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癌症对人类是仅次于心血管疾病的第二大“杀手”，严重威胁着人类的生命健康[1]。相关统计表明，2018年，全球新增癌症病例1 810万，死亡病例960万[2-3]。预计到2030年，新增癌症病例和死亡人数将增长约1.5倍，其防治形势十分严峻[4]。目前，治疗恶性肿瘤的方法主要有手术切除、放射疗法、生物治疗以及药物治疗等[5]。其中，药物治疗仍是肿瘤治疗的重要手段。但一半以上的癌症对传统化疗药物已产生明显耐药。临床证据显示，90%以上转移性癌症患者死于不同程度的耐药[6]，肿瘤耐药已成为目前临床化疗失败的首要原因。因此，开发多药耐药的新型抗肿瘤化疗药物已迫在眉睫。
微管蛋白抑制剂一直是抗肿瘤药物研发的热点之一[7]。微管是由α/β微管蛋白组成的异二聚体，是细胞骨架的主要组成部分[8]。微管具有多种生物学功能，能参与细胞增殖、分裂等一系列过程[9-13]，在细胞生命周期中起重要作用，是肿瘤细胞中的重要治疗靶标。紫杉醇、长春碱等微管蛋白抑制剂已广泛用于治疗多种癌症。然而，它们显示出治疗窗窄、选择性差以及多药耐药性问题，通常是由于P糖蛋白[14]或微管相关蛋白的过表达引起的[15]。因此，选择性好的低毒小分子靶向微管蛋白抑制剂仍有很大需求。
查尔酮衍生物是类黄酮中一类重要的化合物，分子结构简单，以1,3-二苯基丙烯酮为基本骨架，具有广泛的生物学活性，如抗肿瘤、抗氧化、抗炎、降血糖、抗菌等[16-19]。吲哚查尔酮是本课题组研究发现的一类新型查尔酮衍生物，相比经典的查尔酮，其抗肿瘤活性显著提高，作用机制研究表明该类化合物作用于β微管蛋白上的秋水仙碱位点[20]，规避了P糖蛋白调控的肿瘤多药耐药机制[21]以及β-Ⅲ型微管蛋白过表达的影响[22]，具有良好的抗肿瘤耐药活性。化合物FC58是本课题组前期合成的查尔酮类衍生物之一，具有非常好的抗肿瘤活性（A549，GI50 = 38 nmol/L）[23]。课题组以此化合物为研究对象，考察其对多种白血病细胞株的生长抑制活性，特别是耐药白血病细胞的活性，并通过细胞周期实验分析其作用特点，现报道如下。
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全自动酶标仪（BioTek，型号：Synergy 2）；流式细胞仪（BD，型号：Accuri C6）；熔点测试仪（上海精科，型号：WRR）；核磁共振仪（Bruker，型号：Ascend 400)；高分辨质谱仪（Waters，型号：UPLC G2-XS Q-TOF）；薄层色谱硅胶板（烟台江友，型号：HSGF254）。实验所用试剂均为分析纯（伊诺凯）。紫杉醇、长春碱、多柔比星（Sigma-Aldrich），纯度>98%。HL60、HL60/DOX、K562、K562/HHT300、CCRF-CEM、CCRF-CEM/VLB100由海军军医大学药学院天然药物化学教研室传代和冻存。
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将1-(3,4,5-三甲氧基苯基)乙-1-酮(1, 0.21 g, 1.0 mmol)与1H-吲哚-3-甲醛(2, 0.07 g, 0.5 mmol)溶于乙醇(4 ml)溶液中，加入哌啶(0.11 ml, 1.2 mmol)，加热至95 ℃搅拌48 h，然后加入盐酸调节pH = 6淬灭反应，用乙酸乙酯萃取，饱和碳酸氢钠溶液、水和饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥、过滤、旋干有机相，剩余粗品经乙醇在−20 ℃重结晶，得到目标化合物FC58 0.017g，重结晶产率：10%，黄色固体，熔点：175.1～176.8 ℃，路线见图1。1H NMR (400MHz, CDCl3) δ : 8.71 (1H, br, NH), 8.13 (1H, d, J = 15.6 Hz, =CH), 8.00 (1H, m, Ar-H), 7.63 (1H, s, Ar-H), 7.55 (1H, d, J = 15.2 Hz, =CH), 7.46 (1H, m, Ar-H), 7.31 (4H, m, Ar-H), 3.96 (9H, s, 3×OCH3)。13C NMR (100MHz, CDCl3) δ : 189.86, 153.10, 138.78, 137.23, 134.44, 130.08, 123.57, 120.54, 117.82, 114.52, 111.99, 105.96, 60.97, 56.40。ESI-MS (m/z) : C20H19NO4 [M+H]+，理论值：338.1387, 实际值：338.1385。
图 1 FC58的合成路线
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样品配制：用适量DMSO（Sigma，C6295）溶解后，配成50 mmol/L的母液备用。取一定量的母液，用完全培养基将其稀释成一定浓度的溶液，作为初浓度。将初浓度溶液用完全培养基3倍稀释，共设置6个浓度梯度。
CellTiter-Blue法测试体外抗肿瘤活性。具体方法简述如下：96孔板每孔加入浓度为(2～4)×104个/ml的细胞悬液200 μl，置37 ℃，5% CO2培养箱内。24 h后，加入配制好的一定浓度梯度的待测物溶液，每孔200 μl，设置3个复孔，空白对照组加入200 μl的含1% DMSO的完全培养基，置于37 ℃，5% CO2的培养箱内48 h。每孔加入含10% CellTiter-Blue（Promega，G8081）的完全培养基，用全自动酶标仪测530/40 nm和590/35 nm处的荧光值(FV)作为背景值。置于37 ℃、5% CO2的培养箱内1～4 h，再用酶标仪在相同条件下读取荧光值。
细胞存活率（%）= 给药孔∆FV/空白对照孔∆FV。
根据各个浓度的细胞存活率值，使用GraphPad Prism 5软件对数据进行拟合可得到量效曲线和抑制细胞生长50%的药物浓度，即GI50。
根据药物对非耐药母代细胞和对耐药细胞的GI50计算药物的耐药指数(DRI)。公式: DRI =GI50(耐药细胞)/GI50(母代细胞)。
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取对数生长的HL60和HL60/DOX细胞，用胰酶消化分散成单细胞悬液，以（5×105个/孔）接种于96孔板中，于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养24 h。加入不同浓度的待测药物继续培养24 h。弃上清液，用0.25% Trypsin-EDTA（Gibco，25200056）消化，1000 r/min离心5 min收集细胞。用1 ml预冷的PBS（Hyclone，SH30256.FS）润洗细胞1次，离心收集细胞。细胞沉淀用9 ml预冷的70%乙醇轻轻混匀，4 ℃固定过夜。次日，离心沉淀细胞后，弃固定液，用1 ml预冷的PBS洗涤细胞2次，再次离心收集细胞。加入1 ml PI（50 μg/ml PI, 0.1 mg/ml RNase A, 0.05 % TritonX-100，碧云天）染液染色，4 ℃下避光孵育30 min，流式细胞仪检测，激发波长为488 nm，用EXPO32 ADC软件进行分析。
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课题组选择多种白血病细胞及其耐药细胞(HL60、HL60/DOX、K562、K562/HHT300、CCRF-CEM、CCRF-CEM/VLB100)对紫杉醇、长春碱、多比柔星以及查尔酮衍生物FC58进行体外抗肿瘤活性测试。结果如表1所示，紫杉醇、长春碱和多柔比星对HL60、K562、CCRF-CEM细胞均有较强活性，GI50在0.12～135.30 nmol/L。而各耐药细胞对上述3种药物明显耐药，GI50在17.16～1398 nmol/L。耐药指数DRI在3.85～684.4。与紫杉醇、长春碱、多柔比星相比，虽然查尔酮衍生物FC58对以上白血病细胞的活性相对较弱，GI50在30.23～44.20 nmol/L，但对耐药白血病细胞具有优异活性，GI50在17.56～51.77 nmol/L，较亲代细胞更为敏感（图2）。DRI分别是0.40、0.90、1.71。其中，CCRF-CEM/VLB100细胞对FC58仅轻微耐药(DRI=1.71)，远低于其他几种化疗药。
表 1 几种化合物的体外抗肿瘤活性的比较（
${\rm{GI}}_{50},\; {\rm{nmol/L}} $ ）细胞系 化合物 紫杉醇 长春碱 多比柔星 FC58 HL60 6.68 2.90 40.27 44.20 HL60/DOX 292.50 89.52 1398 17.56 耐药指数 43.79 30.87 34.72 0.40 K562 12.15 0.12 135.30 31.72 K562/HHT300 98.31 17.16 521.40 28.65 耐药指数 8.09 143 3.85 0.90 CCRF-CEM <1 <1 − 30.23 CCRF-CEM/VLB100 159.3 684.4 − 51.77 耐药指数 >159.3 >684.4 − 1.71 注：“−”表示未检测。 
图 2 FC58对耐药和非耐药白血病细胞的GI50值
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微管蛋白抑制剂可干扰微管蛋白-微管之间的平衡，阻断有丝分裂M期纺锤体的形成，导致有丝分裂停滞于G2/M期，从而诱导细胞凋亡[25]。利用流式细胞技术检测FC58、多柔比星、紫杉醇和长春碱对HL60和HL60/DOX细胞周期的影响，考察其作用机制。
如图3所示，与空白组相比，经1.3倍IC50 FC58处理的组，停滞在G2/M期的细胞明显增多。其作用强于紫杉醇，弱于长春碱。经多柔比星处理的组，停滞在S期和G2/M期的细胞较空白组有一定程度的增多。FC58、紫杉醇和长春碱的耐药细胞组的结果与非耐药细胞组结果基本相同。经FC58处理的组，停滞在G2/M期的细胞明显增多，且作用强于其余药物。多柔比星使细胞周期停滞在S期的耐药细胞明显增多。上述结果提示，FC58的作用靶点为微管蛋白。同时，FC58对细胞周期的影响结果与长春碱较相似，间接证明了FC58和长春碱作用机制相似。这可能是FC58对CCRF-CEM/VLB100细胞轻微耐药的原因。
图 3 FC58、多柔比星、紫杉醇和长春碱作用24 h后对HL60和HL60/DOX细胞周期的影响
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吲哚查尔酮类衍生物FC58对多种白血病细胞均有较强活性，GI50达纳摩尔级。对耐药的白血病细胞同样具有较强的活性，比亲代白血病细胞更为敏感，活性抗耐药指数远强于紫杉醇、长春碱和多柔比星。FC58和其他微管蛋白抑制剂一样都能使细胞周期停滞在G2/M期，间接验证其作用靶点为微管蛋白。FC58作为一个潜在的抗耐药白血病的先导化合物，有必要进一步研究其体内的抗肿瘤活性。
Cytotoxicity study on FC58, an indole-chalcone, against multi-drug resistant leukemia cells
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摘要:
目的 合成吲哚查尔酮衍生物FC58，考察其对白血病细胞的抑制活性。 方法 以3,4,5-三甲氧基苯乙酮和吲哚-3-甲醛为原料，经羟醛缩合得到目标化合物。采用CellTiter-Blue法测试体外抗肿瘤活性，并通过细胞周期实验分析其作用特点。 结果 FC58对多种白血病细胞均有较强活性，活性抗耐药指数远高于传统微管蛋白抑制剂紫杉醇、长春碱和多柔比星，并使细胞周期停滞在G2/M期。 结论 FC58是一个极具潜力的抗耐药白血病的先导化合物。 Abstract:Objective To synthesize and investigate cytotoxicity of an indole-chalcone derivative FC58. Methods The target compound was synthesized through the Aldol condensation with 1-(3,4,5-trimethoxyphenyl)ethan-1-one and 1H-indole-3-carbaldehyde. The Cell Titer-Blue method was used to determine in vitro cytotoxicity. The cell cycle experiment was performed to analyze the action characteristics of FC58. Results FC58 exhibited high cytotoxicity against various leukemia cells and resulted in G2/M phase arrest. It showed stronger drug resistant index than traditional tubulin inhibitors such as paclitaxel, vinblastine and doxorubicin. Conclusion FC58 represents a promising lead compound for multi-drug resistant leukemia. -
Key words:
- indole-chalcone /
- anti-leukemia /
- multi-drug resistance /
- cytotoxicity /
- tubulin
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乳腺癌是多发于女性中的恶性肿瘤性疾病，威胁着广大女性的健康[1-2]。据统计，全球女性癌症中，乳腺癌发病率和致死率均高于肺癌，目前居于首位，2020年约230万人诊断出患有乳腺癌，致死病例约68.5万[3]。先天性因素、膳食、环境、工作、发育成长阶段及雌激素类药物等多种因素都能成为乳腺癌的诱发因素[4-5]。目前，乳腺癌早期诊断普遍使用的是影像学检查（临床乳腺体格检查、超声、乳腺X线摄影、磁共振成像等）[6]以及肿瘤标志物(CEA、CA153、VEGF、TSGF等)临床筛查[7]，前者操作复杂且具有一定的组织伤害性[8]，后者局限于需多项联合检测且特异性不高[7，9]，均难以满足临床需求。尽管手术、化疗技术在不断提高，但是抗肿瘤药物疗效有限，乳腺癌患者预后效果不佳，尤其是晚期复发和转移普遍。因此，寻找乳腺癌细胞早期代谢生物标志物，进行安全灵敏的早期诊断，对于乳腺癌诊疗具有重要意义[10]。
作为继基因组学、转录组学、蛋白质组学的后起之秀，代谢组学以研究不同病理生理或基因突变条件下对机体内源性小分子化合物代谢变化为核心[11]。内源性小分子化合物是基因和蛋白质的下游产物，从分子生物层面实时动态地反映上游基因及外部因素对机体功能的影响[12]。代谢组学采用以高灵敏度、高通量为特征的现代仪器分析技术方法，对机体的内源性小分子化合物进行动态分析[13]。伴随乳腺癌发展，患者机体内与氨基酸、糖类、脂质等代谢有关的小分子代谢物会发生异常变化。利用代谢组学方法，将改变的内源性代谢物作为生物标志物，在此基础上寻找相关代谢途径，合理推测乳腺癌的发病机制，揭示生物标志物与乳腺癌发生发展间的关联，最终帮助乳腺癌的临床诊疗。本文主要综述代谢组学在乳腺癌早期诊断、药理研究与药效评估、疾病进程监测以及预后评估的研究进展。
1. 代谢组学概述
代谢组学以相对分子质量<1000的内源性代谢物为研究对象，研究样本包括血浆、尿液、唾液、脑脊液、细胞以及组织提取液等[14-16]，其中，血液和尿液最为常见[17]，研究思路为收集生物样品、样品分离、检测鉴定、分析数据、建立模型、获取细胞活动终产物信息，整个过程综合分析优势明显。按照研究目的分类，非靶向代谢组学和靶向代谢组学是两种常见策略[18]，前者进行轮廓分析，旨在获得较多的生物体内源性代谢物[12]，后者通过靶向分析，希望获得特定的内源性代谢物[19]。
代谢组学目前主流的仪器分析方法为核磁共振法(NMR)和质谱（MS）联用技术，后者主要包括液相色谱-质谱联用法(LC-MS)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)[20]，以上分析技术各有其特点。NMR可获取大量的物质结构信息，所得样品分析无偏向、无损伤但灵敏度较低[21]。MS通过有损的离子化分析，提供物质分子量及结构信息，灵敏度更高、扫描速度快[22]，常与色谱在线联用以实现分离分析功能。GC-MS灵敏度高但不适用于热稳定性差的样品的分析，LC-MS则克服了GC-MS的劣势，可分析难挥发、热不稳定物质，分离选择性好、效率高，分析时间也随超高液相色谱-质谱联用法（UPLC-MS）的推广得到进一步缩短，因此LC-MS实际应用范围更广[19，23]。近年来质谱成像（MSI）技术发展迅速，随之空间代谢组学作为代谢组学新的补充诞生，解决了传统代谢组学研究代谢物在组织中的空间信息缺失问题[24-26]。
代谢组学的数据分析步骤为数据预处理、数据归一化和数据统计，即通过数据的过滤、补齐、归一化等去除仪器或生物偏差后，利用统计方法处理代谢组数据，其中，统计方法是从高维复杂的数据中提取出有效信息的关键。统计方法按照变量的多少分为单变量统计方法和多变量统计方法。常用的单变量统计方法有t检验、非参数检验、方差分析，主要用于实验-对照类研究中寻找两组间的差异代谢物[27]。多变量分析方法有传统算法和机器算法两类，常用的传统算法有偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）[28]及正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA)、主成分分析（PAC），以上又称为模式识别方法，适用于构建预测模型[29]。机器算法应用日益广泛[30]，目前常用的有随机森林（RF）[31]、支持向量机(SVM)[32]、神经网络(ANNs)[33]等。经以上手段获取具有统计学意义的数据，再与多种生化及代谢的数据库对比，继而对所得物质筛选鉴定，最终寻找到潜在的代谢标志物。
2. 代谢组学在乳腺癌中的应用
2.1 代谢组学在乳腺癌早期诊断中的应用
Catarina等[34]采用核磁共振氢谱（1H-NMR）分析了40位BC患者和38位对照（CTL）健康志愿者尿液代谢谱，采用K-S非参数检验和t检验及OPLS-DA等模式识别方法，发现BC患者肌酸、甘氨酸、丝氨酸、二甲胺、三甲胺N-氧化物、α-羟基异丁酸酯、甘露醇、谷氨酰胺等代谢物表现出高敏感性和特异性，代谢途径分析表明，差异代谢物出现可能与BC患者甘氨酸、谷氨酸、丁酸、糖酵解、TCA循环、牛磺酸和丙酮酸代谢途径遭到破坏有关。获得的差异代谢物具有作为生物标志物的潜力，可将BC患者与CTL区分，应用于早期诊断。
约1/4乳腺癌细胞都是三阴性乳腺癌细胞（TNBC），其特点是易转移浸润且复发率高[16]。Fang等[35]基于早期发现的40种氨基酸目标化合物，使用亲水作用色谱法-串联质谱（HILIC-MS/MS），对TNBC、非TNBC及正常的乳腺上皮细胞36种细胞内和34种细胞外小分子物质进行代谢组学分析。运用Mann–Whitney U检验或Kruskal–Wallis检验及OPLS-DA模式识别方法研究，发现与正常细胞相比，两种乳腺癌细胞氨基酸代谢库均明显扩大；与非TNBC相比，TNBC细胞内谷氨酸、β-丙氨酸、天冬氨酸、谷胱甘肽、N-乙酰丝氨酸和N-乙酰甲硫氨酸代谢明显增加(变化倍数>2，P<0.01, VIP>1)，TNBC对细胞外谷氨酰胺、丝氨酸、β-丙氨酸和赖氨酸摄取显著增加，对谷氨酸和L-半胱氨酸-谷胱甘肽排泄升高(P<0.01，VIP>1)。研究结果表明，TNBC细胞具有独特的氨基酸代谢特征，对其量化分析可为TNBC患者提供更多新的早期治疗目标靶点。
Daniele等[36]使用液相色谱-四级杆飞行时间质谱(LC-Q-TOF/MS），对23名BC患者和35名口腔健康妇女唾液进行非靶向代谢组学分析，使用t检验、卡方检验等单因素统计方法，对比METLIN数据库，鉴定出乳腺癌组中有31种化合物上调（P<0.05），其中，患者与健康人群相比，发现7种寡肽（H-Arg-Arg-Ser-OH，H-His-Lys-(Ala-Ser)-OH or (Gly-Thr)-OH，H-Ala-Lys-Phe-Trp-OH or H-Gly-Lys-Thr-Ser-OH or H-Arg-Arg-Ser-Ser-OH，H-Phe-Ile-Gln-Arg-OH，H-Glu-Phe-Gln-Arg-OH or H-Ile-Lys-Gln-Trp-OH，H-Phe-Lys-Lys-Trp-OH or H-Phe-Gln-Arg-Tyr-OH，H-Phe-Phe-Gln-Trp-OH）和6种甘油磷脂（PG14∶2、PA32∶1、PS28∶0、PS40∶6、PI31∶1、PI38∶7）表达上调，表现出明显的代谢差异，说明唾液代谢物有望区分乳腺癌患者和健康人群，适用于早期诊断。
依据不同亚型乳腺癌患者的代谢物差异性可以用于乳腺癌诊断甚至个性化治疗。Leticia等[37]采集了4种常见LA型、LB型、HER2+型和TN型乳腺癌患者和健康对照组的血浆样本，利用非靶向超高液相色谱-高分辨质谱（HPLC-HRMS）代谢组学方法进行分析，通过单变量非参数Wilcoxon秩和检验区分乳腺癌患者和健康受试者的数据差异，多变量PAC和PLS-DA评价统计模型质量，初步确定了4种乳腺癌分子亚型中变化显著的代谢物：LA，TN和HER2分子亚型患者血浆中L-色氨酸浓度显著降低，可能与L-色氨酸代谢激活芳烃受体帮助癌细胞免疫逃逸有关[38]；4种亚型乳腺癌患者磷酸乙醇胺、磷脂血浆浓度降低，提示乳腺癌中脂质代谢差异具有重要意义。上述代谢组学数据表明，色氨酸和部分脂质具有作为乳腺癌诊断的生物标志物潜力，有望推动乳腺癌患者血浆诊断和个性化治疗的发展。
基于以上研究，笔者对代谢组学在乳腺癌早期诊断中发现部分特征代谢物的应用进行归纳总结，见表1。
表 1 代谢组学在乳腺癌早期诊断中发现的特征代谢物作者 样本来源 技术方法 统计学方法 特征代谢物 Catarina等 尿液 1H-NMR K-S非参数检验和t检验与PAC,PLS-DA和OPLS-DA 肌酸、甘氨酸、丝氨酸、二甲胺、三甲胺N-氧化物、
α-羟基异丁酸酯、甘露醇、谷氨酰胺等Fang等 TNBC、非TNBC及正常的乳腺上皮细胞 HILIC-MS/MS Mann-Whitney U检验或Kruskal-Wallis检验与OPLS-DA 胞内：谷氨酸、β-丙氨酸、天冬氨酸、谷胱甘肽、
N-乙酰丝氨酸、N-乙酰甲硫氨酸
胞外：谷氨酰胺、丝氨酸、β-丙氨酸、赖氨酸谷氨酸、
L-半胱氨酸-谷胱甘肽Daniele等 唾液 UPLC-Q-TOF-MS t检验、卡方检验等 7种寡肽和6种甘油磷脂 Leticia等 血浆 HPLC-HRMS 非参数Wilcoxon秩和检验、PAC、PLS-DA 色氨酸、磷酸乙醇胺、磷脂 综上所述，基于代谢组学，针对不同乳腺癌患者所能提供的研究样品，采用合适的仪器、数据分析方法获取差异显著的内源性小分子代谢物信息，有效减小检查手段对乳腺癌患者造成的机体损伤，并丰富乳腺癌早期诊断方法，使代谢组学成为乳腺癌早期诊断的有力辅助工具。
2.2 代谢组学在乳腺癌药理研究和药效评价中的应用
癌细胞无限增殖需要大量的能量和物质基础。癌细胞具有特殊的代谢方式，即在有氧条件下倾向于糖酵解而不是三羧酸循环来产生能量[39]，这种新陈代谢重编程称为Warburg效应[40]。一方面，糖酵解中间产物可以合成肿瘤细胞生长所需蛋白质和脂质等生物大分子[41]，同时线粒体损伤可限制丙酮酸进入，使更多丙酮酸在胞质内通过无氧氧化释放能量[42]。另一方面，癌细胞可持续摄取营养物质[43]以及通过加强糖异生途径弥补Warburg效应缺陷。基于癌细胞特殊的代谢重编程，通过药物代谢组学分析，监测机体用药后内源小分子代谢物变化有利于乳腺癌药理研究和药效评估。
Ghanem等[44]对经抗坏血酸处理的管腔和基底样乳腺癌细胞，进行了代谢组学分析，结合细胞存活率数据，发现高剂量抗坏血酸使得乳腺癌细胞糖酵解过程中磷酸丙糖途径（PPP）被严重破坏，ATP水平下降，代谢物重新定向积累为脂质小滴，以及磷酸戊糖途径中代谢物和酶活性增加；细胞死亡依赖于抗坏血酸诱导的氧化应激和ROS积累、DNA损伤以及细胞内辅助因子(包括NAD+/NADH)耗竭效应。综上表明，高剂量抗坏血酸通过诱发乳腺癌细胞“氧化还原危机和能量灾难”发挥细胞毒作用。
Arminan等[45]通过NMR技术检测及主成分分析方法分析处理数据，以评估在N-（2-羟丙基）甲基丙烯酰胺-阿霉素共聚物（HPMA-Dox）影响下体外细胞培养模型和体内原位乳腺癌模型的精准抗癌效果，并结合蛋白质表达和流式细胞技术，研究了给药前后原位乳腺癌患者内源性小分子化合物相关生化改变，发现与游离Dox给药相比，用HPMA-Dox进行治疗后，乳腺癌细胞凋亡增加，糖酵解减弱，磷脂水平降低，且HPMA-Dox在体内模型的血液循环时间增加，同时肿瘤储积高、心脏储积低，说明HPMA-Dox药代动力学加强、组织分布得以优化。提示HPMA-Dox可作为一种更精确的抗癌药物模式用于乳腺癌临床治疗。
Panis等[14]将120名单侧乳腺浸润性癌患者随机分为未经化疗组(CA组，n=50)、单剂量短期紫杉醇静脉滴注组(PTX组，n=30)、心脏剖面健康组(CTR组，n=40)，采用LC-MS对其血浆样品进行分析后发现，与CA组乳腺癌患者相比，单剂量短期紫杉醇静脉滴注可使患者血浆高密度脂蛋白水平显著降低，过氧化氢水平升高；与CTR组相比，PTX组患者C反应蛋白和肌酸激酶分数明显升高。以上表明单剂量短期紫杉醇静脉滴注就足以引起脂质代谢显著改变，可能导致毒性累积效应，进一步增加乳腺癌患者心脏病发生风险。可见，代谢组学可参与化疗药物给药优化方案研究，提高药物抗癌效果。
左旋肉碱、酰基肉碱和相关酶是癌症代谢网络中的重要介质。以往研究中LC-MS对乳腺癌中左旋肉碱、酰基肉碱的研究都是均质组织分析，缺乏异质性癌症组织中肉碱的空间分布差异[46]。Sun等[47]利用MSI对异种移植小鼠模型和人类癌组织样本及正常组织中的17种肉碱进行成像并开发了高空间分辨率基质辅助激光解吸电离-质谱成像（MALDI-MSI）方法，发现由170个癌症样本和128个正常样本组成的肉碱谱模型能准确区分乳腺癌，L-肉碱和短链酰基肉碱在人类乳腺癌和异种移植小鼠模型中都有显著改变，乳腺癌中由肉碱系统介导的β氧化代谢途径改变，并且首次发现代谢酶CPT2和CRAT在乳腺癌组织中差异表达。证明肉碱代谢在乳腺癌的代谢物和酶水平上都被重新编程。
2.3 代谢组学在乳腺癌疾病进程监测及预后评估中的应用
心理神经病症(PN)是指许多乳腺癌患者在化疗期间及化疗之后出现疼痛、疲劳和抑郁症状。Debra等[48]使用液相色谱高分辨率质谱法对19位早期乳腺癌女性化疗前后血清样本分别进行非靶向和靶向代谢组学分析，非靶向分析发现化疗后乳腺癌患者乙酰-L-丙氨酸和硫酸吲哚酚浓度升高，5-氧代-L-脯氨酸浓度降低；色氨酸途径靶向分析表明尿氨酸水平、犬尿氨酸/色氨酸水平升高。t检验和Pearson相关系数进一步揭示上述差异代谢物与PN症状显著相关，促进了早期乳腺癌女性PN症状发展程度生物学机制研究。
研究表明，患者他莫昔芬体内代谢物因多昔芬浓度与雌激素受体α(ERα)阳性乳腺癌复发有关[49]，同时他莫昔芬本身和其他代谢物也表现出抗雌激素抗肿瘤活性[50]。Vries等[50]用细胞增殖法测定他莫昔芬、(Z)-因多昔芬、(Z)-4-羟基他莫昔芬、N-去甲基他莫昔芬抗刺激素活性，建立抗雌激素活性评分模型(AAS)，采用Cox回归方法研究AAS与复发的关系，证明因多昔芬浓度可作为他莫昔芬和代谢物抗雌激素作用的代替，与乳腺癌复发显著相关。
Kamil等[51]用LC-MS/MS对小鼠原位接种4T1转移性乳腺癌细胞进行血浆代谢组学分析和脂质组学分析，建立PLS-DA模型。结果显示，荷癌小鼠癌细胞早期转移表现为L-精氨酸代谢减弱，精氨酸酶和多胺合成增强；晚期转移表现为精氨酸代谢途径改变，不对称二甲基精氨酸血浆浓度升高，能量代谢重新编程为糖酵解，戊糖磷酸途径加速以及三羧酸循环速率降低，脂质分布模式改变，包括总磷脂酰胆碱减少，与二酯结合的磷脂分数减少以及溶血磷脂增加，以上代谢变化在一定程度上表征了癌症转移进展。
目前，OncotypeDX 21基因表达检测技术常用来评估乳腺癌的复发以指导乳腺癌治疗，但在临床的不确定性和基因组不一致的情况下，许多早期乳腺癌的患者仍然会受到过度治疗[52-54]。McCartney等[55]利用1H-NMR分析了87例内分泌受体阳性、HER2阴性早期乳腺癌（eBC）患者血清，使用RF建立eBC患者复发风险的统计模型。最终根据代谢组学特征进一步细分复发风险，并有效区分了每个Oncotype风险分类：在7例复发中代谢组学分析准确预测了其中的6例，1例复发发生在低风险组，3例发生在中风险组，3例发生在高风险组，成功建立了一种通过血清代谢组学分析进一步完善OncotypeDX基因检测风险评分的方法。
3. 总结与展望
乳腺癌在全球发病率日益上升，长期困扰广大女性健康，成为全球医疗卫生领域研究焦点[56]。目前，乳腺癌的早期诊断、药物开发应用以及预后测评等方面还需攻克众多难关，迫切需要新的研究技术的支持。代谢组学以高通量、高灵敏度为特征的技术在乳腺癌领域应用日趋广泛，为乳腺癌潜在代谢标志物的筛选，药物靶点发现、药物潜在作用机制等提供新思路[11]。与其他研究方法相比，代谢组学具有无创取样、研究对象相对简单、检测工作量较小、可实现实时监测、全面综合分析等明显优势。同时，代谢组学作为一门新兴组学，虽然已取得部分进展，但本身发展仍处于探索阶段，应用于临床实践还有所不足：代谢组学研究具有数据维度高的特点，采集与处理过程中可能存在信息丢失、低含量差异代谢物可能被掩盖的问题；数据库不够完善，目前大量未知代谢物的结构鉴定和细胞功能研究困难，对已鉴定出产物的变化机制研究大多仍不明确难以直接指导临床；联用技术操作和数据分析处理的综合性专业人才储备不足等。在精准医疗浪潮推动下，进一步完善代谢组学研究的标准化流程后，利用代谢组学与基因组学、转录组学、蛋白组学以及微生物菌群学[57]对乳腺癌进行多学科技术互补、大数据综合分析，将有利于乳腺癌的早期诊断、发病机制研究以及疾病预后相关诊疗方案的系统优化，为乳腺癌个性化靶向治疗提供更合理的科学指导。
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表 1 几种化合物的体外抗肿瘤活性的比较（
${\rm{GI}}_{50},\; {\rm{nmol/L}} $ ）细胞系 化合物 紫杉醇 长春碱 多比柔星 FC58 HL60 6.68 2.90 40.27 44.20 HL60/DOX 292.50 89.52 1398 17.56 耐药指数 43.79 30.87 34.72 0.40 K562 12.15 0.12 135.30 31.72 K562/HHT300 98.31 17.16 521.40 28.65 耐药指数 8.09 143 3.85 0.90 CCRF-CEM <1 <1 − 30.23 CCRF-CEM/VLB100 159.3 684.4 − 51.77 耐药指数 >159.3 >684.4 − 1.71 注：“−”表示未检测。 
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[1] FERLAY J, SOERJOMATARAM I, DIKSHIT R, et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012[J]. Int J Cancer,2015,136(5):E359-E386. doi: 10.1002/ijc.29210 [2] BRAY F, FERLAY J, SOERJOMATARAM I, et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J]. CA: A Cancer J Clin,2018,68(6):394-424. doi: 10.3322/caac.21492 [3] FERLAY J, COLOMBET M, SOERJOMATARAM I, et al. Estimating the global cancer incidence and mortality in 2018: GLOBOCAN sources and methods[J]. Int J Cancer,2019,144(8):1941-1953. doi: 10.1002/ijc.31937 [4] SIEGEL R L, MILLER K D, JEMAL A. Cancer statistics, 2016[J]. CA: A Cancer J Clin,2016,66(1):7-30. doi: 10.3322/caac.21332 [5] ALY H A. Cancer therapy and vaccination[J]. J Immunol Methods,2012,382(1-2):1-23. doi: 10.1016/j.jim.2012.05.014 [6] LONGLEY D B, ALLEN W L, JOHNSTON P G. Drug resistance, predictive markers and pharmacogenomics in colorectal cancer[J]. Biochim Biophys Acta,2006,1766(2):184-196. [7] TEICHER B A. Newer cytotoxic agents: attacking cancer broadly[J]. Clin Cancer Res,2008,14(6):1610-1617. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-07-2249 [8] 刁磊, 刘明一, 鲍岚. 微管蛋白亚型及其功能[J]. 中国细胞生物学学报, 2019, 41(3):322-332. [9] NOGALES E. Structural insights into microtubule function[J]. Annu Rev Biochem,2000,69:277-302. doi: 10.1146/annurev.biochem.69.1.277 [10] WITTMANN T, HYMAN A, DESAI A. The spindle: a dynamic assembly of microtubules and motors[J]. Nat Cell Biol,2001,3(1):E28-E34. doi: 10.1038/35050669 [11] NEWTON C N, WAGENBACH M, OVECHKINA Y, et al. MCAK, a Kin I kinesin, increases the catastrophe frequency of steady-state HeLa cell microtubules in an ATP-dependent manner in vitro[J]. FEBS Lett,2004,572(1-3):80-84. doi: 10.1016/j.febslet.2004.06.093 [12] SOBIERAJSKA K, GŁOS J, DĄBOROWSKA J, et al. Visualization of the interaction between Gβγ and tubulin during light-induced cell elongation of Blepharisma japonicum[J]. Photochem Photobiol Sci,2010,9(8):1101. doi: 10.1039/c0pp00031k [13] PORTRAN D, ZOCCOLER M, GAILLARD J, et al. MAP65/Ase1 promote microtubule flexibility[J]. Mol Biol Cell,2013,24(12):1964-1973. doi: 10.1091/mbc.e13-03-0141 [14] KAVALLARIS M, ANNEREAU J P, BARRET J M. Potential mechanisms of resistance to microtubule inhibitors[J]. Semin Oncol,2008,35(3 suppl 3):S22-S27. [15] KAVALLARIS M. Microtubules and resistance to tubulin-binding agents[J]. Nat Rev Cancer,2010,10(3):194-204. doi: 10.1038/nrc2803 [16] SINGH P, ANAND A, KUMAR V. Recent developments in biological activities of chalcones: a mini review[J]. Eur J Med Chem,2014,85:758-777. doi: 10.1016/j.ejmech.2014.08.033 [17] BATOVSKA D I, TODOROVA I T. Trends in utilization of the pharmacological potential of chalcones[J]. Curr Clin Pharmacol,2010,5(1):1-29. doi: 10.2174/157488410790410579 [18] SAHU N K, BALBHADRA S S, CHOUDHARY J, et al. Exploring pharmacological significance of chalcone scaffold: a review[J]. Curr Med Chem,2012,19(2):209-225. doi: 10.2174/092986712803414132 [19] ZHUANG C L, ZHANG W, SHENG C Q, et al. Chalcone: a privileged structure in medicinal chemistry[J]. Chem Rev,2017,117(12):7762-7810. doi: 10.1021/acs.chemrev.7b00020 [20] ZHOU B, YU X, ZHUANG C, et al. Unambiguous identification of β-tubulin as the direct cellular target responsible for the cytotoxicity of chalcone by photoaffinity labeling[J]. ChemMedChem,2016,11(13):1436-1445. doi: 10.1002/cmdc.201600150 [21] HU T, LI Z, GAO C Y, et al. Mechanisms of drug resistance in colon cancer and its therapeutic strategies[J]. World J Gastroenterol,2016,22(30):6876-6889. doi: 10.3748/wjg.v22.i30.6876 [22] GAN P P, MCCARROLL J A, PO'UHA S T, et al. Microtubule dynamics, mitotic arrest, and apoptosis: drug-induced differential effects of betaIII-tubulin[J]. Mol Cancer Ther,2010,9(5):1339-1348. doi: 10.1158/1535-7163.MCT-09-0679 [23] CONG H, ZHAO X, CASTLE B T, et al. An indole-chalcone inhibits multidrug-resistant cancer cell growth by targeting microtubules[J]. Mol Pharm,2018,15(9):3892-3900. doi: 10.1021/acs.molpharmaceut.8b00359 [24] LI J, WU Y, GUO Z, et al. Discovery of 1-arylpyrrolidone derivatives as potent p53-MDM2 inhibitors based on molecule fusing strategy[J]. Bioorg Med Chem Lett,2014,24(12):2648-2650. doi: 10.1016/j.bmcl.2014.04.063 [25] NEGI A S, GAUTAM Y, ALAM S, et al. Natural antitubulin agents: Importance of 3,4,5-trimethoxyphenyl fragment[J]. Bioorg Med Chem,2015,23(3):373-389. doi: 10.1016/j.bmc.2014.12.027 -
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