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马兜铃酸（AAs）是存在于马兜铃科植物中结构相似的硝基菲羧酸类化合物，广泛存在于马兜铃属和细辛属植物中。含AAs成分的中药，如青木香、关木通、细辛、马兜铃等都有明确的肾毒性[1-2]。马兜铃酸肾病（AAN）是因服用含有AAs成分的药物而造成的急、慢性肾小管间质疾病，表现为肾小管变性、萎缩、坏死和广泛的肾间质纤维化[3]，临床上以夜尿增多、贫血、消化道症状、高血压就诊者居多，易被漏诊和误诊。AAN急性肾损害患者大部分预后良好，慢性肾损害患者预后较差。笔者所在单位是全军肾病中西医结合治疗中心，每年均收治一定数量的AAN患者，但尚未进行全面的回顾性分析。本文就此开展研究，旨在分析AAN临床特点和规律，避免误诊漏诊，提高临床确诊率。
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依据2004—2022年该中心收治的因服用含有AAs引起药品不良反应（ADR）报表中患者信息，对患者病历进行回顾性调查。
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采用Excel 2007进行数据统计调查，内容包括患者性别、年龄、引起AAN临床表现、引起AAN药品、引起AAN药品服用时间、原患疾病、实验室检查等。计量描述以（
$ \bar{x}\pm s $ ）表示，计数以频数（构成比/%）表示。 -
拟定评判ADR标准为：①明确有口服AAs成分药物史，临床诊断以间质性肾炎为主要诊断的AAN；②无长期或近期使用引起间质性肾损害的药物史，如解热镇痛药、抗菌药物、利尿剂等；③可排除临床系统性疾病伴发的肾小管间质病变、肾小球疾病、感染相关性间质性肾炎、肾动脉狭窄、高血压肾病及糖尿病肾病等；④典型病理形态学为寡细胞性肾间质纤维化及肾小管萎缩。最终确定AAN患者111例。
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111例AAN患者中，男性31例，女性80例，女性多于男性（2.58∶1）。年龄最小者31岁，最大者 88岁，平均年龄（63.70 ± 11.67）岁，大于50岁的101例（90.99%），详见表1。
表 1 111例AAN患者年龄、性别分布情况
性别 年龄（岁） 合计 30~39 40~49 50~59 60~69 70~79 80~89 男 1 1 5 4 13 7 31 女 2 6 28 28 13 3 80 合计 3 7 33 32 26 10 111 构成比(%) 2.70 6.31 29.73 28.83 23.42 9.01 100.00 -
111例AAN患者中，服用AAs成分药物时间最长的30年，最短20 d，平均服药时间（8.08±6.94）年。107例（96.40%）服用超过1年，其中1~5年病例数最多，超过5年次之，10年以上的累计占36.04%，详见表2。
表 2 111例服用含有AAs成分药物持续时间
序号 服用时间（年） 数量（例） 构成比（%） 1 <1.0 4 3.60 2 1.0～<5 41 36.94 3 ≥5.0～<10 26 23.42 4 ≥10.0～<15 21 18.92 5 ≥15～<20 8 7.21 6 ≥20 11 9.91 合计 111 100.00 -
111例AAN患者中，服用冠心苏合丸和龙胆泻肝丸共106例（95.50%）。111例患者按药品说明书规定剂量服用62例（55.86%），随意服用45例（40.54%），不详4例（3.60%），111例中单用药103例（92.79%）、联合用药8例（7.21%）， 详见表3。
表 3 111例AAN患者服用药物情况及原患疾病
序号 药物名称 例数 构成比（%） 原患疾病 1 冠心苏合丸 78 70.27 冠心病（38）、心前区不适（9）、风湿性心脏病（1）、急性心肌梗死（1）、间断胸闷+气短（1）、
口干+心慌（1）、心动过速（1）、心功能Ⅲ级（1）、心慌+气短（1）、心脏病（1）、不详（23）2 龙胆泻肝丸 22 19.82 祛火（7）、身体不适（5）、乙肝（3）、护肝（1）、酒后去肝火（1）、口腔溃疡（1）、
皮肤过敏（1）、眼干（1）、子宫肌瘤（1）、清肝明目（1）3 冠心苏合丸+龙胆泻肝丸 6 5.41 冠心病（3）、不详（3） 4 木通（中药饮片） 2 1.80 心前区不适（1）、不详（1） 5 耳聋丸 1 0.90 内耳眩晕症（1） 6 冠心苏合丸+冠心泰丸 1 0.90 不详（1） 7 龙胆泻肝丸+蛇王贝毒胶囊 1 0.90 不详（1） 合计 111 100.00 -
111例AAN患者中，实验室检查：血肌酐升高108例，结果范围为83～1600 μmol/L（514.31±206.48 μmol/L）；尿素氮升高106例，结果范围为3.01～65.79 mmol/L（20.23±8.96 mmol/L）；血红蛋白降低103例，结果范围为40～168 g/L（84.89±15.56 g/L），无检查结果7例；24 h尿蛋白区间0.1~4.1 g/d（0.48±0.35 g/d），多数为低比重尿，蛋白尿及潜血（±）～（＋＋＋）不等。超声检查肾脏均不同程度受损，呈肾体积缩小（大小不对称）、结构不清晰、弥漫性改变、血流不丰富等，详见图1。肾病理形态学多为肾小管上皮细胞脱落变性、肾小管萎缩，有不同程度的肾小管间质损害，典型的为寡细胞性肾间质纤维化，详见图2。多数患者起病隐匿，进展程度不一，与年龄、服药时间不成正比。临床上肾功能呈进行性损害，多数不可逆、预后较差，多表现纳差、夜尿增多，乏力、面色苍白、水肿不明显，多伴有贫血，贫血程度与肾功能减退程度不平行。临床均以AAN或因服用AAs药物引起的间质性肾炎和伴有进行性肾功能减退等原因收住院治疗。
图 1 2例典型AAN超声影像-双肾体积缩小、结构不清晰
图 2 2例典型AAN肾病理组织形态学-寡细胞性肾间质纤维化
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111例AAN患者中，女性多于男性（2.58∶1），与有关报道[4]基本相似，可能因男女解剖和生理上有一定区别，女性较男性更易受药物影响[5]。其次，可能与绝经后女性因体内雌激素水平下降，易患更年期综合征、心血管疾病等，使用冠心苏合丸、龙胆泻肝丸治疗上述疾病会引起AAN的机会增加有关。本研究AAN患者年龄大于50岁共101例，占比90.99%。有报道指出，50～90岁人肾小球滤过率可下降50%，65岁后肝血流量为青年人的40%～50%[6]，中老年患者肝、肾功能的降低会影响药物代谢，使半衰期延长，导致药物在体内蓄积，增加患AAN的风险。最新研究证明，肾脏血流动力学的改变及肾小管上皮细胞损伤后重吸收功能的异常也是AAN的致病机制[7]。
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111例AAN患者中，服用含AAs药物最长的30年，最短20 d，107例服用超过1年。有研究发现，关木通临床等倍剂量提取物用药持续3周，可明显引起肾损害，证明肾毒性马兜铃酸累积阈剂量与给药剂量具有相关性[8]。中药中的很多成分是小分子物质，肾功能减退时肾脏排泄减少，加重残存肾单位药物负荷，药物在体内蓄积造成肾损害[9]。本研究发现，发生AAN的原因可能与长时间、超剂量服用AAs药物有关，使AAs在肾脏最主要的蓄积场所产生蓄积效应[10]，引起肾功能减退，进一步加重肾功能损伤。
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111例AAN患者中，涉及药物有7个品种，冠心苏合丸和龙胆泻肝丸共106例（95.50%）。本研究调查发现，患者服用冠心苏合丸和龙胆泻肝丸多在90 年代中后期，当时两药成分中含有AAs植物青木香和关木通，长期或短期服用可引起AAN。原国家食品药品监督管理局因青木香和关木通能引起AAN，于2003年将处方中的关木通换为木通，2004年将青木香替换为土木香，有效制止了青木香、关木通制剂引起的肾损害[11]。冠心苏合丸常用于冠心病、心绞痛的临床治疗，功效是宽胸、理气、止痛，用于寒凝气滞、心脉不通所致的胸闷、心前区疼痛的症状。龙胆泻肝丸具有泻肝胆实火、清下焦湿热的功效，主治肝胆实火上炎所致的头痛、目赤、胁痛、耳鸣等，以及肝胆湿热下注所引起的外阴瘙痒、小便淋浊、妇女带下等症。本研究调查发现，患者对中药毒副作用普遍存在认知偏差，认为中药没有毒副作用或毒副作用较小，多数患者为自我药疗，服药较随意，存在滥用现象。提示中药制剂应在中医理论指导下辨证施治，不可盲目擅自服用，避免引起药源性损害。
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本研究调查发现，患者服用AAs时间与肾功能受损情况不相关，服用时间的长短与个体差异有关，与年龄、服药时间不成正比。如78岁男性，服用冠心苏合丸2年，血肌酐1600 μmol /L，尿素氮43.8 mmol/L。81岁男性，服用冠心苏合丸30年，血肌酐721 μmol /L，血尿素氮25.9 mmol /L。61岁男性服用冠心苏合丸6年，血肌酐83 μmol /L，尿素氮6.7 mmol /L。55岁女性，服用含有木通中药汤剂20 d，血肌酐377 μmol /L，尿素氮17.2 mmol/L。AAN目前尚无特异性诊断标准,当服用含有AAs中草药制剂而出现无法解释的进行性发展相对较快的肾脏病时，需对AAN的可能性进行排查[10]。有研究显示，在早期肾小管损伤检测中，黄醇结合蛋白、β2微球蛋白、胱抑素C、尿-乙酰-β氨基葡萄糖苷酶等较血肌酐和尿素氮有一定检测优势[12-13]。提示临床对出现贫血、肾功能损害及肾脏大小改变等的患者，应追问其服药史，以求尽快确诊救治。
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AAs是一种广泛存在的毒性物质[14]，其引起肾损害毒性最大的是马兜铃酸Ⅰ[15-16]。文献通过对急性AAN患者随访1～7年，其中一半的患者因肾衰竭需要透析治疗，另外一半患者进展成4期慢性肾脏病，持续性损伤发展为终末期肾病[17]。AAN的特点是肾功能损害进展迅速，即便停止使用含AAs成分药物，病情依然进展[18]。目前尚无有效针对AAN的治疗方法[10]。有报道低剂量糖皮质激素可延缓AAs诱导的肾功能减退[19]；前列腺素E1对AAs诱导的急性肾脏微血管损伤可能有一定的治疗作用[20]；AAs诱导的慢性肾损伤通过同基因间充质干细胞移植有治疗肾间质纤维化的作用[21]；此外中药大黄附子汤[22]、丹参酮I可减轻AAs诱导的肾损伤等。以上方法因缺乏长期研究及病例数较少，尚难以对AAN疗效作出客观性评价[23]。在本研究中，临床通过中西医结合药物治疗，中药治疗为行益气养血固肾、活血化瘀、和胃降逆、通腑泄浊等辨证治疗，如百令胶囊、肾衰宁片、尿毒清颗粒、肾康注射液、中药汤剂等保肾降氮治疗，丹参川芎嗪注射液、冠心宁注射液、舒血宁注射液等活血化瘀治疗，叶酸、铁剂、促红细胞生成素等纠正贫血，硝苯地平、缬沙坦等降压治疗，对达到尿毒症期的患者行血液透析治疗，多数患者病情好转或稳定出院。
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多数AAN患者因纳差、夜尿增多、乏力等原因就诊，实验室检查后，多有不同程度的血尿肌酐、尿素氮升高等肾功能损害表现，临床初诊多诊断为慢性肾功能不全、血肌酐升高、肾功能衰竭等，易造成漏诊、误诊。分析原因：①AAN临床表现不典型，最初表现以纳差、乏力、夜尿增多为主，如果检查不全面，易造成误漏诊；②接诊医师对AAN的临床表现及发病特点认识不足，实验室检查血肌酐、尿素氮升高，就草率诊断为肾功能不全、肾功能衰竭、血肌酐升高等；③非专科医师对AAs毒副作用认识不够，接诊医师对AAN的病因、鉴别诊断要点不熟悉或忽视；④医生问诊时对患者服用药物询问不详细，忽略患者曾服用含有AAs的药物；⑤AAN多发生于50岁以上的中、老年人，以女性居多，存在个体差异，有肾脏实质性疾病的患者反应更为敏感[24]，初诊中要重点关注特殊人群。
AAs可通过一种或者多种机制导致不同程度的肾损伤[7]。肾损失患者个体差异较大，与服用AAs药物时间长短、剂量不相关，且AAN进展迅速，即使停止使用含AAs药物后病情依然进展。因此，进一步加强药物警戒工作，防范含有AAs成分药物引起的严重肾功能损害具有重要意义。临床诊疗过程中应重视对AAN的诊断，掌握AAN临床特点和规律，在中医药理论指导下辨证施治，进行早期的诊断和有效的干预，有条件的可进行治疗药物监测（TDM），有助于尽快确诊救治，避免误诊漏诊，减少AAN的发生或延缓其发展。
Analysis of 111 cases of aristolochic acids nephropathy
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摘要:
目的 分析含有马兜铃酸成分的药物引起马兜铃酸肾病的临床特点和规律。 方法 回顾性研究 111例服用含马兜铃酸成分的药物致肾损害患者的临床资料，分析马兜铃酸肾病的临床特点、服药及治疗方法等。 结果 111例患者中，女性多于男性（2.58∶1），大于50岁的101例（90.99%）；年龄（63.70±11.67）岁；平均用药时间（8.08±6.94）年；涉及冠心苏合丸和龙胆泻肝丸共106例（95.50%）；血肌酐升高108例，尿素氮升高106例，血红蛋白降低103例，多见低比重尿、轻中度蛋白尿和潜血；B 超检查示肾脏均不同程度受损。肾脏病理活检为肾小管损害。多数患者起病隐匿，进展程度不一，与年龄、服药时间不成正比，临床上肾功能呈进行性损害, 多数不可逆、预后较差。 结论 肾损害患者个体差异较大,肾损伤与服用马兜铃酸药物时间长短、剂量不平行；马兜铃酸肾病进展迅速，且停止服用含马兜铃酸药物后病情依然进展。加强药物警戒工作，实施早期的诊断和有效的干预，有助于减少马兜铃酸肾病的发生，延缓其发展。 Abstract:Objective To analyze the clinical characteristics and regularity of aristolochic acid nephropathy (AAN) induced by drugs containing aristolochic acid. Methods The clinical data of 111 patients with AAN induced by aristolochic acid were reviewed. The clinical features, medication and treatment of AAN were analyzed. Results Among 111 patients, there were more females than males (2.58∶1), 101 cases (90.99%) were over 50 years old; the mean age was (63.70±11.67) years old;the average duration of medication was (8.08±6.94) years. The drugs involved were Guanxinsuhe pill and Longdanxiegan pill in 106 cases (95.50%). Serum creatinine increased in 108 cases, urea nitrogen increased in 106 cases and hemoglobin decreased in 103 cases, most of which were hypogravity urine, mild to moderate proteinuria and occult blood. Ultrasonic examination revealed that the kidneys were damaged to varying degrees. Pathological biopsy of kidney showed renal tubular damage. Most patients had an insidious onset and varying degrees of progression, which were not proportional to the age and the duration of taking the medicine. In clinical, the renal function was progressively damaged, most of which were irreversible and with a poor prognosis. Conclusion Patients with renal impairment differed greatly individually, and the renal damage was not paralleled with the medication duration and dose of drugs containing aristolochic acid.AAN progressed rapidly, and the disease still progressed even after stopping taking drugs containing aristolochic acid. Strengthening pharmacovigilance, implementing early diagnosis and effective intervention could help to reduce the occurrence of AAN and attenuate its development. -
骨质疏松症是一种全身性骨代谢疾病，其典型特征是骨密度下降、骨脆性增加和骨微环境被破坏[1]。骨稳态失衡是其发生的主要病理学基础。骨稳态是指成骨细胞行使的骨形成功能和破骨细胞行使的骨吸收功能处在一个相对平衡的过程[2]。破骨细胞分化及其功能的过度活化是导致骨稳态失衡的重要因素[3]。中国骨质疏松症流行病学调查显示，我国50岁以上人群骨质疏松发病率为19.2%，65岁以上人群发病率为32%[4]。目前临床上治疗骨质疏松症的药物主要是骨吸收抑制剂，其在抑制骨吸收的同时，也干扰骨形成进程。因而发掘更好的治疗骨质疏松的药物是迫切需要的。
骨髓来源的巨噬细胞(BMMs)向破骨细胞分化需要重组小鼠巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子κB受体活化因子配体(RANKL)的持续刺激[5]。M-CSF增加了早期BMMs的增殖，RANKL与受体RANK结合激活肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)，进而激活细胞凋亡信号调节激酶1(ASK1)和NF-κB抑制物激酶(IKKs)，活化的ASK1和IKKs磷酸化JNK、ERK和P38以及NF-κB特异性抑制因子IκB特定部位的丝氨酸，激活MAPK和NF-κB信号。活化的MAPK和NF-κB使c-Fos、NFATc1表达增加，促进DC-STAMP、ATP6V0d2、TRAP、CTSK等破骨细胞特异性基因的转录与表达，导致破骨细胞分化[6]。研究表明，减弱破骨细胞分化及功能，能够有效地治疗骨质疏松症[7]。
冬虫夏草是一味传统中药，有增强免疫、抗炎、抗氧化和延缓衰老等作用[8]。先前的研究表明，富含锶的冬虫夏草菌丝发酵液对去卵巢骨质疏松大鼠有良好的治疗效果，其机制是提高了血清中的雌二醇水平，但是该研究仅基于整体水平解释了冬虫夏草作用于骨质疏松症的机制，对冬虫夏草的菌种也未作鉴定，并且野生的冬虫夏草提取液在骨质疏松症中的作用也未见报道[9-11]。本研究旨在探讨冬虫夏草提取液(CSE)对去卵巢小鼠的治疗作用以及对破骨细胞分化和功能的影响，为CSE防治骨质疏松症提供实验依据。
1. 材料
1.1 动物
SPF级雌性C57BL/6小鼠（上海西普尔-必凯实验动物有限公司），12周龄24只，6周龄7只，体质量20～22 g，合格证号：SCXK（沪）2018-0006。本实验经江西中医药大学实验动物伦理委员会批准（批号JZLLSC2019-0194），且遵循中国伦理委员会指导原则。
1.2 试剂
α-MEM培养基（美国Hyclone，批号：SH30265.01）；胎牛血清（美国Gbico，批号：10099-141）；重组小鼠RANKL、M-CSF蛋白（美国R&D，批号：462-TEC-010、416-ML-010）；TRAP染色试剂盒（浙江卓腾生物公司）；RNAiso Plus、TB Green（日本Takara，批号：9109、RR420B）；p-JNK、JNK、p-ERK1/2、ERK1/2、p-P38、P38和GAPDH兔单克隆抗体（美国CST，批号：4668、9252、4370、4695、4511、8690、5174）；山羊抗兔IgG H&L (IRDye® 800CW)预吸附二抗（美国Abcam，批号：ab216773）；冬虫夏草（上海雷允上药业有限公司）；羟基磷灰石涂板/96孔板（美国Corning，批号：3989）；小鼠抗酒石酸酸性磷酸酶、骨钙素、骨碱性磷酸酶ELISA试剂盒（上海生工，批号：D721140、D721126、D721049）。
1.3 仪器
371型细胞培养箱（美国Thermo）；Cytation 5多功能酶标仪（美国Bio-Tek）；CFX96型实时荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad）；SA型近红外双色激光成像系统（美国odyssey）；TI-SR型倒置显微镜（日本Nikon）；RM2016型病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）；JB-P5型包埋机（武汉俊杰）。
2. 方法
2.1 CSE制备
冬虫夏草(Cordyceps sinensis)药材产地为青海玉树，购自上海雷允上药业有限公司，经海军军医大学黄宝康教授鉴定。提取详情见引文[12]。
2.2 BMMs分离与培养
选取6周龄C57BL/6小鼠，使用颈椎脱臼法处死，取双侧股骨和胫骨，使用PBS将骨髓从骨髓腔中冲出，收集PBS并离心，弃上清液，使用α-MEM培养基重悬，于T75培养瓶内（含10%血清，1%青霉素-链霉素溶液及30 ng/ml M-CSF完全培养基）培养3 d。使用PBS清洗去除未贴壁细胞，加入适量新鲜完全培养基，直至细胞数量达到5×106个[13]。
2.3 CCK-8法检测BMMs细胞活性
在96孔板中，BMMs以8×103个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.125、0.25、0.5、1、2、4 mg/ml CSE干预处理，培养48 h或96 h，加入CCK-8检测液，37 ℃孵育1 h后在波长480 nm处检测吸光度。
2.4 体外破骨细胞分化实验
在96孔板中，BMMs以6×103个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE干预处理，同时加入50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF，阴性对照组不加入RANKL；每2 d更换一次培养基，直至第5天对破骨细胞进行TRAP染色。
将同样密度的BMMs接种于96孔板，孵育过夜；记过夜后为第1天，分别于第1、3、5天加入1 mg/ml CSE干预处理，每2 d更换一次培养基至第7天（仅加药1次，之后更换培养基均不加CSE），进行TRAP染色[14]。
2.5 F-actin环染色和骨吸收实验
在96孔板中，BMMs以6×103个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE干预处理，同时加入50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF，每2 d更换一次培养基。第5天用鬼笔环肽和DAPI分别对F-actin环和细胞核进行染色。
骨吸收实验：BMMs以5×105个/孔的密度接种于6孔板，孵育过夜；加入含50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF完全培养基，每2 d换液，至第4天出现小的破骨样细胞，胰酶消化以8×103个/孔密度重新接种至羟基磷灰石涂板内，并且加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE处理。培养3 d后，用次氯酸钠洗去细胞，PBS清洗后晾干，于光学显微镜下拍照，统计每个孔的骨陷窝面积[15]。
2.6 q-PCR检测
在12孔板中，BMMs以5×104个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE干预处理，同时加入50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF，每2 d更换一次培养基至第5天。抽提RNA，逆转录后使用q-PCR检测DC-STAMP、ATP6V0d2、TRAP、CTSK、NFATc1基因的表达，引物序列详情见引文[16]。
2.7 蛋白印迹法检测
在6孔板中，BMMs以5×105个/孔的密度接种，孵育过夜；使用无血清的α-MEM培养基饥饿细胞1 h，实验组更换含1 mg/ml的CSE的完全培养基，对照组更换含相同体积PBS的完全培养基，孵育3 h；均使用50 ng/ml RANKL刺激5、10、20、30、60 min，未被刺激的细胞作为0 min。刺激完成后，抽提总蛋白。经SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、5%脱脂奶粉封闭1 h，4 ℃下一抗孵育过夜，室温下荧光素偶联的二抗孵育1 h，用odyssey成像系统扫膜，分析JNK(1∶2000)、p-JNK(1∶2000)、ERK(1∶2000)、p-ERK(1∶2000)、P38(1∶2000)、p-P38(1∶2000)的表达。
2.8 动物造模、分组及给药
在24只12周龄小鼠中随机挑选6只作为假手术组（Sham组），其余小鼠使用异氟烷气麻，去除背部毛发，切开皮肤和背膜，使卵巢暴露，切除双侧卵巢并使用可吸收缝合线结扎、缝合（假手术组仅切开背部皮肤和腹膜）[14]。术后1周，按照文献报道方法[17]，将卵巢切除小鼠随机分为3组：模型组（OVX组）、CSE低剂量组、CSE高剂量组，每组6只。术后7 d开始给药，由预实验确定给药浓度为312.5和625 mg/kg，按照每只200 μl/d连续灌胃给药6周。
2.9 HE染色和TRAP染色
小鼠处死后取双侧股骨，4%多聚甲醛固定后进行脱钙处理，之后常规脱水、石蜡包埋，切成4 μm切片，分别进行HE染色和TRAP染色。统计破骨细胞数量/骨表面积（N. Oc/BS）、破骨细胞面积/骨表面积（Oc. S/BS）和骨体积/组织体积（BV/TV）。
2.10 ELISA法检测血清生化指标
小鼠处死前统一摘除小鼠左眼取血，将全血收集并在4 ℃静置30 min，之后在4 ℃下2 000 r/min离心20 min，吸取上清液置于−80 ℃冰箱中保存。按照Elisa试剂盒《用户操作手册》检测血清中TRAP、ALP、BGP含量。
2.11 统计学方法
使用Image J统计破骨细胞面积和个数、F-actin环面积和环内核数、骨陷窝面积、蛋白条带灰度值、N. Oc/BS、Oc. S/BS和BV/TV。使用SPSS 21.0统计学软件对数据进行分析。计量资料用均数±标准差（
$\bar x $ ±s）表示，多组间比较使用方差分析，以P<0.05认为差异具有统计学意义。3. 结果
3.1 CSE对BMMs细胞活力的影响
CCK-8结果显示，与空白组比较，CSE浓度范围在0.125～4 mg/ml时，48 h内和96 h内CSE对BMMs无细胞毒性（图1）。据此结果选择0.5、1、2 mg/ml作为之后的细胞实验浓度。
3.2 CSE对RANKL诱导的破骨细胞分化的影响
TRAP染色显示，与空白组比较，RANKL组的BMMs分化为成熟的TRAP阳性多核巨噬细胞（有完整的圆形状细胞形态且细胞核数目≥3）。与RANKL组比较，CSE不同剂量组的TRAP阳性多核巨噬细胞数量明显减少，且呈剂量依赖的方式下降，并且破骨细胞的大小也被显著抑制（图2A-C）。结果表明CSE不仅抑制破骨细胞的分化也阻碍了破骨细胞前体细胞的融合。
图 2 CSE对破骨细胞分化的影响（n=3）A.破骨细胞图像（×40）；B.每孔TRAP阳性多核细胞（细胞核数≥3）面积百分比；C.每孔TRAP阳性多核细胞（细胞核数≥3）个数；D.不同时间段加入CSE处理后的破骨细胞图像（×40）；E.加药时间示意图；F.每孔TRAP阳性多核细胞（细胞核数≥3）个数**P<0.01，与RANKL组比较在RANKL持续刺激的BMMs中按时段加入CSE。染色结果显示，与空白组比较，0 d组的BMMs几乎全部分化为成熟的破骨细胞，数量多，且形状完整。与0 d组比较，给予CSE1～3 d组的BMMs分化为成熟破骨细胞的数量最少，3～5 d组其次，5～7 d组最多（图2D、2E、2F）。结果表明CSE对破骨细胞生成的任一阶段均有作用，在早期阶段作用最为明显。
3.3 CSE对RANKL诱导的破骨细胞F-actin环形成和骨吸收功能的影响
鬼笔环肽和DAPI染色显示，RANKL组的F-actin环形成完整，数量多且面积大，环内细胞核数量多。与RANKL组比较，CSE不同剂量组的F-actin环数量和大小均下降，环内细胞核数量也明显减少（图3A、3B、3C）。
图 3 CSE对破骨细胞F-actin环形成和骨吸收功能的影响（n=3）A.F-actin环和细胞核共聚焦图像（×100）；B.每孔内F-actin环面积百分比；C.单个F-actin环内细胞核个数；D.骨陷窝图像（×40）；E.每孔未吸收面积百分比**P<0.01，与RANKL组比较骨板吸收显示，RANKL组未被吸收面积为70%， 1 mg/ml CSE组未被吸收面积为85%，2 mg/ml CSE组为95%，与RANKL组比较，不同剂量的CSE均有效的减少了骨板吸收的面积（图3D、3E）。结果表明CSE显著抑制了成熟破骨细胞骨吸收的功能。
3.4 CSE对RANKL诱导的破骨细胞特异性基因表达的影响
q-PCR结果显示，与RANKL组比较，CSE中、高剂量组显著性地抑制了破骨细胞特异性基因TRAP、CTSK、ATP6V0d2、DC-STAMP和NFATc1的表达，且呈剂量依赖性（图4）。这与CSE抑制破骨细胞分化及功能的结果相一致。
图 4 CSE对破骨细胞特异性基因表达的影响（n=3）A.TRAP；B.CTSK; C.ATP6V0d2; D.DC-STAMP; E.NFATc1*P<0.05，**P<0.01，与RANKL组比较3.5 CSE对破骨细胞分化过程中MAPK通路的影响
Wsetern-blot结果显示，RANKL组各时间段JNK、ERK和P38蛋白磷酸化显著。与RANKL组比较， CSE组p-JNK蛋白表达在第10～30 min明显下降，p-ERK蛋白表达在第20～60 min明显下降和p-P38蛋白表达在第10～60 min明显下降，见图5。结果表明在破骨细胞的分化过程中，CSE作用于MAPK通路JNK、ERK和P38的磷酸化。
3.6 CSE对卵巢切除小鼠的影响
HE和TRAP染色显示，与假手术组比较，OVX组小鼠的骨小梁数目和面积明显减少（BV/TV值下降）且间距变大，骨小梁表面破骨细胞数量增多、面积变大（N. Oc/BS、Oc. S/BS值上升）。与OVX组比较，CSE低剂量和高剂量组小鼠的骨小梁数目和面积均增加（BV/TV值上升）且间距减小，骨小梁表面破骨细胞数量减少、面积变小（N. Oc/BS、Oc. S/BS值下降），见图6。结果表明，CSE可以增加卵巢切除小鼠骨小梁数目，抑制破骨细胞活性，缓解骨量流失。
图 6 CSE对去卵巢小鼠股骨破骨细胞数量和骨小梁的影响（n=6）A.HE染色和TRAP染色；B.BV/TV；C.Oc. S/BS；D.N. Oc/BS；**P<0.01，与OVX组比较；##P<0.01，与假手术组比较3.7 CSE对TRAP、ALP、BGP含量的影响
ELISA结果显示，与假手术组比较，OVX组小鼠血清中的TRAP含量明显增加，BGP含量明显减少，ALP含量无明显变化；CSE高剂量组小鼠血清中的TRAP、BGP含量无明显变化， ALP含量明显增加。与OVX组比较，CSE低剂量和高剂量组小鼠血清中的ALP、BGP含量明显增加，TRAP含量明显减少（图7）。结果表明，CSE可以调节骨代谢相关指标，具有平衡骨稳态作用。
图 7 CSE对TRAP、ALP和BGP含量的影响（n=6）A.TRAP；B.ALP；C.BGP；*P＜0.05，**P<0.01，与OVX组比较；##P<0.01，与假手术组比较4. 讨论
骨质疏松症是一种与年龄相关的骨代谢疾病，骨重建失衡是其发生的主要原因，因绝经造成的骨质疏松占骨质疏松症的绝大部分。研究表明，雌激素对骨骼的生长、发育和维持至关重要，因雌激素缺失致使RANKL介导的信号通路过度活化，进而使破骨细胞功能异常，是绝经后骨质疏松症主要原因[18]。因而抑制破骨细胞的分化及其功能是治疗骨质疏松的有效途径[19]。在本研究中，我们发现CSE通过抑制MAPK信号通路的激活来抑制RANKL介导的破骨细胞生成，同时对OVX小鼠的骨质流失具有良好的保护作用。
研究表明，在RANKL的刺激下，BMMs中的MAPK通路被激活，进而刺激破骨细胞特异性基因的表达，促进BMMs分化为破骨细胞[19-21]。NFATc1和DC-STAMP是破骨细胞分化和前体破骨细胞融合的主要调控者，TRAP、CTSK、ATP6V0d2是反映破骨细胞活性和骨吸收状态的特异性指标[22-23]。本研究表明，CSE显著抑制RANKL介导的破骨细胞分化，而且在破骨细胞分化的早期阶段作用最为明显。其机制是抑制JNK、ERK和P38的激活，进而抑制破骨细胞特异性基因的表达。
F-actin环是分化成熟的破骨细胞在骨面上极化，使骨架重排，F-actin紧密排列形成的一个环，是破骨细胞进行骨吸收的先决条件。因而阻碍破骨细胞前体细胞的融合，能够有效抑制F-actin环的形成和骨吸收功能[24]。本研究发现CSE显著性地抑制F-actin环的形成，并降低了环内细胞核数以及骨陷窝面积，这表明CSE阻碍了破骨细胞前体细胞的融合和骨吸收功能，与CSE抑制破骨细胞分化及其特异性基因表达的结果相一致。
我们构建了去卵巢小鼠模型模拟绝经后的骨质疏松症，经CSE灌胃给药6周后，采用HE和TRAP染色对小鼠股骨进行骨组织形态学分析以及ELISA检测血清中ALP、TRAP、BGP含量。TRAP是酸性磷酸酶的同工酶，其血清浓度可反映破骨细胞的活性[25]。ALP是一种磷酸单酯酶，由成骨细胞分泌，能有效地反映成骨细胞的活性[27]。BGP由成骨细胞合成及分泌，绝大部分的BGP随成骨细胞矿化在骨基质中沉积，仅有一小部分进入到血液循环[14]。血液中的BGP是成骨细胞分泌完成后直接进入血液，并非是破骨细胞降解骨基质而进入血液，因而检测血液中的BGP含量，对评判机体经药物治疗后变化有较大的参考价值。结果显示，CSE能有效缓解骨量丢失，表现在CSE各剂量组小鼠的骨小梁数量增多，间距减少，以及骨表面破骨细胞数量和面积减少，表明了CSE对去卵巢小鼠的骨量流失具有良好的保护作用。同时CSE提高了血清中ALP含量，使BGP和TRAP含量回归正常水平，说明其可抑制破骨细胞分化，减弱骨吸收功能，具有缓解骨量流失和调节骨代谢作用。
总之，本研究发现CSE在体外抑制了RANKL诱导的破骨细胞分化及其骨吸收功能，其可能机制部分归因于CSE抑制了级联信号中ERK、JNK和P38的激活，在体内有效的缓解了因卵巢切除造成的骨量丢失，这为CSE防治骨质疏松症提供了初步的药理学证据。
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表 1 111例AAN患者年龄、性别分布情况
性别 年龄（岁） 合计 30~39 40~49 50~59 60~69 70~79 80~89 男 1 1 5 4 13 7 31 女 2 6 28 28 13 3 80 合计 3 7 33 32 26 10 111 构成比(%) 2.70 6.31 29.73 28.83 23.42 9.01 100.00 
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表 2 111例服用含有AAs成分药物持续时间
序号 服用时间（年） 数量（例） 构成比（%） 1 <1.0 4 3.60 2 1.0～<5 41 36.94 3 ≥5.0～<10 26 23.42 4 ≥10.0～<15 21 18.92 5 ≥15～<20 8 7.21 6 ≥20 11 9.91 合计 111 100.00
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表 3 111例AAN患者服用药物情况及原患疾病
序号 药物名称 例数 构成比（%） 原患疾病 1 冠心苏合丸 78 70.27 冠心病（38）、心前区不适（9）、风湿性心脏病（1）、急性心肌梗死（1）、间断胸闷+气短（1）、
口干+心慌（1）、心动过速（1）、心功能Ⅲ级（1）、心慌+气短（1）、心脏病（1）、不详（23）2 龙胆泻肝丸 22 19.82 祛火（7）、身体不适（5）、乙肝（3）、护肝（1）、酒后去肝火（1）、口腔溃疡（1）、
皮肤过敏（1）、眼干（1）、子宫肌瘤（1）、清肝明目（1）3 冠心苏合丸+龙胆泻肝丸 6 5.41 冠心病（3）、不详（3） 4 木通（中药饮片） 2 1.80 心前区不适（1）、不详（1） 5 耳聋丸 1 0.90 内耳眩晕症（1） 6 冠心苏合丸+冠心泰丸 1 0.90 不详（1） 7 龙胆泻肝丸+蛇王贝毒胶囊 1 0.90 不详（1） 合计 111 100.00
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