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新型冠状病毒肺炎(COVID-19)由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)引起[1-2]。SARS-CoV-2是冠状病毒科和β冠状病毒属的成员，是影响人类呼吸功能的新冠肺炎大流行的病原体[1, 3-4]，因其对公共卫生构成严重威胁而受到全球关注。中医对传染性疾病的认识较早，早在秦汉时期的《黄帝内经》中就记载有“五疫之至，皆相染易，无问大小，病状相似”。数年来，传统中医药在防病治病中积累了丰富的临床经验，开拓了数以万计的中药复方[5]。根据我国中医药出版社在2020年2月出版发行的《新型冠状病毒肺炎中医诊疗手册》，新冠肺炎属中医“瘟疫”范畴，通过分析历代中医药对瘟疫的防治经验，对于新冠肺炎的预防和治疗具有积极作用。
清肺排毒汤作为国家卫健委、国家中医药管理局推荐在新冠肺炎临床治疗期使用的中药复方，在此次疫情防控中起到关键性的作用，其由麻杏石甘汤、射干麻黄汤、小柴胡汤、五苓散、橘枳姜汤等加减化裁而成[6]，方中各味药材在新冠肺炎不同病理过程治疗阶段都发挥重要作用[7-8]。中药复方麻杏石甘汤，始载于张仲景《伤寒杂病论》，书中所述“若汗出喘，无大热者，可与麻黄杏仁石膏甘草汤”。原方由麻黄、杏仁、石膏和甘草四味药配伍而成[9]，君药为麻黄，辛苦宣肺、解表平喘；臣药为石膏，辛凉宣泄，君臣配合发散肺经郁热而平喘；佐药为杏仁，宣降肺气，辅助麻黄止咳平喘；使药为甘草，协调诸药[10]，主治外感风邪、邪热壅肺证[4, 11-13]。多年以来，以麻杏石甘汤为基础方的各类制剂广泛应用于临床中。近年来，研究学者们在麻杏石甘汤的研究上也取得了众多成果，其具有多种药理活性，包括抗流感病毒活性，改善微血管通透性过高和抑制炎症反应等[14]。袁丽等[15]使用网络药理学初步预测了麻杏石甘汤对新冠肺炎的抗病毒和抗炎作用，并建立了IL-6诱导的大鼠肺上皮Ⅱ型细胞（RLE-6TN）损伤模型，探讨麻杏石甘汤的抗炎活性和可能的作用机制。吴佳等[16]探讨以麻杏石甘汤联合西药对症治疗新型冠状病毒肺炎的临床疗效及不良反应，研究结果表明，加味麻杏石甘汤联合推荐的治疗方案可促进新冠肺炎患者的康复，而且不增加不良反应的风险。
同化学药相比，中药研究最大的困难在于它是一个复杂体系。明确中药复方的化学成分对中药的药效与作用机制的阐明具有重要意义。本研究利用 UPLC-QTOF/MS技术，系统分析麻杏石甘汤的化学组分，其目的在于揭示麻杏石甘汤中各组方的药理活性与组方原理，为促进传统中医药方剂在新冠肺炎临床实践中提供重要的参考数据。
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安捷伦1290型超高效液相色谱仪、6538 UHD Accurate-Mass Q-TOF/MS、MassHunter工作站和质谱分析软件 (美国Agilent公司)；低温高速离心机、低温双开门冰箱(美国Thermo公司)；循环水式真空泵(上海东玺制冷仪器设备有限公司)；涡旋仪(美国Labnet公司)；电子天平(日本A＆D Company Limited 公司)。
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麻黄、甘草、苦杏仁、石膏(上海雷允上医药公司) ；苦杏仁苷(29883-15-6，纯度≥98%)、甘草苷(551-15-5，纯度≥98%)、甘草酸(1405-86-3，纯度≥98%)购自成都格利普生物科技有限公司；麻黄碱(50-98-6，纯度≥98%，中国食品药品检定研究院)；二甲基亚砜、乙腈、甲醇、甲酸(美国Sigma Chemical公司)；屈臣氏纯净水(广州屈臣氏食品饮料有限公司)。
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依照《伤寒杂病论》中麻杏石甘汤处方的配伍，用电子天平称取药材麻黄9 g，苦杏仁9 g，石膏18 g，甘草6 g放置于干净的1000 ml的圆底烧瓶内，加入纯化水1.4 L，先浸泡1 h，然后冷凝回流提取2 h。提取液用四层纱布过滤，得滤液。将滤渣再次用1.4 L纯化水回流提取1 h，四层纱布过滤，将两次滤液合并后，使用旋转蒸发仪浓缩至50 ml。麻杏石甘汤13 000×g离心10 min，然后，吸取上清液用0.22 μm微孔滤膜过滤，即可得到麻杏石甘汤供试品溶液，冰箱4 ℃冷藏，备用。分别准确称取苦杏仁苷，甘草苷，甘草酸，麻黄碱各适量，用二甲基亚砜溶剂进行溶解稀释, 定容, 即可得到1 mg/ml的单一成分对照品储备液；分别精密量取100 μl混合，二甲基亚砜定容，制成100 μg/ml的对照品混合母液，分装后4 ℃冰箱冷藏，备用。
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色谱柱：UPLC BEH C18柱(2.1 mm×100 mm，2.5 μm)；流动相A：含0.1%甲酸的水，流动相B：含0.1%甲酸的乙腈，梯度洗脱：A相为0～2 min，95%，2～13 min，95%～5%，13～15 min，5%，B相为0～2 min，5%，2～13 min，5%～95%，13～15 min，95%；进样体积：3 μl；样品进样前基线用流动相平衡5～10 min；流速：0.4 ml/min；柱温：40 ℃；检测时间15 min。
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离子源：电喷雾（ESI）离子源；正负离子模式下采集数据；扫描模式为：全扫描/数据依赖的二级扫描（Full scan/ddMS2）。ESI源条件如下：干燥气温度：350 ℃，干燥气体流量：11 L/min；碎裂电压：120 V；毛细管电压：4000 V（ESI+）/3500 V（ESI-）；质谱扫描范围：50~1500 m/z。正离子模式下参考离子m/z取值范围为121.0509 ~ 922.0098，负离子模式下参考离子m/z取值范围为112.9856 ~ 1033.9881。MS2采用40 eV的碰撞能量对母离子进行二级碎裂。得到的数据使用安捷伦MassHunter工作站进行计算和分析。
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采用UPLC-QTOF-MS/MS技术对麻杏石甘汤化学成分的数据信息进行了定性分析，我们通过查阅国内外文献、数据库（HMDB, PubChem）等，建立麻杏石甘汤的化学成分数据库，利用QTOF/MS提供的精确分子量导入MassHunter分析软件，对采集的数据与化合物库进行进一步的比对和鉴定。
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按照“2.1”和“2.2”项下色谱质谱条件，各种化合物在正、负离子扫描模式下的分离效果和离子化程度均比较明显，得到麻杏石甘汤供试品溶液正、负离子模式下的UPLC-QTOF/MS总离子流图（见图1），结合麻杏石甘汤的化合物自建库，初步筛选出59种化合物，其中正离子模式下有42种化合物，而负离子模式下则有30种化合物，同时在正离子模式下和负离子模式下鉴别出了13种化合物。
图 1 麻杏石甘汤的 UPLC-QTOF/MS色谱图
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将所得数据导入MassHunter分析软件进行采集和分析，并且通过与化学成分数据库逐一比对得到麻杏石甘汤化合物成分的鉴定结果。共鉴定出59个化合物如表1所示，为进一步确定该复方的成分，本研究结合购买的对照品和国内外报道文献在120 V电压、40 eV条件下对所得数据中可能存在同分异构体的化合物 (甘草苷，甘草酸，麻黄碱，苦杏仁苷)进行了二级质谱碎片离子的分析与鉴定。
表 1 麻杏石甘汤的UPLC-QTOF/MS鉴定结果
序号 保留时间(min) 化合物 分子式 离子模式 m/z 质量 误差(ppm) 药材来源 1 0.645
0.657蔗糖 C12H22O11 [M+Na]+
[M+HCOO]−365.1045
387.1176342.1163
342.1194−2.15
9.37苦杏仁 2 0.905 柠檬酸 C6H8O7 [M-H]− 191.0911 192.0271 0.54 苦杏仁 3 0.918 腺苷 C10H13N5O4 [M+H]+ 268.1024 267.0949 −6.79 苦杏仁 4 1.034 异亮氨酸 C6H13NO2 [M+H]+ 132.1012 131.0939 −5.88 苦杏仁 5 1.034 丙位己内酯 C6H10O2 [M+NH4]+ 132.1012 114.0673 −6.68 苦杏仁 6 1.572 复盆子酮 C10H12O2 [M+NH4]+ 182.1165 164.0824 −8 麻黄 7 1.630 1-苯基-1,2-丙二酮 C9H8O2 [M+NH4]+ 166.0857 148.0519 −3.55 麻黄 8 1.630 苯丙氨酸 C9H11NO2 [M+H]+ 166.0852 165.0784 −3.3 苦杏仁 9 2.118
2.155杏仁核酰胺 C20H29NO12 [M+Na]+
[M+HCOO]−498.1582
520.1677475.1686
475.1694−0.73
0.99苦杏仁 10 2.176 吲哚酮 C8H7NO [M+H]+ 134.0599 133.0525 −1.66 苦杏仁 11 2.457 间甲基丙酮 C9H10O [M+NH4]+ 152.1065 134.0747 −3.78 麻黄 12 2.457 去甲基麻黄碱 C9H13NO [M+H]+ 152.1065 151.0922 −3.54 麻黄 13 3.244 麻黄碱 C10H15NO [M+H]+ 166.1221 165.1448 −3.27 麻黄 14 3.244 4-异丙基-苯甲醛 C1OH12O [M+NH4]+ 166.1221 148.0883 −3.62 麻黄 15 3.542 O-N-甲基伪麻黄碱 C11H17NO [M+H]+ 180.1382 179.1308 −1.08 麻黄 16 3.583
3.603扁桃酸-β-龙胆二糖苷 C20H28O13 [M+Na]+
[M-H]−499.1420
475.1469476.1525
476.1542−1.02
2.45苦杏仁 17 3.727 对羟基苯甲酸乙酯 C9H10O3 [M-H]− 165.0555 166.0628 −1.3 麻黄 18 3.727 苯甲醛 C7H6O [M+CH3COO]− 165.0556 106.0417 −1.83 麻黄 19 3.727 苯乙酮 C8H8O [M+HCOO]− 165.0555 120.0573 −1.93 麻黄 20 3.752
3.804对香豆酸 C9H8O3 [M+HCOO]−
[M+H]+209.0450
165.0542164.0469
164.0464−2.43
−5.88麻黄 21 3.992
4.005(+)-儿茶素 C15H14O6 [M-H]−
[M+H]+289.0724
291.0850290.0793
290.07760.97
−4.94麻黄、苦杏仁 22 4.034 苄基-β-龙胆二酸 C19H28O11 [M+HCOO]− 477.1618 432.1632 0.09 苦杏仁 23 4.270
4.270
4.274苦杏仁苷 C20H27NO11 [M+H]+ [M+NH4]+
[M+HCOO]−458.1649
475.1927
502.1570457.1587
457.1587
457.1590−0.62
−0.62
−1.46苦杏仁 24 4.274 6″-O-乙酰苦参碱 C23H24O10 [M+CH3COO]− 519.1482 460.1341 −6.1 甘草 25 4.712 异夏佛塔苷 C26H28O14 [M-H]− 563.1422 564.1481 0.4 甘草 26 4.717 夏佛塔苷 C26H28O14 [M+H]+ 565.1552 564.1472 −1.25 甘草 27 4.754 野黑樱苷 C14H17NO6 [M+HCOO]− 340.1035 295.1051 −1.79 苦杏仁 28 5.007
5.0271-甲氧基槲皮素 C27H30O14 [M+H]+
[M-H]−579.1700
577.1563578.1630
578.1639−1.04
0.51甘草 29 5.147
5.176芹糖异甘草苷 C26H30O13 [M+H]+
[M-H]−551.1744
549.1619550.1672
550.1690−2.61
0.56甘草 30 5.205 4',7-二羟基黄酮 C15H12O4 [M+H]+ 257.0802 256.0726 −2.72 甘草 31 5.205
5.225甘草苷 C21H22O9 [M+H]+
[M-H]−419.1377
417.1203418.1267
418.12730.84
2.26甘草、苦杏仁 32 5.225 槲皮素 C20H20O7 [M+HCOO]− 417.1203 372.1220 2.83 甘草 33 6.132
6.161芒柄花苷 C22H22O9 [M+H]+
[M+HCOO]−431.1330
475.1249430.1252
430.1260−2.86
−1甘草 34 6.161 芹菜素-5-鼠李糖苷 C21H20O9 [M+CH3COO]− 475.1248 416.1105 −0.57 麻黄 35 6.687 甘草皂苷A3 C48H72O21 [M+H]+ 985.4643 984.4567 0.11 甘草 36 6.964 甘草皂苷E2 C42H60O16 [M+CH3COO]− 879.3996 820.3863 −2.28 甘草 37 7.026 甘草内酯 C30H44O4 [M+H]+ 469.3302 468.3230 −1.99 甘草 38 7.407
7.410田蓟苷 C22H22O10 [M+Na]+
[M+HCOO]−469.1100
491.1210446.1209
446.1223−0.88
2.19麻黄 39 7.410 芹菜甙元-8-O-葡萄糖苷 C21H20O10 [M+CH3COO]− 491.1211 432.1068 2.77 麻黄 40 7.415
7.419甘草皂苷G2 C42H62O17 [M+H]+
[M-H]−839.4060
837.3909838.3982
838.3980−0.6
−0.8甘草 41 7.419 光甘草轮 C16H10O6 [M+CH3COO]− 357.0631 298.0489 3.88 甘草 42 7.668 18-α-甘草次酸 C30H46O4 [M+H]+ 471.3464 470.3388 −1.72 甘草 43 7.697
7.717甘草酸 C42H62O16 [M+H]+
[M-H]−823.4107
821.3976822.4030
822.4044−0.93
0.78苦杏仁、
甘草44 8.044 反式-2-壬烯醛 C9H16O [M+NH4]+ 158.1536 140.1198 −6.07 麻黄 45 8.255 3-丁基-3a,4,5,6-四氢-顺式-1(3H)-异苯并呋喃酮 C12H18O2 [M+CH3COO]− 253.1441 194.1301 −2.92 麻黄 46 8.263 反式-2-癸烯酸乙酯 C12H22O2 [M+HCOO]− 243.1593 198.1617 −1.26 麻黄 47 8.263 2-十一烯酸 C11H20O2 [M+CH3COO]− 243.1597 184.1459 −2.32 苦杏仁 48 8.284 甘草皂苷J2 C42H64O16 [M+H]+ 825.4220 824.4146 −5.92 甘草 49 8.375 十六烷酸 C16H32O2 [M+NH4]+ 274.2734 256.2394 −3.33 麻黄 50 8.458 2-十四酮 C14H28O [M+NH4]+ 230.2467 212.2127 −6.07 甘草 51 8.483 2-羟基十六烷酸 C16H32O3 [M+NH4]+ 290.2674 272.2339 −4.56 苦杏仁 52 9.360 康唑烷酮 C26H28O6 [M+H]+ 437.1925 436.1852 −7.69 甘草 53 9.369 双(4-乙基亚苯亚甲基)山梨糖醇 C24H30O6 [M+H]+ 415.2111 414.2035 −1.76 苦杏仁 54 9.451 棕榈酸乙酯 C18H36O2 [M+NH4]+ 302.3040 284.2702 −4.79 麻黄 55 10.428 花生酸 C2OH4OO2 [M+NH4]+ 330.3354 312.3015 −4.23 麻黄 56 11.280 对苯二甲酸二丁酯 C16H22O4 [M+H]+ 279.1585 278.1509 −3.11 苦杏仁 57 11.314 二十二烷酸 C22H44O2 [M+NH4]+ 358.3663 340.3324 −5.08 苦杏仁 58 11.466 2,3,4-三甲基-5-苯基恶唑啉 C12H17NO [M+CH3COO]− 250.1457 191.1318 3.86 麻黄 59 14.310 苯乙烯 C8H8 [M+NH4]+ 122.0962 104.0621 −4.99 麻黄 -
麻黄的主要有效成分为总生物碱，其具有平喘的功效，麻黄碱不仅是临床常用的生物碱类化合物，并且是麻黄中的标志性成分，其作用于支气管平滑肌并伴有解痉的疗效，以达到止咳平喘的效果。在正离子模式下，13号峰的母离子峰是m/z 166.1210[M+H]+ ，m/z 148.1093为该化合物的主要碎片离子峰，可判断为母离子峰先脱去一分子的H2O而得；得到的碎片离子脱掉一个CH3即可得到m/z 133.0869[M+H-H2O-CH3]+的碎片离子；碎片离子m/z148.1093[M+H-H2O]+进一步脱掉一个CH3NH2，得到碎片离子m/z 117.0602[M+H-H2O-CH5N]+，对照品的二级质谱碎片离子图，如图2所示，同时参考麻黄碱的碎片离子（m/z），根据生物碱类化合物的裂解规律可以推测出该峰为麻黄碱，裂解途径如图3所示。
图 2 麻黄碱正离子模式下二级质谱碎片图
图 3 麻黄碱的裂解途径
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甘草中成分繁多，黄酮类是其主要成分之一，31号峰在正离子模式下裂解途径如下：其母离子峰m/z 419.1328[M+H]+首先脱去一分子的脱水葡萄糖，得到m/z 257.0831[M+H-C6H10O5]+的一个碎片离子峰；其碎片离子进一步失去一个H2O分子，得到碎片离子m/z 239.0746[M+H-C6H10O5-H2O]+；碎片离子再一次分别脱掉一个CO和C6H4O，产生m/z 211.0743[M+H-C6H10O5-H2O-CO]+和m/z 147.0443[M+H-C6H10O5-H2O-C6H4O]+的两种碎片离子峰，在逆狄尔斯-阿尔德反应（RDA）的裂解下，碎片离子峰m/z 257.0831[M+H-C6H10O5]+产生了两种碎片离子，分别是m/z137.0240[M+H-C6H10O5-C8H8O]+和m/z119.0495[M+H-C6H10O5-C7H4O3]+，通过参考甘草苷化合物的碎片离子（m/z），对照对照品二级质谱碎片图，如图4所示，由此可以鉴定出该化合物为甘草苷，裂解途径如图5所示。
图 4 甘草苷正离子模式下二级质谱碎片图
图 5 甘草苷的裂解途径
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甘草酸属于三萜皂苷类，在甘草、苦杏仁中都有其成分。在正离子的扫描模式下，43号峰的母离子峰为m/z 823.4118[M+H]+，母离子峰首先脱去一分子的糖醛酸，得到碎片离子m/z 647.3810[M+H-C6H8O6]+，然后又脱去一个糖醛酸，得到碎片离子m/z 471.3449[M+H-2C6H8O6]+，接着又失去一分子的H2O，得到m/z 453.3341[M+H-2C6H8O6-H2O]+的碎片离子峰，本研究参考化合物甘草酸的碎片离子（m/z），以及参照对照品二级质谱碎片图，如图6所示，根据该类化合物的相关裂解规律可以判断为甘草酸，裂解途径如图7所示。
图 6 甘草酸正离子模式下二级质谱碎片图
图 7 甘草酸的裂解途径
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苦杏仁属传统常用中药，苦杏仁苷是苦杏仁中的一种主要成分。在正离子模式下，化合物23的分子式为C20H27NO11，由m/z 458.1649([M+H]+)和m/z 475.1927([M+NH4]+)的两个峰可知，m/z 296.1153处的峰值归因于[M+NH4-Glc]+。将可能的碎片化途径与参考数据进行比较[17-19]，并结合ESI(+)模式保留时间与参照对照品二级质谱碎片图（见图8），结果表明化合物23为苦杏仁苷，是苦杏仁中存在的一种化学成分，其他特征碎片以及可能的碎片裂解途径如图9所示。
图 8 苦杏仁苷正离子模式下二级质谱碎片图
图 9 苦杏仁苷的裂解途径
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麻杏石甘汤由麻黄、杏仁、石膏和甘草组方而成，方中麻黄主要的生物碱类化合物具有止咳平喘、镇痛等临床疗效，甘草中的黄酮类成分有明显的抗炎、抗菌、抗肿瘤的功效，此外，方中甘草酸和苦杏仁苷等有效成分均有其平喘、止咳的作用。麻杏石甘汤组方简单，药效显著，在新冠肺炎不同病理过程的治疗阶段都有其身影，但是已有研究对该方的化学成分的深入研究尚浅，因此，明确麻杏石甘汤的主要化学成分对于揭示其组方原理，阐明作用机制与药效物质基础具有一定的参考价值。
本研究采用 UPLC-QTOF/MS 技术，在短时间内对麻杏石甘汤的化学成分进行了定性分析，一共鉴定出了59种有效的化学成分，该方法分离速度快，分辨率高且分析时间短。采用二级质谱分析验证了麻黄碱等主要成分的质谱碎片裂解规律，为麻杏石甘汤的入血成分的快速鉴定提供方法学基础。本研究为麻杏石甘汤抗新冠肺炎药效物质基础及其作用机制的深入研究奠定基础。
Analysis of the chemical constituents of Maxing Shigan decoction by UPLC-Q-TOF/MS
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摘要:
目的 通过超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC-QTOF/MS）联用技术定性分析中药复方麻杏石甘汤中的主要化学成分。 方法 采用UPLC BEH C18柱(2.1 mm×100 mm，2.5 μm)，柱温是40 ℃，以0.4 ml/min流速的0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈流动相梯度洗脱，分析时间为15 min；质谱条件为电喷雾离子源(ESI)，正、负离子全扫描模式采集质谱数据。 结果 通过UPLC-QTOF/MS分析和对照品验证，共鉴别出麻杏石甘汤组方中59种化学成分。 结论 本研究建立了一种超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱 (UPLC-QTOF/MS) 联用方法鉴别中药麻杏石甘汤的化学成分，该方法简便高效，灵敏准确，为麻杏石甘汤药效物质基础与作用机制的深入研究提供依据，有助于中药治疗新冠肺炎的组方配伍优化和质量控制。 -
关键词:
- 麻杏石甘汤 /
- 化学成分 /
- 新型冠状病毒肺炎 /
- UPLC-QTOF/MS
Abstract:Objective To analyze chemical constituents of compound Maxing Shigan decoction by ultra-high perfor-mance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-QTOF/MS). Methods The separation was performed on a UPLC BEH C18 column (2.1 mm×100 mm, 2.5 µm), with a gradient elution applying 0.1% aqueous formic acid solution and 0.1% formic acid acetonitrile as a mobile phase. The column temperature was 40 °C. The flow rate was 0.4 ml/min and the analysis time was 15 min. Mass spectrometry (MS) data were collected in both positive and negative ESI ion modes. Results Through UPLC-QTOF/MS analysis and reference validation, a total of 59 chemical components in Maxing Shigan decoction were identified. Conclusion In this study, an ultra-high performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-QTOF/MS) method was established to identify the chemical components of Maxing Shigan decoction. This method is simple, efficient, sensitive and accurate, and provides a basis for the elucidation of the pharmacodynamic material basis and mechanism of Maxing Shigan decoction. It can provide data reference for the optimization of the compatibility of traditional Chinese medicine in the treatment of COVID-19. -
Key words:
- Maxing Shigan decoction /
- chemical composition /
- COVID-19 /
- UPLC-Q-TOF-MS
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卡培他滨是一种新型的氟尿嘧啶类口服药，它是5-氟尿嘧啶（5-FU）的前体药物。卡培他滨口服给药方便、依从性好、疗效确切，是治疗结直肠癌的基石药物，但在治疗过程中产生的不良反应（手足综合征等）极大地影响了患者的治疗。手足综合征（HFS）是卡培他滨引起的不良反应中较为特殊的反应，也是卡培他滨在治疗过程中的药物剂量限制性不良反应，主要表现为皮肤红肿、水泡、出血、疼痛。合并使用环氧合酶、尿素霜、维生素B6、奥美拉唑也不能完全阻断手足综合征的发生[1-3]；合并使用中草药如白芍、桂枝、甘草等可降低手足综合征的发生率[4]。口服卡培他滨的患者手足综合征发生率高达60%[1]，严重降低患者用药依从性，严重手足综合征（约17%）的患者只能减少药物摄入量乃至停止服用药物，影响化疗按期、足量进行[5-6]。明确手足综合征的发生机制和有效干预对卡培他滨安全有效的应用具有重要价值。目前手足综合征模型的建立还没有统一的金标准，本实验尝试用ICR小鼠灌胃卡培他滨后建立手足综合征模型，为卡培他滨致手足综合征模型的建立及机制研究提供参考。
1. 材料与方法
1.1 动物与药品
雄性ICR小鼠，SPF级，5周龄左右，共42只小鼠，小鼠由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供。经上海中医药大学动物伦理委员会批准，实验动物伦理审查号为PZSHUTCM210715004。将小鼠随机编号1~42号，对照组ICR小鼠6只，实验组ICR小鼠36只。卡培他滨（商品名希罗达，上海罗氏制药有限公司，规格：0.5 g/片，国药准字号H20073024）；羧甲基纤维素钠（CMC-Na）(国药集团)；离心管（Titan公司）；动物解剖手术器材（瑞沃德公司）；消毒酒精、棉花球、锡箔纸（国药集团）。
1.2 饲养条件与环境
造模前小鼠先饲养1周，保证充足的水源与饲料，42只ICR小鼠自由摄取食物，环境湿度保持区间50%~60%（±5%），控制温度在(23±1) ℃，调节光照为12 h（6: 30至18: 30光照），其余时间为光暗周期。定期观察小鼠培养环境，定期为小鼠更换垫料，清理排泄物。
1.3 给药剂量、方式及周期
卡培他滨0.5 g/片，溶解于10 ml CMC-Na（0.5%）中，制得50 mg/ml悬浊液备用。实验组ICR小鼠（36只），灌胃给药，按275 mg/kg（即小鼠0.15 ml/30g）连续灌胃14 d，2次/d（按照卡培他滨临床给药方案1 250 mg/kg，2次/d的剂量换算）。对照组ICR小鼠（6只），灌胃给予CMC-Na（0.5%）溶液，按照4 ml/kg剂量连续的灌胃14 d，2次/d。
1.4 手足综合征阳性判断标准
1.4.1 小鼠手足综合征观察
取ICR小鼠的后足跖部皮肤组织，用生理盐水冲洗并擦干，以多聚甲醛（4%）对小鼠组织进行固定，石蜡包埋切片，使用苏木精-伊红对小鼠组织染色（H&E染色），使用普通光镜（比例尺5 μm）检测（注：染色呈现蓝色的为表皮层，该层位于淡粉色的角质层和淡蓝色的真皮层之间）。每天肉眼观察，若小鼠出现足跖部特征性改变，立即拍照并记录手足综合征发生时间，每3 d拍照记录小鼠足跖部皮肤变化情况。
1.4.2 小鼠体重观察
实验组与对照组自由饲养1周后称重，记录原始体重，灌胃给药后每3 d对所有实验小鼠称重一次并记录体重变化。
1.4.3 手足综合征阳性参考标准
标准参考美国国家癌症研究所（NCI）关于手足综合征的分级规定，建模实验中若实验小鼠足跖部的皮肤呈现了红色斑块、组织肿胀、角质层脱屑、溃疡、角质层厚度明显增加及其他明显体征者均可判定为手足综合征阳性。
1.5 样本收集方案
1.5.1 手足综合征阳性ICR小鼠的血浆和足趾部皮肤组织样本制备
对于手足综合征阳性的小鼠，在出现手足综合征后，经眼眶采样，用1.5 ml离心管（肝素钠抗凝）取血约0.5 ml，12 000 r/min离心10 min，收集血浆约0.25 ml，置于−80 ℃冰箱冷冻保存。采集小鼠血样后按照实验动物伦理要求规范处死小鼠，用手术剪取小鼠手足部皮肤，生理盐水冲洗后用锡纸包裹住样本并标号。所有样本置于−80 ℃冰箱冷冻保存，所有操作在1 h内完成。
1.5.2 手足综合征阴性ICR小鼠的血浆和足趾部皮肤组织样本制备
小鼠经过14 d给药未出现手足综合征阳性反应，则认定该类小鼠为造模失败小鼠，在第15天对该类小鼠统一进行眼眶采血和足趾部皮肤组织样本收集，方法同“1.5.1”。对照组小鼠在第15天收集样本，方法同“1.5.1”。
1.6 统计分析
数据采用平均值±标准差（mean±SD）表示，组与组之间根据数据分布状态比较采用学生t检验或秩检验，P<0.05认为有统计学差异。制图采用Excel或Graphpad 8.0软件。
2. 结果与讨论
2.1 小鼠体重变化及生存状态
通过对比对照组与实验组ICR小鼠体重变化，发现对照组ICR小鼠，灌胃14 d后，体重明显增加；而实验组ICR小鼠，灌胃14 d后，体重明显降低。表1和图1 为14 d内ICR小鼠的体重变化，实验过程中实验组小鼠死亡3只。
表 1 实验周期内小鼠体重变化情况（m/g，$ \bar{x}\pm s $ ）组别 n 0 d 7 d 14 d 对照组 6 28.54±0.71 32.56±0.88 34.66±1.07 实验组 33 29.07±0.76 26.84±1.74*** 23.15±2.31*** *** P<0.001，与对照组比较。 2.2 小鼠手足综合征病理观察
与对照组ICR小鼠相比，19只实验组小鼠的足底皮肤明显出现红斑、肿涨并出现少许水泡（图2），认为该小鼠出现手足综合征，按照伦理要求将小鼠处死，收集足底皮肤组织样本和血浆样本。
2.3 小鼠足底皮肤H&E染色
将ICR小鼠四肢皮肤用4%多聚甲醛固定后进行H&E染色（因苏木精呈碱性，细胞核内的染色质与胞质内的核酸显紫蓝色；伊红呈酸性，细胞质和细胞外基质中的成分显红色），如图3显示。与正常ICR小鼠相比，手足综合征阳性小鼠皮肤表皮层增厚，角质层呈现粉红色，真皮层呈现浅蓝色，表皮层处在二者之间呈现蓝色。发生HFS小鼠皮肤颗粒层变薄，基底层和棘层间细胞数量减少。正常小鼠角质层明显较薄。
2.4 小鼠手足综合征发生率
ICR小鼠共39只（对照组6只，实验组33只），19只实验组ICR小鼠出现手足综合征阳性症状，发生率为57.58%。实验组ICR小鼠灌胃给药1周，出现手足综合征阳性小鼠与未出现手足综合征小鼠相比：实验组小鼠足底皮肤颜色变深（深红色），少量小鼠四肢掌心有透明水泡样组织出现；在灌胃给药10 d后，实验组小鼠出现手足综合征阳性症状，四肢出现了红斑、脱屑、水泡（红斑出现最多，脱屑其次，水泡最少）等情况。
2.5 卡培他滨及其代谢产物暴露浓度分析
将收集的血浆样本按照前期报道的方法进行卡培他滨及其5种代谢产物（5'-脱氧-5-氟胞嘧啶核苷、去氧氟尿苷、5'-氟-2'-脱氧尿苷、5-氟尿嘧啶、5-氟二氢嘧啶-2,4-二酮[7]）定量（ng/ml，mean±SD）。结果发现，发生手足综合征小鼠与未发生手足综合征小鼠相比，卡培他滨浓度(ng/ml)分别为(58.08±44.54)和(39.23±26.98)，5'-脱氧-5-氟胞嘧啶核苷浓度(ng/ml)分别为(
6047.42 ±3331.94 )和(4442.77 ±2140.44 )，去氧氟尿苷浓度(ng/ml)分别为(2899.28 ±1821.15 )和(2018.81 ±1037.86 )，5'-氟-2'-脱氧尿苷浓度(ng/ml)分别为(112.89±36.85) 和(122.23±19.16)，5-氟尿嘧啶浓度(ng/ml)分别为(46.86±23.08)和(38.33±20.62)，5-氟二氢嘧啶-2,4-二酮浓度(ng/ml)分别为(24.45±14.79)和(27.34±17.84)。卡培他滨及其代谢产物在发生和未发生手足综合征小鼠体内暴露水平均无明显差异（P>0.05，图4）。
图 4 卡培他滨及其代谢产物暴露浓度分析注：Cap：卡培他滨；5-DFCR：5'-脱氧-5-氟胞嘧啶核苷；5-DFUR：去氧氟尿苷；2-DFUR：5'-氟-2'-脱氧尿苷；5-FU：5-氟尿嘧啶；FUH2：5-氟二氢嘧啶-2,4-二酮。3. 讨论
体内药物暴露水平同药物疗效和不良反应密切相关。目前药物暴露水平常用的参数有曲线下面积（AUC）、稳态浓度（css）、峰浓度（cmax）、谷浓度（cmin）等。有研究发现[8]，根据5-FU的AUC调整给药剂量后，患者血液系统出现3~4级不良反应发生率从之前的17.5%下降为 7.6%（P<0.05），黏膜炎的发生率也从5%降低为0%（P<0.01），总生存时间显著增加，从原来的16个月延长到22个月（P<0.01）。因此，5-FU在体内浓度可能成为预测疗效及不良反应的潜在预警生物标志物之一[9-10]。本研究中未发现卡培他滨及其代谢产物同手足综合征具有相关性，但Daher Abdi在20名75岁以上老年患者中发现，卡培他滨及其代谢产物在发生手足综合征患者体内暴露水平明显较高[11]，但体外研究表明，5-FU同手足综合征无明显关联[12]。另有研究表明，手足皮肤局部较高表达的胸苷磷酸化酶可产生局部较高浓度的5-FU，同卡培他滨引发的手足综合征密切相关[13]。总之，卡培他滨引发手足综合征的机制仍需进一步研究。
在卡培他滨致手足综合征模型的建立方面，黎鹏等灌胃给予SD大鼠200~400 mg/d，2次/d，用药1~2周（1周后停药3 d），建立了卡培他滨致手足综合征模型，并认为200 mg/kg的剂量，灌胃2周可较好地建立手足综合征模型（造模成功率77.5%）[14]。但有研究显示，卡培他滨在大鼠体内的代谢过程与人体不同，因大鼠体内胞苷脱胺酶活性较低，5-DFCR通过糖基化生成其他产物，产生的5-FU较少，而卡培他滨在小鼠体内的代谢过程与人体基本相同，可能是最好的动物模型[15-16]；Hiromoto [3]等利用ICR小鼠，灌胃给予200 mg/kg，1次/d，5次/周的方法建立手足综合征模型，3周建立手足综合征模型，但成功率未报道。He和Chen等给予ICR小鼠灌胃200 mg/kg，1次/d，连续灌胃30 d后，6只小鼠中仅有1只未发生手足综合征[17]。前期预实验中，采用灌胃200 mg/kg，2次/d的方法在ICR小鼠上建立手足综合征模型，灌胃1周后，6只小鼠仅有1只发生手足综合征。因此，根据临床卡培他滨用药剂量（1 250 mg/kg，2次/d）换算小鼠剂量为275 mg/kg，2次/d，既缩短了给药时间，又提高了建模成功率（57.6%），且较少有小鼠死亡（3只）。
4. 小结
本实验成功建立了卡培他滨致手足综合征的ICR小鼠模型，在给药时长、造模成功率方面均有一定优势。卡培他滨及其代谢产物在小鼠体内暴露浓度同手足综合征发生可能无关。手足综合征的发生机制仍需进一步研究。
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表 1 麻杏石甘汤的UPLC-QTOF/MS鉴定结果
序号 保留时间(min) 化合物 分子式 离子模式 m/z 质量 误差(ppm) 药材来源 1 0.645
0.657蔗糖 C12H22O11 [M+Na]+
[M+HCOO]−365.1045
387.1176342.1163
342.1194−2.15
9.37苦杏仁 2 0.905 柠檬酸 C6H8O7 [M-H]− 191.0911 192.0271 0.54 苦杏仁 3 0.918 腺苷 C10H13N5O4 [M+H]+ 268.1024 267.0949 −6.79 苦杏仁 4 1.034 异亮氨酸 C6H13NO2 [M+H]+ 132.1012 131.0939 −5.88 苦杏仁 5 1.034 丙位己内酯 C6H10O2 [M+NH4]+ 132.1012 114.0673 −6.68 苦杏仁 6 1.572 复盆子酮 C10H12O2 [M+NH4]+ 182.1165 164.0824 −8 麻黄 7 1.630 1-苯基-1,2-丙二酮 C9H8O2 [M+NH4]+ 166.0857 148.0519 −3.55 麻黄 8 1.630 苯丙氨酸 C9H11NO2 [M+H]+ 166.0852 165.0784 −3.3 苦杏仁 9 2.118
2.155杏仁核酰胺 C20H29NO12 [M+Na]+
[M+HCOO]−498.1582
520.1677475.1686
475.1694−0.73
0.99苦杏仁 10 2.176 吲哚酮 C8H7NO [M+H]+ 134.0599 133.0525 −1.66 苦杏仁 11 2.457 间甲基丙酮 C9H10O [M+NH4]+ 152.1065 134.0747 −3.78 麻黄 12 2.457 去甲基麻黄碱 C9H13NO [M+H]+ 152.1065 151.0922 −3.54 麻黄 13 3.244 麻黄碱 C10H15NO [M+H]+ 166.1221 165.1448 −3.27 麻黄 14 3.244 4-异丙基-苯甲醛 C1OH12O [M+NH4]+ 166.1221 148.0883 −3.62 麻黄 15 3.542 O-N-甲基伪麻黄碱 C11H17NO [M+H]+ 180.1382 179.1308 −1.08 麻黄 16 3.583
3.603扁桃酸-β-龙胆二糖苷 C20H28O13 [M+Na]+
[M-H]−499.1420
475.1469476.1525
476.1542−1.02
2.45苦杏仁 17 3.727 对羟基苯甲酸乙酯 C9H10O3 [M-H]− 165.0555 166.0628 −1.3 麻黄 18 3.727 苯甲醛 C7H6O [M+CH3COO]− 165.0556 106.0417 −1.83 麻黄 19 3.727 苯乙酮 C8H8O [M+HCOO]− 165.0555 120.0573 −1.93 麻黄 20 3.752
3.804对香豆酸 C9H8O3 [M+HCOO]−
[M+H]+209.0450
165.0542164.0469
164.0464−2.43
−5.88麻黄 21 3.992
4.005(+)-儿茶素 C15H14O6 [M-H]−
[M+H]+289.0724
291.0850290.0793
290.07760.97
−4.94麻黄、苦杏仁 22 4.034 苄基-β-龙胆二酸 C19H28O11 [M+HCOO]− 477.1618 432.1632 0.09 苦杏仁 23 4.270
4.270
4.274苦杏仁苷 C20H27NO11 [M+H]+ [M+NH4]+
[M+HCOO]−458.1649
475.1927
502.1570457.1587
457.1587
457.1590−0.62
−0.62
−1.46苦杏仁 24 4.274 6″-O-乙酰苦参碱 C23H24O10 [M+CH3COO]− 519.1482 460.1341 −6.1 甘草 25 4.712 异夏佛塔苷 C26H28O14 [M-H]− 563.1422 564.1481 0.4 甘草 26 4.717 夏佛塔苷 C26H28O14 [M+H]+ 565.1552 564.1472 −1.25 甘草 27 4.754 野黑樱苷 C14H17NO6 [M+HCOO]− 340.1035 295.1051 −1.79 苦杏仁 28 5.007
5.0271-甲氧基槲皮素 C27H30O14 [M+H]+
[M-H]−579.1700
577.1563578.1630
578.1639−1.04
0.51甘草 29 5.147
5.176芹糖异甘草苷 C26H30O13 [M+H]+
[M-H]−551.1744
549.1619550.1672
550.1690−2.61
0.56甘草 30 5.205 4',7-二羟基黄酮 C15H12O4 [M+H]+ 257.0802 256.0726 −2.72 甘草 31 5.205
5.225甘草苷 C21H22O9 [M+H]+
[M-H]−419.1377
417.1203418.1267
418.12730.84
2.26甘草、苦杏仁 32 5.225 槲皮素 C20H20O7 [M+HCOO]− 417.1203 372.1220 2.83 甘草 33 6.132
6.161芒柄花苷 C22H22O9 [M+H]+
[M+HCOO]−431.1330
475.1249430.1252
430.1260−2.86
−1甘草 34 6.161 芹菜素-5-鼠李糖苷 C21H20O9 [M+CH3COO]− 475.1248 416.1105 −0.57 麻黄 35 6.687 甘草皂苷A3 C48H72O21 [M+H]+ 985.4643 984.4567 0.11 甘草 36 6.964 甘草皂苷E2 C42H60O16 [M+CH3COO]− 879.3996 820.3863 −2.28 甘草 37 7.026 甘草内酯 C30H44O4 [M+H]+ 469.3302 468.3230 −1.99 甘草 38 7.407
7.410田蓟苷 C22H22O10 [M+Na]+
[M+HCOO]−469.1100
491.1210446.1209
446.1223−0.88
2.19麻黄 39 7.410 芹菜甙元-8-O-葡萄糖苷 C21H20O10 [M+CH3COO]− 491.1211 432.1068 2.77 麻黄 40 7.415
7.419甘草皂苷G2 C42H62O17 [M+H]+
[M-H]−839.4060
837.3909838.3982
838.3980−0.6
−0.8甘草 41 7.419 光甘草轮 C16H10O6 [M+CH3COO]− 357.0631 298.0489 3.88 甘草 42 7.668 18-α-甘草次酸 C30H46O4 [M+H]+ 471.3464 470.3388 −1.72 甘草 43 7.697
7.717甘草酸 C42H62O16 [M+H]+
[M-H]−823.4107
821.3976822.4030
822.4044−0.93
0.78苦杏仁、
甘草44 8.044 反式-2-壬烯醛 C9H16O [M+NH4]+ 158.1536 140.1198 −6.07 麻黄 45 8.255 3-丁基-3a,4,5,6-四氢-顺式-1(3H)-异苯并呋喃酮 C12H18O2 [M+CH3COO]− 253.1441 194.1301 −2.92 麻黄 46 8.263 反式-2-癸烯酸乙酯 C12H22O2 [M+HCOO]− 243.1593 198.1617 −1.26 麻黄 47 8.263 2-十一烯酸 C11H20O2 [M+CH3COO]− 243.1597 184.1459 −2.32 苦杏仁 48 8.284 甘草皂苷J2 C42H64O16 [M+H]+ 825.4220 824.4146 −5.92 甘草 49 8.375 十六烷酸 C16H32O2 [M+NH4]+ 274.2734 256.2394 −3.33 麻黄 50 8.458 2-十四酮 C14H28O [M+NH4]+ 230.2467 212.2127 −6.07 甘草 51 8.483 2-羟基十六烷酸 C16H32O3 [M+NH4]+ 290.2674 272.2339 −4.56 苦杏仁 52 9.360 康唑烷酮 C26H28O6 [M+H]+ 437.1925 436.1852 −7.69 甘草 53 9.369 双(4-乙基亚苯亚甲基)山梨糖醇 C24H30O6 [M+H]+ 415.2111 414.2035 −1.76 苦杏仁 54 9.451 棕榈酸乙酯 C18H36O2 [M+NH4]+ 302.3040 284.2702 −4.79 麻黄 55 10.428 花生酸 C2OH4OO2 [M+NH4]+ 330.3354 312.3015 −4.23 麻黄 56 11.280 对苯二甲酸二丁酯 C16H22O4 [M+H]+ 279.1585 278.1509 −3.11 苦杏仁 57 11.314 二十二烷酸 C22H44O2 [M+NH4]+ 358.3663 340.3324 −5.08 苦杏仁 58 11.466 2,3,4-三甲基-5-苯基恶唑啉 C12H17NO [M+CH3COO]− 250.1457 191.1318 3.86 麻黄 59 14.310 苯乙烯 C8H8 [M+NH4]+ 122.0962 104.0621 −4.99 麻黄 
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