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丙硫氧嘧啶（propylthiouracil），为硫脲类化合物，它可通过抑制甲状腺内过氧化物酶系统，阻止酪氨酸的碘化及碘化酪氨酸的缩合，从而抑制甲状腺激素的合成，是临床常用的治疗甲亢的药物[1-3]。其口服吸收迅速，约1~1.5 h达血药浓度峰值；代谢快，24 h内约有35%的药物以原型和葡萄糖醛酸化物的形式从尿中排出，血浆半衰期约为1~3 h[4]。口服丙硫氧嘧啶个体差异较大，由于其血浆蛋白结合率高（约为80%），且存在肝毒性，因此对其进行血药浓度监测，能使药物应用更为安全合理[5-6]。进口丙硫氧嘧啶的价格昂贵，研发高质量、低价格的国产仿制药具有良好的经济效益和社会效益[7]，开发高效稳定的丙硫氧嘧啶的血药浓度测定方法，可为仿制药一致性评价中的生物等效性试验（BE）提供依据。
目前，丙硫氧嘧啶的体内测定方法主要为高效液相色谱法（HPLC）[8-10]，早期开发的液相测定方法，分析时间长，专属性和灵敏度均无法满足临床高通量测定的需求，因此，建立简单快速、灵敏准确的丙硫氧嘧啶血药浓度质谱分析方法（MS）具有重要意义。本文建立UPLC-MS/MS法测定人血浆中丙硫氧嘧啶的含量，可为临床治疗药物监测（TDM）和生物等效性试验（BE）提供方法学基础。
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Agilent 1290 UPLC超高效液相色谱（安捷伦科技有限公司，美国），配有在线脱气机、二元泵、低温自动进样器和柱温箱；Agilent 6470 Triple Quad三重四极杆质谱（安捷伦科技有限公司，美国），配有AJS-ESI喷射流电喷雾离子源、MassHunter分析工作站；SECURA125-1CN型十万分之一电子天平、Arium mini超纯水仪（赛多利斯，德国）；Fresco 21低温离心机（赛默飞，美国）。
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对照品丙硫氧嘧啶（批号：100803-201503，纯度>99.4%）购自中国食品药品检定研究院，内标丙硫氧嘧啶-D5（批号：13-EQJ-150-1，纯度>98%），购自Toronto Research Chemicals；甲酸为色谱纯（ACS恩科化学，美国）；甲醇和乙腈为色谱纯（霍尼韦尔，美国）；水为超纯水。
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色谱柱为Agilent SB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相采用甲醇-0.1%甲酸水溶液（80∶20，V/V），等度洗脱；流速：1 ml/min，柱后分流比2∶3；柱温30 ℃；进样量5 μl，分析时间3min。
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采用AJS-ESI源，正离子模式，离子源参数：干燥气温度350 ℃；干燥气流速10 L/min；雾化器压力40 psi；鞘气温度350 ℃；鞘气流速11 L/min；毛细管电压4 000 V。多反应监测（MRM）的参数：丙硫氧嘧啶m/z 171.1→112.1，碎片电压110 V，碰撞能量30 eV；丙硫氧嘧啶-D5（IS）m/z 176.1→117.0，碎片电压110 V，碰撞能量30 eV。丙硫氧嘧啶和氘代内标的保留时间均为1.9 min。
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精密称取丙硫氧嘧啶对照品1.5mg，置于2 ml称量瓶中，用移液器（已校准）加入甲醇适量溶解，涡旋混匀，配成1.0 mg/ml的对照品储备液；取上述对照品储备液适量，用甲醇逐级稀释，配成浓度分别为200、500、1000、2 000、10 000、20 000、40 000、80 000、100 000 ng/ml的系列对照品溶液，置4 ℃冰箱保存，备用。
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精密称取丙硫氧嘧啶-D5对照品1.3mg，置于2 ml称量瓶中，用移液器（已校准）加入甲醇适量溶解，涡旋混匀，配成1.0 mg/ml的内标储备液；取上述储备液适量，用乙腈（含5%甲酸）稀释400倍，得2 500 ng/ml的内标溶液，置于4 ℃冰箱保存，备用。
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取空白血浆950 μl，精密加入“2.2.1”项下制备的丙硫氧嘧啶系列标准溶液50 μl，旋涡混匀，配成浓度分别为10、25、50、100、500、1 000、2 000、4 000、5 000 ng/ml的标准含药血浆。同法制备4个浓度的质控样品（QC），分别为10、25、500、4 000 ng/ml，待用。
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血浆样品先置于室温下解冻，取100 μl血浆，依次加入200 μl内标溶液，200 μl乙腈（含5%甲酸），涡旋1min，于4 ℃下13000×g高速离心10 min，取100 μl上清液于进样瓶中，进行UPLC-MS/MS分析。
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通过比较6个不同健康志愿者的空白血浆样品、质控样品和给药后实际样品的色谱图来评估。分别取空白血浆、质控样品（QC-L）和受试者给药后的血样各100 μl，按“2.3”项下血浆样品前处理方法操作，进样，获得样品的色谱图（图1），包括空白样品色谱图、质控样品色谱图和实际样品色谱图。结果显示，空白血浆中的内源性成分不干扰待测物和内标出峰，选择性良好。
图 1 血浆中丙硫氧嘧啶和内标的典型色谱图
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取“2.2.3”项下制备的标准含药血浆样品100 μl，按“2.3”项下血浆样品前处理方法操作，进样分析，记录色谱图。以待测物血浆浓度为横坐标（X），待测物与内标峰面积比为纵坐标（Y），进行回归，使用1/X 加权，求得回归方程： Y=0.000 4X−0.000 2（r=0.999 3）。结果表明，血浆中的丙硫氧嘧啶在10~5 000 ng/ml范围内线性关系良好。以S/N>10确定，定量下限（LLOQ）10 ng/ml，为标准曲线最低点。
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在LLQQ（10 ng/ml）、QC-L（25 ng/ml）、QC-M（500 ng/ml）、QC-H（4 000 ng/ml）4个浓度下，通过批内和批间分别考察。按“2.2.3”项下制备丙硫氧嘧啶4个浓度质控样品，每个浓度平行5份，按“2.3”项下血浆样品前处理操作，进样分析。并于每天制备4个浓度质控样本各5份，进样分析，连续3 d，计算批内、批间的精密度（RSD）及准确度（RE），批内和批间的RSD<10%， RE<±10%，结果见表1。
表 1 丙硫氧嘧啶精密度和准确度试验结果
浓度(ng/ml) 批内(n=5) 批间(n=15) 精密度(RSD/%) 准确度 (RE/%) 精密度(RSD/%) 准确度(RE/%) 10 3.40 −0.55 8.38 −0.88 25 8.35 −5.59 9.53 1.63 500 7.61 −1.00 6.21 −3.39 4 000 2.90 −2.79 4.71 −5.95 -
取6位健康志愿者的空白血浆，在相当于QC-L（25 ng/ml）和QC-H（4000 ng/ml）的2个浓度下来考察。先按“2.3”项下血浆样品前处理方法制备空白基质上清，然后加入丙硫氧嘧啶及内标的标准溶液，以使其终浓度与处理后QC-L和QC-H一致；同时制备相同浓度不含基质的待测物和内标的乙腈溶液，进样分析。通过峰面积分别计算待测物和内标的基质因子，进一步得到经内标归一化的基质因子。不同基质下，2个浓度基质效应的变异系数均小于5%，符合方法学要求，结果见表2。
表 2 丙硫氧嘧啶的基质效应试验结果(n=6)
浓度(ng/ml) 待测物
基质因子（%）内标
基质因子（%）归一化
基质因子（%）变异系数（%） 25 25.94 23.99 108.18 1.78 4 000 21.91 21.92 100.62 0.66 -
取单一来源的空白血浆，在相当于QC-L（25 ng/ml）、QC-M（500 ng/ml）、QC-H（4 000 ng/ml）的3个浓度下来考察。先按“2.3”项下血浆样品前处理方法制备空白基质上清，然后加入丙硫氧嘧啶及内标的标准溶液，以使其终浓度与处理后QC-L、QC-M、QC-H一致；同时按“2.2.3”和“2.3”项下制备和处理3个浓度的QC样品，每个浓度平行操作5份，分别进样分析。通过峰面积计算待测物的提取回收率，平均回收率为101.60%~113.56%，结果见表3。
表 3 丙硫氧嘧啶的提取回收率试验结果(n=5)
被分析物 浓度(ng/ml) 回收率（%） RSD（%） 丙硫氧嘧啶 25 101.60 5.30 500 113.56 1.72 4 000 108.82 6.26 -
首先通过新鲜配制丙硫氧嘧啶和内标的储备液1.0 mg/ml，考察对照品储备液于4 ℃下放置30 d的稳定性，结果显示，RE<±10%，稳定性良好。然后在QC-L（25 ng/ml）、QC-H（4 000 ng/ml）2个浓度下，分别考察4种条件下丙硫氧嘧啶的稳定性：室温放置4 h、自动进样器（4 ℃）放置24 h，冻融循环3次，以及−80 ℃下冻存30 d，每个浓度平行操作5份。按“2.3”项下血浆样品前处理操作，进样分析，将丙硫氧嘧啶和内标峰面积的比值代入随行标准曲线求得实测浓度，计算RE以及RSD，结果（见表4）显示稳定性良好。
表 4 考察不同条件下丙硫氧嘧啶的稳定性试验结果(n=5)
浓度(ng/ml) 室温放置4h 4 ℃放置24h 冻融循环3次 −80 ℃冻存30 d RE(%) RSD(%) RE(%) RSD(%) RE(%) RSD(%) RE(%) RSD(%) 25 2.82 6.58 1.99 6.00 4.67 4.85 8.17 5.59 4 000 −4.65 6.24 −7.70 4.51 4.82 3.90 3.73 1.93 -
通过在定量上限（ULOQ）5 000 ng/ml完成测定之后立即测定空白样品来评估。结果显示，分析物保留时间处峰面积小于LLOQ的20%，IS保留时间处的峰面积小于实际IS的5%。该方法几乎无残留，不影响测定。
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通过使用空白基质将定量上限（ULOQ）10倍（50 000 ng/ml）和50倍（250 000 ng/ml）浓度的样品稀释至定量范围（10~5 000 ng/ml）来评估，每个浓度平行操作5次。结果表明，RSD和RE均低于15%，样品稀释不影响测定的精密度和准确度。
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常用的样品前处理方法为蛋白沉淀和液液萃取，优先采用简单的蛋白沉淀法。沉淀剂考察了甲醇和乙腈，结果发现乙腈沉淀更完全，在同位素内标下，归一化的基质效应更低，添加5%甲酸后，待测物峰形更好，因此选择乙腈（含5%甲酸）为沉淀剂。进一步考察了血浆与沉淀剂的比例（1∶3、1∶4、1∶5，V/V），结果发现，比例为1∶4时，提取回收率最高，最终选定为前处理方法。
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首先考察了甲醇-水和乙腈-水体系，结果发现，虽然乙腈-水体系的洗脱能力更强，但甲醇-水体系下峰形更佳，血浆中内源性成分与主峰分离完全，基线噪音小。在水相中添加0.1%的甲酸，可以显著提高丙硫氧嘧啶的质谱响应，检测灵敏度令人满意，也可进一步改善峰拖尾。柱后采用了2∶3分流，实际进入质谱的流速约为0.4 ml/min，既保障了色谱柱的最佳流速（1 ml/min），又保证了ESI源的离子化效率，结果稳定可靠。
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丙硫氧嘧啶在正离子模式下的响应明显优于负离子模式，因此确定采用正离子模式检测。采用Optimizer质谱参数优化程序依次对雾化室参数（鞘气温度、鞘气流速、干燥气温度、干燥气流速、雾化器压力、毛细管电压）以及MRM参数（母离子、子离子、碎片电压、碰撞能）进行调节优化，最终依据丙硫氧嘧啶和内标的检测灵敏度，确定了“2.2.2”项下最佳的质谱参数。得益于采用的同位素内标，丙硫氧嘧啶和氘代内标出峰稳定，虽保留时间同为1.9 min，但并没有离子串扰影响，而且归一化的基质效应结果满意。
综上，本文建立了快速简便、灵敏准确的测定人血浆中丙硫氧嘧啶含量的UPLC-MS/MS方法。样品采用简单蛋白沉淀法处理，LLOQ为10 ng/ml，基质效应低，回收率高，每个样本的分析时间3 min，每天可分析超过400样本，满足高通量测定需要。本研究为丙硫氧嘧啶的治疗药物监测（TDM）和生物等效性试验（BE）提供了方法学基础。
Determination of propylthiouracil in human plasma by UPLC-MS/MS
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摘要:
目的 建立UPLC-MS/MS法测定人血浆中丙硫氧嘧啶的含量，为临床治疗药物监测（TDM）和生物等效性试验（BE）提供方法学基础。 方法 采用Agilent SB-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流动相为甲醇-0.1%甲酸水溶液（80∶20，V/V），等度洗脱。质谱采用AJS-ESI源，多反应监测（MRM）正离子模式，检测离子对为：丙硫氧嘧啶m/z 171.1→112.1、内标（丙硫氧嘧啶-D5）m/z 176.1→117.0。 结果 血浆中丙硫氧嘧啶在10~5 000 ng/ml范围内线性关系良好，r=0.999 3；批内和批间的精密度和准确度良好（RSD<10%，RE<±10%）；不同浓度的基质效应均<110%，变异系数<5%；不同浓度的平均回收率为101.60%~113.56%，符合方法学要求。 结论 该方法快速简便、灵敏准确，适用于血浆中丙硫氧嘧啶的含量测定。 -
关键词:
- 超高效液相色谱-串联质谱 /
- 丙硫氧嘧啶 /
- 血浆 /
- 含量测定
Abstract:Objective To establish a method for the determination of propylthiouracil in human plasma by UPLC-MS/MS and provide methodological basis for therapeutic drug monitoring (TDM) and bioequivalence test (BE) in clinical. Methods The chromatographic separation was performed on an Agilent SB-C18 column (4.6 mm×150 mm, 5 μm), the mobile phase was methanol and water containing 0.1% formic acid (80∶20, V/V), isocratic elution. MS condition was optimized in the positive ion detection mode by multiple reaction monitoring (MRM), along with the Agilent JetStream electrospray source interface (AJS-ESI). The precursors to the product ion transitions were m/z 171.1→112.1 for propylthiouracil and m/z 176.1→117.0 for the internal standard (IS). Results The calibration curve was linear in the range of 10−5 000 ng/ml for propylthiouracil in human plasma, r=0.999 3. The intra-day and inter-day precision and accuracy were good (RSD<10%, RE<±10%). The matrix effect of different concentrations was less than 110% and the coefficient of variation was less than 5%. The average recovery of different concentrations was 101.60%−113.56%, which conformed with the requirement of methodological validation. Conclusion The method is rapid, sensitive and accurate, which can be used for the determination of propylthiouracil in human plasma. -
Key words:
- UPLC-MS/MS /
- propylthiouracil /
- plasma /
- content determination
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表 1 丙硫氧嘧啶精密度和准确度试验结果
浓度(ng/ml) 批内(n=5) 批间(n=15) 精密度(RSD/%) 准确度 (RE/%) 精密度(RSD/%) 准确度(RE/%) 10 3.40 −0.55 8.38 −0.88 25 8.35 −5.59 9.53 1.63 500 7.61 −1.00 6.21 −3.39 4 000 2.90 −2.79 4.71 −5.95 
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表 2 丙硫氧嘧啶的基质效应试验结果(n=6)
浓度(ng/ml) 待测物
基质因子（%）内标
基质因子（%）归一化
基质因子（%）变异系数（%） 25 25.94 23.99 108.18 1.78 4 000 21.91 21.92 100.62 0.66
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表 3 丙硫氧嘧啶的提取回收率试验结果(n=5)
被分析物 浓度(ng/ml) 回收率（%） RSD（%） 丙硫氧嘧啶 25 101.60 5.30 500 113.56 1.72 4 000 108.82 6.26
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表 4 考察不同条件下丙硫氧嘧啶的稳定性试验结果(n=5)
浓度(ng/ml) 室温放置4h 4 ℃放置24h 冻融循环3次 −80 ℃冻存30 d RE(%) RSD(%) RE(%) RSD(%) RE(%) RSD(%) RE(%) RSD(%) 25 2.82 6.58 1.99 6.00 4.67 4.85 8.17 5.59 4 000 −4.65 6.24 −7.70 4.51 4.82 3.90 3.73 1.93
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