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脓毒症作为机体对感染反应失调的器官功能障碍综合征，常累及肾脏，是危重患者发生急性肾损伤最常见的原因之一。脓毒症引起的急性肾损伤不仅使住院死亡率增加6~8倍，还与远期慢性肾脏病的发展和远期死亡风险增加有关[1-3]。通常认为脓毒症相关急性肾损伤的发病过程与过度炎症反应、血流动力学障碍、凝血功能障碍、小管上皮细胞损害等有关[1]，然而，脓毒症相关急性肾损伤的机制尚未完全阐明。近年来，代谢组学作为反应疾病内环境与内源性代谢物之间关系的一种方法，被广泛应用于各种疾病，因此，利用代谢组学探究脓毒症相关急性肾损伤中内源性代谢物的变化有助于进一步理解其发病机制。黄连作为常见中药，具有抗炎、抗氧化等功能，被广泛用于各种疾病[4]。既往研究发现黄连可以通过减轻炎症改善脓毒症诱导的急性肝损伤[5]，而黄连是否对脓毒症相关急性肾损伤存在保护作用还有待进一步研究。本研究旨在研究黄连对脓毒症相关肾损伤的影响，并利用代谢组学探讨其潜在机制。
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C57BL/6小鼠（上海斯莱克实验动物有限责任公司）；黄连生药获于安徽亳州；生化指标试剂盒（南京建成生物工程研究所有限公司）；Agilent 7890A /5975C气相色谱-质谱联用仪（美国）；Agilent J&W Scientific HP-5ms（30 m × 0.25 mm，0.25 μm）毛细管色谱柱。
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黄连生药由海军军医大学药学院孙连娜教授鉴定；根据《中国药典》(2015年版)准备黄连水提取物。
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采用盲肠结扎穿孔术（CLP）建立脓毒症相关急性肾损伤模型。将18只小鼠随机分为3组，每组6只。具体分组如下，假手术组（Sham组）：仅对小鼠切开缝合，并给予等体积生理盐水灌胃；模型组（CLP组）：小鼠行CLP，并给予等体积生理盐水灌胃；给药组（RCE组）：小鼠行CLP，并给予黄连提取物100 mg/kg灌胃。
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干预完成24 h后，对所有小鼠行内眦静脉取血，4 ℃冰箱静置40 min后，以3000 r/min离心5 min，取血清置于−80 ℃冰箱保存，以行生化指标检测。取血后处死小鼠，行心脏灌流，切取肾脏置于−80 ℃冰箱中保存，以行代谢组学分析。
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利用试剂盒检测血清肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）水平。
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取出−80 ℃冰箱中储存的肾组织，取皮髓交界部分，称取50 mg加入内标甲醇1 ml，再加入碾磨珠，4 ℃，70 Hz碾磨120 s，再置入4 ℃离心机中，以12 000 r/min离心10 min，取上清液200 μl置离心管中，温和氮气吹干。加入15 mg/ml的甲氧胺吡啶溶液50 μl，涡旋30 s，置于70 ℃的烘箱中反应60 min，再加入N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺（含1%的三甲基氯硅烷）50 μl，涡旋1 min，室温反应30 min，再加入100 μl正庚烷，涡旋30 s，4 000 r/min离心5 min，取上清液100 μl上样。余上清液每个取10 μl混合成质量控制样本（QC），涡旋后取100 μl上样。
采用气相色谱-质谱（GC-MS）进行代谢组学分析。仪器参数设定为：进样口温度280 ℃，EI离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，高纯氦气（纯度<99.999%）作为载气，不分流进样，进样量1.0 μl。升温程序为：初始温度80 ℃，维持2 min，10 ℃/min的速度升至320 ℃，并维持6 min。采用全扫描模式进行质谱检测，质谱检测范围为50~550 m/z。采用随机顺序进行连续样本分析，避免因仪器信号波动造成的影响。
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在R软件平台下采用自写的程序代码进行数据预处理，包括基线过滤、峰识别和积分，然后在TagFinder软件下进行保留时间校正、峰对齐和质谱碎片归属等分析，最后在Excel软件中进行后期编辑，包括来自于柱流失和样本制备造成的杂质峰剔除和定量离子选择等，将最终结果组织为二维数据矩阵，包括变量（保留时间及质荷比）、观察量（样本）和积分面积。本项目共得到1 234个物质（每组样本至少存在80%以上的物质）。将中心化和归一化后的数据导入SIMCA-P V11.0进行主成分分析（PCA）和偏最小二乘法-判别式分析（PLS-DA）进行排列测试以评估模型的质量，生成变量重要性投影（VIP），表示对每种代谢物离子的群间区分的贡献。选择VIP 值>1.0的代谢物用于进一步分析。
所有数据以（
$\bar x$ +s）形式表示，使用one-way ANOVA 和 post hoc Tukey’s 检验，通过 SPSS 17.0 软件计算P值，以P<0.05为差异有统计学意义。 -
假手术组、模型组及给药组Scr水平分别为（9.83±1.95）、（50.83±13.53）、（29.67±4.96）μmol/L；BUN水平分别为（8.08±0.84）、（27.67±5.22）、（16.33±2.69）mmol/L。模型组较假手术组Scr水平、BUN水平均上调；而给药组较模型组均下调，差异均有统计学意义（P<0.05，表1），表明黄连提取物在脓毒症相关急性肾损伤中可改善肾功能。
表 1 黄连提取物对小鼠外周血生化指标的影响
组别 Scr (μmol/L) BUN (mmol/L) 假手术组 9.83±1.95 8.08±0.84 模型组 50.83±13.53* 27.67±5.22* 给药组 29.67±4.96# 16.33±2.69# *P<0.05，与假手术组比较；#P<0.05，与给药组比较。 -
按照上述色谱-质谱条件，分别对各组样品进样分析，得到典型的总离子流图（图1）。
图 1 小鼠肾组织典型的GC-MS总离子流图
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采用PCA方法对各组样本进行整体分析，并通过质量控制样本的聚集程度对系统的稳定性进行考察。根据整体PCA得分图（图2）所示，质量控制样本均聚集良好，其离散度明显低于待分析样本的离散度，表明系统稳定性良好。
图 2 正离子模式下所有样本PCA得分图
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采用PLS-DA方法对假手术组、模型组、给药组样本进行分析。首先对假手术组和模型组单独进行分析，两组在正/负离子模式下的得分图显示，假手术组与模型组区分明显（图3）。进一步对3组样本进行分析，3组在正/负离子模式下的得分图显示，假手术组与模型组有较明显的区分趋势，同时，给药组较模型组有一定程度的回调（图4）。提示脓毒症相关急性肾损伤中，经黄连提取物干预后，代谢物变化发生回调。
图 3 假手术组与模型组的PLS-DA得分图
图 4 假手术组、模型组和给药组的PLS-DA得分图
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S-plot可以很好地反映各个离子对组间差异的贡献程度，离原点越远的点表明其对组间差异的贡献度越大，其VIP值也越大。正离子模式下对照组和模型组的S-plot显示两组间存在差异代谢物（图5）。
图 5 正离子模式下假手术组与模型组S-plot图
在VIP值>1，且3组ANOVA分析以及Turkey两两分析P值均<0.05的条件下，共筛选并鉴别出16个差异代谢物，包括天冬氨酸、甘氨酸、苏氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、酪氨酸、色氨酸、磷酸、苹果酸、柠檬酸、果糖、葡萄糖、松二糖、肌醇，主要参与氨基酸代谢和糖代谢（表2）。在这16个代谢物中，其中8个代谢物水平在黄连提取物干预下发生回调，它们是天冬氨酸、甘氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、柠檬酸、葡萄糖、肌醇。提示黄连提取物可能通过改善脓毒症相关急性肾损伤的代谢物变化从而起到治疗作用。
表 2 脓毒症相关肾损伤差异代谢物及代谢途径
序号 保留时间（t/min） VIP 代谢途径 代谢物 分子式 倍数变化 模型组/假手术组 给药组/模型组 1 7.37 1.37 氨基酸代谢 L-天冬氨酸（L-aspartic acid） C4H7NO4 0.63 1.56 2 10.99 1.36 L-甘氨酸（glycine） C2H5NO2 1.25 0.78 3 12.65 1.49 L-苏氨酸（L-threonine） C4H9NO3 1.18 0.64 4 14.96 2.71 L-脯氨酸（L-proline） C5H9NO2 0.79 0.38 5 15.64 1.48 L-苯丙氨酸（L-phenylalanine） C9H11NO2 1.45 0.18 6 20.52 1.68 L-缬氨酸（L-valine） C5H11NO2 0.84 0.13 7 21.11 1.07 L-酪氨酸（L-tyrosine） C9H11NO3 1.28 0.12 8 25.58 1.93 色氨酸（tryptophan） C11H12N2O2 0.71 0.61 9 10.63 1.69 糖代谢 磷酸（phosphoric acid） H3PO4 0.7 0.99 10 14.13 1.08 L-苹果酸（L-malic acid） C4H6O5 0.9 0.64 11 17.03 1.56 L-苏糖酸（L-threonic acid） C4H8O5 0.81 0.37 12 20.1 1.63 柠檬酸（citric acid） C6H8O7 0.77 1.99 13 20.91 4.44 D-果糖（D-fructose） C7H15NO6 0.82 0.68 14 21.38 1.34 D-葡萄糖（D-glucose） C6H12O6 1.33 0.68 15 22.3 1.91 松二糖（turanose） C12H22O11 0.81 0.66 16 24.27 2.26 肌醇（inositol） C6H12O6 1.34 0.59 -
脓毒症是由机体对感染反应失调所引起的威胁生命的多器官系统功能障碍，而急性肾损伤是最常见的情况，多发生在脓毒症早期。约51%的脓毒症患者会发生急性肾损伤，导致病死率增高41%[6]。与非脓毒症性急性肾损伤比较，脓毒症相关急性肾损伤起病更急、肾功能损害程度更严重、系统性炎症反应更重、器官功能衰竭评分也更高[7]。目前，我们对急性肾损伤发病机制的了解有限，肾血管收缩和肾血流减少导致肾缺血，促炎和抗炎反应的早期激活，以及肾小管细胞的凋亡均可导致肾损伤[8]。由于肾脏是排泄代谢终产物的主要器官，故其损伤必然会引起肾脏代谢状况的改变。
近年来，中草药在世界范围内得到越来越多的认可，而黄连以其泻火解毒、清热燥湿的功效被广泛使用。黄连的主要成分包括小檗碱、巴马汀、药根碱等生物碱类[9]。大量研究表明，黄连具有抗菌、消炎、抗高血压、抗氧化、降糖和降胆固醇的作用，具有很强的临床使用意义[10]。Huang等[11]研究发现黄连解毒汤能通过抑制炎症反应延长脓毒症大鼠的生存时间，有效保护心肌细胞。Zhang等[12]证实黄连对慢性肾功能衰竭大鼠的肾功能有一定的改善作用。代谢组学通过考察生物体受刺激后代谢产物的变化，以研究生物体代谢途径，研究对象包括代谢中间产物或终产物等体内小分子代谢物[13]。黄连对脓毒症相关的急性肾损伤有何影响，是否具有保护作用，本研究利用基于GC-MS的代谢组学对此进一步探讨。
本研究通过代谢组学研究，发现共有16个代谢物与脓毒症相关急性肾损伤有关，主要参与氨基酸代谢和糖代谢。在这些代谢物中，有8个代谢物在黄连提取物干预后发生回调。
在氨基酸代谢中，天冬氨酸水平在脓毒症相关急性肾损伤中降低，甘氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸水平升高，这些代谢物在黄连提取物干预后都发生了回调。既往研究提示，脓毒症相关急性肾损伤的肾组织中，天冬氨酸和苏氨酸水平均降低[8]，可能是由于防御和修复过程中的蛋白质合成增加了氨基酸的消耗，这与本课题组的结果存在部分差异，可能需要进一步通过血液及尿液样本进行研究及探讨。甘氨酸作为一种抗炎、抗氧化的保护剂，有研究提示甘氨酸衍生物可以通过减轻脂质过氧化从而改善肾缺血/再灌注损伤[14]。有趣的是，另有研究显示甘氨酸通过激活N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受体加重氧化应激以及肾缺血/再灌注损伤[15]。因此，课题组推测脓毒症相关急性肾损伤中，甘氨酸水平升高一方面可能起到自我保护作用，而另一方面可能加重肾损伤；黄连提取物可能通过减少甘氨酸从而抑制NMDA受体的激活，减轻脓毒症相关急性肾损伤。苯丙氨酸通过苯丙氨酸羟化酶生成酪氨酸，在慢性肾脏病患者中，苯丙氨酸水平升高，酪氨酸水平降低，这可能与苯丙氨酸羟化酶活性降低相关[16]。而在脓毒症相关急性肾损伤中，苯丙氨酸及酪氨酸水平均升高，提示该过程中苯丙氨酸羟化酶活性可能未发生明显变化，而可能与其他代谢途径相关。对甲酚硫酸盐作为一种尿毒症毒素，为肠道细菌代谢酪氨酸、苯丙氨酸的产物。在脓毒症情况下，肠道微环境收到干扰[17]，我们推测苯丙氨酸及酪氨酸水平的升高可能进一步引起对甲酚硫酸盐水平的升高，加重肾损伤。既往有研究提示，黄连可以调节肠道菌群[18]，我们推测黄连可能通过联合改善内源代谢变化和调节肠道环境对脓毒症相关急性肾损伤起到保护作用。
在糖代谢中，柠檬酸水平在脓毒症相关急性肾损伤中降低，葡萄糖和肌醇水平升高，这些代谢物在黄连提取物干预后都发生了回调。曾有研究表明，柠檬酸循环是脓毒症中受影响最大的代谢途径[19]。在脓毒症相关急性肾损伤模型中，三羧酸循环/氧化磷酸化过程减弱，糖酵解过程增强，这一代谢重编程现象称为瓦博格效应[20]。柠檬酸水平的降低也验证了这一现象。葡萄糖水平升高的可能原因是糖异生维持内源性葡萄糖生成，以防止低血糖的发展，从而建立脓毒症耐受性[21]。脓毒症时，体内迅速升高的升糖激素和前炎性因子加重了这一现象。但是，糖异生过程增强可能进一步减弱氧化磷酸化过程，我们推测黄连提取物可能通过抑制糖酵解、增强氧化磷酸化，从而增强机体抗炎能力，减轻脓毒症相关急性肾损伤。
本研究尚有一些不足之处，主要在于分析黄连提取物功效时局限于脓毒症的某一时间点，而不能获知脓毒症相关性急性肾损伤全病程中肾损伤的情况，以及黄连提取物对肾脏的保护作用。其次，收集样本的手段比较简单，难以消除潜在的影响因素。总之，黄连提取物可能通过改善脓毒症相关急性肾损伤的代谢物变化从而起到治疗作用，但其中的机制还有待进一步研究。这一研究结果表明，黄连具有成为脓毒症相关急性肾损伤新的治疗手段的潜质，尽管可行性需要更多验证，但为治疗脓毒症相关急性肾损伤提供了新的思路。
The protective effect of Rhizoma Coptidis extracts against the sepsis associated with acute kidney injury based on metabolic analysis
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摘要:
目的 探讨黄连提取物（Rhizoma Coptidis extracts，RCE）对脓毒症相关急性肾损伤的影响及潜在机制。 方法 将C57BL/6小鼠分为假手术组、模型组以及治疗组3组；采用试剂盒检测血清肌酐（serum creatinine，Scr）及尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）水平；采用气相色谱-质谱进行代谢组学分析。 结果 模型组较假手术组Scr、BUN水平均上调；而治疗组较模型组均下调，差异均有统计学意义（P<0.05）。代谢组学分析共获得16个代谢物可能与脓毒症相关急性肾损伤过程有关，主要参与氨基酸代谢和糖代谢。在这16个代谢物中，8个代谢物水平在黄连提取物干预下发生回调。 结论 黄连提取物可能通过改善脓毒症相关急性肾损伤的代谢物变化从而起到治疗作用。 Abstract:Objective To investigate the potential mechanism of Rhizoma Coptidis extracts (RCE) against sepsis associated with acute kidney injury. Methods C57BL/6 mice were divided into sham group, model group and RCE treatment group. The levels of Scr and BUN were measured by test kits. Gas chromatography-mass spectrometry was used to analyze metabolic changes in kidneys. Results The levels of Scr and BUN were increased in the model group than sham, which were reversed by RCE. 16 metabolites related to the progress of sepsis associated with acute kidney injury were detected, which were involved in amino acid metabolism and carbohydrate metabolism. Among these metabolites, the level of 8 metabolites can be reversed with RCE treatment. Conclusion RCE might exert therapeutic effects in sepsis associated with acute kidney injury by altering multiple metabolic pathways. -
Key words:
- sepsis /
- acute kidney injury /
- Rhizoma Coptidis /
- metabonomics
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西罗莫司（sirolimus，SRL），又称雷帕霉素，是第三代免疫抑制剂，在临床上常用于抑制肝、肾等器官移植后的免疫排斥反应。SRL属于生物药剂学分类Ⅱ类药物，在水中的溶解度极低，而渗透性良好[1-4]。SRL药理活性高，但因水溶性差，且易被肠壁和肝中的CYP3A4同工酶广泛代谢，致使其口服生物利用度较低。这是临床应用SRL的重要缺陷之一。目前，已上市的SRL制剂主要是纳米结晶片，生物利用度约为17%[5-7]。
通过适当的制剂技术提高SRL在胃肠道中的溶解度，可提高其口服生物利用度。在前期研究中，课题组分别独立进行了含SRL的自微乳（self-microemulsifying drug delivery system，SMEDDS）、固体分散体（solid dispersion，SD）和纳米结构脂质载体（nanostructured lipid carriers，NLC）的构建，均显著改善了SRL的体外溶出。本实验在前期研究的基础上，新增环糊精衍生物对SRL的增溶研究，结合体外溶出度和体内生物利用度，综合分析和评价各增溶制剂的优势和缺陷，从而为解决口服难溶性药物的研究提供参考。
1. 仪器与试剂
1.1 仪器
Agilent 1200型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；Starter 2C型pH计(上海奥豪斯仪器公司)；RCZ-6BZ型药物溶出仪(上海黄海药检仪器公司)；真空冷冻干燥箱(北京博医康试验仪器公司)；NS1001L2K高压匀质机(意大利NiroSoavi公司)；UV-2800AH型紫外可见分光光度仪(上海优尼科仪器有限公司)；液相色谱-质谱联用仪(美国AB-SCIEX有限公司)。
1.2 试剂
SRL对照品(含量99.9%)、SRL原料药(含量99.6%)，购自福建科瑞药业有限公司；子囊霉素对照品(上海齐奥化工科技有限公司)，Rapamune®(美国惠氏制药)。聚乙二醇6000(PEG 6000）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP K30）均购自国药集团化学试剂有限公司；聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(Poloxamer 188)、聚氧乙烯35蓖麻油(Cremophor EL）、聚氧乙烯氢化蓖麻油(Cremophor RH40）均购自德国BASF公司；油酸聚乙二醇甘油酯(Labrafil M1944CS)、二乙二醇单乙基醚(Transcutol P)、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯(Labrasol)、棕榈酸硬脂酸甘油酯(Precirol ATO5)、月桂酸聚乙二醇甘油酯 (Gelucire 44/14)均购自法国GATTEFOSSE公司；HP-β-CD、DM-β-CD、SBE-β-CD(山东滨州智源生物科技有限公司)。
2. 方法
2.1 SRL含量测定方法
采用高效液相色谱仪（HPLC）测定样品中的SRL含量[8]。色谱柱为Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-甲醇-水（45∶34∶21），流速为1 ml/min，检测波长为278 nm，柱温为50 ℃，进样量为20 μl。配制浓度为2、4、8、12、16、20 μg/ml的SRL对照品溶液，得标准曲线为Y=54.712X+1.221，r=0.999 9，表明在2~20 μg/ml浓度范围内线性关系良好。另外，精密度、回收率符合要求。
2.2 SRL增溶方法
2.2.1 SRL-SMEDDS的制备
参考前期研究[9]，称取1 g SRL原料药，加入19 g的助乳化剂Transcutol HP，超声至全部溶解后，加入22 g油相Labrafil M1944CS及39 g乳化剂Cremophor EL，涡旋混匀，得到淡黄色澄清溶液，即SRL-SMEDDS。
2.2.2 SRL-NLC的制备
参考前期研究[10-11]，取Gelucire44/14和Crodamol GTCC在75 ℃水浴中完全熔融后，加入SRL原料药搅拌均匀成澄明油相，再将同温度吐温−80的水溶液迅速倒入油相，以300 r/min搅拌30 min制备初乳，再经高压匀质机90 MPa乳匀5次，即得SRL-NLC分散液，其中SRL为0.21%，Gelucire44/14:Crodamol GTCC（1∶2.1），脂质总量为10%，吐温−80为7.33%。随后，将SRL-NLC（42.6%）加入微晶纤维素和聚乙烯吡咯烷酮（50%，4∶1）中，研磨混合并放置过夜以充分吸附，加入甘露醇（冻干保护剂，3%），经冷冻干燥过夜后，所得固体粉末中加入低取代羟丙基纤维素（崩解剂，4%）和二氧化硅（助流剂，0.4%）即得固化纳米脂质体。
2.2.3 SRL-SD的制备
采用溶剂-熔融法制备SRL-SD。称取载体材料，于80 ℃水浴加热熔融，滴入SRL乙醇溶液，充分混匀，待乙醇挥发完全后，迅速将其倾倒于冰浴条件下的不锈钢板上成薄膜，固化，再于−18 ℃放置4 h后，将固体分散体从不锈钢板上刮下，置真空干燥器中干燥，待脆化后研细，过80目筛，即得SRL-SD。以载体种类、药物-载体比例为考察因素，以0.4% SDS中的溶出度为指标，对SRL-SD进行单因素分析。
2.2.4 SRL-IC的制备
称取适量β-环糊精衍生物溶于去离子水中，缓慢滴加SRL乙醇溶液，在一定温度下磁力搅拌至澄清透明，减压挥发4 h，使乙醇挥发完全，再置于4 ℃冰箱冷藏12 h，降低SRL的溶解度，从而使游离的SRL发生结晶。经0.22 μm微孔滤膜过滤除去结晶，滤液冷冻干燥24 h，所得固体研磨细化，过80目筛，即得SRL-IC。
称取一定量的SRL-IC置10 ml容量瓶中，加入50%甲醇水溶液，超声至全部溶解后，定容至刻度，并采用HPLC测定SRL含量，根据公式：包封率（%）=[（SRL投入量-SRL测定量）/ SRL投入量]×100%，进行计算。以环糊精衍生物的种类、浓度、温度、乙醇体积和投药量为考察因素，以包封率为指标，对SRL-IC进行单因素分析。
2.3 体外溶出试验
参考《中国药典》2015年版四部通则0931项下溶出度与释放度测定法，考察SRL原料药、市售片（Rapamune®）、SRL-SMEDDS、SRL-NLC、SRL-IC及SRL-SD的溶出曲线。除市售片外，其余样品均装入硬胶囊中，每个胶囊含1 mg SRL。采用桨法，搅拌速度为100 r/min，溶出介质体积为250 ml，分别以0.4% SDS、水、pH 1.2盐酸溶液、pH 4.5醋酸盐缓冲液、pH 6.8磷酸盐缓冲液、pH 7.4磷酸盐缓冲液为溶出介质。将两颗胶囊或药片置于沉降篮中，投入溶出介质，在10、30、45、60、90、120 min，吸取2 ml介质，并补充等温等体积的介质，采用HPLC测定样品中的药物含量，绘制溶出曲线。
2.4 体内药代动力学试验
选用比格犬为实验动物，采用6周期6交叉实验设计，进行SRL原料药、市售片（Rapamune®）、SRL-SMEDDS、SRL-NLC、SRL-IC及SRL-SD的药代动力学试验。给药剂量为1 mg SRL，实验动物试验开始前12 h禁食不禁水，给药4 h后自由饮水，2次给药间隔2周以上的清洗期。于给药前，0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、24、36、48及72 h分别经前肢小静脉采血2 ml，置于含肝素和EDTA的抗凝管中，−20 ℃保存备用。血样处理与测定方法参照课题组前期研究[12]。
3. 结果
3.1 SRL-SD的制备
3.1.1 载体种类
如图1A所示，不同载体材料制备的SRL-SD的溶出曲线显示了明显的差异，溶出速率为PEG6000>F68>PVP K30>HPMC606>HPMC-AS-MF。同时，各载体材料的溶出度均不理想（≤50%），因此进一步考察采用二元载体制备SRL-SD。
选择PEG6000联合F68制备二元载体固体分散体[13]，两者比例为3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3。随PEG6000/F68比例的增大，则SRL溶出度呈增大趋势，在PEG6000/F68为2∶1时的溶出度达到最大（图1B）。
3.1.2 药物-载体比例
在PEG6000/F68=2∶1的基础上，进一步考察药物-载体比例对SRL-SD溶出的影响。药物-PEG6000/F68载体比例为1∶2∶1、1∶4∶2及1∶6∶3所制的SRL-SD的溶出曲线相似，没有明显差别，2 h的溶出度都接近100%（图1C）。因此优选载药量最大，即药物- PEG6000/F68载体比例为1∶2∶1。
3.2 SRL-IC的制备
3.2.1 β-环糊精衍生物种类
在其他条件相同的情况下，HP-β-CD、SBE-β-CD和DM-β-CD对SRL的包封率分别为（11.21±3.35）%、（8.24±3.11）%和（31.86±3.26）%，见图2A。因此，优选DM-β-CD制备SRL-IC。
图 2 单因素考察包合物的制备工艺对包合率的影响A.β-环糊精衍生物种类的影响，**P<0.01，与DM-β-CD比较；B. 温度的影响，**P<0.01，与10 ℃比较；C. 环糊精衍生物浓度的影响，*P<0.05，与200 mg/ml比较；D. 乙醇体积的影响；E. SRL投药量的影响3.2.2 温度
采用DM-β-CD制备SRL-IC，考察不同温度对包封率的影响。结果显示（图2B），温度越低，包封率越高，10 ℃条件下制备的SRL-IC的包封率显著高于30 ℃和50 ℃（P<0.01），为（58.61±4.16）%。因此，优选10 ℃制备SRL-IC。
3.2.3 环糊精衍生物浓度
DM-β-CD的浓度由200 mg/ml增大至300 mg/ml，SRL的包封率由（52.12±4.17）%增大至（58.61±4.11）%（P<0.05，图2C）。进一步增大DM-β-CD的浓度至600 mg/ml，包封率没有明显变化（P>0.05）。因此，优选DM-β-CD的浓度为300 mg/ml制备SRL-IC。
3.2.4 乙醇体积
乙醇体积由0.5 ml增大至2 ml，包封率呈增大趋势（图2D）。因此，优选乙醇体积为0.5 ml制备SRL-IC。
3.2.5 投药量
SRL的投药量6 mg增大至8 mg，包封率显著降低，6 mg SRL的包封率为（95.21±1.10）%，见图2E。因此，优选SRL的投药量为6 mg。
3.3 体外溶出度
考察SRL-SD、SRL-IC、SRL-SMEDDS及SRL-NLC在不同介质中的溶出曲线。如图3所示，在0.4% SDS中，各制剂在2 h的溶出度均超过80%，尤其是SMEDDS和NLC的溶出度接近100%。
在pH 6.8和水中，SRL-SD的溶出速率减小，2 h的溶出度分别为（65.00±4.90）%和（76.70±1.95）%。在pH 4.5和pH 7.4的介质中，SRL-SD的溶出在1 h达到最大值，分别为（53.20±4.34）%和（55.20±4.34）%，随后溶出度逐渐降低。在pH 1.2的介质中，未检测到SRL。
在水、pH 4.5、pH 6.8和pH 7.4中，SRL-IC在40 min内的溶出速率有所减小，但2 h的累积溶出没有明显变化，均在80%以上。在pH 1.2的介质中，SRL-IC的溶出度在30 min达到最大值，为（49.84±7.21）%，随后溶出度逐渐降低。
SRL-SMEDDS和SRL-NLC显示了与SRL-SD相似的溶出趋势，即在水和pH 6.8中的溶出度低于0.4% SDS，但大于80%。在pH 4.5和pH 7.4的介质中，溶出达到峰值（约80%）后逐渐降低。
3.4 比格犬体内药动学试验
SRL血药浓度-时间曲线见图4，经DAS 3.2.6软件处理后，具体参数见表 1。
表 1 非房室模型体内药动学参数（$ \bar x$ ±s）参数 SRL SRL-SD SRL-IC SRL- NLC SRL-SMEDDS Rapamune® AUC0→72(µg·h/ml) 0.70±0.13 2.06±0.79 3.66±2.64 8.60±2.03 10.76±1.57 11.02±2.73 AUC0→t(µg·h/ml) 0.73±0.15 2.07±0.81 3.78±2.84 8.67±1.95 11.15±2.11 11.75±3.13 t1/2 (t/h) 16.53±1.50 14.50±2.15 20.64±5.45 8.97±6.87 12.97±5.67 14.54±5.67 tmax(t/h) 1.04±0.25 1.25±0.28 1.04±0.25 1.13±0.31 1.50±0.38 1.83±0.26 cmax (ng/ml) 0.16±0.05 0.36±0.05 0.53±0.13 0.90±0.09 1.23±0.07 1.28±0.13 以原料药为参比制剂，SRL-SD、SRL-IC、SRL-SMEDDS、SRL-NLC、Rapamune®的相对生物利用度分别为332.8%、522.9%、1 228.6%、1 537.1%、1 574.3%，表明各增溶方法都显著提高了SRL的生物利用度。
以市售纳米晶片Rapamune®为参比制剂，SRL-SD、SRL-IC、SRL-NLC、SRL-SMEDDS的相对生物利用度分别为18.7%、33.2%、78.0%、97.6%，可见在各增溶方法中，SMEDDS对SRL体内吸收的作用最显著，与市售制剂相当。
4. 讨论
本研究同时制备和比较了SRL的4种增溶制剂，均显示了良好的体外溶出度。同时，各制剂都提高了SRL的生物利用度，但体内吸收程度有较明显的差异。
首先，SRL本身的性质是影响体内吸收的重要因素。在理化性质方面，SRL在电解质溶液中可发生开环水解，特别是在强酸和碱性条件下，降解速率显著增加[14]。在生理因素方面，SRL是肠道内CYP3A4酶和P糖蛋白的底物，对肠道吸收有较大影响[15]。
其次，制剂本身的特点对体内吸收有重要影响。SMEDDS和NLC均可形成纳米级的脂质微粒，在胃肠道消化后可形成乳糜胶束[16-17]均减轻了胃肠液的pH对SRL的降解作用，因此SMEDDS和NLC对脂质微粒中的SRL有一定的保护作用。相比之下，SD中的SRL快速释放后，载体材料失去了对药物的隔离保护作用，导致SRL在极短的时间内发生降解。另外，环糊精的空腔可以容纳药物分子[18]，不仅提高了SRL的溶解度，而且降低了H+和OH-对SRL的作用概率，减缓了SRL的降解。本研究的体外溶出试验也证实了不同增溶制剂中SRL稳定性的差异。
同时，SMEDDS的辅料Labrafil M1944 CS和Cremophor EL[9, 19-21]和NLC中的脂质及其代谢产物能够抑制CYP3A4酶的代谢和P糖蛋白外排，消化后形成的乳糜胶束还可通过淋巴途径吸收[22]，从而提高了生物利用度[10-11]。
另外，由于SRL分子量较大，分子结构可能仅有部分插入环糊精的空腔中。因此，尽管环糊精提高了SRL的溶出度，但包合物的稳定性较差，进入胃肠道后，药物可被胃肠液中的成分替换[23]，导致SRL加速降解或发生重结晶，进而生物利用度下降。
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表 1 黄连提取物对小鼠外周血生化指标的影响
组别 Scr (μmol/L) BUN (mmol/L) 假手术组 9.83±1.95 8.08±0.84 模型组 50.83±13.53* 27.67±5.22* 给药组 29.67±4.96# 16.33±2.69# *P<0.05，与假手术组比较；#P<0.05，与给药组比较。 
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表 2 脓毒症相关肾损伤差异代谢物及代谢途径
序号 保留时间（t/min） VIP 代谢途径 代谢物 分子式 倍数变化 模型组/假手术组 给药组/模型组 1 7.37 1.37 氨基酸代谢 L-天冬氨酸（L-aspartic acid） C4H7NO4 0.63 1.56 2 10.99 1.36 L-甘氨酸（glycine） C2H5NO2 1.25 0.78 3 12.65 1.49 L-苏氨酸（L-threonine） C4H9NO3 1.18 0.64 4 14.96 2.71 L-脯氨酸（L-proline） C5H9NO2 0.79 0.38 5 15.64 1.48 L-苯丙氨酸（L-phenylalanine） C9H11NO2 1.45 0.18 6 20.52 1.68 L-缬氨酸（L-valine） C5H11NO2 0.84 0.13 7 21.11 1.07 L-酪氨酸（L-tyrosine） C9H11NO3 1.28 0.12 8 25.58 1.93 色氨酸（tryptophan） C11H12N2O2 0.71 0.61 9 10.63 1.69 糖代谢 磷酸（phosphoric acid） H3PO4 0.7 0.99 10 14.13 1.08 L-苹果酸（L-malic acid） C4H6O5 0.9 0.64 11 17.03 1.56 L-苏糖酸（L-threonic acid） C4H8O5 0.81 0.37 12 20.1 1.63 柠檬酸（citric acid） C6H8O7 0.77 1.99 13 20.91 4.44 D-果糖（D-fructose） C7H15NO6 0.82 0.68 14 21.38 1.34 D-葡萄糖（D-glucose） C6H12O6 1.33 0.68 15 22.3 1.91 松二糖（turanose） C12H22O11 0.81 0.66 16 24.27 2.26 肌醇（inositol） C6H12O6 1.34 0.59
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