关键词：钙调神经磷酸酶抑制剂致疼痛综合征，他克莫司致疼痛综合征，环孢素致疼痛综合征，移植后疼痛综合征，移植后骨疼痛。检索时间段为1991年1月至2020年12月，纳入标准为：肾移植受者、病例报告，排除标准为：非肾移植受者、综述和重复文献。经过筛选和研究入组后，共11篇文章，包括15例病例报告和患者。
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收集患者的年龄、性别、肾移植类型和原发病，患者发生CIPS的时间、临床表现和实验室检查结果，以及针对CIPS的治疗方法和症状改善时间。
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采用SPSS22.0进行统计分析。分类变量记录为频数和百分比。正态分布的测量值表示为（
$\bar x $ ±s）以及范围，非正态分布的表示为中位数和四分位间距（IQR）。 -
对所纳入的11篇文章（均为外文文章）中的15例肾移植受者进行了定性和定量分析。表1总结了肾移植受者中CIPS的研究[5-15]。诊断时患者的平均年龄为（44.6±8.31）岁（范围为23～59岁）。在这些患者中，有8名（53.3%）男性，7名（46.7%）女性。肾移植的类型包括：尸体肾移植（n=10，66.7%），活体供体（n=3，20%）和数据缺乏（n=2，13.3%）。导致肾脏移植的原发病包括：IgA肾病（n=3，20%），肾小球肾炎（n=1，6.7%），高血压肾病（n=2，13.3%），自身免疫性疾病（类风湿关节炎、系统性红斑狼疮，n=3，20%），镇痛性肾病（n=1，6.7%），左侧肾脏发育不全（n=1，6.7%），伯杰病（n=1，6.7%），病因不明的终末期肾脏疾病（ESRD）（n=2，13.3%）和数据缺乏（n=1，6.7%）。
表 1 肾移植受者中发生CIPS的患者特征
病例 年龄 性别 肾移植类型 原发病 参考文献 1 41 男 尸肾移植 不明原因的慢性肾功能衰竭 [5] 2 59 女 第二次活体肾脏移植 病因不明的ESRD [6] 3 44 男 左肾发育不全致终末期肾病的肾移植 左肾发育不全 [7] 4 53 女 原发性ABO不相容的活体肾脏移植 控制良好的类风湿性关节炎和慢性肾脏疾病 [8] 5 37 男 活体肾脏移植 伯杰病 [9] 6 48 女 尸肾移植 镇痛性肾病 [10] 7 49 男 尸肾移植 IgA肾病 [10] 8 50 男 尸肾移植 IgA肾病 [10] 9 40 女 尸肾移植 系统性红斑狼疮 [10] 10 50 女 尸肾移植 未提及 [11] 11 49 男 尸肾移植 高血压肾病 [12] 12 42 男 尸肾移植 动脉高血压 [12] 13 23 女 从一名41岁的头部外伤捐赠者那里接受了肾脏同种异体移植 狼疮性肾炎 [13] 14 43 女 第二次尸肾移植 肾小球肾炎 [14] 15 41 男 第二次尸肾移植 IgA肾病和高血压 [15] -
受累的关节表现包括: 双侧膝盖疼痛(n = 4, 26.7%), 双足对称性疼痛(n = 3, 20%), 双侧膝盖和双足疼痛(n = 2, 13.3%), 双足和脚踝疼痛(n = 1, 6.7%), 双侧膝盖和脚踝疼痛(n = 1, 6.7%), 双侧腕、肘、手和膝盖疼痛(n = 1, 6.7%), 双侧手、膝盖、脚踝和双足疼痛(n = 1, 6.7%), 双侧手、肘、膝盖、脚踝和双足疼痛(n = 1, 6.7%), 后背疼痛(n = 1, 6.7%)。肾移植后CIPS出现的平均时间为(2.42±3.07)个月(1例描述为肾移植后不久, 具体时间不详), 中位数为1.22个月, IQR为1～2个月。具体详见表 2。
表 2 发生CIPS的患者症状、累及关节和发生时间
病例 症状表现 累及关节 症状出现时间 1 双足对称性的严重疼痛 双足 过去的9年 (发生在肾移植后不久) 2 双侧踝关节和膝盖疼痛，双侧下肢左下踝外侧踝乏力 膝盖，脚踝 第2次肾移植后6周 3 首先是左脚疼痛，然后是双脚（在脚趾两侧）和膝盖（在两个膝盖的外侧）进行性疼痛，患处伴有水肿 膝盖，双足 移植后2个月 4 高热，疲劳和关节疼痛 手肘，手腕，膝盖 移植后14 d 5 双脚突发严重的对称性疼痛，行走受限 双足 肾移植后1年 6 突发严重的双侧膝关节疼痛 膝盖 移植后第1个月 7 突发严重的双侧膝关节疼痛 膝盖 移植后第1个月 8 突发严重的双侧膝关节疼痛 膝盖 移植后第1个月 9 突发严重的双侧膝关节疼痛，双足严重的骨痛 膝盖，双足 移植后第1个月 10 膝部进行性双侧对称性疼痛且行走困难 膝盖 移植后2个月 11 运动时多个关节剧烈疼痛，并在移植后2个月使用拐杖走路 双手，膝盖，脚踝和双足 移植后1个月 12 双足疼痛，无法行走 双足 移植后6个月 13 从胸腔到腰骶的严重后背钝痛，疼痛评分为10/10。背部伸展使疼痛加重，背部弯曲和躺下缓解。坐位时，尾骨区疼痛加重；背部中线以外无疼痛辐射 后背 移植后43 d 14 双足和脚踝进行性疼痛 双足和脚踝 术后1个月 15 双侧足部疼痛和轻微的脚踝疼痛，最后延伸至膝盖；4个月后，疼痛变得难以忍受，手和肘部出现轻微疼痛 双足，脚踝，膝盖，手和肘部 肾移植后73 d -
CNIs水平的影响在此研究中是无法估计的, 原因在于缺少实际治疗水平(谷浓度范围)的数据。CIPS发生时, CNIs水平升高或正常。7名(46.7%)患者使用环孢素作为初始免疫抑制药物, 其中6名(40%)测量了环孢素水平, 环孢素的平均全血谷浓度为(194.5±92.9) ng/ml(范围为38～278 ng/ml)。其中3名患者的环孢素谷浓度较高, 平均谷浓度为(268±12.5)ng/ml(范围为254～278 ng/ml)。8名(53.3%)患者使用他克莫司作为初始免疫抑制药物, 其中6名(40%)测量了他克莫司水平, 其平均全血谷浓度为(21.6±9.3) ng/ml(范围为5～28.2 ng/ml)。3名(20%)患者的碱性磷酸酶水平升高, 1名(6.7%)患者的碱性磷酸酶水平正常, 而11名(73.3%)患者的数据缺乏。4名(26.7%)患者的甲状旁腺激素(PTH)水平增加, 平均水平为(260±383)ng/L(范围为26～833 ng/L), 4名(26.7%)患者的PTH水平正常, 7名(46.7%)患者的数据缺乏。3名(20%)患者出现了高钙血症, 1名(6.7%)患者的血清钙水平正常, 11名(73.3%)患者的数据缺乏。2名(13.3%)患者出现低磷血症, 1名(6.7%)患者出现高磷血症, 1名(6.7%)患者血磷水平正常, 11名(73.3%)患者的数据缺乏。1名患者(6.7%)的C反应蛋白升高, 8名患者(53.3%)的C反应蛋白正常, 6名(40%)患者的数据缺乏。2名(13.3%)患者类风湿因子水平正常, 13名(86.7%)患者的数据缺乏。4名(26.7%)患者的尿酸水平正常, 11名(73.3%)患者的数据缺乏。
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在本研究纳入的15名患者中, 4名(26.7%)患者调整了环孢素剂量, 治疗后3个月症状缓解。1名(6.7%)患者将环孢素更换为依维莫司, 出院后两周和随访4个月后, 疼痛有所改善, 后给予降钙素治疗4周后无临床获益。1名(6.7%)患者开始使用氨氯地平并不能改善其症状, 但将小剂量环孢素更换为依维莫司后, 疼痛得到明显改善。6个月后, MRI显示骨髓水肿消失, 关节周围轻度积液缓解。2名(13.3%)患者在他克莫司减量后症状改善。1名(6.7%)患者在停用他克莫司并更换为CsA1周内其症状消失, 且血清肌酐水平正常, 肾移植术后无急性排斥反应和疼痛。2名患者(13.3%)将他克莫司更换为西罗莫司后症状均改善, 但其中1例在几周后由于华法林引起的脑出血而死亡。将依维莫司更换为小剂量环孢素后2个月, 1名(6.7%)患者的症状改善, 并且未采用任何特殊治疗, 发病后7个月其疼痛症状消失。1名(6.7%)患者在开始静脉注射帕米膦酸后其活动能力有所改善。1名(6.7%)患者在合用克霉唑2 d后出现背部疼痛, 考虑克霉唑导致他克莫司水平升高, 故停用克霉唑, 并给予硝苯地平治疗, 患者背部疼痛无缓解, 但在普瑞巴林首次给药后30 min内患者疼痛评分明显降低, 并在发病后3周疼痛症状消失。1名(6.7%)患者将他克莫司更换为依维莫司后疼痛未缓解, 给予曲马多、氨酚氢可酮、芬太尼、度洛西汀、西那卡塞和双膦酸盐后患者疼痛亦无明显缓解, 但在将硝苯地平更换为尼卡地平后患者疼痛缓解, 最终在移植后9个月症状完全缓解。13名患者的症状好转时间平均为(4.43±3.31)个月, 另外2名患者未描述。CIPS有效治疗方式的分布见图 1。
图 1 CIPS有放治疗方式的图解分布
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在本研究中, 肾移植术后出现CIPS的患者无明显性别差异且为中青年人群, 其肾移植类型多为尸体肾移植, 原发病主要为IgA肾病、自身免疫性疾病和高血压。既往研究报道CIPS主要累及下肢, 本研究显示可出现CIPS症状的部位众多, 涉及双侧手、肘、腕、膝盖、脚踝、双足以及后背。CIPS多表现为神经性症状, 如异常性疼痛和电击样疼痛, 也有相关瘙痒的报道。没有营养性皮肤变化或血管舒缩不稳的迹象。体格检查通常是正常的。
本研究中CIPS出现的时间范围为肾移植后14 d至1年, 经治疗后缓解期最短为20 d, 最长可达1年。实验室检查提示发生CIPS时CNIs的谷浓度升高或正常, 部分患者的碱性磷酸酶、甲状旁腺激素、血钙、C反应蛋白水平升高, 血磷水平异常, 而类风湿因子、尿酸水平正常。CIPS已被证实可能发生在肝、肾移植以及干细胞移植中。CNIs阻断可下调背景电流的脊髓钾离子通道, 进而通过影响动作电位传播的速度来增强兴奋性信号传导[16]。Grotz等提出了这样的假说, 即CNIs引起的血管紊乱导致骨髓血管通透性增加并伴有骨髓水肿, 后期报道的一些CIPS患者受累关节中示踪剂摄入增加和轻度骨髓水肿亦证实了这一假说。他克莫司可通过增加潜在的N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)活性导致不受限制的伤害性输入, 并且其磷酸化状态由蛋白激酶和蛋白磷酸酶活性之间的平衡动态控制。酪蛋白激酶II的激活可增加NMDARs的磷酸化和活性, 而钙调磷酸酶可以负反馈调节大脑中NMDARs的磷酸化及其功能。尽管CNIs导致脊髓NMDAR活性增加的机制尚不完全清楚, 但在CIPS中, CNIs可能通过抑制钙调磷酸酶的活性, 使脊髓背角中NMDARs的磷酸化/去磷酸化周期转变为以磷酸化状态为主[17]。初级感觉神经元和脊髓背角神经元的中央末端之间的第一感觉突触在感觉信息的传递和转换中起着重要作用。谷氨酸是一种重要的兴奋性神经递质, 而NMDARs在与背角疼痛传导相关的脊髓突触可塑性中起着关键作用[18]。
针对CIPS的药物治疗中, 阿片类镇痛药如吗啡、芬太尼、羟考酮等通常对CIPS无效。非甾体类抗炎药可以缓解症状, 但会对肾功能产生不利影响。据报道, 核心减压可迅速改善短暂性骨髓水肿的症状, 但如果保守处理, CIPS和短暂性骨髓水肿通常会在2～4个月内改善。氯膦酸盐和降钙素的使用似乎可以通过抑制骨溶解来减轻疼痛。CNIs减量或停用也可以缓解疼痛症状。在许多情况下, CNIs交换(如从他克莫司更换为环孢素或从环孢素更换为他克莫司)是有效的。下肢疼痛时建议将腿抬高。使用不抑制细胞色素P450的钙通道拮抗剂似乎也能有效地降低骨内高压。前列环素类似物伊洛前列素可能至少在重症患者中是一种安全的治疗选择。在Tillmann等进行的一项原始研究中, 采用标准方案静注伊洛前列素治疗10名患者, 通过评分从1～10的视觉类似量表测量, 结果表明伊洛前列素可促进疼痛的缓解: 治疗前(5.6±1.5), 治疗后(2.1±1.3), P = 0.0004[19]。Taşoğlu等的病例报告中首次描述了通常能有效用于神经性疼痛的γ-氨基丁酸(GABA)类似物, 如加巴喷丁或普瑞巴林。作者介绍了一名48岁接受了肝移植手术的男性患者, 该患者出现了双脚剧烈疼痛, 且疼痛程度逐渐增加, 有时甚至累及到膝盖。而给予普瑞巴林150 mg, 每天2次, 显著减轻了他的疼痛[20]。尽管已描述了在使用双膦酸盐(30 mg)后, CIPS症状得到改善, 但目前对其有效性仍存在争议。本研究中76.9%(10/13)的肾移植受者通过将CNIs减量或将CNIs更换为同类药物中的另一种药物, 使CIPS症状得到了缓解, 其他缓解症状的方法还包括静脉注射帕米膦酸、使用普瑞巴林以及尼卡地平。而使用阿片类镇痛药、双磷酸盐、降钙素、氨氯地平或硝苯地平未能明显改善症状。
CIPS是移植受者中发生的一种难治性疼痛综合征, 受累部位广泛, 病程长短不一, 其发病机制仍有待进一步研究。CIPS的最有效治疗方法是减少CNIs的剂量和更换免疫抑制剂, 其他治疗方式包括GABA类似物、帕米膦酸钠静脉注射、钙通道阻滞剂和保守疗法等。
Clinical features and treatment of calcineurin inhibitor-induced pain syndrome in renal transplant recipients
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摘要:
目的 了解肾移植受者中钙调神经磷酸酶抑制剂致疼痛综合征（calcineurin inhibitor induced pain syndrome，CIPS）的临床特征及其治疗方法。 方法 通过检索1991年1月至2020年12月PubMed、Google学术、中国知网、万方、维普等获得可能相关的全文或摘要，剔除综述、非肾移植受者以及重复的文献。最终纳入11篇文章，共包括15例病例报告。 结果 诊断CIPS时患者的平均年龄为（44.6±8.31）岁，男性患者比例为53.3%。CIPS出现的平均时间为肾移植后（2.42±3.07）个月。受累的部位主要包括双侧手、肘、腕、膝盖、脚踝、双足以及后背。实验室检查提示：发生CIPS时钙调神经磷酸酶抑制剂（calcineurin inhibitors，CNIs）的谷浓度升高或正常，部分患者的碱性磷酸酶、甲状旁腺激素、血钙、C反应蛋白水平升高，血磷水平异常，而类风湿因子、尿酸水平正常。通过减少CNIs剂量或更换CNIs种类，静脉注射帕米膦酸，加用普瑞巴林、钙通道拮抗剂等，多数患者CIPS症状消失，症状好转时间为（4.43±3.31）个月。 结论 CIPS的最有效治疗方法是减少CNIs的剂量和更换免疫抑制剂，其他治疗方式包括给予GABA类似物、帕米膦酸钠、钙通道阻滞剂和保守疗法。 -
关键词:
- 肾移植 /
- 钙调神经磷酸酶抑制剂 /
- 疼痛综合征 /
- 临床特征 /
- 治疗
Abstract:Objective To understand the clinical features and therapeutic methods for calcineurin inhibitor-induced pain syndrome (CIPS) in kidney transplant recipients. Methods The related articles or abstracts from January 1991 to December 2020 were obtained by searching PubMed, Google Scholar, CNKI, Wanfang and VIP databases. The reviews, duplicate literatures and the articles involved in non-kidney transplant recipients were excluded. 11 full papers were included with 15 case reports. Results The average age of patients at the time of diagnosis of CIPS was (44.6±8.31) years, and the 53.3% of the patients was male. The average appearance time of CIPS was (2.42±3.07) months after kidney transplantation. CIPS mainly affected bilateral hands, elbows, wrists, knees, ankles, feet and back. The patients had normal or elevated trough concentrations of calcineurin inhibitors (CNIs) when CIPS occurred. Some patients had elevated alkaline phosphatase, parathyroid hormone, blood calcium, C-reactive protein levels, and abnormal phosphorus levels, while rheumatoid factor and uric acid levels were normal. CIPS symptoms in most patients disappeared with dose reduction of CNIs, change to different class of CNIs, pamidronate IV injection, pregabalin, calcium channel antagonists, etc. The average recovery time was (4.43±3.31) months. Conclusion The most effective treatment for CIPS is to reduce the dose of CNIs and replace immunosuppressants. Other treatments include GABA analogs, intravenous pamidronate, calcium channel blockers and conservative therapy. -
Key words:
- renal transplantation /
- calcineurin inhibitors /
- pain syndrome /
- clinical features /
- treatment
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超多孔水凝胶（SPF）是一种三维结构的亲水性高分子聚合网格，在水中能够溶胀但不溶解，且因其具有良好的生物相容及生物可降解性，被广泛应用于医学、药学等领域。与传统水凝胶相比，超多孔水凝胶通过致孔剂、模板等方法调整孔隙率，从而改变溶胀速率以及释药速率[1-3]。胰岛素等生物大分子类药物不仅体内稳定性差、易被酶解、生物半衰期短、不易透过生理屏障，故现有给药方式多以注射为主，患者依从性差[4]。有研究显示[5]，超多孔水凝胶承载胰岛素灌胃后可以显著降低大鼠血糖：给药2 h后血糖显著下降，4～6 h降至最低，但12 h即回至最初血糖的80%，说明该制剂起效快但持续时间短，血糖波动大，需频繁给药，患者依从性差。上述情况，结合胃肠道对胰岛素的灭活等原因，本实验拟合成具有缓释作用的聚（丙烯酸-丙烯酰胺）/O-羧甲基壳聚糖[P(AA-co-AM)/O-CMC]互穿网络聚合物超多孔水凝胶（SPH-IPN），以期通过皮下给药包载胰岛素的SPH-IPN后，实现长效、减小血糖波动的目的。
1. 材料与仪器
1.1 材料与试剂
丙烯酰胺（AM）、丙烯酸（AA）、N,N′-亚甲基-双丙烯酸胺（Bis）、过硫酸铵（APS）、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺（TEMED）均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；泊洛沙姆127（PF127，北京化工厂）；O-羧甲基壳聚糖（O-CMC，大连美仑生物技术有限公司）；戊二醛（GA，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；姜黄素（宝鸡国康生物科技有限公司）；牛胰岛素（上海源叶生物有限公司）；十二烷基硫酸钠（SDS）、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）、碳酸氢钠、盐酸、乙醇、甲醇、乙酸乙酯、氢氧化钠均为分析纯，实验用水为去离子水。
1.2 仪器
85-2型恒温磁力搅拌器（上海司乐仪器有限公司）；恒温水浴锅（余姚市东方电工仪器厂）；透析袋（Viskase，美国）；Nicolet iS50傅里叶变换红外光谱仪（Thermo，美国）；AVANCE III 400核磁共振谱仪（Bruker，德国）；FE28型pH计（Mettler Toledo，美国）；Waters UPLC：二元溶剂管理系统、在线脱气机、自动进样器、PDA检测器（Waters公司，美国）；TTL-DC型多功能氮吹仪（北京同泰联科技发展有限公司）；SHA-B双功能恒温水浴振荡器（常州金坛良友仪器有限公司）。
1.3 实验动物
雄性SD大鼠，体重范围（220±20）g，合格证号：SCXK（京）2017-0002，购自北京斯贝福实验动物科技有限公司，饲养于北京中医药大学动物房。
2. 方法与结果
2.1 超多孔水凝胶（SPH-IPN）的制备[5]
依次向西林瓶中加入50% AM和AA溶液，以10 mol/L NaOH调节pH至5.0。随后再加入2.5% Bis溶液、10% PF 127溶液、20%APS溶液和50 μl 16.7% TEMED溶液，磁力搅拌混匀。室温放置15 min后，逐滴加入 6% O-CMC溶液，使溶液中O-CMC/单体比（w/w）为0.144，迅速加入NaHCO3粉末，搅拌约20 s使其产生气泡，将其置于40 ℃水浴加热5 min，室温固化30 min，即得半互穿网络水凝胶（semi-IPN）。将所得semi-IPN置于GA/O-CMC比（w/w）为2∶10的GA溶液（用0.2 mol/L的盐酸溶液调节pH至1.0）中至将其吸干，室温放置1 h，得粗P(AA-co-AM)/O-CMC超多孔水凝胶（SPH-IPN）。将SPH-IPN置于0.1 mol/L盐酸溶液中，透析5 d，无水乙醇中脱水透析2 d，30 ℃烘干至恒重，干燥密闭保存，即得纯化后的SPH-IPN。
2.2 SPH-IPN的结构表征
将样品充分干燥，KBr压片法制样，使用傅里叶变换红外光谱仪测定500～4 000 cm−1波数的SPH-IPN的IR谱。将样品置于氧化锆样品管（A=4 mm），转速5 000 Hz，固体碳谱测定。
2.3 SPH-IPN的溶胀性能测定
取干燥的SPH-IPN，室温下浸于过量水中（pH 7.0），于不同时间点用筛网取出SPH-IPN，吸去表面残余水后称重，根据以下公式计算SPH-IPN在不同时间点的溶胀比（QS）：
$$ {Q_{\rm{S}}} = \frac{{{W_{\rm{S}}} - {W_{\rm{d}}}}}{{{W_{\rm{d}}}}} $$ 其中，WS为溶胀后SPH-IPN质量（g）；Wd为干SPH-IPN质量（g）。
2.4 SPH-IPN孔隙率测定
采用乙醇替代法测定SPH-IPN的孔隙率[6]。取干燥的SPH-IPN，置无水乙醇中浸泡12 h，取出后吸去表面残余乙醇，称重，根据以下公式计算孔隙率：
$$ {\text{孔隙率}}=\frac{{M}_{2}-{M}_{1}}{\rho V}\times 100\;\text{%}$$ 其中，M1为干SPH-IPN质量（g）；M2为乙醇浸泡后的SPH-IPN质量（g）；ρ为乙醇密度（g/cm），V为SPH-IPN体积（cm3，以游标卡尺测量长方体SPH-IPN的长、宽、高后计算而得）。
2.5 载胰岛素SPH-IPN的制备及含量测定
2.5.1 载胰岛素SPH-IPN的制备
取胰岛素15 mg，精密称定，置10 ml量瓶中，加0.1 mol/L pH 7.4 PBS溶解并定容至刻度，得1.5 mg/ml的胰岛素溶液。称取50 mg SPH-IPN置装有10 ml胰岛素溶液的西林瓶中，37 ℃温浴放置2 h，取出，置烘箱内，30 ℃恒温干燥。
2.5.2 载药量的测定
取胰岛素SPH-IPN适量，研磨粉碎，取20 mg，精密称定，置10 ml量瓶中，加入0.1 mol/L pH 7.4 PBS，定容至刻度。37 ℃温浴2 h，超声10 min，精密量取上清液20 μl注入HPLC仪，记录色谱图，计算胰岛素含量，并根据以下公式计算载药量：
$$ {\text{载药量}}(\%)=\frac{cV}{M}\times 100$$ 其中，c为测得胰岛素的浓度（mg/ml），V为量瓶体积（ml），M为SPH-IPN的质量（mg）。
2.6 载胰岛素SPH-IPN降血糖实验
2.6.1 不同方法载药SPH-IPN的制备
按“2.5.1”项下方法制备载胰岛素SPH-IPN，采用冷冻干燥法将其冻干即得含胰岛素的冻干SPH-IPN。称取空白凝胶200 mg置于1.5 mg/ml的胰岛素溶液37 ℃中溶胀2 h，备用，即得含胰岛素的预溶胀SPH-IPN。
2.6.2 糖尿病大鼠模型的建立
给大鼠喂食高脂饲料（88.8%基础饲料、1%胆固醇、10%猪油和 0.2%胆盐[7]）喂养4周，动物自由进食和饮水，每周记录体重。于喂养的第28天晚禁食，在第29天一次性腹腔注射链脲佐菌素（STZ）35 mg/kg，将一次性注射STZ 3 d后大鼠空腹血糖≥11.1 mmol/L或随机血糖≥16.7 mmol/L作为成模标准[8]。对照组大鼠则腹腔注射无菌生理盐水（0.3 ml/100 g）。注意测血糖前应禁食12 h，空腹测血糖。造模期间要防止感染，注意消毒。未造模成功的大鼠再次注射STZ35 mg/kg，3 d后测血糖验证是否造模成功。
2.6.3 分组、给药及血糖测定
取糖尿病大鼠12只，按随机数字表分为2组，即模型1组和模型2组；取正常大鼠12只，按随机数字表分为2组，即正常1组和正常2组。模型组1组和正常1组皮下埋植含胰岛素的预溶胀SPH-IPN，模型2组和正常2组皮下埋植含胰岛素的冻干SPH-IPN。给药后分别于1、2、4、6、8、10、12、24、28、32、36、48、60、72 h不同时间间隔大鼠尾部取血0.02 ml，用血糖仪测定血糖值，考察不同时间血糖值的变化情况。
3. 实验结果
3.1 IPN结构表征
3.1.1 傅立叶变换红外光谱（FTIR）
图1为SPH-IPN的FTIR图。在1 651 cm−1处有-COOH的伸缩振动峰，且1 615 cm−1附近无AA和AM的C=C双键吸收峰，说明已聚合成P(AA-co-AM)，SPH-IPN中存在P（AA-co-AM），图中3 335和2 922 cm-1处分别为-O-H和-C-H的伸缩振动峰；1 604和1 416 cm−1处分别为羧酸盐-COO-的反对称伸缩振动峰和对称伸缩振动峰；1 086、1 044和1 171 cm−1处分别为O-CMC中糖环羟基-CH-OH、一级羟基-CH2-OH和醚基C-O-C中的C-O伸缩振动峰。以上结果表明SPH-IPN中存在P(AA-co-AM)，还存在的一些杂峰可能是还有一些未反应单体未被除尽。
3.1.2 核磁共振（13C-NMR）
图2为SPH-IPN的13C-NMR图。图中41.926×10−6为P(AA-co-AM)上主链碳原子的化学位移峰；179.499处为羧基碳原子的化学位移峰，说明结构中含有羧基官能团，AA与AM已聚合形成P(AA-co-AM)。
由于制得的水凝胶未找到合适的溶液将其溶解，因此在测定核磁共振图谱时，采用的是固体核磁技术[9]。
综合红外和碳谱结果可知，通过该方法可聚合形成P(AA-co-AM)结构，而该结构又是超多孔水凝胶SPH-IPN的主要结构，由此可说明已成功聚合SPH-IPN。
3.2 SPH-IPN的溶胀性能
图3为不同温度介质中SPH-IPN的溶胀曲线，可见随着温度升高，SPH-IPN的溶胀速率加快，平衡溶胀比增大，原因是温度较高时相互缠绕的聚合物链松开，破坏分子间的氢键，增加链运动，水分子在凝胶骨架内外的扩散速率加快，从而促进了聚合物的溶胀[10]。
3.3 SPH-IPN孔隙率的测定
表1为SPH-IPN孔隙率测定结果，所制SPH-IPN超多孔水凝胶空隙分布均匀。除此之外，与传统水凝胶相比[11]，孔隙率高，更利于药物的释放。
表 1 SPH-IPN的孔隙率测定结果干重M1
(m/g)湿重M2
(m/g)乙醇密度
(g/cm3)体积
(V/cm3)孔隙率
(%)平均值
(%)RSD
(%)0.5425 0.6327 0.816 0.13 85.03 81.63 3.88 0.5751 0.6779 0.816 0.16 78.74 0.5628 0.6621 0.816 0.15 81.13 3.4 SPH-IPN载胰岛素含量测定结果
37 ℃时SPH-IPN溶胀比较大，温度过高易引起胰岛素变性，故选择37 ℃温度载药，胰岛素的载药量试验结果见表2。
表 2 SPH-IPN对胰岛素的载药量试验组 载药量(w/w,%) 平均值(w/w,%) RSD（%） 1 3.13 3.19 1.88 2 3.25 3 3.20 3.5 载胰岛素凝胶降血糖实验
图4是含胰岛素的预溶胀SPH-IPN和冻干SPH-IPN对糖尿病大鼠和正常大鼠降糖作用的比较。图中预溶胀模型组在10 h时血糖值才有所降低，最低值为10 h的16.8 mmol/L，之后血糖又开始慢慢升高；预溶胀正常大鼠组在给药4 h后血糖开始降低，到24 h时血糖达到7.3 mmol/L，之后维持平稳状态；冻干模型组在包埋1 h后血糖便开始下降，血糖值降到6.7 mmol/L，在24 h后血糖开始慢慢升高，冻干正常大鼠组在1 h后血糖降至5.3 mmol/L，之后虽有起伏，但也一直在正常范围内。说明冻干凝胶的降糖作用较预溶胀组好，冻干凝胶在1～24 h时间段内的降糖作用较平稳。
4. 讨论
4.1 SPH-IPN的制备
本实验选用了能够迅速聚合的水溶性原料AA、AM为聚合反应单体；以APS/TEMED为引发体系；PF127为泡沫稳定剂，使产生的泡沫稳定时间更长；NaHCO3为起泡剂；O-CMC在合成过程中作为增稠剂，维持合适的起泡速率，使产生的气泡均匀、稳定，不致产生的气泡过快逸散[12]。采用溶液聚合法制备了含semi-IPN的水凝胶。因为该聚合反应在反应过程中会产生大量热量，这对泡沫的稳定极为有利，因此在常温条件下便能进行聚合反应，条件温和。以pH 1.0的GA溶液交联O-CMC时，可避免过度溶胀对孔隙结构的破坏，且pH 1.0时GA的交联能力较好。除此之外，相较于参考文献[5]，本实验中O-CMC/单体比较高，当O-CMC/单体比为0.144时，虽然可形成具有大量相互贯通孔隙的聚合物，但会导致其溶胀速率减慢，溶胀比降低，从而影响载药量和释药速率。随着溶胀速率减慢，药物溶出速率也相应减慢；随着溶胀比的降低，吸收的药物溶液减少，载药量随之降低。本实验提高O-CMC/单体的目的是希望通过减慢SPH-IPN的溶胀速率，从而尝试制备缓释制剂。
4.2 水凝胶的载药方法
水凝胶的载药方法通常有2种：一是将药物与单体溶液混合，随着单体聚合、交联将药物包埋于水凝胶中[13]；另一种方法为吸附载药，即凝胶在被载药液中溶胀，将载药水凝胶干燥，实现药物包埋[14]。姜黄素属于脂溶性药物，课题组前期研究结果表明，0.5%的SDS对姜黄素有一定的增溶效果；0.1 mol/L pH 7.4 PBS中SPH-IPN的溶胀比较大，对胰岛素具有一定的增溶作用，故分别选用这两种溶剂配制胰岛素溶液。
4.3 超多孔水凝胶的释药性能
文献[5]表明，超多孔水凝胶载药后的释药性能与O-CMC的含量、pH、离子强度、温度等多个因素有关，同时也有可能与载药SPH-IPN的制备过程有关。
笔者曾用SPH-IPN包载姜黄素，并开展探索性实验。结果发现20、40、60目不同粒径的凝胶累积释放率不同，前13 h三者的累积释放率均几乎一样（接近0），13 h后累积释放率逐渐增加，以40目凝胶的效果最佳，48 h后达到6.00%，明显高于其他组，但其释放速度慢，见图5。灌胃给予载姜黄素SPH-IPN后，部分大鼠排泄物中可见载姜黄素SPH-IPN，说明SPH-IPN在体内溶胀速率很慢；而载姜黄素SPH-IPN组和姜黄素原药组，灌胃后大鼠眼眶血中均未检出姜黄素，也进一步体现SPH-IPN未促进姜黄素的吸收。
将载胰岛素SPH-IPN予灌胃给药溶胀很慢，降糖效果极不明显，为延长SPH-IPN溶胀时间，最终考虑将其进行皮下包埋给药。
载胰岛素SPH-IPN皮下包埋给药发现，载胰岛素冻干SPH-IPN组的降糖效果优于载胰岛素溶胀SPH-IPN组，表明载药SPH-IPN的释放性能除与溶胀比有关外，其制备过程也会一定程度影响被载药物的疗效，与文献[5]报道一致。实验中将冻干组和溶胀组均进行包埋，均可延长溶胀时间，但冻干SPH-IPN组的降糖效果优，皮下包埋2 h后表现出明显的降糖作用，相比溶胀组而言，起效时间快（8 h左右）且持续时间长，24 h之内均具有良好的降糖作用。提示我们在制备载药SPH-IPN的过程中应该时刻关注被载药物的活性及稳定性，应在适当的条件下对药物进行包载以提高药物疗效，同时也说明载胰岛素冻干SPH-IPN可作为控释制剂，实现调节大鼠血糖的目的。结合实验结果分析可知，SPH-IPN能够增强药物的稳定性，提高生物利用度，比较适合作为蛋白质药物给药载体。
4.4 SPH-IPN载胰岛素的微针给药展望
文献研究发现，胰岛素经皮给药具有不错的疗效，与皮下给药效果几无差异，且依从性好，成为最新、有效、方便的给药方式。Norduist等[15]将微针贴剂用于胰岛素给药，结果发现，血浆胰岛素浓度变化与传统的皮下注射并无太大差异，但微针贴剂能极大地提高实验大鼠的依从性。无痛中空微针皮内胰岛素给药系统已获得 FDA批准，进入II期临床，相关产品有以色列纳米通道技术公司采用MEMS技术开发的中空微针器具，其中包括用于无痛释放胰岛素薄片与胰岛素微型泵相结合。Liu等[16]将可溶性材料透明质酸制备成负载胰岛素的微针阵列。在体实验发现，负载胰岛素的微针能够在1 h内完全溶解，携带的胰岛素快速释放入体内。
与上述研究及应用相比，本实验的载胰岛素SPH-IPN，释放药物无需微型泵，皮下包埋给药可以24 h内保持平稳、正常的血糖浓度，适合作为一日一次给药的控释制剂。为了提高患者的依从性，进一步研究将载胰岛素SPH-IPN制备为微针阵列的形式，以期得到一种方便、快捷、安全的胰岛素缓释递药系统。
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表 1 肾移植受者中发生CIPS的患者特征
病例 年龄 性别 肾移植类型 原发病 参考文献 1 41 男 尸肾移植 不明原因的慢性肾功能衰竭 [5] 2 59 女 第二次活体肾脏移植 病因不明的ESRD [6] 3 44 男 左肾发育不全致终末期肾病的肾移植 左肾发育不全 [7] 4 53 女 原发性ABO不相容的活体肾脏移植 控制良好的类风湿性关节炎和慢性肾脏疾病 [8] 5 37 男 活体肾脏移植 伯杰病 [9] 6 48 女 尸肾移植 镇痛性肾病 [10] 7 49 男 尸肾移植 IgA肾病 [10] 8 50 男 尸肾移植 IgA肾病 [10] 9 40 女 尸肾移植 系统性红斑狼疮 [10] 10 50 女 尸肾移植 未提及 [11] 11 49 男 尸肾移植 高血压肾病 [12] 12 42 男 尸肾移植 动脉高血压 [12] 13 23 女 从一名41岁的头部外伤捐赠者那里接受了肾脏同种异体移植 狼疮性肾炎 [13] 14 43 女 第二次尸肾移植 肾小球肾炎 [14] 15 41 男 第二次尸肾移植 IgA肾病和高血压 [15] 
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表 2 发生CIPS的患者症状、累及关节和发生时间
病例 症状表现 累及关节 症状出现时间 1 双足对称性的严重疼痛 双足 过去的9年 (发生在肾移植后不久) 2 双侧踝关节和膝盖疼痛，双侧下肢左下踝外侧踝乏力 膝盖，脚踝 第2次肾移植后6周 3 首先是左脚疼痛，然后是双脚（在脚趾两侧）和膝盖（在两个膝盖的外侧）进行性疼痛，患处伴有水肿 膝盖，双足 移植后2个月 4 高热，疲劳和关节疼痛 手肘，手腕，膝盖 移植后14 d 5 双脚突发严重的对称性疼痛，行走受限 双足 肾移植后1年 6 突发严重的双侧膝关节疼痛 膝盖 移植后第1个月 7 突发严重的双侧膝关节疼痛 膝盖 移植后第1个月 8 突发严重的双侧膝关节疼痛 膝盖 移植后第1个月 9 突发严重的双侧膝关节疼痛，双足严重的骨痛 膝盖，双足 移植后第1个月 10 膝部进行性双侧对称性疼痛且行走困难 膝盖 移植后2个月 11 运动时多个关节剧烈疼痛，并在移植后2个月使用拐杖走路 双手，膝盖，脚踝和双足 移植后1个月 12 双足疼痛，无法行走 双足 移植后6个月 13 从胸腔到腰骶的严重后背钝痛，疼痛评分为10/10。背部伸展使疼痛加重，背部弯曲和躺下缓解。坐位时，尾骨区疼痛加重；背部中线以外无疼痛辐射 后背 移植后43 d 14 双足和脚踝进行性疼痛 双足和脚踝 术后1个月 15 双侧足部疼痛和轻微的脚踝疼痛，最后延伸至膝盖；4个月后，疼痛变得难以忍受，手和肘部出现轻微疼痛 双足，脚踝，膝盖，手和肘部 肾移植后73 d
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