下载:
下载:
-
艰难梭菌是一种革兰阳性厌氧芽孢杆菌，通过粪-口途径传播，艰难梭菌感染会引起腹泻，严重感染可导致伪膜性结肠炎、中毒性巨结肠、肠坏死，甚至危及生命[1-2]。
近年来艰难梭菌感染的发病率、复发率和病死率明显增加，已成为全球性的健康威胁[3]。美国艰难梭菌引起的医院感染为12.1%[4]。中国住院腹泻患者艰难梭菌感染发生率高达19%[5]，大型医院住院腹泻患者艰难梭菌感染的检出率为11%～22%[6]。妊娠期若发生艰难梭菌感染，治疗方案需兼顾母儿安全。
现报道1例成功救治妊娠患者感染艰难梭菌的病例，临床药师参与了该患者药物治疗的全过程，协助医生制订用药方案，提供药物选择、注意事项等建议，并对特殊群体的用药安全性进行药学监护，得到临床医护人员、患者和家属的认可。
-
患者，女，27岁，因“停经24+3周，间断腹痛，加重不缓解6 h余”入院。患者2019年3月因反复腹痛、体温38.3 ℃，入住鼓楼医院。因注射用头孢唑林钠皮试阳性，改用盐酸克林霉素注射液0.6 g q8 h抗感染治疗，病情好转后于2019-04-02出院。2019-04-06、2019-04-13再次无明显诱因出现腹痛，自上腹正中逐渐转移至下腹两侧，呈间断性隐痛，无恶心、呕吐，无腹胀、腹泻，无发热。均1 h后自行缓解，未予特殊处理。2019-04-19再次出现腹痛，较前剧烈，伴头晕，收住入院。
既往史：患者既往月经规则，末次月经：2018-10-29，预产期：2019-08-05。停经50 d，B超提示宫内早孕，左侧附件混合性包块。2019-01-22 NT示1.7 mm，宫腔积液，子宫肌瘤。既往有子宫肌瘤病史2年，肌瘤直径2 cm。2018年5月行腹腔镜探查+经腹直肠切除肠、吻合术，术后病理提示：梭形细胞肿瘤，考虑为富于细胞性恶性潜能未定的平滑肌肿瘤。
过敏史：注射用头孢唑林钠皮试阳性。
入院查体：体温38.1 ℃，脉搏90/min，呼吸19/min，血压120/78 mmHg。胎儿生长各项指标均正常，示孕妇子宫肌瘤（部分变性）。降钙素原：0.435 ng/ml，C反应蛋白：97.8 mg/L，D-二聚体：3.96 mg/L，白细胞计数：21.5×109/L，中性粒细胞占比：0.942，血红蛋白：83 g/L。
入院诊断：①妊娠合并子宫肌瘤变性；②中孕(孕24+3周)；③妊娠合并中度贫血。
患者入院后的重要临床信息及治疗时间轴见图1。
图 1 患者住院期间的重要临床信息及治疗时间轴
-
妊娠期患者机体各系统和脏器均发生了一系列生理改变，胎儿在不同的发育阶段对药物的敏感性和反应也不同，因此，妊娠期用药需全面考虑对母体和胎儿的影响。临床药师从不同角度对该患者在院期间的用药进行监护，确保了母儿安全。
-
以下几类患者发生艰难梭菌感染的风险较高，包括：①老年患者；②住院时间长；③患严重基础疾病；④长期使用广谱抗菌药物；⑤使用质子泵抑制剂或其他抑酸剂；⑥机体存在免疫抑制（包括恶性肿瘤和器官移植等因素）等[7]。该患者住院时长达2个多月，确诊艰难梭菌感染之前曾应用盐酸克林霉素注射液和注射用哌拉西林钠他唑巴坦钠，且诊断为妊娠合并子宫肌瘤变性，存在多项艰难梭菌感染的高风险因素。因此，出现难治性腹泻时，高度怀疑是艰难梭菌感染。确认艰难梭菌感染后，根据《中国成人艰难梭菌感染诊断和治疗专家共识》[8]，临床药师建议立即停用注射用哌拉西林钠他唑巴坦钠，并避免使用止泻剂。
-
2018年美国感染病学会指南推荐，非重度艰难梭菌感染治疗首选万古霉素或非达霉素。若这两种药物无法获得，可选用甲硝唑[9]。然而，万古霉素价格昂贵且可能增加耐万古霉素肠球菌的产生，非达霉素尚未广泛进入我国市场，故而甲硝唑仍具有一定临床优势，需结合患者的综合情况进行考虑。
《中国成人艰难梭菌感染诊断和治疗专家共识》推荐，不同程度艰难梭菌感染的治疗方案有所差异：①轻-中度感染：可给予甲硝唑500 mg，q8 h。②重症感染：给予万古霉素125 mg溶液（口服或胃管入），q6 h。③重症感染伴并发症：首先需外科、感染内科医生会诊，评估结肠切除手术指征；给予万古霉素500 mg，q6 h，配伍甲硝唑500 mg，q8 h；患者一旦病情稳定，万古霉素立即减量至125 mg，q6 h，同时停用甲硝唑；口服给药受限或完全性肠梗阻的患者，可经Foley导管给予万古霉素500 mg直肠保留灌肠，q6 h，配伍甲硝唑500 mg，静脉输注，q8 h。
艰难梭菌感染治疗的注意事项包括：①疗程：10～14 d。②以下情况可考虑万古霉素或去甲万古霉素溶液：服用甲硝唑治疗5 d无效；复发性艰难梭菌感染；妊娠；≥65岁的患者；存在其他甲硝唑治疗禁忌证及显著不良反应者。③尽可能避免使用止泻剂和质子泵抑制剂[8]。
本例患者处于妊娠的特殊生理时期，甲硝唑的妊娠安全性分级为B级，说明其动物生殖研究未能证明对胎儿有风险，但并未在设对照的妊娠妇女中得到证实，故口服甲硝唑对胎儿存在一定风险。注射用盐酸万古霉素在静脉给药时的安全性分级为C级，为中度风险。而将注射用盐酸万古霉素溶于生理盐水中口服，可直接作用于患者肠道中的艰难梭菌，且基本不吸收入血，采用125 mg，口服4次/d，粪便中药物浓度次日达67～760 mg/g，第4天则可达152～880 mg/g，且药物浓度稳定，全身不良反应较小[10]。因此，口服万古霉素不会突破胎盘屏障对胎儿造成影响，且无需进行血药浓度检测。该方案既能满足疾病治疗的需要，又确保了母儿安全。
临床药师指导护士将500 mg注射用盐酸万古霉素溶于500 ml 0.9%氯化钠注射液中混匀，每次给患者服用125 ml，每日4次。另外，临床药师教育患者密切关注并记录腹泻情况，及时向医生反馈。实践证明治疗效果颇佳，用药14 d后，艰难梭菌毒素测定中各项指标皆为阴性，在院期间未再复发。
-
患者2019-06-10出现妊娠合并肝损害，ALT为348.5 U/L，AST为380.2 U/L，医生开具多烯磷脂酰胆碱注射液2支，qd静滴给药，用于紧急降低肝酶。多烯磷脂酰胆碱注射液辅料中含有的苯甲醇可穿透胎盘，可能对胎儿造成伤害[11]。临床药师告知医师该潜在风险，并给出建议，一旦患者肝酶水平得到改善，即可将多烯磷脂酰胆碱注射液静脉滴注改为多烯磷脂酰胆碱胶囊口服。当ALT和AST水平明显下降，立即停用多烯磷脂酰胆碱注射液，予多烯磷脂酰胆碱胶囊1粒，tid口服给药，2019-06-27生化检查提示患者肝酶恢复正常，ALT为35.5 U/L，AST为38.1 U/L，予停用多烯磷脂酰胆碱胶囊。在护肝用药期间，临床药师密切关注患者肝酶指标和胎儿情况，及时建议调整药物，在改善肝功能的同时降低药物对胎儿的风险。
-
贫血对母体可增加妊娠期高血压、胎膜早破、产褥期感染等疾病的发病风险，对胎儿可增加胎儿生长受限、胎儿缺氧、早产等发病风险[12]。该患者入院后初次血常规检查提示，血红蛋白值为83 g/L，低于正常范围，临床药师建议口服铁剂补铁，医生开具医嘱予多糖铁复合物胶囊1粒，qd给药。临床药师监护患者的血红蛋白水平，以及是否出现胃肠道不适等不良反应，教育患者餐后服用铁剂可缓解胃部不适并且安抚患者情绪，大便颜色轻微变深为服用铁剂后的正常现象，不必惊慌。服用铁剂一段时间后，血常规结果提示血红蛋白上升至115 g/L，有效纠正了患者的血红蛋白水平。
-
妊娠本身即是发生静脉血栓栓塞症（VTE）的一项危险因素，妊娠期母体存在静脉血流淤滞、血管内皮损伤和高凝状态的特点，均可造成VTE风险增加[13]。本例患者妊娠合并子宫肌瘤变性，且卧床时间较长，均为VTE的高风险因素。依据相关指南推荐，对该患者启动抗凝方案预防VTE发生[14]。肝素类药物不会穿过胎盘，不会引起胎儿出血或致畸[15]。该患者住院期间予依诺肝素钠注射液4 000 Axa IU皮下注射，至剖宫产术前24 h停用。术后予气压治疗并恢复依诺肝素钠注射液预防血栓至产后42 d，住院期间患者未出现血栓或出血倾向，围生期抗凝方面用药合理。药师全程监护患者的血栓及出血风险，协助医生选择合适的抗凝药物，为抗凝管理提供理论支持。
-
该病例为妊娠患者长期使用广谱抗菌药物导致的艰难梭菌感染，临床药师建议病原学检测。并根据相关指南，建议医生及时调整治疗方案，同时对治疗药物的有效性、安全性、不良反应进行全程监护，在医、护、药三方努力下，成功治愈艰难梭菌感染。因此，临床药师应积极参与临床治疗，并通过临床典型病例进行总结和分析，以丰富临床治疗经验。
-
艰难梭菌感染以其高发病率、致死性和广泛的波及范围已引起医务人员高度重视。在妊娠期这一特殊生理时期若发生艰难梭菌感染，治疗方案应同时考虑母、儿安全。临床药师建议该病例采用口服万古霉素的治疗方案，最终取得较满意的临床效果，可为妊娠期发生艰难梭菌感染类似病例的治疗提供参考。
Clinical pharmacist participation in the treatment of a pregnancy complicated with Clostridium difficile infection
-
摘要:
目的 探讨临床药师参与妊娠合并肠道艰难梭菌感染患者的药学实践重点和模式，保障母儿安全。 方法 临床药师从药物角度切入，严格按照循证医学证据将药学理论与临床实践相结合，为药物选择、剂量调整、保肝治疗等方面提供全程药学监护，协助医生制定用药方案，积极参与个体化治疗。 结果 临床药师融入治疗团队，保障了妊娠期患者用药的有效性和安全性。 结论 临床药师的个体化药学服务提高了药物治疗水平。 Abstract:Objective To explore the clinical pharmacist participation in the treatment of pregnancy complicated with Clostridium difficile infection. Methods From the perspective of medications, clinical pharmacists followed evidence-based medical practice, combined pharmaceutical theory with clinical evidence and provided individualized pharmacy care in drug selection, dose adjustment, medication regime and liver protection treatment. Results Clinical pharmacists integrated into the treatment team to ensure the effectiveness and safety of medication in the patient with pregnancy. Conclusion The individualized pharmacy care improved the effectiveness of drug treatment. -
Key words:
- clinical pharmacist /
- pregnancy /
- Clostridium difficile /
- pharmaceutical practice
-
骨质疏松症是一种全身性骨代谢疾病，其典型特征是骨密度下降、骨脆性增加和骨微环境被破坏[1]。骨稳态失衡是其发生的主要病理学基础。骨稳态是指成骨细胞行使的骨形成功能和破骨细胞行使的骨吸收功能处在一个相对平衡的过程[2]。破骨细胞分化及其功能的过度活化是导致骨稳态失衡的重要因素[3]。中国骨质疏松症流行病学调查显示，我国50岁以上人群骨质疏松发病率为19.2%，65岁以上人群发病率为32%[4]。目前临床上治疗骨质疏松症的药物主要是骨吸收抑制剂，其在抑制骨吸收的同时，也干扰骨形成进程。因而发掘更好的治疗骨质疏松的药物是迫切需要的。
骨髓来源的巨噬细胞(BMMs)向破骨细胞分化需要重组小鼠巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子κB受体活化因子配体(RANKL)的持续刺激[5]。M-CSF增加了早期BMMs的增殖，RANKL与受体RANK结合激活肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)，进而激活细胞凋亡信号调节激酶1(ASK1)和NF-κB抑制物激酶(IKKs)，活化的ASK1和IKKs磷酸化JNK、ERK和P38以及NF-κB特异性抑制因子IκB特定部位的丝氨酸，激活MAPK和NF-κB信号。活化的MAPK和NF-κB使c-Fos、NFATc1表达增加，促进DC-STAMP、ATP6V0d2、TRAP、CTSK等破骨细胞特异性基因的转录与表达，导致破骨细胞分化[6]。研究表明，减弱破骨细胞分化及功能，能够有效地治疗骨质疏松症[7]。
冬虫夏草是一味传统中药，有增强免疫、抗炎、抗氧化和延缓衰老等作用[8]。先前的研究表明，富含锶的冬虫夏草菌丝发酵液对去卵巢骨质疏松大鼠有良好的治疗效果，其机制是提高了血清中的雌二醇水平，但是该研究仅基于整体水平解释了冬虫夏草作用于骨质疏松症的机制，对冬虫夏草的菌种也未作鉴定，并且野生的冬虫夏草提取液在骨质疏松症中的作用也未见报道[9-11]。本研究旨在探讨冬虫夏草提取液(CSE)对去卵巢小鼠的治疗作用以及对破骨细胞分化和功能的影响，为CSE防治骨质疏松症提供实验依据。
1. 材料
1.1 动物
SPF级雌性C57BL/6小鼠（上海西普尔-必凯实验动物有限公司），12周龄24只，6周龄7只，体质量20～22 g，合格证号：SCXK（沪）2018-0006。本实验经江西中医药大学实验动物伦理委员会批准（批号JZLLSC2019-0194），且遵循中国伦理委员会指导原则。
1.2 试剂
α-MEM培养基（美国Hyclone，批号：SH30265.01）；胎牛血清（美国Gbico，批号：10099-141）；重组小鼠RANKL、M-CSF蛋白（美国R&D，批号：462-TEC-010、416-ML-010）；TRAP染色试剂盒（浙江卓腾生物公司）；RNAiso Plus、TB Green（日本Takara，批号：9109、RR420B）；p-JNK、JNK、p-ERK1/2、ERK1/2、p-P38、P38和GAPDH兔单克隆抗体（美国CST，批号：4668、9252、4370、4695、4511、8690、5174）；山羊抗兔IgG H&L (IRDye® 800CW)预吸附二抗（美国Abcam，批号：ab216773）；冬虫夏草（上海雷允上药业有限公司）；羟基磷灰石涂板/96孔板（美国Corning，批号：3989）；小鼠抗酒石酸酸性磷酸酶、骨钙素、骨碱性磷酸酶ELISA试剂盒（上海生工，批号：D721140、D721126、D721049）。
1.3 仪器
371型细胞培养箱（美国Thermo）；Cytation 5多功能酶标仪（美国Bio-Tek）；CFX96型实时荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad）；SA型近红外双色激光成像系统（美国odyssey）；TI-SR型倒置显微镜（日本Nikon）；RM2016型病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）；JB-P5型包埋机（武汉俊杰）。
2. 方法
2.1 CSE制备
冬虫夏草(Cordyceps sinensis)药材产地为青海玉树，购自上海雷允上药业有限公司，经海军军医大学黄宝康教授鉴定。提取详情见引文[12]。
2.2 BMMs分离与培养
选取6周龄C57BL/6小鼠，使用颈椎脱臼法处死，取双侧股骨和胫骨，使用PBS将骨髓从骨髓腔中冲出，收集PBS并离心，弃上清液，使用α-MEM培养基重悬，于T75培养瓶内（含10%血清，1%青霉素-链霉素溶液及30 ng/ml M-CSF完全培养基）培养3 d。使用PBS清洗去除未贴壁细胞，加入适量新鲜完全培养基，直至细胞数量达到5×106个[13]。
2.3 CCK-8法检测BMMs细胞活性
在96孔板中，BMMs以8×103个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.125、0.25、0.5、1、2、4 mg/ml CSE干预处理，培养48 h或96 h，加入CCK-8检测液，37 ℃孵育1 h后在波长480 nm处检测吸光度。
2.4 体外破骨细胞分化实验
在96孔板中，BMMs以6×103个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE干预处理，同时加入50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF，阴性对照组不加入RANKL；每2 d更换一次培养基，直至第5天对破骨细胞进行TRAP染色。
将同样密度的BMMs接种于96孔板，孵育过夜；记过夜后为第1天，分别于第1、3、5天加入1 mg/ml CSE干预处理，每2 d更换一次培养基至第7天（仅加药1次，之后更换培养基均不加CSE），进行TRAP染色[14]。
2.5 F-actin环染色和骨吸收实验
在96孔板中，BMMs以6×103个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE干预处理，同时加入50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF，每2 d更换一次培养基。第5天用鬼笔环肽和DAPI分别对F-actin环和细胞核进行染色。
骨吸收实验：BMMs以5×105个/孔的密度接种于6孔板，孵育过夜；加入含50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF完全培养基，每2 d换液，至第4天出现小的破骨样细胞，胰酶消化以8×103个/孔密度重新接种至羟基磷灰石涂板内，并且加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE处理。培养3 d后，用次氯酸钠洗去细胞，PBS清洗后晾干，于光学显微镜下拍照，统计每个孔的骨陷窝面积[15]。
2.6 q-PCR检测
在12孔板中，BMMs以5×104个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE干预处理，同时加入50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF，每2 d更换一次培养基至第5天。抽提RNA，逆转录后使用q-PCR检测DC-STAMP、ATP6V0d2、TRAP、CTSK、NFATc1基因的表达，引物序列详情见引文[16]。
2.7 蛋白印迹法检测
在6孔板中，BMMs以5×105个/孔的密度接种，孵育过夜；使用无血清的α-MEM培养基饥饿细胞1 h，实验组更换含1 mg/ml的CSE的完全培养基，对照组更换含相同体积PBS的完全培养基，孵育3 h；均使用50 ng/ml RANKL刺激5、10、20、30、60 min，未被刺激的细胞作为0 min。刺激完成后，抽提总蛋白。经SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、5%脱脂奶粉封闭1 h，4 ℃下一抗孵育过夜，室温下荧光素偶联的二抗孵育1 h，用odyssey成像系统扫膜，分析JNK(1∶2000)、p-JNK(1∶2000)、ERK(1∶2000)、p-ERK(1∶2000)、P38(1∶2000)、p-P38(1∶2000)的表达。
2.8 动物造模、分组及给药
在24只12周龄小鼠中随机挑选6只作为假手术组（Sham组），其余小鼠使用异氟烷气麻，去除背部毛发，切开皮肤和背膜，使卵巢暴露，切除双侧卵巢并使用可吸收缝合线结扎、缝合（假手术组仅切开背部皮肤和腹膜）[14]。术后1周，按照文献报道方法[17]，将卵巢切除小鼠随机分为3组：模型组（OVX组）、CSE低剂量组、CSE高剂量组，每组6只。术后7 d开始给药，由预实验确定给药浓度为312.5和625 mg/kg，按照每只200 μl/d连续灌胃给药6周。
2.9 HE染色和TRAP染色
小鼠处死后取双侧股骨，4%多聚甲醛固定后进行脱钙处理，之后常规脱水、石蜡包埋，切成4 μm切片，分别进行HE染色和TRAP染色。统计破骨细胞数量/骨表面积（N. Oc/BS）、破骨细胞面积/骨表面积（Oc. S/BS）和骨体积/组织体积（BV/TV）。
2.10 ELISA法检测血清生化指标
小鼠处死前统一摘除小鼠左眼取血，将全血收集并在4 ℃静置30 min，之后在4 ℃下2 000 r/min离心20 min，吸取上清液置于−80 ℃冰箱中保存。按照Elisa试剂盒《用户操作手册》检测血清中TRAP、ALP、BGP含量。
2.11 统计学方法
使用Image J统计破骨细胞面积和个数、F-actin环面积和环内核数、骨陷窝面积、蛋白条带灰度值、N. Oc/BS、Oc. S/BS和BV/TV。使用SPSS 21.0统计学软件对数据进行分析。计量资料用均数±标准差（
$\bar x $ ±s）表示，多组间比较使用方差分析，以P<0.05认为差异具有统计学意义。3. 结果
3.1 CSE对BMMs细胞活力的影响
CCK-8结果显示，与空白组比较，CSE浓度范围在0.125～4 mg/ml时，48 h内和96 h内CSE对BMMs无细胞毒性（图1）。据此结果选择0.5、1、2 mg/ml作为之后的细胞实验浓度。
3.2 CSE对RANKL诱导的破骨细胞分化的影响
TRAP染色显示，与空白组比较，RANKL组的BMMs分化为成熟的TRAP阳性多核巨噬细胞（有完整的圆形状细胞形态且细胞核数目≥3）。与RANKL组比较，CSE不同剂量组的TRAP阳性多核巨噬细胞数量明显减少，且呈剂量依赖的方式下降，并且破骨细胞的大小也被显著抑制（图2A-C）。结果表明CSE不仅抑制破骨细胞的分化也阻碍了破骨细胞前体细胞的融合。
图 2 CSE对破骨细胞分化的影响（n=3）A.破骨细胞图像（×40）；B.每孔TRAP阳性多核细胞（细胞核数≥3）面积百分比；C.每孔TRAP阳性多核细胞（细胞核数≥3）个数；D.不同时间段加入CSE处理后的破骨细胞图像（×40）；E.加药时间示意图；F.每孔TRAP阳性多核细胞（细胞核数≥3）个数**P<0.01，与RANKL组比较在RANKL持续刺激的BMMs中按时段加入CSE。染色结果显示，与空白组比较，0 d组的BMMs几乎全部分化为成熟的破骨细胞，数量多，且形状完整。与0 d组比较，给予CSE1～3 d组的BMMs分化为成熟破骨细胞的数量最少，3～5 d组其次，5～7 d组最多（图2D、2E、2F）。结果表明CSE对破骨细胞生成的任一阶段均有作用，在早期阶段作用最为明显。
3.3 CSE对RANKL诱导的破骨细胞F-actin环形成和骨吸收功能的影响
鬼笔环肽和DAPI染色显示，RANKL组的F-actin环形成完整，数量多且面积大，环内细胞核数量多。与RANKL组比较，CSE不同剂量组的F-actin环数量和大小均下降，环内细胞核数量也明显减少（图3A、3B、3C）。
图 3 CSE对破骨细胞F-actin环形成和骨吸收功能的影响（n=3）A.F-actin环和细胞核共聚焦图像（×100）；B.每孔内F-actin环面积百分比；C.单个F-actin环内细胞核个数；D.骨陷窝图像（×40）；E.每孔未吸收面积百分比**P<0.01，与RANKL组比较骨板吸收显示，RANKL组未被吸收面积为70%， 1 mg/ml CSE组未被吸收面积为85%，2 mg/ml CSE组为95%，与RANKL组比较，不同剂量的CSE均有效的减少了骨板吸收的面积（图3D、3E）。结果表明CSE显著抑制了成熟破骨细胞骨吸收的功能。
3.4 CSE对RANKL诱导的破骨细胞特异性基因表达的影响
q-PCR结果显示，与RANKL组比较，CSE中、高剂量组显著性地抑制了破骨细胞特异性基因TRAP、CTSK、ATP6V0d2、DC-STAMP和NFATc1的表达，且呈剂量依赖性（图4）。这与CSE抑制破骨细胞分化及功能的结果相一致。
图 4 CSE对破骨细胞特异性基因表达的影响（n=3）A.TRAP；B.CTSK; C.ATP6V0d2; D.DC-STAMP; E.NFATc1*P<0.05，**P<0.01，与RANKL组比较3.5 CSE对破骨细胞分化过程中MAPK通路的影响
Wsetern-blot结果显示，RANKL组各时间段JNK、ERK和P38蛋白磷酸化显著。与RANKL组比较， CSE组p-JNK蛋白表达在第10～30 min明显下降，p-ERK蛋白表达在第20～60 min明显下降和p-P38蛋白表达在第10～60 min明显下降，见图5。结果表明在破骨细胞的分化过程中，CSE作用于MAPK通路JNK、ERK和P38的磷酸化。
3.6 CSE对卵巢切除小鼠的影响
HE和TRAP染色显示，与假手术组比较，OVX组小鼠的骨小梁数目和面积明显减少（BV/TV值下降）且间距变大，骨小梁表面破骨细胞数量增多、面积变大（N. Oc/BS、Oc. S/BS值上升）。与OVX组比较，CSE低剂量和高剂量组小鼠的骨小梁数目和面积均增加（BV/TV值上升）且间距减小，骨小梁表面破骨细胞数量减少、面积变小（N. Oc/BS、Oc. S/BS值下降），见图6。结果表明，CSE可以增加卵巢切除小鼠骨小梁数目，抑制破骨细胞活性，缓解骨量流失。
图 6 CSE对去卵巢小鼠股骨破骨细胞数量和骨小梁的影响（n=6）A.HE染色和TRAP染色；B.BV/TV；C.Oc. S/BS；D.N. Oc/BS；**P<0.01，与OVX组比较；##P<0.01，与假手术组比较3.7 CSE对TRAP、ALP、BGP含量的影响
ELISA结果显示，与假手术组比较，OVX组小鼠血清中的TRAP含量明显增加，BGP含量明显减少，ALP含量无明显变化；CSE高剂量组小鼠血清中的TRAP、BGP含量无明显变化， ALP含量明显增加。与OVX组比较，CSE低剂量和高剂量组小鼠血清中的ALP、BGP含量明显增加，TRAP含量明显减少（图7）。结果表明，CSE可以调节骨代谢相关指标，具有平衡骨稳态作用。
图 7 CSE对TRAP、ALP和BGP含量的影响（n=6）A.TRAP；B.ALP；C.BGP；*P＜0.05，**P<0.01，与OVX组比较；##P<0.01，与假手术组比较4. 讨论
骨质疏松症是一种与年龄相关的骨代谢疾病，骨重建失衡是其发生的主要原因，因绝经造成的骨质疏松占骨质疏松症的绝大部分。研究表明，雌激素对骨骼的生长、发育和维持至关重要，因雌激素缺失致使RANKL介导的信号通路过度活化，进而使破骨细胞功能异常，是绝经后骨质疏松症主要原因[18]。因而抑制破骨细胞的分化及其功能是治疗骨质疏松的有效途径[19]。在本研究中，我们发现CSE通过抑制MAPK信号通路的激活来抑制RANKL介导的破骨细胞生成，同时对OVX小鼠的骨质流失具有良好的保护作用。
研究表明，在RANKL的刺激下，BMMs中的MAPK通路被激活，进而刺激破骨细胞特异性基因的表达，促进BMMs分化为破骨细胞[19-21]。NFATc1和DC-STAMP是破骨细胞分化和前体破骨细胞融合的主要调控者，TRAP、CTSK、ATP6V0d2是反映破骨细胞活性和骨吸收状态的特异性指标[22-23]。本研究表明，CSE显著抑制RANKL介导的破骨细胞分化，而且在破骨细胞分化的早期阶段作用最为明显。其机制是抑制JNK、ERK和P38的激活，进而抑制破骨细胞特异性基因的表达。
F-actin环是分化成熟的破骨细胞在骨面上极化，使骨架重排，F-actin紧密排列形成的一个环，是破骨细胞进行骨吸收的先决条件。因而阻碍破骨细胞前体细胞的融合，能够有效抑制F-actin环的形成和骨吸收功能[24]。本研究发现CSE显著性地抑制F-actin环的形成，并降低了环内细胞核数以及骨陷窝面积，这表明CSE阻碍了破骨细胞前体细胞的融合和骨吸收功能，与CSE抑制破骨细胞分化及其特异性基因表达的结果相一致。
我们构建了去卵巢小鼠模型模拟绝经后的骨质疏松症，经CSE灌胃给药6周后，采用HE和TRAP染色对小鼠股骨进行骨组织形态学分析以及ELISA检测血清中ALP、TRAP、BGP含量。TRAP是酸性磷酸酶的同工酶，其血清浓度可反映破骨细胞的活性[25]。ALP是一种磷酸单酯酶，由成骨细胞分泌，能有效地反映成骨细胞的活性[27]。BGP由成骨细胞合成及分泌，绝大部分的BGP随成骨细胞矿化在骨基质中沉积，仅有一小部分进入到血液循环[14]。血液中的BGP是成骨细胞分泌完成后直接进入血液，并非是破骨细胞降解骨基质而进入血液，因而检测血液中的BGP含量，对评判机体经药物治疗后变化有较大的参考价值。结果显示，CSE能有效缓解骨量丢失，表现在CSE各剂量组小鼠的骨小梁数量增多，间距减少，以及骨表面破骨细胞数量和面积减少，表明了CSE对去卵巢小鼠的骨量流失具有良好的保护作用。同时CSE提高了血清中ALP含量，使BGP和TRAP含量回归正常水平，说明其可抑制破骨细胞分化，减弱骨吸收功能，具有缓解骨量流失和调节骨代谢作用。
总之，本研究发现CSE在体外抑制了RANKL诱导的破骨细胞分化及其骨吸收功能，其可能机制部分归因于CSE抑制了级联信号中ERK、JNK和P38的激活，在体内有效的缓解了因卵巢切除造成的骨量丢失，这为CSE防治骨质疏松症提供了初步的药理学证据。
-
[1] PARSONS A S, BURGER A, PAHWA A K. Clinical guideline highlights for the hospitalist: diagnosis and management of Clostridium difficile in adults[J]. J Hosp Med,2020,15(2):95-96. [2] ELLIOTT B, ANDROGA G O, KNIGHT D R, et al. Clostridium difficile infection: Evolution, phylogeny and molecular epidemiology[J]. Infect Genet Evol,2017,49:1-11. doi: 10.1016/j.meegid.2016.12.018 [3] HE M, MIYAJIMA F, ROBERTS P, et al. Emergence and global spread of epidemic healthcare-associated Clostridium difficile[J]. Nat Genet,2013,45(1):109-113. doi: 10.1038/ng.2478 [4] MAGILL S S, EDWARDS J R, BAMBERG W, et al. Multistate point-prevalence survey of health care-associated infections[J]. N Engl J Med,2014,370(13):1198-1208. doi: 10.1056/NEJMoa1306801 [5] 谢和宾, 曾鸿, 尹柯, 等. 我国住院腹泻患者艰难梭菌感染率的荟萃分析[J]. 中华医院感染学杂志, 2017, 27(5):961-964. [6] 徐亚青, 邓敏. 难辨梭状芽胞杆菌医院感染的流行病学特征及感染控制现状分析[J]. 中华医院感染学杂志, 2013, 23(20):5073-5075. [7] BASSETTI M, VILLA G, PECORI D, et al. Epidemiology, diagnosis and treatment of Clostridium difficile infection[J]. Expert Rev Anti - Infect Ther,2012,10(12):1405-1423. doi: 10.1586/eri.12.135 [8] 程敬伟, 刘文恩, 马小军, 等. 中国成人艰难梭菌感染诊断和治疗专家共识[J]. 协和医学杂志, 2017(Z1):131-138. [9] JOHNSON S, LOUIE TJ, GERDING DN, et al. Vancomycin, metronidazole, or tolevamer for Clostridium difficile infection: results from two multinational, randomized, controlled trials[J]. Clin Infect Dis,2014,59(3):345-354. doi: 10.1093/cid/ciu313 [10] MCDONALD L C, GERDING D N, JOHNSON S, et al. Clinical practice guidelines for Clostridium difficile infection in adults and children: 2017 update by the infectious diseases society of America (IDSA) and society for healthcare epidemiology of America (SHEA)[J]. Clin Infect Dis,2018,66(7):987-994. doi: 10.1093/cid/ciy149 [11] HALLIDAY H L. Useless perinatal therapies[J]. Neonatology,2010,97(4):358-365. doi: 10.1159/000297765 [12] 段涛. 妊娠期铁缺乏和缺铁性贫血诊治指南[J]. 中华围产医学杂志, 2014, 17(7):451-454. doi: 10.3760/cma.j.issn.1007-9408.2014.07.006 [13] BATES S M, GREER I A, MIDDELDORP S, et al. VTE, thrombophilia, antithrombotic therapy, and pregnancy: antithrombotic therapy and prevention of thrombosis, 9th Ed: American college of chest physicians evidence-based clinical practice guidelines[J]. Chest,2012,141(2 Suppl):e691S-e736S. [14] JAMES A, COMMITTEE ON PRACTICE BULLETINS—OBSTETRICS. Practice bulletin No. 123: thromboembolism in pregnancy[J]. Obstet Gynecol,2011,118(3):718-729. doi: 10.1097/AOG.0b013e3182310c4c [15] STEINBERG Z L, DOMINGUEZ-ISLAS C P, OTTO C M, et al. Maternal and fetal outcomes of anticoagulation in pregnant women with mechanical heart valves[J]. J Am Coll Cardiol,2017,69(22):2681-2691. doi: 10.1016/j.jacc.2017.03.605 -
点击查看大图
计量
- 文章访问数: 5674
- HTML全文浏览量: 1783
- PDF下载量: 49
- 被引次数: 0
