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黄连是毛茛科植物黄连、三角叶黄连或云连的干燥根茎[1]。黄连最早记载于《神农本草经》，传统中医理论中认为其性味苦寒，具有清热燥湿，泻火解毒的功效[2]，主要用于治疗心火亢盛、心烦失眠、热毒泻痢、疮疡肿毒等病症。现代药理研究表明，黄连药材中除含有生物碱、黄酮等主要活性成分外还有香豆素、挥发油、多糖、甾体等多种化学物质[3-5]，具有广泛的药理活性如抗病原微生物、保护心血管、抗肿瘤、降糖以及免疫调节等[6-7]。其中，黄连抑制微生物作用的主要活性成分研究是热点领域之一[8-9]。
中药指纹图谱研究方法是采用图像化的方法加以现代理化分析技术对药材的化学信息进行具象表达，提供准确丰富的特征理化信息，进而对药材中所含的化学成分进行定性定量的反映呈现[10]，通过各种数理指标反映中药材的化学信息的质量控制模式。但其不能准确体现具体药效学活性成分，而中药谱效关系研究主要通过研究指纹图谱与药效学指标之间的关联，揭露或表明中药药材或者中药制剂中所含化学成分与具体药理活性的联系。
本文通过参考有关文献[11-15]，采用不同溶剂提取制备黄连提取物，应用高效液相色谱法（HPLC）建立不同黄连提取物指纹图谱，通过GRA法考察黄连指纹图谱中各共有峰与其体外抑制金黄色葡萄球菌的相关度，探索中药黄连抑菌作用的药效物质基础，以期为之后研究黄连有效活性成分和其抗菌作用机制提供参考。
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Agilent1200型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；BSC-1300IIB2型生物安全柜（苏洁医疗器械有限公司）；InfiniteF50酶标仪（奥地利Untersbergstr公司）；LDZH-150KBS型立式自动电热蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；AUX220电子分析天平（日本岛津公司）；KQ-500B超声清洗机（昆山超声波仪器厂）；HWS-400型恒温恒湿箱（上海精宏实验设备有限公司）；101-2A型数显式电热恒温干燥箱（上海阳光实验仪器有限公司）；DG-2B多功能恒温箱（上海医疗器械厂）；DKB-600电热恒温水槽（扬州慧科电子有限公司）。
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金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003，批号：5a32-1（274），来源：中国食品药品检定研究院]；胰酪大豆胨液体培养基（TBS，批号：1082451，广东环凯微生物科技有限公司）。
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盐酸小檗碱（批号：110713-201212，含量按86.7%计）、盐酸药根碱（批号：110733-201609，含量按89.5%计））、阿魏酸（批号：110773-201313，含量按99.6%计）均来源于中国食品药品检定研究院；盐酸巴马汀（批号：171869-957，纯度≥98%）、盐酸表小檗碱（批号：889665-86-5，纯度≥98%）均来源于贵州迪大科技有限责任公司；黄连片（批号：20190403，产地：四川，广东汇群堂中药饮品股份有限公司）经联勤保障部队第九〇九医院/厦门大学附属东南医院（本院）中药师曹毅祥鉴定，均为毛茛科植物黄连的干燥根茎；乙腈（批号：21045061，色谱纯，安徽天地高纯溶剂有限公司）；盐酸、甲醇、无水乙醇、95%乙醇等均购自西陇化工股份有限公司，均为分析纯；水为纯化水。
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取金黄色葡萄球菌冷冻管（2代）接种于TBS培养基中，于35℃条件下培养48 h；取培养液用0.9%无菌氯化钠溶液按10倍逐级稀释，制成各稀释级的菌悬液。采用平板计数法，测定含菌量，选取浓度为105～106 cfu/ml的菌悬液，放置2～8℃冰箱备用。
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取黄连片经105℃干燥，粉碎，过40~60目筛，称取黄连药材粉末9份，每份10 g。取药材粉末分别加入100 ml的水、1%盐酸甲醇、60%乙醇，每种溶剂各3份；各取一份，分别超声震荡（50 Hz）、水浴加热回流、50℃恒温水箱浸泡60 min，冷却至室温，滤过；滤渣加入相应溶剂80 ml，继续用相同提取方法处理40 min，滤过，合并滤液，并定容至200 ml，即得含药量为0.05 g/ml的提取物溶液，超声法提取物溶液A组、B组、C组；加热回流法提取物溶液D组、E组、F组；浸泡法提取物溶液G组、H组、I组，2～8℃冷藏备用。
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色谱柱：依利特 Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5 µm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B），其中每1 000 ml磷酸溶液中含500 µl三乙胺，梯度洗脱：0~20 min，95%~79% B；20~45 min，79%~74% B；45~50 min，74%~95% B；流速：1.0 ml/min；检测波长：278 nm；柱温30℃；进样量10 µl。
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精密量取上述A~I 9组黄连提取物溶液1 ml，分别置10 ml容量瓶中，纯化水稀释至刻度，摇匀，即得A~I 9组黄连提取物供试品溶液。
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称取盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸表小檗碱、盐酸药根碱以及阿魏酸对照品适量，精密称定，分别用甲醇溶解并定容，即得各对照品溶液储备液；分别精密量取各对照品储备液适量，置10 ml容量瓶中，甲醇稀释并定容，即得含量分别为0.046 2、0.019 6、0.014 8、0.019 2、0.065 2 mg/ml的混合对照品溶液。
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取混合对照品溶液，按上述色谱条件连续进样6次，以将盐酸小檗碱色谱峰为参照峰，计算各对照品峰相对保留时间及相对峰面积RSD值均<1.5%，表明仪器精密度良好。
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取提取物溶液D组，按照“2.3.2.1”项下方法平行制备供试品溶液6份，按上述色谱条件依次进样，各共有峰与参照峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD均<3%，表明该方法重复性良好。
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取提取物溶液D组，按照“2.3.2.1”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件分别于0、2、4、6、8、12 h进样，记录指纹图谱。各共有峰相对于参照峰的保留时间及峰面积的RSD值均<3%，表明供试品溶液在12 h内稳定。
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取混合对照品溶液及9组提取物供试品溶液，按照上述色谱条件依次进样，记录色谱图。采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012年版）进行数据分析匹配，采取中位数法建立对照指纹图谱（R），见图1，通过与混合对照品溶液HPLC图谱（图2）比对，结合光谱图分析，确认4号峰为阿魏酸、6号峰为盐酸表小檗碱、7号峰为盐酸药根碱、8号峰为盐酸巴马汀、9号峰为盐酸小檗碱。计算各组黄连提取物溶液指纹图谱与对照指纹图谱的相似度，结果表明，各指纹图谱相似度在0.990~1之间，相似度良好，结果见表1。
图 1 黄连提取物供试品溶液HPLC指纹图谱
图 2 混合对照品HPLC图谱
表 1 9组黄连提取物指纹图谱与对照图谱的相似度
组别 相似度 组别 相似度 A组 0.997 F组 0.998 B组 0.997 G组 0.994 C组 0.997 H组 0.994 D组 0.997 I组 0.993 E组 0.999 -
依照美国临床和实验室标准协会（CLSI）所发布要求规范，采用微量肉汤稀释法[16-17]进行黄连提取物的体外抑菌试验，分别设置试验组、阴性对照组、阳性对照组、空白对照组。取无菌96孔板：于A1~A10孔中分别加入药材浓度为50、25、12.5、6.25、3.125、1.563、0.781、0.391、0.195、0.098 g/L的提取物溶液100 µl，再加入浓度为105～106 cfu/ml的金黄色葡萄球菌悬液100 µl，作为实验组；B1~B10孔依次加入系列提取浓度物溶液（同A1~A10）100 µl，再加入TBS培养基，作为阴性；A12孔加入经灭菌的纯化水与菌悬液各100 µl，作为阳性对照组；B12孔中加入经灭菌的纯化水与TBS培养基各100 µl，作为空白对照组；每组平行3次，于405 nm波长下的酶标仪测定吸光度值（A），抑菌率使用以下公式计算：
$$ \text{抑菌率} x=[1-\frac{({A}_{\text{实验组}}-{A}_{\text{阴性对照组}})}{({A}_{\text{阳性对照组}}-{A}_{\text{空白对照组}})}]\times 100 \text{%。} $$ -
以各共有峰的峰面积作为各组提取物指纹图谱的数据表达，以药材浓度为0.781 g/L的供试品溶液抑菌率作为黄连抑菌效果的表达（该药物浓度下，9组提取物供试品溶液抑菌率具有明显差异，0.781 g/L为药材抑制金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度），结果见表2。
表 2 黄连提取物指纹谱图数据及抑菌效果分析
指标 乙醇-超声 乙醇-回流 乙醇-浸提 水-超声 水-回流 水-浸提 甲醇-超声 甲醇-回流 甲醇-浸提 抑菌率% X0 70.16 96.95 94.51 56.82 96.62 54.78 101.47 94.51 71.38 峰面积 X1 14.26 22.47 14.53 15.35 20.12 18.24 52.18 54.80 54.83 X2 21.57 34.54 22.80 20.14 26.24 25.50 24.70 38.74 31.70 X3 24.93 39.82 24.62 19.86 26.71 19.58 5.04 6.94 6.55 X4 14.62 24.70 15.25 11.83 17.00 13.71 19.41 29.37 21.97 X5 34.81 56.69 33.85 26.35 37.74 30.09 43.51 62.36 43.89 X6 56.15 86.45 53.49 48.65 63.01 53.02 65.44 94.10 63.40 X7 94.65 155.43 98.46 79.20 109.92 87.79 117.01 168.24 130.84 X8 73.33 108.55 72.50 61.92 81.01 67.57 83.87 111.80 83.71 X9 149.18 201.76 153.63 130.73 160.78 138.19 166.35 204.62 175.00 -
本实验考察不同提取工艺以及不同提取溶剂的黄连提取物溶液中化学组分对金黄色葡萄球菌抑菌率的影响程度，以抑菌率为母序列（参考序列），记作X0（k），k=1、2、3…9；以9个标志峰的峰面积作为子序列（比较序列），记作Xi（k），i=1、2…9，k=1、2、3…9。
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本实验采用均值化法数据，即取各个序列的元素与相应序列的平均值的比值，计算公式为
${{X}}'_{{i}} $ （k）=Xi（k）/Xi，其中i=1、2…9，k=1、2、3…9。其中Xi为序列i中样本数据的平均值，Xi（k）为原数据，${{X}}'_{{i}} $ （k）为无纲量化处理后的数据，从而得到序列[${{X}}'_{{i}} $ （k）]。计算母序列与子序列差值的绝对值ΔXi（k）=|${{X}}'_{{i}} $ （k）−${{X}}'_{\mathrm{0}} $ （k）|。 -
灰色关联系数ζi（k）表示参考序列X0和比较序列Xi在序列k时的关联程度，使用以下公式计算：
$$ \zeta_{i}(k)= \frac{\underset{{i}}{\rm{min}}\underset{{k}}{\rm{min}}\left|{{X}}_{0}({k})-{{X}}_{{i}}({k})\right|+{\rho }\underset{{i}}{\rm{min}}\underset{{k}}{\rm{min}}\left|{{X}}_{0}({k})-{{X}}_{{i}}({k})\right|}{\left|{{X}}_{0}({k})-{{X}}_{{i}}({k})\right|+{\rho }\underset{{i}}{\rm{max}}\underset{{k}}{\rm{max}}\left|{{X}}_{0}({k})-{{X}}_{{i}}({k})\right|} $$ 其中，i=1、2…9，k=1、2、3…9，
$ \left|{{X}}_{0}({k})-{{X}}_{{i}}({k})\right| $ 为序列与序列在k点差值的绝对值；$ \underset{{i}}{\rm{min}}\underset{{k}}{\mathrm{min}}\left|{{X}}_{0}({k})-{{X}}_{{i}}({k})\right| $ 为在各序列差值最小值的基础上，进一步得出所有序列的差值最小值，$ \underset{{i}}{\mathrm{max}}\underset{{k}}{\mathrm{max}}\left|{{X}}_{0}({k})-{{X}}_{{i}}({k})\right| $ 为在各序列差值最大值的基础上，进一步得出所有序列的最大值，$ \mathrm{\rho } $ 为分辨系数，0≤$ \mathrm{\rho } $ ≤1，本实验取$ \mathrm{\rho } $ =0.5。 -
灰色关联度
$ {\mathrm{\gamma }}_{0} $ i=$ \dfrac{1}{{n}}\displaystyle\sum\nolimits_{{k}=1}^{9}\mathrm{\zeta }\mathrm{i}\left(\mathrm{k}\right)$ ，式中n为任一序列i下的样本数，本实验中n=9。序列${{X}}'_{{i}} $ （k）与${{X}}'_{\mathrm{0}} $ （k）之间的关联极性$ {\mathrm{\sigma }}_{{i}} $ 计算如下：$$ {\mathrm{\sigma }}_{{i}} = \sum\nolimits_{{k}=1}^{9}{k}\cdot{{X}}_{{i}} '(k)- \frac{\displaystyle\sum\nolimits_{{k}=1}^{9}{{X}}'_{{i}}({k})\cdot\sum\nolimits_{{k}=1}^{9}{k}}{{n}} $$ 其中i=1、2…9，k=1、2、3…9，n=9；若sgn（
$ {\mathrm{\sigma }}_{{i}} $ ）= −sgn（$ {\mathrm{\sigma }}_{0} $ ），则表示Xi与X0负相关，即前者对后者起到减弱作用，sgn（X）为符号函数，即sgn（X）=$ \left\{\begin{array}{l}1,X > 1\\ 0,X=1\\ -1,X < 1\end{array}\right. $ 。 -
通过灰色关联分析方法对黄连提取物谱-效关系进行分析，结果见表3。由结果可知，组分3、8、9对抑菌起到增强作用外，关联度最高的是峰9（盐酸小檗碱），其关联度为0.803 3。
表 3 抑菌质量标志峰与抑菌率之间的关联度
峰号 关联度 关联极性 关联性 关联排序 成分 1 0.561 9 1 负 8 — 2 0.738 8 1 负 7 — 3 0.559 1 −1 正 9 — 4 0.740 1 1 负 6 阿魏酸 5 0.762 3 1 负 5 — 6 0.773 8 1 负 3 盐酸表小檗碱 7 0.764 1 1 负 4 盐酸药根碱 8 0.785 2 −1 正 2 盐酸巴马汀 9 0.803 3 −1 正 1 盐酸小檗碱 注：各组分关联极性与X0关联极性（−1）相同则为正相关，反之则为负相关。 -
试验前期，分别考察甲醇/乙腈-水、甲醇/乙腈-0.1~0.5%磷酸、甲醇-冰醋酸等流动相体系；考察不同厂家、不同粒径色谱柱对黄连提取物的分离效果，综合考虑分离效果、基线平稳与多数色谱峰峰形等因素，最终选用依利特Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5 µm）色谱柱、选择用乙腈-0.1%磷酸作为流动相，同时在每
1000 ml磷酸溶液中加入500 µl三乙胺来改善峰型，梯度洗脱达到更好的分离效果。采用DAD全波长范围扫描，结合三维光谱图分析，最终选择色谱峰数量较多，反映信息较全面的278 nm作为检测波长。抑菌试验时，考虑到提取溶剂甲醇、盐酸对金黄色葡萄球菌有一定的抑制作用，在预实验阶段尝试采用水浴蒸干、纯化水复溶的方法来考察溶剂对于实验结果的影响，结果表明溶剂对抑菌效果的影响不明显。本试验采用谱-效结合方法，建立HPLC对不同提取溶剂、不同提取方法的9 种黄连提取物进行指纹图谱分析，标定共有特征峰；通过酶标仪测定吸光度法，计算提取物抑菌率；运用灰色关联分析方法对提取物的指纹图谱与抑菌率进行关联分析。但3号共有峰不能标定，且抑菌试验仅以金黄色葡萄球菌为代表，存在一定局限性，因此试验仍需进一步深入研究，为探索黄连抑菌的质量标志物及黄连药材质量控制的建立等方面的研究提供参考。
Preliminary study on the antibacterial material basis of Coptidis Rhizome extracts by diffierent methods based on spectrum-effect relationship
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摘要:
目的 建立黄连提取物的高效液相色谱法（HPLC）指纹图谱及其体外抑制金黄色葡萄球菌作用的谱-效关系，为探索黄连抑菌作用的药效物质基础提供依据。 方法 分别以60%乙醇、1%盐酸甲醇以及水为提取溶剂，采用超声、加热回流以及浸泡等提取方法制备9种黄连提取物；建立提取物HPLC指纹图谱；以金黄色葡萄球菌为对象，根据培养基微量稀释法采用酶标仪测定吸光度，计算抑菌率；运用灰色关联分析法（GRA）对谱-效数据进行关联分析。 结果 建立9种黄连提取物的HPLC指纹图谱，确定9个共有特征指纹峰，通过对照品对比指认其中5个峰；GRA分析显示：9个共有峰成分与抑菌作用的关联度均在0.559 1~0.803 3之间；其中3号峰、8号峰（盐酸巴马汀）、9号峰（盐酸小檗碱）为正相关，其中9号峰（盐酸小檗碱）的相关度最高，其关联度值为0.803 3。 结论 通过对黄连提取物谱-效关系进行研究，以盐酸小檗碱为主的生物碱类物质可能是黄连抑制金黄色葡萄球菌的主要药效物质基础。 Abstract:Objective To establish the HPLC fingerprints for the different extracts from Coptidis Rhizoma, and investigate the spectrum-effect relationship between HPLC fingerprints and anti-Staphylococcus aureus activity in vitro to analyze the pharmacodynamic material basis. Methods Nine kinds of Coptidis Rhizoma extracts were prepared, and establish the HPLC fingerprints for them. The antibacterial rate of each extracts were determined by the broth microcultion method with Staphylococcus aureus as the test bacteria. The grey relational analysis （GRA） method was used to analyze the correlation between the fingerprint data and the in vitro antibacterial test data. Results The HPLC fingerprints of nine kinds of Coptidis Rhizoma extracts were established, nine common characteristic fingerprint peaks were calibrated, and 5 peaks were identified by the reference substance comparison method. GRA analysis experiments the correlation between nine peaks and antibacterial effect was 0.559 1~0.803 3; and the peak 3, peak 8 （palmatine hydrochloride）, peak 9 （berberine hydrochloride） were positively correlated with the inhibition of Staphylococcus aureus,well the peak 9 （berberine hydrochloride） has the strongest effect, and its correlation degree is 0.803 3. Conclusion The effective substance of antibacterial was preliminarily determined through the study of spectrum-effect relationship for Coptidis Rhizoma extracts,which may be the alkaloids, mostly containing hydrochloride. It provides a reference for further research on the pharmacodynamic material basis of Coptidis Rhizoma. -
表 1 9组黄连提取物指纹图谱与对照图谱的相似度
组别 相似度 组别 相似度 A组 0.997 F组 0.998 B组 0.997 G组 0.994 C组 0.997 H组 0.994 D组 0.997 I组 0.993 E组 0.999 
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表 2 黄连提取物指纹谱图数据及抑菌效果分析
指标 乙醇-超声 乙醇-回流 乙醇-浸提 水-超声 水-回流 水-浸提 甲醇-超声 甲醇-回流 甲醇-浸提 抑菌率% X0 70.16 96.95 94.51 56.82 96.62 54.78 101.47 94.51 71.38 峰面积 X1 14.26 22.47 14.53 15.35 20.12 18.24 52.18 54.80 54.83 X2 21.57 34.54 22.80 20.14 26.24 25.50 24.70 38.74 31.70 X3 24.93 39.82 24.62 19.86 26.71 19.58 5.04 6.94 6.55 X4 14.62 24.70 15.25 11.83 17.00 13.71 19.41 29.37 21.97 X5 34.81 56.69 33.85 26.35 37.74 30.09 43.51 62.36 43.89 X6 56.15 86.45 53.49 48.65 63.01 53.02 65.44 94.10 63.40 X7 94.65 155.43 98.46 79.20 109.92 87.79 117.01 168.24 130.84 X8 73.33 108.55 72.50 61.92 81.01 67.57 83.87 111.80 83.71 X9 149.18 201.76 153.63 130.73 160.78 138.19 166.35 204.62 175.00
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表 3 抑菌质量标志峰与抑菌率之间的关联度
峰号 关联度 关联极性 关联性 关联排序 成分 1 0.561 9 1 负 8 — 2 0.738 8 1 负 7 — 3 0.559 1 −1 正 9 — 4 0.740 1 1 负 6 阿魏酸 5 0.762 3 1 负 5 — 6 0.773 8 1 负 3 盐酸表小檗碱 7 0.764 1 1 负 4 盐酸药根碱 8 0.785 2 −1 正 2 盐酸巴马汀 9 0.803 3 −1 正 1 盐酸小檗碱 注：各组分关联极性与X0关联极性（−1）相同则为正相关，反之则为负相关。
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