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对各种药品生产相关的数据进行统计分析，可以有效地对药品质量进行宏观控制。能力六合图是质量控制图中的一种，“六合图”包含单值控制图、极差控制图、最后25个观测值、能力直方图、正态概率图及能力图。Minitab软件能力分析的“六合图”，能对数据进行自动分析、对过程稳定性和过程能力进行综合评估[1]，通过判定一个过程的过程能力绩效，起到对生产过程的改进与提高作用。此方法快速准确，是制药行业实施新版GMP时进行产品质量回顾的有效工具，也是提升质量管理水平的较好途径。
硫酸镁口服溶液为我院院内制剂，临床上主要用于利胆、导泻。硫酸镁口服溶液生产工艺流程图见图1。通过能力六合图分析27批次硫酸镁口服溶液中硫酸镁含量的质量数据，判断在生产过程中对硫酸镁含量是否达到控制状态、硫酸镁口服溶液的生产工艺是否处于稳定状态。
图 1 硫酸镁口服溶液生产工艺流程图
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查阅我院2015年2月至2020年1月生产的硫酸镁口服溶液的工艺规程、主要生产设备的标准操作规程、检验操作规程和记录等文件，确定药品是在同一生产工艺及同一检验环境下完成，生产记录和检验结果真实可靠。统计2015年2月至2020年1月我院生产的连续27批次硫酸镁口服溶液的检验结果，分析项目包括：性状、鉴别、装量、微生物限度、硫酸镁含量[2-3]。
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根据《中国人民解放军医疗机构制剂规范》（2015年版）中硫酸镁口服溶液的质量标准，对27批次的硫酸镁口服溶液进行质量考察。硫酸镁口服溶液质量标准见表1。其中，性状、鉴别、装量和微生物限度等检查项目依据标准直接进行判定，硫酸镁含量使用Minitab软件的六合图功能进行分析[4]。
表 1 硫酸镁口服溶液质量标准
项目名称 标准 性状 无色、澄清液体，味苦、咸 镁盐、硫酸盐 阳性、阳性 装量 ≥97%的标示量 微生物限度 菌数≤100 cfu/ml，不得检出大肠杆菌 硫酸镁含量 标示量的95.0%～105.0% -
2015年2月至2020年1月生产的27批次硫酸镁口服溶液的性状、鉴别、装量、微生物限度均合格，各批次硫酸镁含量结果汇总见表2。打开Minitab软件，输入数据，硫酸镁口服溶液中硫酸镁含量的能力六合图见图2。
表 2 27批次硫酸镁口服溶液含量的检验结果（2015年2月至2020年1月）
序号 批号 含量
（%）序号 批号 含量
（%）序号 批号 含量
（%）1 150203 99.7 10 161219 97.9 19 180507 101.0 2 150616 102.4 11 170316 99.7 20 181129 102.0 3 150824 98.7 12 170515 101.0 21 190226 100.0 4 151030 101.6 13 170629 98.5 22 190506 99.2 5 151224 102.0 14 170925 99.9 23 190624 98.2 6 160411 102.3 15 171113 100.8 24 190628 97.3 7 160614 100.5 16 180119 98.9 25 191101 101.9 8 160808 98.1 17 180307 99.3 26 200106 102.6 9 161017 99.8 18 180402 100.4 27 200111 97.4 
图 2 硫酸镁含量的能力六合图
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Minitab软件依据统计理论的小概率事件原理，对控制图有8项检验标准[4-5]：①超出上下控制界限；②连续9点落在中心线同一侧；③连续6点递增或递减；④连续14点上下交错；⑤连续3点中有2个点距离中心线（同侧）大于2个标准差；⑥连续5点中有4个点距离中心线（同侧）大于1个标准差；⑦连续15点在距离中心线（任意一侧）1个标准差之内；⑧连续8点距离中心线（任一侧）大于1个标准差。以上8项检验标准的意义在于：①是公认的、用于检测失控情况的必要检验；②可以标识过程居中或变异中的偏移，可创建一个敏感度更高的控制图；③用于检测趋势；④可检测系统变异；⑤和⑥用于检测过程中的较小偏移；⑦可检测是否存在控制限过宽的现象；⑧检测混合模式。在混合模式中，这些点趋于避开中心线，而落在控制限附近。
为了使硫酸镁含量的控制图敏感度更高，我们选择对其进行8项检验。由图2知，硫酸镁含量的移动极差控制图、单值控制图上所有的点在控制限内随机分布，进行8项检验亦无异常值，说明该组数据处于控制状态，即硫酸镁口服溶液中硫酸镁含量处于受控状态。
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由图2知，硫酸镁含量的最后25个观测值显示数据波动在正常范围内，能力直方图显示工艺过程受控，正态概率图显示数据分布密集且呈正态分布（P>0.05）。
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能力图用于计算工序能力指数（Cpk）。传统统计控制理论将工序能力分为5级[6]：①Cpk≥1.67，工序能力过剩；②1.33<Cpk<1.67，一般加工工序能力富裕，可维持现状；③1<Cpk≤1.33，工序能力尚可，但有缺陷发生；④0.67<Cpk≤1，工序能力不足；⑤Cpk≤0.67，工序能力严重不足，需采取紧急措施。
硫酸镁含量的能力六合图显示Cpk为1.06，工序能力尚可，但提示有缺陷发生。在该能力指数下，单值图的上下控制线分别为95.34和104.74，几乎和规格线95、105重叠，因此，该控制限起不到控制的作用，只能用于分析用。
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应用Minitab软件制作的硫酸镁含量的能力六合图显示，在硫酸镁口服溶液生产过程中对硫酸镁成分达到控制状态，硫酸镁口服溶液的生产工艺处于受控状态，但能力图同时也提示了该品种的工艺过程有潜在缺陷发生。
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由于该产品的数据收集时间跨度长，潜在异常原因分析难度大，如果仅依靠经验判断，难以提出有针对性的预防措施。基于风险管理理念，我们需要系统地识别、查找潜在风险来源，做好质量风险的前瞻性管理。在本制剂室现有的风险管理程序下，我们采用失败模式和效应分析（FMEA）为本次风险管理工具[7]，对风险的严重程度（S）、发生概率（O）以及风险被检测的可能性（D）评分，评分实行5分制[8-10]，建立的风险评估表见表3。风险指数(RPN)=严重程度（S）×发生概率（O）×风险被检测的可能性（D），风险指数下的风险级别见表4。采用头脑风暴法列出可能发生硫酸镁含量偏差的因素，最后确定潜在的失效模式与潜在风险因素，并对风险进行分析分级，结果见表5。
表 3 风险评估表
严重程度（S） 发生概率（O） 可检测性（D） 评分 严重危害：直接影响产品质量，导致产品不可使用 极高：每批次发生或每年发生3批次以上 不能或极小 5 高：影响产品质量，导致产品质量不可控 高：每年发生1批次 可能性较低 4 中等：间接影响产品质量，导致产品质量可控但不稳定 中等：每3年发生1批次 中等可能性 3 低：较小影响产品质量，导致产品质量可控，较少出现不稳定 低：每5年发生1批次 可能性较大 2 微小：不影响产品质量 微小：几乎不发生 可能性非常大或几乎肯定能 1 表 4 风险级别表
风险指数 风险级别 评估 ≤25 低 可接受 26≤RPN≤59 中 考虑改进措施 ≥60 高 不可接受，需要整改 表 5 硫酸镁含量偏差风险因素分级结果
风险项目 失效模式 严重程度（S） 发生几率（O） 可检测性(D) RPN 风险等级 失败影响 评分 失败原因 评分 现有控制措施 评分 人员 配制、检验岗位人员岗位职责不熟悉、操作失误 不能准确称量投药量、准确测定含量 5 岗位职责不明确、管理规程指导性差、操作规程不切实际、人员培训未到位 3 岗位职责、管理规程、操作规程等文件齐全；定期进行各项操作培训，每年度进行各项考核。 2 30 中 原辅料 原辅料质量不合格 原辅料硫酸镁含量不合格或杂质超标，导致产品质量不可控 5 未按照入库规程进行原辅料入库；原辅料库环境不符合要求 1 原辅料入库实行双人验收，且药检人员对原辅料进行抽检。原辅料库每天监测温湿度并有防虫防霉措施 2 10 低 设备 天平未定期及时校准 硫酸镁含量可控但不稳定 3 设备管理人员因各种原因未及时进行天平校准 3 设备管理人员职责规定必须及时校验设备；天平侧部贴有校准结果和时效 1 9 低 方法 含量测定方法未验证 含量测定结果不准确，导致产品质量不可控 4 相关法规变更、检测方法变更、首次使用未验证 3 制订了相关岗位职责和操作规程 2 24 低 根据硫酸镁含量偏差风险因素分级结果，人员是硫酸镁口服溶液中硫酸镁含量偏差风险控制的关键。对此，我们进行如下改进措施：重新审核岗位职责、管理规程及操作规程等文件，由岗位人员、管理人员共同参与修订，增强文件的可操作性；人员培训时：理论培训需结合实际案例进行，同时注重现场操作的讲解且讲解结束后需进行全员实际技能操作，培训考核以笔试和实际操作相结合，并不定期进行考核，随时保证岗位人员的操作水平和理论知识水平。
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医院制剂的很多品种为小批量、经常性生产品种，结合医院制剂的国家政策、制剂本身、医药市场等因素影响，原有的经常性生产品种也可能因为政策变化导致大幅减产[11]。在对医院制剂进行质量分析时，存在医院制剂年生产批次少，难以进行趋势分析的问题。因此，我们采用在年度产品批次少于10批时，对这些批次的生产数据进行罗列，避免因人员更替等原因导致数据丢失，同时可确保产品年度质量回顾工作的开展。但该阶段只确认年度该产品所有质量数据未超出标准范围，不进行趋势分析。当10≤批次<25时，采用单值-移动极差控制图（I-MR控制图）对数据进行分析[12-13]，此时，对比第一阶段单纯的罗列数据，控制图可以直接反映单值、控制限、规格限、移动极差的分布，以及数据是否存在异常波动，可反映生产过程的大概趋势及稳定程度，判断过程是否受控。当数据足够多，即能收集25批次以上数据时，用Minitab软件中六合图对数据进行分析，除了可以有效观测到第二阶段情况外，还可考察样本正态分布情况，观察数据波动情况，以及从能力图中获得Cpk和工序性能指数（Ppk）等相关数据，为科学的评价工艺、流程的稳定性和可靠性提供数据支持。
常规控制图按用途可分为分析用控制图和控制用控制图。前者用来控制生产过程中有关质量特性值的变化情况，判断工序是否处于受控状态，后者主要用于发现生产过程是否有异常情况出现，以防不合格品产生。实际工作中，当数据积累足够多时，若与产品生产相关的各项因素没有发生变更，且控制图性能良好，绘制出的控制图就可用于生产过程的控制。在本文中，我们所绘制的控制图因控制限与规格线几乎重叠，且过程能力指数较低，只能用于分析用而不能转化成控制用控制图。
我们通过将能力六合图应用于医院制剂硫酸镁口服溶液的质量分析，发现虽然硫酸镁口服溶液的生产工艺处于受控状态，但存在潜在缺陷。基于风险管理理念，采用FMEA进行风险的前瞻性管理，并针对风险等级提出改进措施。但风险管理是一个持续、动态的过程，该改进措施能否有效控制风险还需进行一段时间的验证。只有风险得到有效控制，风险管理能力不断提高，才能使硫酸镁口服溶液的生产工艺更稳定，质量更优异。
Application of capability sixpack in quality analysis of hospital preparation magnesium sulfate oral solution
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摘要:
目的 应用能力六合图对医院制剂硫酸镁口服溶液进行质量分析。 方法 运用Minitab软件中能力分析的“六合图”功能，以硫酸镁口服溶液的硫酸镁含量为指标，判断生产过程中硫酸镁含量是否达到控制状态，硫酸镁口服溶液的生产工艺是否稳定。 结果 硫酸镁含量及硫酸镁口服溶液的生产工艺处于受控状态，但存在潜在缺点。基于风险管理理念，应用失败模式和效应分析（FMEA）进行了潜在风险的前瞻性管理。 结论 应用能力六合图于医院制剂硫酸镁口服溶液的质量分析，有助于我们发现生产工艺受控状态下的潜在风险，有利于制剂生产过程的改进以及制剂质量的保证。 Abstract:Objective To analyze the quality of the hospital preparation magnesium sulfate oral solution by using capability sixpack. Methods By using the capability sixpack of Minitab, the content of magnesium sulfate in the magnesium sulfate oral solution was used as an indicator to determine whether the magnesium sulfate composition reached a controlled state during the production process and whether the production process of magnesium sulfate oral solution was stable. Results The content of magnesium sulfate and the production process of magnesium sulfate oral solution was under control, but there were potential disadvantages. Based on the concept of risk management philosophy, The failure model and effect analysis (FMEA) were applied to the prospective management of potential risks. Conclusion The application of the capability sixpack in the quality analysis of the hospital preparation of magnesium sulfate oral solution is helpful for us to discover the potential risks under the controlled state of the production process, which is beneficial to the improvement of the preparation production process and the assurance of the quality of the preparation. -
骨质疏松症是一种全身性骨代谢疾病，其典型特征是骨密度下降、骨脆性增加和骨微环境被破坏[1]。骨稳态失衡是其发生的主要病理学基础。骨稳态是指成骨细胞行使的骨形成功能和破骨细胞行使的骨吸收功能处在一个相对平衡的过程[2]。破骨细胞分化及其功能的过度活化是导致骨稳态失衡的重要因素[3]。中国骨质疏松症流行病学调查显示，我国50岁以上人群骨质疏松发病率为19.2%，65岁以上人群发病率为32%[4]。目前临床上治疗骨质疏松症的药物主要是骨吸收抑制剂，其在抑制骨吸收的同时，也干扰骨形成进程。因而发掘更好的治疗骨质疏松的药物是迫切需要的。
骨髓来源的巨噬细胞(BMMs)向破骨细胞分化需要重组小鼠巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子κB受体活化因子配体(RANKL)的持续刺激[5]。M-CSF增加了早期BMMs的增殖，RANKL与受体RANK结合激活肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)，进而激活细胞凋亡信号调节激酶1(ASK1)和NF-κB抑制物激酶(IKKs)，活化的ASK1和IKKs磷酸化JNK、ERK和P38以及NF-κB特异性抑制因子IκB特定部位的丝氨酸，激活MAPK和NF-κB信号。活化的MAPK和NF-κB使c-Fos、NFATc1表达增加，促进DC-STAMP、ATP6V0d2、TRAP、CTSK等破骨细胞特异性基因的转录与表达，导致破骨细胞分化[6]。研究表明，减弱破骨细胞分化及功能，能够有效地治疗骨质疏松症[7]。
冬虫夏草是一味传统中药，有增强免疫、抗炎、抗氧化和延缓衰老等作用[8]。先前的研究表明，富含锶的冬虫夏草菌丝发酵液对去卵巢骨质疏松大鼠有良好的治疗效果，其机制是提高了血清中的雌二醇水平，但是该研究仅基于整体水平解释了冬虫夏草作用于骨质疏松症的机制，对冬虫夏草的菌种也未作鉴定，并且野生的冬虫夏草提取液在骨质疏松症中的作用也未见报道[9-11]。本研究旨在探讨冬虫夏草提取液(CSE)对去卵巢小鼠的治疗作用以及对破骨细胞分化和功能的影响，为CSE防治骨质疏松症提供实验依据。
1. 材料
1.1 动物
SPF级雌性C57BL/6小鼠（上海西普尔-必凯实验动物有限公司），12周龄24只，6周龄7只，体质量20～22 g，合格证号：SCXK（沪）2018-0006。本实验经江西中医药大学实验动物伦理委员会批准（批号JZLLSC2019-0194），且遵循中国伦理委员会指导原则。
1.2 试剂
α-MEM培养基（美国Hyclone，批号：SH30265.01）；胎牛血清（美国Gbico，批号：10099-141）；重组小鼠RANKL、M-CSF蛋白（美国R&D，批号：462-TEC-010、416-ML-010）；TRAP染色试剂盒（浙江卓腾生物公司）；RNAiso Plus、TB Green（日本Takara，批号：9109、RR420B）；p-JNK、JNK、p-ERK1/2、ERK1/2、p-P38、P38和GAPDH兔单克隆抗体（美国CST，批号：4668、9252、4370、4695、4511、8690、5174）；山羊抗兔IgG H&L (IRDye® 800CW)预吸附二抗（美国Abcam，批号：ab216773）；冬虫夏草（上海雷允上药业有限公司）；羟基磷灰石涂板/96孔板（美国Corning，批号：3989）；小鼠抗酒石酸酸性磷酸酶、骨钙素、骨碱性磷酸酶ELISA试剂盒（上海生工，批号：D721140、D721126、D721049）。
1.3 仪器
371型细胞培养箱（美国Thermo）；Cytation 5多功能酶标仪（美国Bio-Tek）；CFX96型实时荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad）；SA型近红外双色激光成像系统（美国odyssey）；TI-SR型倒置显微镜（日本Nikon）；RM2016型病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）；JB-P5型包埋机（武汉俊杰）。
2. 方法
2.1 CSE制备
冬虫夏草(Cordyceps sinensis)药材产地为青海玉树，购自上海雷允上药业有限公司，经海军军医大学黄宝康教授鉴定。提取详情见引文[12]。
2.2 BMMs分离与培养
选取6周龄C57BL/6小鼠，使用颈椎脱臼法处死，取双侧股骨和胫骨，使用PBS将骨髓从骨髓腔中冲出，收集PBS并离心，弃上清液，使用α-MEM培养基重悬，于T75培养瓶内（含10%血清，1%青霉素-链霉素溶液及30 ng/ml M-CSF完全培养基）培养3 d。使用PBS清洗去除未贴壁细胞，加入适量新鲜完全培养基，直至细胞数量达到5×106个[13]。
2.3 CCK-8法检测BMMs细胞活性
在96孔板中，BMMs以8×103个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.125、0.25、0.5、1、2、4 mg/ml CSE干预处理，培养48 h或96 h，加入CCK-8检测液，37 ℃孵育1 h后在波长480 nm处检测吸光度。
2.4 体外破骨细胞分化实验
在96孔板中，BMMs以6×103个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE干预处理，同时加入50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF，阴性对照组不加入RANKL；每2 d更换一次培养基，直至第5天对破骨细胞进行TRAP染色。
将同样密度的BMMs接种于96孔板，孵育过夜；记过夜后为第1天，分别于第1、3、5天加入1 mg/ml CSE干预处理，每2 d更换一次培养基至第7天（仅加药1次，之后更换培养基均不加CSE），进行TRAP染色[14]。
2.5 F-actin环染色和骨吸收实验
在96孔板中，BMMs以6×103个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE干预处理，同时加入50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF，每2 d更换一次培养基。第5天用鬼笔环肽和DAPI分别对F-actin环和细胞核进行染色。
骨吸收实验：BMMs以5×105个/孔的密度接种于6孔板，孵育过夜；加入含50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF完全培养基，每2 d换液，至第4天出现小的破骨样细胞，胰酶消化以8×103个/孔密度重新接种至羟基磷灰石涂板内，并且加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE处理。培养3 d后，用次氯酸钠洗去细胞，PBS清洗后晾干，于光学显微镜下拍照，统计每个孔的骨陷窝面积[15]。
2.6 q-PCR检测
在12孔板中，BMMs以5×104个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE干预处理，同时加入50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF，每2 d更换一次培养基至第5天。抽提RNA，逆转录后使用q-PCR检测DC-STAMP、ATP6V0d2、TRAP、CTSK、NFATc1基因的表达，引物序列详情见引文[16]。
2.7 蛋白印迹法检测
在6孔板中，BMMs以5×105个/孔的密度接种，孵育过夜；使用无血清的α-MEM培养基饥饿细胞1 h，实验组更换含1 mg/ml的CSE的完全培养基，对照组更换含相同体积PBS的完全培养基，孵育3 h；均使用50 ng/ml RANKL刺激5、10、20、30、60 min，未被刺激的细胞作为0 min。刺激完成后，抽提总蛋白。经SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、5%脱脂奶粉封闭1 h，4 ℃下一抗孵育过夜，室温下荧光素偶联的二抗孵育1 h，用odyssey成像系统扫膜，分析JNK(1∶2000)、p-JNK(1∶2000)、ERK(1∶2000)、p-ERK(1∶2000)、P38(1∶2000)、p-P38(1∶2000)的表达。
2.8 动物造模、分组及给药
在24只12周龄小鼠中随机挑选6只作为假手术组（Sham组），其余小鼠使用异氟烷气麻，去除背部毛发，切开皮肤和背膜，使卵巢暴露，切除双侧卵巢并使用可吸收缝合线结扎、缝合（假手术组仅切开背部皮肤和腹膜）[14]。术后1周，按照文献报道方法[17]，将卵巢切除小鼠随机分为3组：模型组（OVX组）、CSE低剂量组、CSE高剂量组，每组6只。术后7 d开始给药，由预实验确定给药浓度为312.5和625 mg/kg，按照每只200 μl/d连续灌胃给药6周。
2.9 HE染色和TRAP染色
小鼠处死后取双侧股骨，4%多聚甲醛固定后进行脱钙处理，之后常规脱水、石蜡包埋，切成4 μm切片，分别进行HE染色和TRAP染色。统计破骨细胞数量/骨表面积（N. Oc/BS）、破骨细胞面积/骨表面积（Oc. S/BS）和骨体积/组织体积（BV/TV）。
2.10 ELISA法检测血清生化指标
小鼠处死前统一摘除小鼠左眼取血，将全血收集并在4 ℃静置30 min，之后在4 ℃下2 000 r/min离心20 min，吸取上清液置于−80 ℃冰箱中保存。按照Elisa试剂盒《用户操作手册》检测血清中TRAP、ALP、BGP含量。
2.11 统计学方法
使用Image J统计破骨细胞面积和个数、F-actin环面积和环内核数、骨陷窝面积、蛋白条带灰度值、N. Oc/BS、Oc. S/BS和BV/TV。使用SPSS 21.0统计学软件对数据进行分析。计量资料用均数±标准差（
$\bar x $ ±s）表示，多组间比较使用方差分析，以P<0.05认为差异具有统计学意义。3. 结果
3.1 CSE对BMMs细胞活力的影响
CCK-8结果显示，与空白组比较，CSE浓度范围在0.125～4 mg/ml时，48 h内和96 h内CSE对BMMs无细胞毒性（图1）。据此结果选择0.5、1、2 mg/ml作为之后的细胞实验浓度。
3.2 CSE对RANKL诱导的破骨细胞分化的影响
TRAP染色显示，与空白组比较，RANKL组的BMMs分化为成熟的TRAP阳性多核巨噬细胞（有完整的圆形状细胞形态且细胞核数目≥3）。与RANKL组比较，CSE不同剂量组的TRAP阳性多核巨噬细胞数量明显减少，且呈剂量依赖的方式下降，并且破骨细胞的大小也被显著抑制（图2A-C）。结果表明CSE不仅抑制破骨细胞的分化也阻碍了破骨细胞前体细胞的融合。
图 2 CSE对破骨细胞分化的影响（n=3）A.破骨细胞图像（×40）；B.每孔TRAP阳性多核细胞（细胞核数≥3）面积百分比；C.每孔TRAP阳性多核细胞（细胞核数≥3）个数；D.不同时间段加入CSE处理后的破骨细胞图像（×40）；E.加药时间示意图；F.每孔TRAP阳性多核细胞（细胞核数≥3）个数**P<0.01，与RANKL组比较在RANKL持续刺激的BMMs中按时段加入CSE。染色结果显示，与空白组比较，0 d组的BMMs几乎全部分化为成熟的破骨细胞，数量多，且形状完整。与0 d组比较，给予CSE1～3 d组的BMMs分化为成熟破骨细胞的数量最少，3～5 d组其次，5～7 d组最多（图2D、2E、2F）。结果表明CSE对破骨细胞生成的任一阶段均有作用，在早期阶段作用最为明显。
3.3 CSE对RANKL诱导的破骨细胞F-actin环形成和骨吸收功能的影响
鬼笔环肽和DAPI染色显示，RANKL组的F-actin环形成完整，数量多且面积大，环内细胞核数量多。与RANKL组比较，CSE不同剂量组的F-actin环数量和大小均下降，环内细胞核数量也明显减少（图3A、3B、3C）。
图 3 CSE对破骨细胞F-actin环形成和骨吸收功能的影响（n=3）A.F-actin环和细胞核共聚焦图像（×100）；B.每孔内F-actin环面积百分比；C.单个F-actin环内细胞核个数；D.骨陷窝图像（×40）；E.每孔未吸收面积百分比**P<0.01，与RANKL组比较骨板吸收显示，RANKL组未被吸收面积为70%， 1 mg/ml CSE组未被吸收面积为85%，2 mg/ml CSE组为95%，与RANKL组比较，不同剂量的CSE均有效的减少了骨板吸收的面积（图3D、3E）。结果表明CSE显著抑制了成熟破骨细胞骨吸收的功能。
3.4 CSE对RANKL诱导的破骨细胞特异性基因表达的影响
q-PCR结果显示，与RANKL组比较，CSE中、高剂量组显著性地抑制了破骨细胞特异性基因TRAP、CTSK、ATP6V0d2、DC-STAMP和NFATc1的表达，且呈剂量依赖性（图4）。这与CSE抑制破骨细胞分化及功能的结果相一致。
图 4 CSE对破骨细胞特异性基因表达的影响（n=3）A.TRAP；B.CTSK; C.ATP6V0d2; D.DC-STAMP; E.NFATc1*P<0.05，**P<0.01，与RANKL组比较3.5 CSE对破骨细胞分化过程中MAPK通路的影响
Wsetern-blot结果显示，RANKL组各时间段JNK、ERK和P38蛋白磷酸化显著。与RANKL组比较， CSE组p-JNK蛋白表达在第10～30 min明显下降，p-ERK蛋白表达在第20～60 min明显下降和p-P38蛋白表达在第10～60 min明显下降，见图5。结果表明在破骨细胞的分化过程中，CSE作用于MAPK通路JNK、ERK和P38的磷酸化。
3.6 CSE对卵巢切除小鼠的影响
HE和TRAP染色显示，与假手术组比较，OVX组小鼠的骨小梁数目和面积明显减少（BV/TV值下降）且间距变大，骨小梁表面破骨细胞数量增多、面积变大（N. Oc/BS、Oc. S/BS值上升）。与OVX组比较，CSE低剂量和高剂量组小鼠的骨小梁数目和面积均增加（BV/TV值上升）且间距减小，骨小梁表面破骨细胞数量减少、面积变小（N. Oc/BS、Oc. S/BS值下降），见图6。结果表明，CSE可以增加卵巢切除小鼠骨小梁数目，抑制破骨细胞活性，缓解骨量流失。
图 6 CSE对去卵巢小鼠股骨破骨细胞数量和骨小梁的影响（n=6）A.HE染色和TRAP染色；B.BV/TV；C.Oc. S/BS；D.N. Oc/BS；**P<0.01，与OVX组比较；##P<0.01，与假手术组比较3.7 CSE对TRAP、ALP、BGP含量的影响
ELISA结果显示，与假手术组比较，OVX组小鼠血清中的TRAP含量明显增加，BGP含量明显减少，ALP含量无明显变化；CSE高剂量组小鼠血清中的TRAP、BGP含量无明显变化， ALP含量明显增加。与OVX组比较，CSE低剂量和高剂量组小鼠血清中的ALP、BGP含量明显增加，TRAP含量明显减少（图7）。结果表明，CSE可以调节骨代谢相关指标，具有平衡骨稳态作用。
图 7 CSE对TRAP、ALP和BGP含量的影响（n=6）A.TRAP；B.ALP；C.BGP；*P＜0.05，**P<0.01，与OVX组比较；##P<0.01，与假手术组比较4. 讨论
骨质疏松症是一种与年龄相关的骨代谢疾病，骨重建失衡是其发生的主要原因，因绝经造成的骨质疏松占骨质疏松症的绝大部分。研究表明，雌激素对骨骼的生长、发育和维持至关重要，因雌激素缺失致使RANKL介导的信号通路过度活化，进而使破骨细胞功能异常，是绝经后骨质疏松症主要原因[18]。因而抑制破骨细胞的分化及其功能是治疗骨质疏松的有效途径[19]。在本研究中，我们发现CSE通过抑制MAPK信号通路的激活来抑制RANKL介导的破骨细胞生成，同时对OVX小鼠的骨质流失具有良好的保护作用。
研究表明，在RANKL的刺激下，BMMs中的MAPK通路被激活，进而刺激破骨细胞特异性基因的表达，促进BMMs分化为破骨细胞[19-21]。NFATc1和DC-STAMP是破骨细胞分化和前体破骨细胞融合的主要调控者，TRAP、CTSK、ATP6V0d2是反映破骨细胞活性和骨吸收状态的特异性指标[22-23]。本研究表明，CSE显著抑制RANKL介导的破骨细胞分化，而且在破骨细胞分化的早期阶段作用最为明显。其机制是抑制JNK、ERK和P38的激活，进而抑制破骨细胞特异性基因的表达。
F-actin环是分化成熟的破骨细胞在骨面上极化，使骨架重排，F-actin紧密排列形成的一个环，是破骨细胞进行骨吸收的先决条件。因而阻碍破骨细胞前体细胞的融合，能够有效抑制F-actin环的形成和骨吸收功能[24]。本研究发现CSE显著性地抑制F-actin环的形成，并降低了环内细胞核数以及骨陷窝面积，这表明CSE阻碍了破骨细胞前体细胞的融合和骨吸收功能，与CSE抑制破骨细胞分化及其特异性基因表达的结果相一致。
我们构建了去卵巢小鼠模型模拟绝经后的骨质疏松症，经CSE灌胃给药6周后，采用HE和TRAP染色对小鼠股骨进行骨组织形态学分析以及ELISA检测血清中ALP、TRAP、BGP含量。TRAP是酸性磷酸酶的同工酶，其血清浓度可反映破骨细胞的活性[25]。ALP是一种磷酸单酯酶，由成骨细胞分泌，能有效地反映成骨细胞的活性[27]。BGP由成骨细胞合成及分泌，绝大部分的BGP随成骨细胞矿化在骨基质中沉积，仅有一小部分进入到血液循环[14]。血液中的BGP是成骨细胞分泌完成后直接进入血液，并非是破骨细胞降解骨基质而进入血液，因而检测血液中的BGP含量，对评判机体经药物治疗后变化有较大的参考价值。结果显示，CSE能有效缓解骨量丢失，表现在CSE各剂量组小鼠的骨小梁数量增多，间距减少，以及骨表面破骨细胞数量和面积减少，表明了CSE对去卵巢小鼠的骨量流失具有良好的保护作用。同时CSE提高了血清中ALP含量，使BGP和TRAP含量回归正常水平，说明其可抑制破骨细胞分化，减弱骨吸收功能，具有缓解骨量流失和调节骨代谢作用。
总之，本研究发现CSE在体外抑制了RANKL诱导的破骨细胞分化及其骨吸收功能，其可能机制部分归因于CSE抑制了级联信号中ERK、JNK和P38的激活，在体内有效的缓解了因卵巢切除造成的骨量丢失，这为CSE防治骨质疏松症提供了初步的药理学证据。
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表 1 硫酸镁口服溶液质量标准
项目名称 标准 性状 无色、澄清液体，味苦、咸 镁盐、硫酸盐 阳性、阳性 装量 ≥97%的标示量 微生物限度 菌数≤100 cfu/ml，不得检出大肠杆菌 硫酸镁含量 标示量的95.0%～105.0% 
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表 2 27批次硫酸镁口服溶液含量的检验结果（2015年2月至2020年1月）
序号 批号 含量
（%）序号 批号 含量
（%）序号 批号 含量
（%）1 150203 99.7 10 161219 97.9 19 180507 101.0 2 150616 102.4 11 170316 99.7 20 181129 102.0 3 150824 98.7 12 170515 101.0 21 190226 100.0 4 151030 101.6 13 170629 98.5 22 190506 99.2 5 151224 102.0 14 170925 99.9 23 190624 98.2 6 160411 102.3 15 171113 100.8 24 190628 97.3 7 160614 100.5 16 180119 98.9 25 191101 101.9 8 160808 98.1 17 180307 99.3 26 200106 102.6 9 161017 99.8 18 180402 100.4 27 200111 97.4
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表 3 风险评估表
严重程度（S） 发生概率（O） 可检测性（D） 评分 严重危害：直接影响产品质量，导致产品不可使用 极高：每批次发生或每年发生3批次以上 不能或极小 5 高：影响产品质量，导致产品质量不可控 高：每年发生1批次 可能性较低 4 中等：间接影响产品质量，导致产品质量可控但不稳定 中等：每3年发生1批次 中等可能性 3 低：较小影响产品质量，导致产品质量可控，较少出现不稳定 低：每5年发生1批次 可能性较大 2 微小：不影响产品质量 微小：几乎不发生 可能性非常大或几乎肯定能 1
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表 5 硫酸镁含量偏差风险因素分级结果
风险项目 失效模式 严重程度（S） 发生几率（O） 可检测性(D) RPN 风险等级 失败影响 评分 失败原因 评分 现有控制措施 评分 人员 配制、检验岗位人员岗位职责不熟悉、操作失误 不能准确称量投药量、准确测定含量 5 岗位职责不明确、管理规程指导性差、操作规程不切实际、人员培训未到位 3 岗位职责、管理规程、操作规程等文件齐全；定期进行各项操作培训，每年度进行各项考核。 2 30 中 原辅料 原辅料质量不合格 原辅料硫酸镁含量不合格或杂质超标，导致产品质量不可控 5 未按照入库规程进行原辅料入库；原辅料库环境不符合要求 1 原辅料入库实行双人验收，且药检人员对原辅料进行抽检。原辅料库每天监测温湿度并有防虫防霉措施 2 10 低 设备 天平未定期及时校准 硫酸镁含量可控但不稳定 3 设备管理人员因各种原因未及时进行天平校准 3 设备管理人员职责规定必须及时校验设备；天平侧部贴有校准结果和时效 1 9 低 方法 含量测定方法未验证 含量测定结果不准确，导致产品质量不可控 4 相关法规变更、检测方法变更、首次使用未验证 3 制订了相关岗位职责和操作规程 2 24 低
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