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食管癌是一种消化道恶性肿瘤，在全球发病率很高且患病人数在逐年上升。2020年全球新发确诊食管癌病例60.4万，因食管癌死亡人数约54.4万，发病率和病死率分别位居全球恶性肿瘤第7位和第6位[1]。我国是全球食管癌发病人数和死亡人数最多的国家，食管癌俨然已成为严重威胁我国国民健康的主要恶性肿瘤之一。在过去的几十年里，食管癌的治疗模式主要是手术切除结合放化疗，但该疗法效果并不理想，预后差，病死率高。近些年，分子靶向治疗和免疫治疗应运而生，打破了食管癌的治疗瓶颈，在食管癌的治疗中发挥重要作用，正逐步成为食管癌的一线治疗方案。本研究综述目前主要的食管癌治疗靶点及其相关靶向药物的研究进展。
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目前，食管癌治疗策略包括手术切除、放化疗、分子靶向治疗及其组合治疗。由于食管癌致病因素复杂，大部分患者确诊时已是中晚期，无法及时采取根治性手术切除，而传统放化疗在消灭肿瘤细胞的同时对体内正常细胞的损伤较严重，产生的毒副作用较大。分子靶向治疗的出现打破了食管癌传统治疗模式的诸多限制，为患者提供了更多的选择性。分子靶向治疗是一种在细胞分子水平上使用靶向特定分子的药物来阻断癌细胞生长和扩散的治疗方式，因为药物针对已经明确的致癌位点，进入体内特异性结合靶点发挥作用，所以也被称作“生物导弹”。理想的靶点对于癌症分子靶向治疗的成功至关重要。通常来说，能够区分癌症细胞和正常细胞的基因，可作为分子靶向药物开发的靶点。近年来，可用于食管癌分子靶向治疗的靶点主要包括表皮生长因子受体（EGFR）、血管内皮生长因子（VEGF）及其受体（VEGFR）、人表皮生长因子受体2（HER-2）、细胞紧密连接蛋白CLAN18、哺乳动物雷帕霉素（mTOR） 、酪氨酸激酶受体（MET）以及凋亡抑制蛋白(XIAP)等。
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EGFR是ErbB受体酪氨酸家族的成员之一，由胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域3个部分组成，其中胞外结构域又包含Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 4个亚域。EGFR属于酪氨酸激酶受体，能引起下游酪氨酸激酶活化。大量研究表明，EGFR的异常表达会加速肿瘤进展[2]。食管鳞状细胞癌（ESCC）中EGFR高表达的频率较高，约为60%~70%，并且是患者不良预后的独立危险因素[3]。因此，以EGFR为靶点的药物可能会对食管癌的临床治疗产生积极的影响。
西妥昔单抗（cetuximab）是对EGFR具有高亲和力的人鼠嵌合型IgG1单克隆抗体，它主要通过与EGFR的结构域Ⅲ相互作用，竞争性阻碍内源性表皮生长因子和其他配体与EGFR结合，阻断细胞内信号传导通路，抑制肿瘤进展。Ruhstaller等[4]在一项临床试验中比较了可切除食管癌患者术前辅助治疗和术后辅助治疗中西妥昔单抗加入与否对疗效以及预后的影响，结果发现西妥昔单抗可显著改善病灶的局部区域控制，且没有增加不良事件的发生率。根据Huang等[5]的报道，在多模式治疗中，加入西妥昔单抗可显著提高转移性食管癌患者的缓解率和疾病控制率 （DCR）。Suntharalingam 等[6]在一项临床试验中评估西妥昔单抗联合同步放化疗对食管癌非手术治疗患者的益处，结果发现西妥昔单抗的使用并未改善患者的总生存期（OS）。这些研究表明，西妥昔单抗是一种安全的治疗选择，但仅针对特定食管癌患者群体获益。尼妥珠单抗（nimotuzumab ）是一种抗EGFR的人源化单克隆抗体，其作用机制与西妥昔单抗相似。Lu等[7]研究发现，在标准紫杉醇和顺铂治疗局部晚期不可切除ESCC中添加尼妥珠单抗是安全有效的，患者的客观缓解率（ORR）和OS显著改善，无毒性积累且耐受性良好。
吉非替尼（gefitinib）与厄洛替尼（erlotinib）都是EGFR酪氨酸激酶抑制剂，均属于小分子化学药物，都是通过抑制酪氨酸激酶自身磷酸化阻止EGFR激活来发挥抗肿瘤作用。Dutton等[8]研究发现，与安慰剂相比，吉非替尼作为食管癌的二线治疗药物并不能改善患者的OS，但对一些预期寿命较短难以手术治疗患者的姑息治疗有益。此外，研究发现扩大淋巴结照射联合厄洛替尼能够显著降低无法手术ESCC的局部复发，同时进行放化疗可改善局部晚期ESCC的长期生存率[9]。因此，吉非替尼、厄洛替尼联合放化疗对食管癌患者有一定疗效，值得进一步验证。
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VEGF是一种重要的细胞因子，在调节血管生成方面发挥关键作用。人体VEGF家族共包括8个成员：VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F、胎盘生长因子（PLGF）以及内分泌腺源性血管内皮生长因子（EG-VEGF）。VEGFR有3种类型，包括VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3。VEGF与VEGFR的相互作用可触发一系列级联反应，导致血管的通透性发生变化，促进细胞增殖、迁移与存活。研究发现VEGF的表达与食管癌患者的进展和预后密切相关，因此靶向VEGF和VEGFR的药物有可能改善食管癌患者的疾病状况[10]。
雷莫芦单抗（ramucirumab）是针对VEGFR-2的全人源IgG1单克隆抗体，可阻断VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D与VEGFR-2的结合。REGARD研究评估雷莫芦单抗单药治疗既往经一线含铂或含氟嘧啶化疗的晚期胃食管结合部癌的疗效，结果显示接受雷莫芦单抗治疗患者的OS显著高于安慰剂组[11]。RAINBOW临床试验研究雷莫芦单抗加紫杉醇对比安慰剂加紫杉醇治疗晚期食管腺癌或胃食管结合部癌的疗效，结果显示雷莫芦单抗的加入显著提高了患者的OS[12-13]。综上所述，多项研究支持使用雷莫芦单抗或使用雷莫芦单抗联合紫杉醇作为晚期胃食管结合部癌的二线治疗方案。
阿帕替尼（apatinib）是我国自主研发的新型酪氨酸激酶抑制剂，具有高度选择性，可与VEGFR-2相互作用。Li等[14]研究阿帕替尼单药治疗不可切除的转移性食管癌患者或化疗难治性食管癌患者的有效性及安全性，结果显示使用阿帕替尼作为食管癌的二线治疗有效，且与治疗有关的不良反应均在可接受范围内。该研究表明，如果能控制好原发性肿瘤进展，不严重侵犯气管、支气管或危及主要血管时，使用阿帕替尼有希望成为化疗难治性ESCC患者安全有效的二线治疗或部分患者更高级别的治疗方法[14-15]。
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HER-2属于ErbB家族的成员，是一种定位于细胞膜表面的酪氨酸激酶，参与细胞生长和分化，是促进肿瘤发展的重要信号传导分子。HER-2高表达的频率在不同类型的肿瘤中有所不同，但普遍与不良预后相关[16]。
曲妥珠单抗（trastuzumab）是一种针对 HER-2 的人源化单克隆抗体。 TOGA实验评估了曲妥珠单抗联合化疗与单纯化疗治疗HER-2阳性晚期胃食管结合部癌患者的疗效与安全性。结果显示，曲妥珠单抗联合化疗能显著延长患者的中位OS，两组不良事件发生率相似[17]。此外，Doi等[18]研究发现，曲妥珠单抗单药在HER-2低表达的晚期胃食管结合部癌的治疗中也可以改善和控制大多数患者的疾病发展。Makiyama等[19]研究发现，曲妥珠单抗联合紫杉醇对一线化疗后无效的HER-2阳性晚期胃食管结合部癌患者无益。虽然曲妥珠单抗已获批为治疗HER-2阳性食管腺癌患者的一线治疗药物，但与其他疗法的联合治疗仍需要临床试验进一步研究。
拉帕替尼（ lapatinib ）是一种口服的，可同时阻断EGFR与HER-2的双酪氨酸激酶抑制剂。研究发现，拉帕替尼与紫杉醇联合使用具有高度协同作用，可显著降低ESCC细胞中EGFR和HER-2的磷酸化，阻断下游信号分子AKT和MAPKs的激活，降低ESCC细胞的侵袭和迁移能力[20]。LOGiC临床研究发现，在XELOX化疗方案（卡培他滨+奥沙利铂）的基础上添加拉帕替尼并不能延长HER-2阳性晚期胃食管腺癌患者的OS，但亚组分析发现，在亚洲人群和一些年轻患者的治疗中添加拉帕替尼，OS有一定的获益，提示未来可针对这方面的相关性作进一步深入研究[21]。
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claudin蛋白是一种正常的上皮紧密连接蛋白，是参与细胞间黏附、维持细胞极性的重要物质。claudin18.2属于CLDN18的一个亚型，在正常的胃黏膜上皮紧密连接的细胞中低表达，但在多种肿瘤细胞中显著上调，且提示与不良预后相关[22]。
佐妥昔单抗（zolbetuximab）是首个针对Claudin 18.2的嵌合型单克隆抗体。临床前研究结果表明，佐妥昔单抗具有良好的安全性和有效性[23]。MONO研究证明佐妥昔单抗单药治疗对Claudin18.2阳性晚期胃食管结合部腺癌患者具有良好的耐受性和活性[24]。FAST系列研究发现，与单独使用化疗方案EOX（表阿霉素+奥沙利铂+卡培他滨）相比，在一线EOX治疗中添加佐妥昔单抗可显著延长转移性Claudin18.2阳性胃食管结合部腺癌患者的无进展生存期（PFS）和OS，使患者维持更长时间的良好生活质量[25-26]。因此，佐妥昔单抗与一线化疗药物联合治疗Claudin18.2阳性晚期胃食管腺癌可能是一种不错的选择。
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MET是一种酪氨酸激酶受体,也是目前唯一已知的肝细胞生长因子（HGF）的受体。研究证实HGF及c-Met在各种类型的癌症中高表达，且普遍与不良预后相关。它们主要通过激活RAS-MAPK及PI3K-AKT信号通路，促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移。研究发现， MET高表达与食管癌的侵袭转移、临床分期和不良预后密切相关[27]。因此，许多靶向HGF/c-Met途径的药物也在开发应用于食管癌的治疗。
利妥木单抗（rilotumumab）是一种针对HGF的全人源化IgG2单克隆抗体,可选择性靶向和中和HGF，从而阻止下游信号通路的异常激活。一项Ⅱ期临床研究结果显示，利妥木单抗联合表柔比星、顺铂和卡培他滨（ECX）治疗晚期胃食管结合部癌比安慰剂加 ECX 具有更好的活性，但外周水肿、中性粒细胞减少、贫血等不良反应的发生率高于安慰剂组[28]。而RILOMET-1 Ⅲ期临床研究结果显示，与ECX相比，利妥木单抗联合ECX对晚期胃食管结合部癌患者并无益处[29]。因此，利妥木单抗对改善MET 阳性胃食管结合部癌患者的临床研究仍然需要进一步确证。
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哺乳动物雷帕霉素（mTOR）是一种丝-苏氨酸蛋白激酶，主要通过PI3K/AKT/mTOR途径调控细胞增殖、存活、代谢及蛋白质合成等多种生理功能，该途径的失调与肿瘤的发生和发展密切相关。Chuang等[30]研究发现磷酸化哺乳动物雷帕霉素蛋白(p-mTOR)表达与 ESCC 临床分级相关。体外实验证明，mTOR通路在大多数ESCC中存在异常激活，mTOR和p-mTOR 的高表达被证实是影响ESCC总体生存率的独立不良预后因素[31]。
依维莫司(everolimus)是mTOR的口服蛋白激酶抑制剂，体内外研究证明，作为单药或与顺铂联合使用均对ESCC具有抑制效果，可能是一种有前景的抗ESCC药物[32]。
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凋亡抑制蛋白（IAP）是一类具有抑制细胞凋亡功能的同源性蛋白家族。X 连锁凋亡抑制蛋白 （XIAP）是IAP家族最具特征、作用最强的成员。XIAP可以通过其BIR、RING结构域直接结合并抑制胱天蛋白酶-3、7、9发挥抗凋亡作用，也可以通过RING结构域自身调节使胱天蛋白酶泛素化阻断凋亡通路[33]。XIAP在多种恶性肿瘤中高表达[34]。Peng等[35]研究发现，XIAP基因多态性（rs8371和rs9856）与ESCC易感性相关，rs8371多态性可作为改善 ESCC 患者临床疗效和预后的指标。Dizdar等[36]也证明XIAP可以作为ESCC的预后标志物。Jin等[37]研究发现，XIAP可能通过激活TGF-β介导的上皮间充质转化来促进ESCC的迁移，同时证明XIAP高表达与ESCC的不良预后显著相关。因此XIAP可能是ESCC治疗的一个新的潜在靶点。
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除了靶向食管癌细胞的内在信号外，免疫治疗也是食管癌治疗的一个热门研究领域，其主要是通过增强免疫细胞的功能和特异性来抑制癌症进展。通常，抗原呈递细胞，特别是树突状细胞，可以识别和加工肿瘤细胞的表面抗原，并将其呈递给T或B淋巴细胞以产生适应性反应，该适应性免疫反应对于肿瘤细胞的清除发挥着至关重要的作用。然而，肿瘤细胞可以通过多种方式来逃避免疫攻击。比如通过表达免疫检查点蛋白分子抑制T细胞免疫来逃逸T细胞的监视和攻击。近年来，食管癌的免疫治疗得到了飞快的发展，它可以重建免疫细胞的识别和杀伤能力防止肿瘤细胞免疫逃逸，从而使免疫反应正常进行。目前，食管癌的免疫治疗主要涉及程序性细胞死亡受体1（PD-1）、程序性细胞死亡配体1（PD-L1）和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）。
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PD-1是CD28受体家族的成员之一，作为一种共抑制受体在肿瘤特异性T细胞上高度表达。研究发现，PD-1在T细胞上的持续表达会导致T细胞衰竭[38]。PD-1的配体PD-L1在人类的多种癌细胞中表达，通过与T细胞上的PD-1结合逃避自身机体免疫系统的杀伤作用。因此，当阻断T细胞上的PD-1与肿瘤细胞上的PD-L1结合时，机体就可以有效地启动免疫系统发挥抗肿瘤作用。目前，PD-1/PD-L1抑制剂单独治疗食管癌表现出良好的疗效和安全性，常用药物包括帕博利珠单抗（Pembrolizumab）、纳武利尤单抗（Nivolumab）、卡瑞利珠单抗（Camrelizumab）和特瑞普利单抗（Toripalimab）等。
帕博利珠单抗是一种人源化IgG4单克隆抗体，可结合PD-1受体并阻断其与PD-L1和PD-L2的相互作用。他是首个获得 FDA 加速批准靶向PD-1的抑制剂,也是国内首个获批一线治疗食管癌的 PD-1单抗。KEYNOTE-028 IB期临床研究结果首次证实了帕博利珠单抗在治疗晚期食管癌方面的疗效和安全性[39]。KEYNOTE-180临床试验进一步证实了帕博利珠单抗对既往治疗过的晚期食管癌患者具有持久的抗肿瘤活性和可耐受的安全性[40]。Janjigian等[41]在一项临床试验中证明，将帕博利珠单抗添加到曲妥珠单抗并与化疗药物联合用于HER-2阳性晚期胃食管结合部癌和食管癌患者效果极佳，比此前曲妥珠单抗联合化疗方案报道的数据提高了近 70%。
纳武利尤单抗也是针对PD-1受体的全人源IgG4单克隆抗体。CheckMate-577临床试验结果显示，纳武利尤单抗治疗经过手术切除后未达病理完全缓解的食管癌及胃食管结合部癌患者后，患者的无病生存期（DFS）显著延长，超过安慰剂组2倍[42]。CheckMate-648 Ⅲ期临床试验评估了纳武利尤单抗联合化疗（n=321）、纳武利尤单抗联合伊匹木单抗（Ipilimumab，n=325）和单纯化疗（n=324）3种方案治疗晚期ESCC的疗效和安全性，结果显示无论肿瘤PD-L1表达状态如何，纳武利尤单抗联合化疗或伊匹木单抗的一线治疗均比单独化疗显著延长患者的OS[43]。纳武利尤单抗在食管癌辅助治疗及一线免疫治疗适应证方面已在中国获批。
卡瑞利珠单抗是一种国产的具有高亲和性的人源化抗PD-1单克隆抗体，其联合化疗治疗中晚期ESCC在缩瘤降期、诱导病理缓解和安全性方面都表现出色。Yang等[44]的研究显示，卡瑞利珠单抗与白蛋白紫杉醇、卡铂联合治疗II-IIIA期ESCC患者治疗的ORR高达90.5%，DCR达到100%。这种免疫联合化疗的方案已在我国获批用于一线治疗晚期ESCC患者。除此之外，替雷利珠单抗、特瑞普利单抗和信迪利珠单抗都是针对PD-1的单克隆抗体。这些PD-1抑制剂与化疗联合在一线治疗晚期或转移ESCC患者的治疗上展现出突出的优势与安全性，且获益与否不受PD-L1表达水平影响。
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CTLA-4是CD28 受体家族的第2个成员，仅在T细胞中表达。CTLA-4可竞争性阻断CD28与其配体的结合，传递抑制信号，阻断T细胞活化，造成肿瘤细胞的免疫逃逸。研究发现，CTLA-4的表达水平在食管癌中显著上升[45]。因此，靶向CTLA-4的抑制剂可阻断CTLA-4对T细胞活化的抑制作用，增强特异性抗肿瘤的免疫反应。
伊匹木单抗是一种全人源IgG1单克隆抗体，可阻断 CTLA-4 以增强抗肿瘤免疫反应。一项Ⅱ期临床试验评估了伊匹木单抗单药治疗与最佳支持治疗对一线化疗后达到病情稳定的晚期转移性胃食管结合部癌患者的疗效[46]，结果与最佳支持治疗组相比，伊匹木单抗单药治疗患者并没有获益。曲美木单抗（Tremelimumab）是全人源化的IgG2单克隆抗体，一项Ⅱ期临床试验研究了曲美木单抗作为食管腺癌患者二线治疗的可行性，结果显示仅少数患者获益[47]。因此，靶向阻断CTLA-4与抗原相结合用于食管癌的治疗仍需要进一步深入研究。
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食管癌是一种高度异质性肿瘤，其起源、分子特征和独特的肿瘤微环境均会影响临床治疗效果。目前，根据临床分期，早期食管癌的主要治疗方式仍然是手术根治性切除，中晚期患者术后辅助放疗和化疗，晚期和转移性食管癌的标准治疗方法是化疗，但由于食管癌初诊时大多数患者已失去最佳手术根治性切除机会，而放化疗又存在严重不良反应和耐药性问题。因此，迫切需要进一步优化治疗方案。
分子靶向治疗和免疫治疗的发展正如火如荼，方兴未艾，它们的出现为过去几十年食管癌以手术联合放化疗为主的治疗模式带来了全新的突破。在分子靶向治疗领域，使用抗EGFR或VEGF的抗体或口服TKIs产生了令人鼓舞的结果，目前已有靶向HER-2和VEGFR的药物批准用于治疗转移性食管癌。除此之外，许多研究还显示其他多种分子靶向药物在食管癌的治疗中表现乐观，有望进一步纳入临床一线治疗方案。但是，在将靶向药物用于改善治疗结果时，我们不可忽视其可能带来的弊端，如靶向治疗成本高，容易发生耐药性，联合放化疗比单药治疗不良事件的发生率更高，药物调控的信号通路交叉容易引发其他并发症等。除此之外，如何精准筛选能获益人群也是困扰分子靶向治疗临床应用的难题之一。在免疫治疗领域，该疗法已在不同类型的食管癌中显示出治疗潜力，但个体患者的反应差异很大，只有小部分患者在基于PD-1/PD-L1的治疗中受益。因此，如何精准筛选获益人群是食管癌患者接受免疫疗法亟待解决的问题。肿瘤微环境极其复杂，食管癌的治疗可以考虑将不同的免疫疗法或药物与某些常规治疗方法相结合，这样可以最大限度地提高治疗效果，如免疫治疗与放疗或化疗相结合即是一个值得探索的方向。目前，免疫治疗和分子靶向治疗的联合疗法也已经粗有眉目。当然，针对各类基因靶点及其靶向药物以及新的免疫受体的开发仍然是未来食管癌治疗的关键，也是食管癌实现精准治疗的方向。因此，未来亟需大量的基础和临床研究来解决这些难题，为患者提供最佳的治疗策略。相信随着新的靶点不断发现，未来将会出现越来越多针对食管癌的新型治疗方法，最终实现该病的有效控制和治愈。
Research progress on targeted therapy and immunotherapy for esophageal cancer
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摘要: 食管癌是一种在全球发病率和致死率都极高的恶性肿瘤，其致病因素复杂、多样，早期无明显症状，大部分患者在初诊时已是中晚期，预后差。常规手术切除结合放化疗的治疗模式已经不能满足当前疾病的治疗需求，亟需寻找新的治疗策略。分子靶向治疗和免疫治疗是近些年兴起的新型治疗方法，打破了食管癌的治疗瓶颈，已经成为食管癌治疗的重要组成部分。该研究就目前食管癌分子靶向治疗和免疫治疗的主要靶点及其相关靶向药物的研究进展进行综述，为精准医学在食管癌领域的应用提供借鉴。Abstract: Esophageal cancer is a malignant tumor with high incidence and mortality rate in the world and its pathogenic factors are complex and diverse. There are no obvious symptoms in the early stage, and most patients are in the middle to late stage at the initial diagnosis. The prognosis of esophageal cancer is poor. The treatment mode of conventional surgical resection combined with chemoradiotherapy can no longer meet the current treatment needs of disease, and new treatment strategies are urgently needed. Molecular targeted therapy and immunotherapy are new treatment methods that have emerged in recent years, which have broken the therapeutic bottleneck and have been proven to play important roles in the treatment of esophageal cancer. The current research progress of the main targets and their related targeted drugs in molecular targeted therapy and immunotherapy for esophageal cancer were reviewed in this article, which provided reference for the application of precision medicine in the field of esophageal cancer.
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Key words:
- esophageal cancer /
- molecular targeted therapy /
- immunotherapy /
- molecular mechanisms
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阿尔茨海默病（AD）是一种以进行性记忆功能和神经行为障碍为表现的中枢神经系统退行性疾病。目前全球约有AD患者
5000 余万人，随着人口老龄化的进展，这一数字还将持续增加，给全球发展带来巨大的健康和经济负担[1] 。到目前为止，临床尚缺乏有效的AD治疗手段。胆碱酯酶抑制剂、NMDA拮抗剂等传统AD治疗药物效果有限，FDA新批准上市的Aβ单克隆抗体仑卡奈单抗等疗效尚存争议，且治疗费用昂贵[2] 。因此，开发经济、有效的AD治疗药物仍是当前研究热点。中药因其多靶点系统作用和低毒副作用的优势，近年来在AD等复杂疾病治疗药物发掘中发挥重要作用[3] 。中药葛根和知母临床应用历史悠久，葛根解肌退热、生津止渴，知母清热泻火、滋阴润燥，二者配伍可清热生津、滋阴润燥，改善代谢紊乱，对热邪灼津、痰浊阻窍所致的健忘呆钝、消渴等症具有治疗作用，主要代表方剂为玉液汤[4-6] 。近年来研究发现该药对的一些成分如葛根素[7] 、芒果苷[8] 、知母皂苷BⅡ[9] 等对AD具有药效作用。作为一种复杂的异质性疾病，AD的发生与糖尿病存在紧密的因果关联，也被称为脑型糖尿病（3型糖尿病）[10] 。但是目前鲜见葛根与知母配伍后在AD治疗中作用效果的报道。因此，本研究拟通过建立AD大鼠模型考察葛根和知母配伍防治AD的效果，同时运用代谢组学策略探究葛根与知母作为药对配伍后防治AD潜在的作用机制，为中药防治AD研究提供参考借鉴。
1. 材料
1.1 仪器
Agilent
1290 Infinity液相色谱仪和6538 UHD Accurate-Mass 四级杆飞行时间串联高分辨质谱仪（美国安捷伦公司）；HERAEUS FRESCO 17高速冷冻离心机（美国赛默飞公司）；ANALOG 涡旋振荡器（美国奥豪斯公司）；Milli-Q Integral超纯水机（美国Millipore公司）；十万分之一电子分析天平（日本A&D公司）；Digbehav动物行为学分析系统-水迷宫（上海吉量软件科技有限公司）。1.2 药物与试剂
葛根（批号：A220901）与知母药材饮片（批号：
20220201 ）购自上海市白鹿堂中药店，经海军军医大学药学系蒋益萍副教授鉴定为豆科植物野葛P. lobate（Willd.）Ohwi的干燥根和百合科植物知母A. asphodeloides Bge.的干燥根茎；乙醇（分析纯，国药集团上海化学试剂有限公司）； 乙腈、甲酸（均为LC-MS级，赛默飞世尔科技中国有限公司）；乙腈、甲醇（色谱纯，北京迪马科技有限公司）；乌拉坦（批号：P2091859）、D-gal（批号：P1616089）和AlCl3（批号：P2391168）购自上海泰坦科技股份有限公司；生理氯化钠溶液（四川科伦药业股份有限公司）；L-2-氯苯丙氨酸（98%，上海麦克林生化有限公司）；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和一氧化氮（NO）试剂盒购自上海源桔生物科技中心。1.3 实验动物
健康雄性清洁级SD大鼠，体重（200±20）g，购自浙江省实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK（浙）2019-0002。大鼠饲养于海军军医大学药学系实验动物中心，笼饲条件为：温度恒定为（22±2）℃，湿度区间为40%～60%，昼夜循环时间为12 h。
2. 实验方法
2.1 中药提取液制备
分别取葛根、知母和葛根-知母药对（15∶12）粉末适量，以10倍体积70%乙醇浸泡，在85 ℃下加热回流提取90 min，滤过，滤渣以同等条件重复提取2次。合并3次滤液，60 ℃减压浓缩至无乙醇味，制备得到用于灌胃的提取液，密封保存于−20 ℃待用。
2.2 AD模型建立与药效评价
2.2.1 分组与给药
40只SD大鼠适应性喂养1周后按照体重随机分为空白对照组、AD模型组、葛根组、知母组和葛根-知母药对组共5组（n=8）。除对照组外，其余4组大鼠每日给予D-gal 300 mg/kg腹腔注射和AlCl3 200 mg/kg灌胃，连续给药21周建立AD动物模型。对照组每日给予等量的生理盐水（灌胃+腹腔注射）。自第14周起，3个中药干预组分别给予葛根、知母和葛根-知母药对提取液灌胃（相当于生药量：葛根6.25 g/（kg·d），知母5 g/（kg·d），药对11.25 g/（kg·d）。对照组和模型组大鼠灌胃等量纯水。
2.2.2 Morris 水迷宫实验
采用Morris水迷宫行为学实验评价大鼠的学习和记忆能力。水迷宫实验全程共6 d，其中包括5 d的定位航行训练和1 d的空间探索试验。利用动物行为学分析系统记录大鼠在定位航行训练期间每日的逃避潜伏时间和空间探索训练中的运动轨迹、穿越站台次数、各象限的运动距离和停留时间等参数，供分析评价使用。
2.2.3 样本获取与前处理
行为学实验结束后，大鼠腹腔注射乌拉坦麻醉，经腹主动脉取血，静置后，在4 ℃、
4 000 r/min转速下离心10 min，取上清液分装冻存于−80 ℃，供后续分析用。2.2.4 血清MDA、SOD和NO检测
使用ELISA试剂盒，按照说明书步骤检测大鼠血清中的SOD、MDA、NO等氧化应激和脂质过氧化相关指标。
2.3 代谢组学实验
2.3.1 含内标的甲醇溶液配制
精密称取L-2-氯苯丙氨酸适量，加入甲醇溶解得浓度为5 mg/ml的内标母液，随后用甲醇稀释得到浓度为2 μg/ml的内标溶液。
2.3.2 分析样本制备
各取200 μl解冻后的血清样本置于1.5 ml的离心管中，加入600 μl预冷的含内标的甲醇溶液，涡旋2 min后，在4 ℃、
12 500 r/min转速下离心15 min，取上清液供UPLC-Q/TOF-MS分析用。取各样本20 μl，混合得到质控（QC）样本。2.3.3 色谱与质谱条件
色谱条件：反相色谱柱为Waters X Select HSS T3柱（2.1 mm×100 mm, 1.8 μm），亲水作用色谱柱为Waters Acquity UPLC BEH HILIC柱（2.1 mm×100 mm, 1.8 μm）；进样量：2 μl；柱温：40 ℃；流动相为0.1%甲酸-水（A ）和0.1%甲酸-乙腈溶液（B）；T3柱梯度洗脱模式：0~2 min，2%B；2~17 min，2%~98% B；17~19 min，98%B。HILIC柱梯度洗脱模式：0~2 min，95%B；2~4 min，95%~89% B；4~10 min， 89% B；10~12 min， 89%~66% B；12~15 min， 66% B。流速：0.4 ml/min；色谱柱平衡时间：5 min。
质谱条件：采用 ESI 离子源，正、负离子检测模式；干燥气温度，350 ℃，干燥气体流量：11 L/min；毛细管电压：正离子模式为
4 000 V，负离子模式为3 500 V；碎裂电压：120 V；质谱扫描范围：50～1 500 m/z。2.3.4 数据预处理与分析
质谱数据用XCMS程序包进行预处理，按80%原则过滤无效数据并进行内标归一化处理。使用SIMCA 14.1（Umetrics公司，瑞典）进行偏最小二乘判别分析（PLS-DA）和正交矫正偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）并进行模型验证，结合R2X、R2Y和Q2判断模型的拟合效果和预测效果。以变量权重值（VIP）>1、P<0.05且差异倍数（fold change，FC）>1.2或<0.8作为筛选标准，获得AD疾病关联生物标志物。借助HMDB数据库（https://hmdb.ca/）等在线代谢物质谱数据库对筛选得到的差异代谢物进行比对和注释。借助MetaboAnalyst 6.0（https://www.metaboanalyst.ca/）网站进行代谢通路分析。
2.4 统计分析
使用SPSS Statistics 23（IBM公司，美国）和GraphPad Prism 8（Graphpad软件公司，美国）进行统计分析与绘图。两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05认为组间差异具有统计学意义。
3. 实验结果
3.1 AD大鼠模型建立与药效评价
3.1.1 学习和记忆能力评价
以水迷宫实验中大鼠逃避潜伏期、穿越站台所在位置次数以及站台所在象限的停留时间作为评价指标，考察大鼠的学习和记忆水平。结果如图1所示，定位航行训练期间，各组大鼠的逃避潜伏期随训练时间增加均呈下降趋势，其中模型组逃避潜伏期下降趋势较为平缓，对照组和3个中药干预组下降趋势均较模型组显著，对照组和葛根-知母药对组第5日逃避潜伏期较模型组均有极显著差异（P<0.01）。同样，空间探索实验中，模型组大鼠穿越站台次数以及站台所在象限的停留时间较对照组均显著减少，组间差异具有统计学意义（P<0.05）。中药干预后各组大鼠穿越站台次数及目标象限停留时间均有所增加，其中，葛根-知母药对组与模型组间差异具有统计学意义（P<0.05）。结果表明，造模后大鼠的学习和记忆能力出现下降，给予葛根、知母和葛根-知母药对干预均可不同程度改善大鼠的学习和记忆能力，以葛根-知母药对最为显著，效果优于单药。
图 1 不同组别大鼠水迷宫实验结果A.逃避潜伏期；B.目标象限停留时间百分比；C.各组大鼠水迷宫代表轨迹图；D.穿越站台次数 *P<0.05, **P<0.01, 与模型组比较#P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001, 与对照组比较。3.1.2 血清生化指标测定
与对照组相比，模型组大鼠血清NO水平相对升高，MDA水平显著升高（P<0.05），SOD含量极显著降低（P<0.01）。中药干预后，各给药组血清NO和MDA水平出现不同程度降低，其中葛根-知母药对组降低效果最为明显，与模型组间差异具有统计学意义（P<0.05）。葛根、知母和葛根-知母药对给药组血清SOD含量较模型组均有所回调，组间差异具有统计学意义（P<0.05），见图2。
图 2 不同组别大鼠血清SOD（A）、MDA（B）和NO（C）水平*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, 与模型组比较； #P<0.05, ##P<0.01，与对照组比较。3.2 血清代谢组学
3.2.1 血清代谢轮廓和多元统计分析
血清样本经UHPLC-Q/TOF-MS分析后得到各组大鼠血清代谢图谱，不同色谱柱分析条件下各组大鼠血清代谢轮廓存在一定差异。多元统计分析结果表明（图3），在PLS-DA多组分析模型中，空白对照组、AD模型组和3个中药干预组组间区分度较好，组内差异相对较小。PLS-DA模型200次置换检验结果显示，Q2回归线与Y轴截距小于0，R2和Q2曲线斜率始终为正值，且Q2<R2，表明模型未出现过拟合，具有相对可靠的解释和预测能力。在OPLS-DA模型中，不同分析条件下，AD模型组与空白对照组间完全分离，表明模型组与对照组间具有显著组间差异，CV-ANOVA验证结果证实所建立的OPLS-DA模型未出现过拟合，具备解释和预测能力。
图 3 UHPLC-Q/TOF-MS正、负离子模式下T3柱和HILIC柱的PLS-DA与OPLS-DA得分图A-D. UHPLC-Q/TOF-MS正、负离子模式下T3柱和HILIC柱的PLS-DA得分图；E-H. 模型组与对照组间OPLS-DA得分图3.2.2 差异代谢物筛选与鉴定
对T3柱和HILIC柱正、负离子模式下的代谢物信息进行差异化分析，以VIP值>1、P<0.05和FC>1.2或FC<0.8作为筛选标准，对不同模式下空白对照组与AD模型组的差异代谢物进行筛选，并以火山图形式呈现（图4）。图中橙色标记点为显著上调代谢物，蓝色标记点为显著下调代谢物。
利用HMDB数据库对差异代谢物质谱信息进行匹配和鉴定，在AD模型组与对照组间鉴定出70个AD相关的潜在生物标志物，其中由HILIC柱鉴定得到31个代谢物，T3柱鉴定得到45个代谢物，T3和HILIC柱共同鉴定得到的代谢物6个，具体如表1所示。
表 1 差异代谢物鉴定、趋势和相关通路分析结果序号 代谢物 色谱柱 分子质量（m/z） 化学式 加合离子 趋势 相关通路 P 值 1 2-羟基丁酸 T3 127.0362 C4H8O3 M+Na ↑ 丙酸代谢 1.22E-03 2 肌酸 T3 132.0781 C4H9N3O2 M+H ↑# 甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢 6.98E-03 3 脯氨酸 T3、HILIC 138.0553 C5H9NO2 M+Na ↓#* 精氨酸和脯氨酸代谢 4.20E-03 4 L-天冬氨酸 T3 133.0606 C4H8N2O3 M+H ↑# 丙氨酸、天冬氨酸和
谷氨酸代谢2.36E-02 5 L-乙酰基肉碱 T3 204.1218 C9H17NO4 M+H ↑ 不饱和脂肪酸的生物合成 1.26E-03 6 棕榈酰肉碱 T3 400.3424 C23H45NO4 M+H ↑#* 脂肪酸降解 2.38E-04 7 喹啉酸 T3 168.0271 C7H5NO4 M+H ↑ 烟酸和烟酰胺代谢 4.97E-04 8 焦谷氨酸 T3 128.0329 C5H7NO3 M-H ↓# 谷胱甘肽代谢 2.89E-02 9 3b-羟基-5-胆酸 T3 357.2789 C24H38O3 M+H-H2O ↑ − 1.01E-02 10 香草酸 T3 151.0361 C8H8O4 M+H-H2O ↑ − 3.05E-03 11 肌酸酐 T3 136.0491 C4H7N3O M+Na ↑# − 1.89E-04 12 戊烯二酸 T3 153.0198 C5H6O4 M+Na ↑ − 8.96E-03 13 亚油酸 T3 303.2327 C18H32O2 M+Na ↑# 亚油酸代谢 2.45E-02 14 4-羟基丁酸 T3 103.0382 C4H8O3 M-H ↑# − 4.49E-03 15 糖原 T3 689.2111 C24H42O21 M+Na ↑ 淀粉和蔗糖代谢 2.24E-02 16 肉豆蔻酸 T3 211.2038 C14H28O2 M+H-H2O ↑# 脂肪酸生物合成 4.15E-02 17 丙酰肉碱 T3 218.1383 C10H19NO4 M+H ↓# 支链脂肪酸的氧化 1.97E-02 18 硬脂酰肉碱 T3 428.3734 C25H50NO4 M+H ↑#* 长链饱和脂肪酸的
线粒体β氧化2.84E-04 19 花生四烯酸 T3 327.232 C20H32O2 M+Na ↑#* 花生四烯酸代谢 1.53E-02 20 N1乙酰精胺 T3 267.208 C12H28N4O M+Na ↑# 赖氨酸降解 3.71E-02 21 N6, N6, N6-三甲基-L-赖氨酸 T3 189.16 C9H20N2O2 M+H ↑# α-亚麻酸代谢 4.44E-02 22 α-亚麻酸 T3 279.2316 C18H30O2 M+H ↑#* 初级胆汁酸生物合成 2.80E-02 23 24羟基胆固醇 T3 425.343 C27H46O2 M+Na ↑# 半胱氨酸和蛋氨酸代谢 8.17E-04 24 2-氧代-4-甲硫基丁酸 T3 131.0189 C5H8O3S M+H-H2O ↑ 不饱和脂肪酸的生物合成 1.14E-02 25 二十碳五烯酸 T3 285.2212 C20H30O2 M+H-H2O ↑# − 2.45E-02 26 油酰乙醇酰胺 T3 348.2891 C20H39NO2 M+Na ↑# − 8.42E-03 27 吲哚-3-丙酸 T3 190.0858 C11H11NO2 M+H ↓# − 4.79E-04 28 棕榈油酸 T3 237.2193 C16H30O2 M+H-H2O ↑#* − 5.79E-03 29 15（S）-羟基二十碳三烯酸 T3 345.2341 C20H34O3 M+Na ↑# − 9.83E-03 30 十四酰肉碱 T3、HILIC 372.3103 C21H41NO4 M+H ↑# − 1.15E-02 31 3-羟基马尿酸 T3 178.0501 C9H9NO4 M+H-H2O ↓#* − 9.53E-03 32 18-羟基花生四烯酸 T3 343.225 C20H32O3 M+Na ↑# − 3.91E-02 33 亚麻酰基肉碱 T3 424.3414 C25H46NO4 M+H ↑# − 4.25E-04 34 LysoPC（15:0/0:0） T3 526.3057 C23H48NO7P M+FA-H ↓#* − 2.55E-02 35 PC（18:1（9Z）e/2:0） T3 550.3872 C28H56NO7P M+H ↑#* − 2.11E-03 36 7-酮胆固醇 T3 401.3455 C27H44O2 M+H ↑#* − 1.08E-04 37 9-十六碳烯酰肉碱 T3 398.3152 C23H43NO4 M+H ↑# − 9.43E-05 38 16（17）-EpDPE T3 343.2219 C22H32O3 M-H ↑#* − 3.33E-02 39 十八烯酰肉碱 T3 426.3578 C25H47NO4 M+H ↑# − 1.84E-04 40 肉豆蔻酰肉碱 T3 370.2951 C21H39NO4 M+H ↑ − 4.25E-03 41 DL-乙酰肉碱 T3 204.1227 C9H17NO4 M+H ↑ 嘧啶代谢 1.85E-03 42 胞苷一磷酸 HILIC 368.0407 C9H14N3O8P M+FA-H ↓# 甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢 2.74E-02 43 胆碱 HILIC 86.0963 C5H14NO M+H-H2O ↑ 初级胆汁酸生物合成 1.20E-02 44 甘胆酸 HILIC 466.33 C26H43NO6 M+H ↑#* 苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成 2.43E-04 45 L-酪氨酸 HILIC 182.0812 C9H11NO3 M+H ↑#* 苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成 2.89E-03 46 苯丙氨酸 HILIC 166.0862 C9H11NO2 M+H ↑ 嘌呤代谢 1.68E-03 47 肌苷酸 HILIC 383.0262 C10H13N4O8P M+Cl ↓#* 丙氨酸、天冬氨酸和
谷氨酸代谢9.85E-04 48 L-天门冬氨酸 HILIC 134.0433 C4H7NO4 M+H ↑ 苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成 5.14E-04 49 苯丙酮酸 HILIC 165.0546 C9H8O3 M+H ↑#* 嘧啶代谢 6.25E-03 50 乳清酸 HILIC、T3 179.0029 C5H4N2O4 M+Na ↓#* 鞘脂代谢 3.04E-02 51 鞘氨醇 HILIC 302.3059 C18H39NO2 M+H ↑# 酪氨酸代谢 6.59E-04 52 香草扁桃酸 HILIC 233.0192 C9H10O5 M+Cl ↑#* 酪氨酸代谢 6.72E-05 53 酪胺 HILIC 120.079 C8H11NO M+H-H2O ↑ − 2.50E-03 54 3-氧代-4, 6 -胆二烯酸 HILIC 393.2315 C24H34O3 M+Na ↑# 初级胆汁酸生物合成 1.46E-02 55 鹅去氧胆酸 HILIC 437.2877 C24H40O4 M+FA-H ↑#* 丙氨酸、天冬氨酸和
谷氨酸代谢7.30E-04 56 谷氨酰胺 HILIC 169.0584 C5H10N2O3 M+Na ↑# − 5.06E-04 57 亮氨酸 HILIC 133.0855 C6H12O3 M+H ↑ − 5.18E-03 58 高-L-精氨酸 HILIC 189.1292 C7H16N4O2 M+H ↑#* − 1.22E-02 59 马尿酸 HILIC、T3 178.0516 C9H9NO3 M-H ↓# − 2.94E-02 60 牛磺胆酸3-硫酸盐 HILIC 596.2653 C26H45NO10S2 M+H ↑ − 1.78E-05 61 鹅去氧胆酸3-硫酸盐 HILIC 455.2515 C24H40O7S M+H-H2O ↑ 半胱氨酸和蛋氨酸代谢 2.76E-03 62 硫代半胱氨酸 HILIC 187.9645 C3H7NO2S2 M+Cl ↓# 亚油酸代谢 8.23E-05 63 13-L-过氧化氢亚油酸 HILIC 311.2187 C18H32O4 M-H ↓# − 4.63E-03 64 S-亚硝基谷胱甘肽 HILIC 381.0763 C10H16N4O7S M+FA-H ↓#* 鞘脂代谢 8.86E-05 65 LacCer（d18:1/12:0） HILIC 806.5705 C42H79NO13 M+H ↑ 花生四烯酸代谢 1.30E-04 66 LysoPC（14:0/0:0） HILIC、T3 512.3009 C22H46NO7P M+FA-H ↓ − 3.34E-02 67 2-（14,15-环氧二十碳三烯酰基）甘油 HILIC 395.2749 C23H38O5 M+H ↑ − 1.41E-03 68 赖氨酰苯丙氨酸 HILIC 294.1891 C15H23N3O3 M+H ↑ 醚脂代谢 2.52E-04 69 二十四碳四烯酸肉碱 HILIC、T3 526.3786 C31H53NO4 M+Na ↑ − 2.98E-05 70 1-（11Z二十二碳烯酰基）-3-磷酸甘油酯 HILIC 515.3163 C25H49O7P M+Na ↑ − 8.91E-07 注：↑表示模型组较对照组相对升高趋势，↓表示模型组较对照组相对下降趋势，P值为模型组与对照组间代谢物水平的t检验计算结果；
#表示代谢物经葛根-知母药对干预后具有回调趋势（共47个），*表示代谢物（共20个）经葛根-知母药对干预后回调差异具有统计学意义（P<0.05）。3.2.3 药物的干预效果
利用各组间的FC值变化情况判断药对干预后的回调代谢物。对于具有回调趋势的代谢物多组间变化情况进行单因素方差分析，P<0.05的代谢物确定为药对干预后显著回调的差异代谢物。结果显示，葛根-知母药对干预后出现回调的差异代谢物共计47个，其中，显著回调代谢物20个（表1和图5）。
图 5 20个显著回调代谢物在不同组间的相对信号强度*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, 与模型组比较; #P<0.05, ##P<0.01，###P<0.001，与对照组比较。对70个AD相关的差异代谢物和葛根-知母药对干预后显著回调的20个差异代谢物分别进行通路富集分析后发现（图6），AD模型大鼠潜在疾病生物标志物涉及通路主要包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、苯丙氨酸代谢、亚油酸代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、精氨酸生物合成、酪氨酸代谢、嘧啶代谢等。葛根-知母药对干预可对苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、苯丙氨酸代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、酪氨酸代谢和初级胆汁酸生物合成等通路产生回调影响。
图 6 血清差异代谢物KEGG通路富集分析A.模型组与对照组；B.葛根-知母药对干预后回调通路（1.苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成；2.苯丙氨酸代谢；3.亚油酸代谢；4.不饱和脂肪酸的生物合成；5.丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢；6.精氨酸生物合成；7.烟酸和烟酰胺代谢；8.嘧啶代谢；9.酪氨酸代谢；10.初级胆汁酸生物合成）4. 讨论
AD是一种复杂的中枢神经系统异质性疾病，具体病因尚不明确。目前已知可导致AD的因素包括基因突变、氧化应激、神经炎症以及多种环境和疾病因素[11] 。衰老被认为是AD最相关的危险因素[12] ，啮齿类动物长期摄入D-gal可产生包括氧化应激、炎症反应在内的多种与人类相似的衰老相关变化[13] 。铝元素可通过促进中枢神经系统炎症反应、降低脑中SOD活性，影响胆碱能神经传递、促进Tau蛋白磷酸化等形式诱导神经毒性，过量铝暴露与AD等中枢神经系统退行性疾病进展相关[14] 。研究表明，D-gal与AlCl3联合应用可产生类似于自然衰老的变化及AD相关特征[15] 。因此，本研究选取D-gal与AlCl3联合造模，通过大鼠长程给药模拟和还原AD相关的病程和病理变化，力求更加精准地反映AD患者体内代谢分子水平变化。药效学实验表明，D-gal和AlCl3联合给药后大鼠学习和记忆能力明显下降，体内氧化应激和炎症相关因子水平发生变化，表明该模型成功模拟AD相关的病理变化和特征。而葛根-知母药对干预可显著改善AD模型大鼠的学习和记忆能力，并回调SOD、NO和MDA等相关生化指标，改善和回调效果优于单药，表明葛根和知母配伍后在AD防治中具有一定的增效作用，具备进一步研究的价值。
代谢组学结果表明，葛根-知母药对可以显著回调血清中20种代谢物，主要涉及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、苯丙氨酸代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、酪氨酸代谢等途径。酪氨酸是一些神经递质或者神经调节剂的前体。Liu[16]等对尸源样本进行非靶向和靶向代谢组学分析发现，AD患者海马中苯丙酮酸含量普遍上调，表明苯丙氨酸代谢失调可能是AD病理形成的重要机制。本研究同样发现AD模型大鼠血清中苯丙酮酸水平较对照组显著升高，葛根-知母药对可以显著回调苯丙酮酸至生理水平。脯氨酸是一种非必需氨基酸，参与氧化还原调控和细胞凋亡，既是活性氧（ROS）清除剂，也是ROS生产者，因此，平衡脯氨酸水平和脯氨酸相关代谢酶活性对维系细胞生理功能至关重要。脯氨酸代谢可能会通过ROS、细胞衰老和细胞免疫等机制影响神经元功能[17] 。Xu等[18]整合代谢组学与蛋白质组学结果发现，脱脂核桃粉可以通过升高小鼠脑组织中脯氨酸等多种氨基酸水平发挥对东莨菪碱诱导的AD小鼠神经保护机制。这与本实验结果相似，葛根-知母药对可以通过回调脯氨酸水平发挥AD防治作用。
此外，本研究发现多种回调代谢物与脂质代谢密切相关。花生四烯酸和α-亚麻酸是由多不饱和脂肪酸氧化产生的脂氧化物，广泛参与机体炎症、免疫等多种生理病理进程。花生四烯酸升高可进一步提高氧化应激水平，与AD等疾病进程紧密相关[19] 。AD与胆汁酸代谢异常之间存在紧密关联，这可能与肠-肝-脑轴机制相关。有研究表明AD患者血浆中胆汁酸水平升高[20] 。磷脂是保持细胞膜完整性的主要物质，溶血磷脂酰胆碱是磷脂的降解产物，与磷脂代谢密切相关，磷脂代谢异常可导致溶血磷脂酰胆碱下调，表现为细胞凋亡及信号转导异常，是AD的潜在诱因之一[21] 。本研究表明，葛根-知母药对的AD防治作用效果可能与显著回调血清中花生四烯酸、α-亚麻酸、甘胆酸、鹅去氧胆酸和溶血磷脂酰胆碱水平相关。
ROS产生与消除之间的不平衡被称为氧化应激，氧化应激是AD等疾病的关键因素和共同点。NO是ROS的一种，也是神经传递和炎症相关的重要因素。高水平ROS会触发不饱和脂肪酸的脂质过氧化，导致MDA等高反应性化合物的产生，因此MDA是脂质过氧化和氧化应激的标志。SOD是抵消ROS有害影响最有效的一线防御机制。SOD可以通过去除超氧自由基防止更具破坏力的过氧亚硝酸盐生成，并维持体内NO在生理相关水平[22, 23] 。代谢组学结果提示，葛根-知母药对回调干预的多种途径与氧化应激和脂质过氧化相关。ELISA实验结果进一步表明，葛根-知母药对干预可提高AD大鼠体内SOD水平，回调NO和MDA至生理水平，提示葛根-知母药对可以通过调节氧化应激和脂质过氧化，维持体内NO的生理水平对AD产生防治作用。
综上，本文通过建立AD大鼠模型考察了葛根-知母药对防治AD的作用效果，药对药效优于单药；运用代谢组学策略揭示其改善AD大鼠学习和记忆能力相关的潜在代谢物和代谢路径，其作用机制可能与调节苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成等代谢通路、改善氧化应激和脂质过氧化水平等相关，为中药药对防治AD的临床应用和进一步开发提供了科学依据。
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