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近年来，我国海军大力加强实战化军事训练，不断提高军事应对能力和应急突击能力，高新技术条件下的未来海上作战对药材保障的要求越来越高，药材保障是影响救治的主要因素之一[1]。海上高温、高湿、高盐环境对药品的运输、储存和使用提出了新的考验。磺胺嘧啶银乳膏为磺胺类抗菌药，临床常用于预防和治疗轻度烧伤继发创面感染等，是一种疗效好、应用广泛的外用抗菌药物。药物制剂的含量符合规定标准是保障药物疗效的重要指标之一。目前，磺胺嘧啶银乳膏含量测定的方法多种多样，《中国药典（二部）》2015年版采用的是永停滴定法[2]，《中国医院制剂规范》（第二版）则采用硫氰酸铵滴定法[3]，而《美国药典》采用HPLC法测定磺胺嘧啶银的含量[4]。用滴定法测定含量时容易受到基质的干扰，影响终点的判断，《美国药典》方法的供试品前处理烦琐。根据已报道的文献资料[5-6]，本研究对磺胺嘧啶银乳膏含量测定方法进行优化，建立了反相HPLC测定磺胺嘧啶银乳膏中该成分含量的方法，并首次采用复合式盐雾试验箱模拟海洋高温、高湿、高盐环境，考察了磺胺嘧啶银乳膏在极端环境下的稳定性，为特殊环境下的药品质量研究提供方法借鉴，并为优化远海作战药材保障提供数据支持。
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LC-20A高效液相色谱仪，包括LC-20AT紫外检测器和Labsolution工作站（日本岛津公司） METTLER AE240型电子天平（瑞士梅特勒公司），ZH-AYSH-90复合式盐雾试验箱 (香港正航仪器设备有限公司)。
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对照品：磺胺嘧啶银(USP，批号：RO3500，纯度99.9％)，磺胺嘧啶银乳膏(海军军医大学附属长海医院，规格：1%，批号：20191207、20191208、20191209)，乙腈为色谱纯，氨水为分析纯，磷酸为优级纯(国药集团化学试剂有限公司)，实验用水为娃哈哈纯净水。
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色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18 (4.6 mm×150 mm，5μm)；流动相：乙腈-0.1％磷酸 (8∶92，V/V)，流速1.0 ml/min，进样量10 μl，柱温30℃，检测波长254 nm。
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取磺胺嘧啶银对照品10 mg，精密称定，置50 ml棕色量瓶中，加入10%氨水溶液溶解稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液(0.2 mg/ml)，精密量取对照品储备液0.5 ml置10 ml量瓶中，加10%氨水溶液稀释至刻度，摇匀，即得磺胺嘧啶银对照品溶液。
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将磺胺嘧啶银乳膏置于复合式盐雾试验箱中，温度50℃，湿度90%，盐度5%氯化钠[7-8]，分别放置0、2、4、6、8、10、12周取样测定。
精密称定磺胺嘧啶银乳膏1 g，置于50 ml棕色量瓶中，加入10%氨水溶液适量，超声20 min，使乳膏充分溶解并稀释至刻度，过滤，取续滤液0.5 ml，置于10 ml量瓶，用流动相稀释至刻度，摇匀，即为供试品溶液。
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根据磺胺嘧啶银乳膏处方制备不含磺胺嘧啶银的空白乳膏剂，按照“2.3”项下制备方法制成阴性样品溶液。
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分别取阴性样品溶液、对照品溶液及供试品溶液各10 μl，按“2.1”项下的色谱条件进样分析，结果如图1所示，供试品溶液在与对照品溶液对应位置出现相对应的色谱峰，阴性样品溶液无干扰，方法专属性良好。
图 1 专属性考察典型色谱图
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精密量取对照品储备液适量置于10 ml棕色量瓶中，用10%氨水稀释，依次配制成浓度分别为4.00、8.00、10.00、12.00、16.00、20.00 μg/ml的对照品溶液，作为线性工作溶液。按“2.1”项下色谱条件，进样10 μl，以磺胺嘧啶银的浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归，得到回归方程：Y=22 808X−1 858，r =0.999 9，结果表明，磺胺嘧啶银在4.00～20.00 μg/ml范围内与峰面积呈良好的线性关系。
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取对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件在1 d内进样６次，以及连续３d分别进样，测定磺胺嘧啶银峰面积，结果显示，日内精密度RSD为0.33％，日间精密度RSD为0.97%，表明仪器的精密度良好。
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取同一批号(20191208)样品1 g，共6份，精密称定，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别测定，结果显示，磺胺嘧啶银平均含量为95.27%，RSD为1.07% (n=6)，表明方法的重复性良好。
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取同一份供试品溶液，室温下分别放置0、2、4、8、12、24 h后分别按“2.1”项下色谱条件进样分析，考察溶液的稳定性，测定结果的RSD为0.97%，表明供试品溶液至少在24 h内稳定性良好。
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精密称取磺胺嘧啶银乳膏空白基质6份，各1 g，置于50 ml量瓶中，分别加入磺胺嘧啶银对照品10 mg，再加入10%氨水溶液适量，超声后按“2.3”项下方法进行制备并测定，计算回收率，结果平均回收率为101.47％，RSD为2.33％ (n=6)。
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考察包括色谱柱（Agilent ZORBAX SB-C18： 4.6 mm×150 mm，5 μm，Agilent EXTEND-C18：4.6 mm×250 mm，5 μm），柱温（28、30、32℃），流速（0.9、1.0、1.1ml／min）3个因素对试验结果的影响，结果显示，磺胺嘧啶银峰面积的 RSD 均<10%，其中，微调流速对保留时间和峰面积的影响较大，但主成分与降解后出现的新杂质分离度良好，不影响含量测定结果，如图2所示，表明该方法具有良好的耐用性。
图 2 耐用性考察流速对分离的影响
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分别取3个批次的样品，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，用“2.1”项下色谱条件测定，记录峰面积，按外标法分别计算磺胺嘧啶银的含量，结果如表1所示。
表 1 不同存储时间样品中磺胺嘧啶银的含量变化测定结果(按标示量计算/%)
批号 存储时间（t/w） 0 2 4 6 8 10 12 20191207 94.22 93.40 94.07 85.28 57.86 63.23 52.33 20191208 94.63 94.09 94.10 82.94 60.19 58.25 51.41 20191209 95.47 96.75 95.93 78.74 66.58 53.25 51.89 -
磺胺嘧啶银是难溶的两性药物，只能在硝酸、氨水等少数溶剂中溶解[9]。本研究采用10%氨水溶解磺胺嘧啶银，并用50℃超声处理，使基质分散，冷却至室温后，定容，静置20 min，过滤，再用流动相稀释，HPLC测定磺胺嘧啶银的含量，并进行了完整的方法学考察，符合药典规定的各项要求。与《美国药典》的样品前处理方法相比，该方法操作简单、容易过滤、重复性良好。
乳膏剂常规应保存在阴凉干燥处，然而，远海作战环境特殊，高温、高湿、高盐是其主要特征，例如，担负海上救护任务的医院船，船舱多为密闭空间，舱内温度高，不利于药品的长期保存[10]。在如此特殊的环境下，药品是否能在其拟定的保质期内保持质量的稳定性，如何确定或延长药品在极端环境下的保质期是值得深入研究的课题。本研究首次采用复合式盐雾试验箱模拟高温、高湿、高盐环境，考察磺胺嘧啶银乳膏的稳定性，结果显示，在此极端环境下，磺胺嘧啶银乳膏在1个月内，其性状、pH值、粒度和含量没有发生显著变化，2个月以后，乳膏由白色转为褐色，明显呈水样状，有较大的块状凝结，含量下降超过30%，结果表明磺胺嘧啶银乳膏在温高、湿高、盐环境下不稳定，在其运输、储存和使用过程中应充分考虑环境的影响，对于长远航任务应考虑对该制剂的外包装加以防护措施，或更换同类型的其他品种。本研究可为极端环境下的药品稳定性研究方法的开发和运用提供参考。
Optimization of determination method for silver sulfadiazine cream and its stability under extreme conditions
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摘要:
目的 优化磺胺嘧啶银乳膏中磺胺嘧啶银的含量测定方法，并考察其在高温、高湿、高盐环境下的稳定性。 方法 采用反相高效液相色谱法，选用Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流动相：乙腈-0.1％磷酸(8∶92，V/V)，流速1.0 ml/min，柱温30 ℃，检测波长254 nm。采用复合式盐雾试验箱模拟高温、高湿、高盐环境，考察0、2、4、6、8、10、12周磺胺嘧啶银含量变化情况。 结果 磺胺嘧啶银在4.00～20.00 μg/ml范围内与峰面积呈良好的线性关系(r=0.999 9)，平均回收率为101.47% (RSD=2.33%)。含量测定结果显示，磺胺嘧啶银乳膏在4周以后含量开始显著下降。 结论 该方法简便、准确、可靠，可用于磺胺嘧啶银乳膏中磺胺嘧啶银的含量测定。测定结果表明，磺胺嘧啶银乳膏在高温、高湿、高盐环境下不稳定，在其运输、储存和使用过程中应充分考虑环境的影响，执行长远航任务时应考虑对其外包装增加防护措施，或更换具有类似药效作用的其他品种。 Abstract:Objective To optimize the method of assay for silver sulfadiazine, and to investigate its stability in high temperature, humidity and salt environment. Methods Agilent ZORBAX SB-C18 column was used in HPLC for the determination of silver sulfadiazine with acetonitrile and 0.1% phosphoric acid as mobile phase.The flowing rate was 1.0 ml/min and column temperature was 30℃. Salt spray test chamber was used to simulate the high temperature, humidity and salt environment. The silver sulfadiazine content was assayed at 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 weeks. Results The calibration curve was linear within the range of 4.00～20.00 μg/ml (r=0.9999). The average recovery was 101.47% (RSD=2.33%). The content of silver sulfadiazine cream began to decrease significantly after 4 weeks. Conclusion This method is convenient, accurate and reliable. It can be used for the content determination of silver sulfadiazine in the cream.The results showed that the silver sulfadiazine cream was unstable in the environment of high temperature, humidity and salt. Therefore, environmental impact should be fully considered in transportation, storage and application. For the long-distance navigation mission, protective measures should be taken for its packaging or replace it with more stable products. -
Key words:
- silver sulfadiazine /
- content determination /
- stability /
- HPLC
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据国际癌症研究机构（IARC，https://www.iarc.who.int/）提供的数据显示，2020年女性乳腺癌现已成为全球最常见的癌症之一[1]。其中有15%～25%的乳腺肿瘤存在人类表皮生长因子受体2（HER2）过表达。HER2阳性的乳腺癌浸润性强、无病生存期短、预后差，对化疗敏感性差，且易复发[2]。曲妥珠单抗是一株靶向HER2的人源化单克隆抗体。虽然曲妥珠单抗单药对乳腺癌治疗起到了很好的改善的效果, 但其疗效还有所不足，如对HER2过表达的乳腺癌患者初次治疗有效率仅在30%左右[3]。EGCG是绿茶中主要的多酚[4]，有抑制肿瘤细胞生长、增殖、转移和血管生成，诱导细胞凋亡和增强抗肿瘤免疫等多种抗肿瘤作用[5-9]。据报道，EGCG在乳腺癌、胃癌、白血病、膀胱癌治疗中均显示有抗肿瘤作用[10-13]。本实验旨在探讨曲妥珠单抗与EGCG对HER2过表达细胞株是否具有协同增殖抑制作用，为HER2高表达乳腺癌的治疗提供新的思路。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 材料
EGCG（MedChemExpress公司），CCK-8检测试剂盒（美国bimake生物科技有限公司）；GAPDH一抗、AKT一抗、p-AKT一抗、MAPK一抗、p-MAPK一抗、EGFR一抗、p-EGFR一抗、HER2一抗、p-HER2一抗、抗兔IgG一抗、抗鼠IgG一抗、HRP抗体二抗（美国Cell Signaling Technology公司），凝胶过滤层析标准品（美国BIO-RAD公司），二抗Goat pAb to Human IgG（英国Abcam公司）。
1.1.2 细胞株
人乳腺癌细胞系BT474、SK-BR-3（购自中国科学院细胞库并保存于本实验室）。
1.1.3 仪器
AKTA Avant 25蛋白纯化仪、Imager 600超灵敏多功能成像仪（美国Cytiva公司）； Agilent 1200 series高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；Spark多功能酶标仪（瑞士TECAN）； Intellicyt® iQue3 高通量流式细胞仪（德国赛多利斯）。
1.2 方法
1.2.1 曲妥珠单抗的表达与纯化
用含有曲妥珠单抗重链和轻链表达载体的质粒共转染Expi293F细胞7 d后收集培养上清液，用Protein A亲和层析法进行纯化。SEC-HPLC对抗体的纯度进行检测，并用流式细胞术检测曲妥珠单抗抗体与HER2过表达细胞株SK-BR-3、BT474的结合活性。
1.2.2 流式细胞术
细胞按3×104个细胞/孔铺于V型底96孔板中，每孔30 μl。曲妥珠单抗按100 nmol/L的起始浓度，3倍比稀释，分成11个浓度梯度，末孔为PBS作为阴性对照，加入铺有细胞的96孔板中，每孔30 μl。曲妥珠单抗与细胞4℃共孵育1～2 h，用含0.1% BSA的PBS洗1遍，加入二抗Goat pAb to Human IgG，1∶200稀释，每孔30 μl，4℃孵育30 min。二抗孵育结束，用含0.1% BSA的PBS洗2遍，每孔加入30 μl 含0.1% BSA的PBS，用 Intellicyt® iQue3 高通量流式细胞仪进行检测。
1.2.3 细胞培养
采用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养SK-BR-3细胞，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养BT474细胞，培养条件为5% CO2，37℃。当细胞密度达到80%～90%时进行传代，每周2～3次。取对数生长期的细胞进行实验。
1.2.4 CCK8检测细胞增殖
将细胞按1×104个细胞/孔的数量接种于96孔板中，在37℃、5% CO2条件下培养24 h。每孔加入100 μl含设定浓度药物的培养基，培养48 h后，弃去孔内培养基，每孔加入100 μl含10%CCK8试剂的培养基，继续培养1～3 h，用酶标仪在450 nm测定光密度值（A），并计算细胞的增殖抑制率。增殖抑制率=（A对照−A实验）/（A对照−A背景）。联合给药组用CompuSyn软件计算CI值（药物联合指数），通过CI值的数值可以定量判断药物间相互作用的强度以及性质（CI>1为拮抗作用；CI=1为相加作用；CI<1为协同作用）。
1.2.5 Western blot检测
根据分组将细胞按5×105个细胞/孔的数量接种于6孔板培养24 h。弃去原培养基，加入含设定浓度药物的培养基继续培养24 h。采用细胞裂解液试剂盒提取各组细胞总蛋白，用BCA试剂盒测定蛋白浓度。按每泳道30 μg蛋白样品的上样量进行聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转移至PVDF膜。用5%脱脂奶粉在摇床上室温封闭1 h，加入一抗4 ℃孵育过夜，加入二抗室温孵育1 h。一抗、二抗均按照抗体使用说明书稀释。洗膜后，加ECL发光液，用超灵敏多功能成像仪进行显影，并用ImageJ软件对条带进行灰度值分析。目的蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/内参GAPDH灰度值 。
1.2.6 统计学方法
采用 GraphPad prism 8.0软件（Version X，USA）进行统计学分析和作图，用compuSyn软件计算联合指数。两组数据之间比较采用t检验，多组数据之间比较采用单因素方差分析（ANOVA）。P<0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 SEC-HPLC检测曲妥珠单抗的纯度
将表达纯化后的曲妥珠单抗用SEC-HPLC进行检测，结果显示曲妥珠单抗的纯度为100%，且分子量大小在150 kDa（1kDa=1×103）左右（图1）。
2.2 流式细胞术验证曲妥珠单抗与SK-BR-3、BT474的结合活性
采用流式细胞术测定曲妥珠单抗与HER2过表达乳腺癌细胞株SK-BR-3和BT474的结合活性。结果显示，曲妥珠单抗以浓度依赖性的方式结合SK-BR-3和BT474细胞，其中，曲妥珠单抗与SK-BR-3细胞株结合的EC50值为1.128 nmol/L，与BT474细胞株结合的EC50值为1.203 nmol/L，两者EC50值大约一致（图2）。
2.3 用CCK8法测定 EGCG 、曲妥珠单抗单独及联合对BT474的增殖抑制作用
采用CCK8法测定EGCG单药、曲妥珠单抗单药及两者联合对BT474的增殖抑制作用。图3A和图3B结果显示， EGCG和曲妥珠单抗对BT474细胞均显示出浓度依赖性的增殖抑制作用。图3C结果显示EGCG和曲妥珠单抗联合给药组的增殖抑制作用显著强于单药组。图3D结果显示EGCG在一定浓度范围内（45～200 μmol/L）与16.67 nmol/L 曲妥珠单抗联用时显示有协同抗肿瘤作用（CI<1）。
图 3 EGCG单药组、曲妥珠单抗单药组及两者联用组对BT474细胞增殖的影响注：A.EGCG对BT474细胞增殖的影响；B.曲妥珠单抗对BT474细胞增殖的影响；C.16.67 nmol/L曲妥珠单抗、16.67 nmol/L IgG 曲妥珠单抗同型对照、45 μmol/L EGCG、16.67 nmol/L曲妥珠单抗与45 μmol/L EGCG联用对BT474细胞增殖的影响；D.16.67 nmol/L曲妥珠单抗联合不同浓度EGCG对BT474细胞增殖的影响，计算联合指数（CI），Fa表示效应值；*P<0.05，****P<0.0001，与空白组比较；△△△△P<0.0001，与IgG组比较；####P<0.0001，与曲妥珠单抗组比较2.4 用CCK8法测定 EGCG 、曲妥珠单抗单独及联合对SK-BR-3细胞的增殖抑制作用
采用CCK8法测定EGCG单药、曲妥珠单抗单药及两者联合对SK-BR-3的增殖抑制作用。图4A和图4B结果显示，EGCG和曲妥珠单抗均对SK-BR-3细胞显示出浓度依赖性的增殖抑制作用。图4C结果显示，EGCG和曲妥珠单抗联合给药组的增殖抑制作用显著强于单药组。图4D结果显示，EGCG在一定浓度范围内（7.5～120 μmol/L）与16.67 nmol/L曲妥珠单抗联用时有协同抗肿瘤作用（CI<1）。
图 4 EGCG单药组、曲妥珠单抗单药组及两者联用组对SK-BR-3细胞增殖的影响注：A.EGCG对SK-BR-3细胞增殖的影响；B. 曲妥珠单抗对SK-BR-3细胞增殖的影响；C. 16.67 nmol/L 曲妥珠单抗、16.67 nmol/L IgG 曲妥珠单抗同型对照、15 μmol/L EGCG、16.67 nmol/L曲妥珠单抗与15 μmol/L EGCG联用对SK-BR-3细胞增殖的影响；D. 16.67 nmol/L曲妥珠单抗联合不同浓度EGCG对SK-BR-3细胞增殖的影响，计算联合指数（CI），Fa表示效应值；**P<0.01，***P<0.001，与空白组比较；△△△P<0.001，与IgG组比较；####P<0.0001，与曲妥珠单抗组比较2.5 Western blot法检测EGCG、曲妥珠单抗单用及二者联用对BT474细胞中EGFR、HER2、Akt、MAPK及其磷酸化蛋白表达的影响
图5A-F结果显示，EGCG单药、曲妥珠单抗单药及两者联用组均能显著降低BT474细胞中p-Akt、p-MAPK、p-EGFR的表达。图5G-H结果显示，曲妥珠单抗单药组能显著降低BT474细胞p-HER2的表达，EGCG单药组虽然无显著性差异（P>0.05），但对p-HER2的表达有一定抑制作用。与EGCG和曲妥珠单抗单药组相比，EGCG与曲妥珠单抗联用可进一步显著降低BT474细胞p-Akt、p-MAPK、p-EGFR、p-HER2蛋白的表达。
图 5 EGCG单药组、曲妥珠单抗单药组及两者联用组对BT474细胞中MAPK、Akt、EGFR、HER2及其磷酸化蛋白的表达的影响注：A. p-Akt、Akt的蛋白表达水平；B. p-Akt、Akt的相对蛋白表达量；C. p-MAPK、MAPK的蛋白表达水平；D. p-MAPK、MAPK的相对蛋白表达量；E. p-EGFR、EGFR的蛋白表达水平；F. p-EGFR、EGFR的相对蛋白表达量；G. p-HER2、HER2的蛋白表达水平；H. p-HER2、HER2的相对蛋白表达量；****P<0.0001，与对照组比较；##P<0.01、###P<0.001、 ####P<0.0001，与曲妥珠单抗组比较3. 讨论
ErbB-2(HER-2/neu)是一种分子量为1.85×105的穿膜受体络氨酸激酶，属于表皮生长因子受体家族[14]。该家族由4个紧密相关的络氨酸激酶（TK）受体组成：HER1(EGFR)、HER2、HER3和HER4。HER2主要是通过与家族中的其他成员形成同源或异源二聚体，激活下游的RAS/MAPK和磷脂酰肌醇-3/激酶（PI3K）/ATK信号通路，进而促进细胞增殖、迁移、血管生成以及抑制细胞的凋亡[15-16]。ERK/MAPK通路是参与细胞增殖控制的主要细胞内信号通路之一。 PI3K/ATK信号通路在控制Her-2/neu过表达细胞的生长和转化表型中起重要作用[17-18]。HER2过表达的癌症表现出较强的转移能力和浸润能力，对化疗敏感性差，且易复发。
曲妥珠单抗是一株靶向HER2的人源化单克隆抗体。1998年，被美国食品药品监督管理局（FDA）批准应用于治疗HER2阳性的转移性乳腺癌[19]。曲妥珠单抗可能通过下调HER2受体在细胞膜上的表达，阻断HER2和HER3形成异源二聚体从而抑制下游通路，导致细胞周期阻滞，以及抗体依赖的细胞介导的细胞毒性活性[20]等。虽然曲妥珠单抗单药治疗起到了一定的效果, 但大部分HER2过表达的乳腺癌患者对曲妥珠单抗治疗不产生反应，初次治疗有效率大约在30%, 即使对曲妥珠单抗产生反应的患者也有约50%会在1年内发生耐药。
茶多酚可以抑制多种与细胞增殖和肿瘤进展相关的酶活性。EGCG是茶多酚中的主要成分之一。研究显示，在人A431表皮样癌细胞中，EGCG可能通过阻断EGF与其受体的结合进而抑制EGFR活性[21]。EGCG能抑制结肠癌细胞中EGFR、HER2、HER3的激活，并抑制细胞生长[22]。
为了进一步提高HER2靶向治疗疗效，在本研究中我们探讨了曲妥珠单抗和EGCG在乳腺癌细胞的联合抗肿瘤作用。实验结果发现EGCG与曲妥珠单抗在一定浓度范围内可以协同抑制HER2过表达乳腺癌细胞的生长，提示临床治疗中如果利用EGCG和曲妥珠单抗联合治疗则需重点关注两者各自的剂量。可以先利用乳腺癌荷瘤小鼠模型对不同剂量的EGCG和曲妥珠单抗的联合抗肿瘤作用进行评价，并参考动物体内药效实验的结果进行EGCG和曲妥珠单抗联合用药临床试验的设计，通过临床试验的结果确定临床治疗时最佳的联合用药剂量。
本研究还对EGCG和曲妥珠单抗的联合抗肿瘤作用机制进行了阐明：与EGCG和曲妥珠单抗单药组相比，EGCG与曲妥珠单抗联用可进一步显著降低BT474细胞中p-EGFR、p-HER2和p-Akt、p-MAPK的表达，提示EGCG和曲妥珠单抗联用对HER2过表达乳腺癌细胞的协同增殖抑制活性可能与其显著增强的对Akt和MAPK信号通路的抑制作用有关。本研究为EGCG与曲妥珠单抗的联合应用提供了理论支持，并为HER2过表达乳腺癌的治疗提供新的思路。
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表 1 不同存储时间样品中磺胺嘧啶银的含量变化测定结果(按标示量计算/%)
批号 存储时间（t/w） 0 2 4 6 8 10 12 20191207 94.22 93.40 94.07 85.28 57.86 63.23 52.33 20191208 94.63 94.09 94.10 82.94 60.19 58.25 51.41 20191209 95.47 96.75 95.93 78.74 66.58 53.25 51.89 
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