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真菌性皮肤病，是指由病原菌真菌所引起的一大类感染性皮肤疾病[1]，其中，浅部真菌感染性皮肤病中，足癣最为常见且发病率最高，而趾间糜烂型和水疱型为最主要的发病类型[2]，患者抓痒造成皮损继发细菌感染，此时感染已不仅仅累及皮肤角质层，而是进入真皮层，甚至透过皮下组织，危害深层组织，甚至导致出现发热等全身症状。驻闽部队官兵长期穿着不透气的作战靴、胶鞋，皮肤真菌感染率普遍较高，且部队官兵训练任务重、居住环境艰苦，往往因诊疗不及时等原因，容易出现继发感染[3-4]。复方特比萘芬是在课题组前期研制的复方酮康唑软膏基础上，选择抗真菌药盐酸特比萘芬和糖皮质激素药糠酸莫米松，联合适宜的抗菌药物莫匹罗星，作为处方的主药[5]。解决了酮康唑不稳定、易变色的问题，既可利用协同作用增强治疗效果，又方便应用，提高了患者使用的依从性，改善了市售产品的有效性和安全性，具有较高的军事利用价值。本实验主要研究在制剂过程考虑加入渗透促进剂，增加药物透皮吸收速率和浓度，达到根治此类疾病、杜绝反复发作的目的。
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DV215CD型电子天平（奥豪斯仪器上海有限公司）；安捷伦1200型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；KQ-600DE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），YSEI型综合药品稳定性实验箱（重庆市永生实验仪器厂），DF-101B集热式恒温加热磁力搅拌器（郑州长城科工贸易有限公司）。
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盐酸特比萘芬对照品（批号：100563-201402，含量99.8%）、莫匹罗星对照品（批号：130568-200501，含量94.2%）、糠酸莫米松对照品（批号：100930-201201，含量99.9%）均购自中国食品药品检定研究院，盐酸特比萘芬原料药（批号：20150405)、莫匹罗星原料药（批号：20150301）均购自武汉鑫佳灵生物科技有限公司，糠酸莫米松原料药（批号：20150228，浙江仙琚制药股份有限公司），聚乙二醇400、聚乙二醇3350（中国医药对外贸易公司），甲醇为色谱纯，水为超纯水；氮酮（广州化学试剂厂），1,2-丙二醇（国药集团化学试剂有限公司），其余所用试剂均为分析纯。
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SPF级SD大鼠，雄性，体重（170～230）g，实验动物合格证号：SCXK沪（2017-0001），购自上海斯莱克实验动物有限公司，于联勤保障部队第九〇〇医院比较医学科实验动物房适应7 d后开始实验。
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色谱柱为ZORBAX SB-C8柱（250 mm×4.6 mm，5 µm），流动相为甲醇-0.1%磷酸溶液（70∶30），检测波长248 nm，流速1.0 ml/min，柱温30 ℃，进样量10 µl。
经专属性考察发现，盐酸特比萘芬、莫匹罗星、糠酸莫米松分离度良好，所用辅料均不会对药物的测定产生干扰。以药物峰面积A为纵坐标，药物浓度C为横坐标作线性回归曲线。实验结果表明，盐酸特比萘芬线性回归方程为：A=1.763×10C+36.63，r=0.999 7，在20～200 µg/ml浓度范围内线性关系良好；莫匹罗星线性回归方程为：A=2.307C+6.777，r=0.999 8，在40～400 µg/ml浓度范围内线性关系良好；糠酸莫米松线性回归方程为：A=2.854×10C+1.763，r=0.999 8，在2～20 µg/ml浓度范围内线性关系良好。对日内、日间精密度及方法的重复性进行考察，其RSD值均小于1%；低、中、高3个水平浓度的平均回收率在98%～101%范围内，且RSD值小于1%；供试品溶液在24 h内稳定，且RSD值小于1%。以上数据表明，实验精密度、重复性、回收率、稳定性均符合要求。
制备复方特比萘酚软膏3批，每批3份，测定药物含量。实验结果表明，供试品中的3种主药莫匹罗星、糠酸莫米松和盐酸特比萘芬的含量均为标示量的90.0%～110.0%，符合规定。
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试验装置为立式Franz扩散池[6-9]，药物透皮扩散试验仪，透皮有效扩散面积是3.14 cm2，接受室体积为7.8 ml。
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断颈处死SD大鼠后，用电剪刀剪除腹部的鼠毛，硫化钠溶液去除绒毛，取腹部处皮肤，将皮下脂肪与筋膜剥离，用0.9%的氯化钠注射液清洗干净后，放于冰箱4 ℃保存，备用。
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通常体外经皮渗透试验的接受液选择0.9%氯化钠注射液，但是由于复方特比萘芬软膏中3种主药在水中的溶解度不佳，为了保持其漏槽条件，考察3种主药在不同比例的聚乙二醇400-生理盐水混合液中的溶解情况。实验结果表明，3种主药在60%聚乙二醇400-40%生理盐水中都可以保持漏槽条件并达到最大溶解度，因此，实验的接受液选择60%聚乙二醇400-40%生理盐水。
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将“2.2.2”项下经过处理的大鼠皮在水平扩散池的两个半池之间固定，加接收液7.8 ml于接受池中，扩散池在(32±1)℃的水浴中预平衡1 h后，分别加入0.5 g不同浓度和种类促进渗透剂的复方特比萘芬软膏于供体池中，于0.5、1、2、4、6、8、24 h分别取样2 ml，过0.22 µm微孔滤膜后注入HPLC仪分析测定。同时，在受体池中补加等量空白接收液。以累积渗透量为指标筛选最适宜的透皮促进剂及其用量。
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累积渗透量的计算公式：
$$ {Q_{\rm{n}}} = \frac{{{C_{\rm{n}}} \times {V_0} + \sum\limits_{i = 1}^{n - 1} {{C_{\rm{i}}} \times V} }}{A} $$ 式中，Cn是在第n个取样点时所测得的药物浓度；V0是接受室的体积；Ci是在第i个取样点时所测得的药物浓度；V是取样体积；A是渗透面积（cm2）。
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取未加渗透促进剂的复方特比萘芬软膏进行体外经皮渗透性试验，计算累积渗透量。实验结果表明，不加渗透促进剂时，复方特比萘芬软膏中盐酸特比萘芬24 h的累积渗透量为8.64 µg/cm2，莫匹罗星24 h的累积渗透量为9.12 µg/cm2，而糠酸莫米松无渗透。
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在复方特比萘芬软膏中分别加入1%、3%、5%氮酮，进行体外经皮渗透性试验。以累积渗透量为纵坐标，渗透时间为横坐标，绘制累积渗透曲线。实验结果表明，以氮酮为渗透促进剂时，不同浓度氮酮对盐酸特比萘芬作用大小为3%>1%>5%，不同浓度氮酮对莫匹罗星作用大小为3%>1%>5%，不同浓度氮酮对糠酸莫米松无渗透作用。结果见表1、表2和图1、图2。
表 1 盐酸特比萘芬在不同浓度氮酮作用下的累积渗透量(µg/cm2)
渗透时间(t/h) 氮酮溶液（%） 1 3 5 0.5 0 0 0 1 0 0 0 2 0 0 0 4 3.42 4.72 1.11 6 7.97 9.19 3.25 8 14.19 15.64 5.47 24 18.50 23.65 7.17 表 2 莫匹罗星在不同浓度氮酮作用下的累积渗透量(µg/cm2)
渗透时间(t/h) 氮酮溶液（%） 1 3 5 0.5 0 0 0 1 0 0 0 2 0 0 0 4 0 0 0 6 0 0 0 8 10.38 18.22 7.01 24 31.67 37.29 19.08 
图 1 盐酸特比萘芬在不同浓度氮酮作用下的累积渗透曲线
图 2 莫匹罗星在不同浓度氮酮作用下的累积渗透曲线
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在复方特比萘芬软膏中分别加入5%、10%、15%丙二醇，进行体外经皮渗透性试验。以渗透时间为横坐标，累积渗透量为纵坐标，绘制累积渗透曲线。实验结果表明，10%丙二醇对复方特比萘芬软膏的促渗作用明显大于15%丙二醇，且10%丙二醇渗透量又大于3%氮酮，故本实验选择10%丙二醇作为渗透促进剂。结果见表3～5和图3～5。
表 3 盐酸特比萘芬在不同浓度丙二醇作用下的累积渗透量(µg/cm2)
渗透时间(t/h) 丙二醇溶液（%） 5 10 15 0.5 0 0 0 1 0 0 0 2 0 0 0 4 1.69 3.84 1.30 6 4.69 12.57 3.63 8 8.37 21.58 6.71 24 9.67 31.05 9.76 表 4 莫匹罗星在不同浓度丙二醇作用下的累积渗透量(µg/cm2)
渗透时间(t/h) 丙二醇溶液（%） 5 10 15 0.5 0 0 0 1 0 0 0 2 0 0 0 4 3.04 4.63 5.84 6 5.92 10.29 11.57 8 11.18 15.58 19.03 24 22.44 31.41 31.73 表 5 糠酸莫米松在不同浓度丙二醇作用下的累积渗透量(µg/cm2)
渗透时间(t/h) 丙二醇溶液（%） 5 10 15 0.5 0 0 0 1 0 0 0 2 0 0 0 4 0 0 0 6 0 3.59 4.15 8 0 5.35 6.24 24 4.02 9.73 10.64 
图 3 盐酸特比萘芬在不同浓度丙二醇作用下的累积渗透曲线
图 4 莫匹罗星在不同浓度丙二醇作用下的累积渗透曲线
图 5 糠酸莫米松在不同浓度丙二醇作用下的累积渗透曲线
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渗透促进剂能够提高或加速药物透过皮肤且对皮肤没有损伤和刺激。渗透促进剂有很多种，包括二甲亚砜及其类似物、醇类化合物、氮酮类化合物、表面活性剂等，其中，氮酮与丙二醇最为常用。丙二醇为无色黏稠液体，近乎无味，毒性和刺激性都非常小。氮酮为无色澄明的液体，无刺激性且副作用小，润滑效果好，理化性质稳定，作为新型渗透促进剂近几年来应用广泛[10-11]。
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促渗剂的选择实验结果显示，以氮酮和丙二醇为渗透剂的累积渗透量均明显高于无渗透促进剂者。作为研究治疗浅部真菌皮肤病合并细菌感染的外用制剂，治疗时要求药物不仅作用于角质层，还需穿透皮肤，提高药物在皮肤中的溶解度，因此有必要在处方中加入渗透促进剂，达到治标又治本的目的。
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以丙二醇为渗透促进剂的实验结果表明，虽然15%丙二醇对莫匹罗星和糠酸莫米松的促渗作用最大，但与10%丙二醇相比，累积渗透量相差不大，而在对盐酸特比萘芬的促渗作用中，10%丙二醇明显优于15%丙二醇。
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以氮酮为渗透促进剂的实验表明，3%氮酮对复方特比萘芬软膏促渗作用最好，但对糠酸莫米松无渗透作用，氮酮未能增加糠酸莫米松透皮量和透皮速度，是否糠酸莫米松仍滞留在皮肤层中或皮肤表面，在今后实验中拟通过皮肤滞留量实验，进一步分析可能原因。对比氮酮和丙二醇的促渗效果，10%丙二醇优于3%氮酮，因此，研究以累积渗透量为指标选择10%丙二醇作为渗透促进剂加入处方。
综上所述，本实验采用60%聚乙二醇400-40%生理盐水为接受液，10%丙二醇作为渗透促进剂加入处方中，大大提高了药物在皮肤中的溶解度。本研究结果为临床治疗浅部真菌皮肤病并申报一种安全有效的院内制剂特比萘酚软膏提供了实验数据，在为部队官兵提供更优质便捷的临床服务方面具有重要的军事意义。
Penetration enhancer for pharmacy prepared compound terbinafine ointment
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摘要:
目的 筛选并确定自制复方特比萘酚软膏中的渗透促进剂。 方法 采用体外经皮渗透试验，使用立式Franz扩散池，接收液为60%聚乙二醇400-40%生理盐水，渗透膜为SD大鼠腹部皮肤，筛选最适渗透促进剂。 结果 10%丙二醇对复方特比萘芬软膏的促渗作用明显大于15%丙二醇，对比氮酮和丙二醇的促渗效果，10%丙二醇优于3%氮酮。 结论 本研究通过对丙二醇和氮酮进行分析比较和筛选，最终选择10%丙二醇作为自制复方特比萘酚软膏渗透促进剂，大大提高了药物在皮肤中的溶解度。 Abstract:Objective To screen and identify the penetration enhancer in pharmacy prepared compound terbinafine ointment. Methods In vitro percutaneous penetration test was conducted with vertical Franz diffusion pool. The SD rat's abdomen skin was used for permeable membrane and 60% polyethylene glycol 400-40% saline for receiving liquid to analyze different osmotic promoters. Results The permeability of compound terbinafine ointment was significantly higher with 10% propylene glycol than 15% propylene glycol. The compound terbinafine ointment with 10% propylene glycol was also better than 3% azone in permeability. Conclusion 10% propylene glycol was selected to be the penetration promoter for pharmacy prepared compound terbinafine ointment, which improved the solubility of the drug in the skin. -
Key words:
- compound terbinafine ointment /
- penetration enhancer /
- propylene glycol
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超多孔水凝胶（SPF）是一种三维结构的亲水性高分子聚合网格，在水中能够溶胀但不溶解，且因其具有良好的生物相容及生物可降解性，被广泛应用于医学、药学等领域。与传统水凝胶相比，超多孔水凝胶通过致孔剂、模板等方法调整孔隙率，从而改变溶胀速率以及释药速率[1-3]。胰岛素等生物大分子类药物不仅体内稳定性差、易被酶解、生物半衰期短、不易透过生理屏障，故现有给药方式多以注射为主，患者依从性差[4]。有研究显示[5]，超多孔水凝胶承载胰岛素灌胃后可以显著降低大鼠血糖：给药2 h后血糖显著下降，4～6 h降至最低，但12 h即回至最初血糖的80%，说明该制剂起效快但持续时间短，血糖波动大，需频繁给药，患者依从性差。上述情况，结合胃肠道对胰岛素的灭活等原因，本实验拟合成具有缓释作用的聚（丙烯酸-丙烯酰胺）/O-羧甲基壳聚糖[P(AA-co-AM)/O-CMC]互穿网络聚合物超多孔水凝胶（SPH-IPN），以期通过皮下给药包载胰岛素的SPH-IPN后，实现长效、减小血糖波动的目的。
1. 材料与仪器
1.1 材料与试剂
丙烯酰胺（AM）、丙烯酸（AA）、N,N′-亚甲基-双丙烯酸胺（Bis）、过硫酸铵（APS）、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺（TEMED）均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；泊洛沙姆127（PF127，北京化工厂）；O-羧甲基壳聚糖（O-CMC，大连美仑生物技术有限公司）；戊二醛（GA，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；姜黄素（宝鸡国康生物科技有限公司）；牛胰岛素（上海源叶生物有限公司）；十二烷基硫酸钠（SDS）、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）、碳酸氢钠、盐酸、乙醇、甲醇、乙酸乙酯、氢氧化钠均为分析纯，实验用水为去离子水。
1.2 仪器
85-2型恒温磁力搅拌器（上海司乐仪器有限公司）；恒温水浴锅（余姚市东方电工仪器厂）；透析袋（Viskase，美国）；Nicolet iS50傅里叶变换红外光谱仪（Thermo，美国）；AVANCE III 400核磁共振谱仪（Bruker，德国）；FE28型pH计（Mettler Toledo，美国）；Waters UPLC：二元溶剂管理系统、在线脱气机、自动进样器、PDA检测器（Waters公司，美国）；TTL-DC型多功能氮吹仪（北京同泰联科技发展有限公司）；SHA-B双功能恒温水浴振荡器（常州金坛良友仪器有限公司）。
1.3 实验动物
雄性SD大鼠，体重范围（220±20）g，合格证号：SCXK（京）2017-0002，购自北京斯贝福实验动物科技有限公司，饲养于北京中医药大学动物房。
2. 方法与结果
2.1 超多孔水凝胶（SPH-IPN）的制备[5]
依次向西林瓶中加入50% AM和AA溶液，以10 mol/L NaOH调节pH至5.0。随后再加入2.5% Bis溶液、10% PF 127溶液、20%APS溶液和50 μl 16.7% TEMED溶液，磁力搅拌混匀。室温放置15 min后，逐滴加入 6% O-CMC溶液，使溶液中O-CMC/单体比（w/w）为0.144，迅速加入NaHCO3粉末，搅拌约20 s使其产生气泡，将其置于40 ℃水浴加热5 min，室温固化30 min，即得半互穿网络水凝胶（semi-IPN）。将所得semi-IPN置于GA/O-CMC比（w/w）为2∶10的GA溶液（用0.2 mol/L的盐酸溶液调节pH至1.0）中至将其吸干，室温放置1 h，得粗P(AA-co-AM)/O-CMC超多孔水凝胶（SPH-IPN）。将SPH-IPN置于0.1 mol/L盐酸溶液中，透析5 d，无水乙醇中脱水透析2 d，30 ℃烘干至恒重，干燥密闭保存，即得纯化后的SPH-IPN。
2.2 SPH-IPN的结构表征
将样品充分干燥，KBr压片法制样，使用傅里叶变换红外光谱仪测定500～4 000 cm−1波数的SPH-IPN的IR谱。将样品置于氧化锆样品管（A=4 mm），转速5 000 Hz，固体碳谱测定。
2.3 SPH-IPN的溶胀性能测定
取干燥的SPH-IPN，室温下浸于过量水中（pH 7.0），于不同时间点用筛网取出SPH-IPN，吸去表面残余水后称重，根据以下公式计算SPH-IPN在不同时间点的溶胀比（QS）：
$$ {Q_{\rm{S}}} = \frac{{{W_{\rm{S}}} - {W_{\rm{d}}}}}{{{W_{\rm{d}}}}} $$ 其中，WS为溶胀后SPH-IPN质量（g）；Wd为干SPH-IPN质量（g）。
2.4 SPH-IPN孔隙率测定
采用乙醇替代法测定SPH-IPN的孔隙率[6]。取干燥的SPH-IPN，置无水乙醇中浸泡12 h，取出后吸去表面残余乙醇，称重，根据以下公式计算孔隙率：
$$ {\text{孔隙率}}=\frac{{M}_{2}-{M}_{1}}{\rho V}\times 100\;\text{%}$$ 其中，M1为干SPH-IPN质量（g）；M2为乙醇浸泡后的SPH-IPN质量（g）；ρ为乙醇密度（g/cm），V为SPH-IPN体积（cm3，以游标卡尺测量长方体SPH-IPN的长、宽、高后计算而得）。
2.5 载胰岛素SPH-IPN的制备及含量测定
2.5.1 载胰岛素SPH-IPN的制备
取胰岛素15 mg，精密称定，置10 ml量瓶中，加0.1 mol/L pH 7.4 PBS溶解并定容至刻度，得1.5 mg/ml的胰岛素溶液。称取50 mg SPH-IPN置装有10 ml胰岛素溶液的西林瓶中，37 ℃温浴放置2 h，取出，置烘箱内，30 ℃恒温干燥。
2.5.2 载药量的测定
取胰岛素SPH-IPN适量，研磨粉碎，取20 mg，精密称定，置10 ml量瓶中，加入0.1 mol/L pH 7.4 PBS，定容至刻度。37 ℃温浴2 h，超声10 min，精密量取上清液20 μl注入HPLC仪，记录色谱图，计算胰岛素含量，并根据以下公式计算载药量：
$$ {\text{载药量}}(\%)=\frac{cV}{M}\times 100$$ 其中，c为测得胰岛素的浓度（mg/ml），V为量瓶体积（ml），M为SPH-IPN的质量（mg）。
2.6 载胰岛素SPH-IPN降血糖实验
2.6.1 不同方法载药SPH-IPN的制备
按“2.5.1”项下方法制备载胰岛素SPH-IPN，采用冷冻干燥法将其冻干即得含胰岛素的冻干SPH-IPN。称取空白凝胶200 mg置于1.5 mg/ml的胰岛素溶液37 ℃中溶胀2 h，备用，即得含胰岛素的预溶胀SPH-IPN。
2.6.2 糖尿病大鼠模型的建立
给大鼠喂食高脂饲料（88.8%基础饲料、1%胆固醇、10%猪油和 0.2%胆盐[7]）喂养4周，动物自由进食和饮水，每周记录体重。于喂养的第28天晚禁食，在第29天一次性腹腔注射链脲佐菌素（STZ）35 mg/kg，将一次性注射STZ 3 d后大鼠空腹血糖≥11.1 mmol/L或随机血糖≥16.7 mmol/L作为成模标准[8]。对照组大鼠则腹腔注射无菌生理盐水（0.3 ml/100 g）。注意测血糖前应禁食12 h，空腹测血糖。造模期间要防止感染，注意消毒。未造模成功的大鼠再次注射STZ35 mg/kg，3 d后测血糖验证是否造模成功。
2.6.3 分组、给药及血糖测定
取糖尿病大鼠12只，按随机数字表分为2组，即模型1组和模型2组；取正常大鼠12只，按随机数字表分为2组，即正常1组和正常2组。模型组1组和正常1组皮下埋植含胰岛素的预溶胀SPH-IPN，模型2组和正常2组皮下埋植含胰岛素的冻干SPH-IPN。给药后分别于1、2、4、6、8、10、12、24、28、32、36、48、60、72 h不同时间间隔大鼠尾部取血0.02 ml，用血糖仪测定血糖值，考察不同时间血糖值的变化情况。
3. 实验结果
3.1 IPN结构表征
3.1.1 傅立叶变换红外光谱（FTIR）
图1为SPH-IPN的FTIR图。在1 651 cm−1处有-COOH的伸缩振动峰，且1 615 cm−1附近无AA和AM的C=C双键吸收峰，说明已聚合成P(AA-co-AM)，SPH-IPN中存在P（AA-co-AM），图中3 335和2 922 cm-1处分别为-O-H和-C-H的伸缩振动峰；1 604和1 416 cm−1处分别为羧酸盐-COO-的反对称伸缩振动峰和对称伸缩振动峰；1 086、1 044和1 171 cm−1处分别为O-CMC中糖环羟基-CH-OH、一级羟基-CH2-OH和醚基C-O-C中的C-O伸缩振动峰。以上结果表明SPH-IPN中存在P(AA-co-AM)，还存在的一些杂峰可能是还有一些未反应单体未被除尽。
3.1.2 核磁共振（13C-NMR）
图2为SPH-IPN的13C-NMR图。图中41.926×10−6为P(AA-co-AM)上主链碳原子的化学位移峰；179.499处为羧基碳原子的化学位移峰，说明结构中含有羧基官能团，AA与AM已聚合形成P(AA-co-AM)。
由于制得的水凝胶未找到合适的溶液将其溶解，因此在测定核磁共振图谱时，采用的是固体核磁技术[9]。
综合红外和碳谱结果可知，通过该方法可聚合形成P(AA-co-AM)结构，而该结构又是超多孔水凝胶SPH-IPN的主要结构，由此可说明已成功聚合SPH-IPN。
3.2 SPH-IPN的溶胀性能
图3为不同温度介质中SPH-IPN的溶胀曲线，可见随着温度升高，SPH-IPN的溶胀速率加快，平衡溶胀比增大，原因是温度较高时相互缠绕的聚合物链松开，破坏分子间的氢键，增加链运动，水分子在凝胶骨架内外的扩散速率加快，从而促进了聚合物的溶胀[10]。
3.3 SPH-IPN孔隙率的测定
表1为SPH-IPN孔隙率测定结果，所制SPH-IPN超多孔水凝胶空隙分布均匀。除此之外，与传统水凝胶相比[11]，孔隙率高，更利于药物的释放。
表 1 SPH-IPN的孔隙率测定结果干重M1
(m/g)湿重M2
(m/g)乙醇密度
(g/cm3)体积
(V/cm3)孔隙率
(%)平均值
(%)RSD
(%)0.5425 0.6327 0.816 0.13 85.03 81.63 3.88 0.5751 0.6779 0.816 0.16 78.74 0.5628 0.6621 0.816 0.15 81.13 3.4 SPH-IPN载胰岛素含量测定结果
37 ℃时SPH-IPN溶胀比较大，温度过高易引起胰岛素变性，故选择37 ℃温度载药，胰岛素的载药量试验结果见表2。
表 2 SPH-IPN对胰岛素的载药量试验组 载药量(w/w,%) 平均值(w/w,%) RSD（%） 1 3.13 3.19 1.88 2 3.25 3 3.20 3.5 载胰岛素凝胶降血糖实验
图4是含胰岛素的预溶胀SPH-IPN和冻干SPH-IPN对糖尿病大鼠和正常大鼠降糖作用的比较。图中预溶胀模型组在10 h时血糖值才有所降低，最低值为10 h的16.8 mmol/L，之后血糖又开始慢慢升高；预溶胀正常大鼠组在给药4 h后血糖开始降低，到24 h时血糖达到7.3 mmol/L，之后维持平稳状态；冻干模型组在包埋1 h后血糖便开始下降，血糖值降到6.7 mmol/L，在24 h后血糖开始慢慢升高，冻干正常大鼠组在1 h后血糖降至5.3 mmol/L，之后虽有起伏，但也一直在正常范围内。说明冻干凝胶的降糖作用较预溶胀组好，冻干凝胶在1～24 h时间段内的降糖作用较平稳。
4. 讨论
4.1 SPH-IPN的制备
本实验选用了能够迅速聚合的水溶性原料AA、AM为聚合反应单体；以APS/TEMED为引发体系；PF127为泡沫稳定剂，使产生的泡沫稳定时间更长；NaHCO3为起泡剂；O-CMC在合成过程中作为增稠剂，维持合适的起泡速率，使产生的气泡均匀、稳定，不致产生的气泡过快逸散[12]。采用溶液聚合法制备了含semi-IPN的水凝胶。因为该聚合反应在反应过程中会产生大量热量，这对泡沫的稳定极为有利，因此在常温条件下便能进行聚合反应，条件温和。以pH 1.0的GA溶液交联O-CMC时，可避免过度溶胀对孔隙结构的破坏，且pH 1.0时GA的交联能力较好。除此之外，相较于参考文献[5]，本实验中O-CMC/单体比较高，当O-CMC/单体比为0.144时，虽然可形成具有大量相互贯通孔隙的聚合物，但会导致其溶胀速率减慢，溶胀比降低，从而影响载药量和释药速率。随着溶胀速率减慢，药物溶出速率也相应减慢；随着溶胀比的降低，吸收的药物溶液减少，载药量随之降低。本实验提高O-CMC/单体的目的是希望通过减慢SPH-IPN的溶胀速率，从而尝试制备缓释制剂。
4.2 水凝胶的载药方法
水凝胶的载药方法通常有2种：一是将药物与单体溶液混合，随着单体聚合、交联将药物包埋于水凝胶中[13]；另一种方法为吸附载药，即凝胶在被载药液中溶胀，将载药水凝胶干燥，实现药物包埋[14]。姜黄素属于脂溶性药物，课题组前期研究结果表明，0.5%的SDS对姜黄素有一定的增溶效果；0.1 mol/L pH 7.4 PBS中SPH-IPN的溶胀比较大，对胰岛素具有一定的增溶作用，故分别选用这两种溶剂配制胰岛素溶液。
4.3 超多孔水凝胶的释药性能
文献[5]表明，超多孔水凝胶载药后的释药性能与O-CMC的含量、pH、离子强度、温度等多个因素有关，同时也有可能与载药SPH-IPN的制备过程有关。
笔者曾用SPH-IPN包载姜黄素，并开展探索性实验。结果发现20、40、60目不同粒径的凝胶累积释放率不同，前13 h三者的累积释放率均几乎一样（接近0），13 h后累积释放率逐渐增加，以40目凝胶的效果最佳，48 h后达到6.00%，明显高于其他组，但其释放速度慢，见图5。灌胃给予载姜黄素SPH-IPN后，部分大鼠排泄物中可见载姜黄素SPH-IPN，说明SPH-IPN在体内溶胀速率很慢；而载姜黄素SPH-IPN组和姜黄素原药组，灌胃后大鼠眼眶血中均未检出姜黄素，也进一步体现SPH-IPN未促进姜黄素的吸收。
将载胰岛素SPH-IPN予灌胃给药溶胀很慢，降糖效果极不明显，为延长SPH-IPN溶胀时间，最终考虑将其进行皮下包埋给药。
载胰岛素SPH-IPN皮下包埋给药发现，载胰岛素冻干SPH-IPN组的降糖效果优于载胰岛素溶胀SPH-IPN组，表明载药SPH-IPN的释放性能除与溶胀比有关外，其制备过程也会一定程度影响被载药物的疗效，与文献[5]报道一致。实验中将冻干组和溶胀组均进行包埋，均可延长溶胀时间，但冻干SPH-IPN组的降糖效果优，皮下包埋2 h后表现出明显的降糖作用，相比溶胀组而言，起效时间快（8 h左右）且持续时间长，24 h之内均具有良好的降糖作用。提示我们在制备载药SPH-IPN的过程中应该时刻关注被载药物的活性及稳定性，应在适当的条件下对药物进行包载以提高药物疗效，同时也说明载胰岛素冻干SPH-IPN可作为控释制剂，实现调节大鼠血糖的目的。结合实验结果分析可知，SPH-IPN能够增强药物的稳定性，提高生物利用度，比较适合作为蛋白质药物给药载体。
4.4 SPH-IPN载胰岛素的微针给药展望
文献研究发现，胰岛素经皮给药具有不错的疗效，与皮下给药效果几无差异，且依从性好，成为最新、有效、方便的给药方式。Norduist等[15]将微针贴剂用于胰岛素给药，结果发现，血浆胰岛素浓度变化与传统的皮下注射并无太大差异，但微针贴剂能极大地提高实验大鼠的依从性。无痛中空微针皮内胰岛素给药系统已获得 FDA批准，进入II期临床，相关产品有以色列纳米通道技术公司采用MEMS技术开发的中空微针器具，其中包括用于无痛释放胰岛素薄片与胰岛素微型泵相结合。Liu等[16]将可溶性材料透明质酸制备成负载胰岛素的微针阵列。在体实验发现，负载胰岛素的微针能够在1 h内完全溶解，携带的胰岛素快速释放入体内。
与上述研究及应用相比，本实验的载胰岛素SPH-IPN，释放药物无需微型泵，皮下包埋给药可以24 h内保持平稳、正常的血糖浓度，适合作为一日一次给药的控释制剂。为了提高患者的依从性，进一步研究将载胰岛素SPH-IPN制备为微针阵列的形式，以期得到一种方便、快捷、安全的胰岛素缓释递药系统。
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表 1 盐酸特比萘芬在不同浓度氮酮作用下的累积渗透量(µg/cm2)
渗透时间(t/h) 氮酮溶液（%） 1 3 5 0.5 0 0 0 1 0 0 0 2 0 0 0 4 3.42 4.72 1.11 6 7.97 9.19 3.25 8 14.19 15.64 5.47 24 18.50 23.65 7.17 
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表 2 莫匹罗星在不同浓度氮酮作用下的累积渗透量(µg/cm2)
渗透时间(t/h) 氮酮溶液（%） 1 3 5 0.5 0 0 0 1 0 0 0 2 0 0 0 4 0 0 0 6 0 0 0 8 10.38 18.22 7.01 24 31.67 37.29 19.08
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表 3 盐酸特比萘芬在不同浓度丙二醇作用下的累积渗透量(µg/cm2)
渗透时间(t/h) 丙二醇溶液（%） 5 10 15 0.5 0 0 0 1 0 0 0 2 0 0 0 4 1.69 3.84 1.30 6 4.69 12.57 3.63 8 8.37 21.58 6.71 24 9.67 31.05 9.76
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表 4 莫匹罗星在不同浓度丙二醇作用下的累积渗透量(µg/cm2)
渗透时间(t/h) 丙二醇溶液（%） 5 10 15 0.5 0 0 0 1 0 0 0 2 0 0 0 4 3.04 4.63 5.84 6 5.92 10.29 11.57 8 11.18 15.58 19.03 24 22.44 31.41 31.73
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表 5 糠酸莫米松在不同浓度丙二醇作用下的累积渗透量(µg/cm2)
渗透时间(t/h) 丙二醇溶液（%） 5 10 15 0.5 0 0 0 1 0 0 0 2 0 0 0 4 0 0 0 6 0 3.59 4.15 8 0 5.35 6.24 24 4.02 9.73 10.64
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