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![](data:image/svg+xml,<svg xmlns='http://www.w3.org/2000/svg' width='210' height='179'><foreignObject width='2000' height='100%'><div xmlns='http://www.w3.org/1999/xhtml' style='font-size:16px;font-family:Helvetica'><table>
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<td class="table_top_border table_bottom_border2" align="center" valign="middle">分类</td>
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<td align="center" valign="top">皮肤科真菌感染治疗</td>
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<td class="table_bottom_border" align="center" valign="top">性激素药物</td>
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<td class="table_bottom_border" align="center" valign="top">治疗因绝经期雌二醇下降引起的血管舒缩性症状</td>
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</tbody>
</table></div></foreignObject></svg>)
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喷雾剂是指将药物与适宜辅料配制成混悬液、溶液或乳液并装载于特定装置的一种制剂形式，使用时借助手动泵压力、高压气体、超声振动等方法使药液呈雾状喷出，既有雾化给药的特点，又避免使用抛射剂。喷雾剂给药方便、均匀度好、吸收快、起效迅速，可实现药物高效均一递送，在局部和全身给药以及治疗呼吸道疾病方面具有很好的优势，常作为皮肤、呼吸道给药的优选方案。此外，近些年喷雾剂的发展也为慢性创面修复、中枢神经系统药物递送、新型传染病防治等难题提供了新思路。喷雾剂的质量控制研究，首先需与其液体形态的特性相结合，评估药液本身的性质；另外也需考察与容器性能相关的参数，包括液滴粒径分布、喷雾模式、羽流几何等，确保喷雾剂质量符合要求。本文综述了喷雾剂目前在临床的应用情况以及发展新趋势，并介绍了喷雾剂质量控制关键参数，旨在为喷雾剂的研发提供思路与借鉴。
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喷雾剂在临床应用上具备独特的优点，首先可直接作用于病变部位，局部浓度高，药效迅速；其次可避免肝脏首关效应，提高药物生物利用度；另外喷雾剂具备靶向给药的特点，可依托“鼻-脑通路”治疗中枢系统疾病。同时与其他制剂形式相比，喷雾剂便携高效、无创安全等优势在临床具有极大的应用及研发前景。
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喷雾剂在呼吸道疾病治疗中占据优势，其药物能直接到达作用部位，局部浓度高，靶向性强，具有方便、安全、高效等特点。喷雾剂经呼吸道给药主要包括药液雾化及呼吸道沉积两个过程，药物溶液在经过喷雾泵后雾化形成液滴状，流速增加至15～20 m/s[1]；喷射的液滴随气流进入呼吸道，并沉积至鼻黏膜、口咽部或肺部。
对于鼻腔喷雾而言，喷雾装置产生的雾滴沉积在鼻腔部，不沉积至下呼吸道或者肺部[2]。故在呼吸系统疾病治疗中，鼻腔喷雾主要应用于鼻炎的治疗。药物成分主要为类固醇激素（例如布地奈德、糠酸莫米松等）以及抗组胺类药物（例如盐酸氮卓斯汀）。特别对于类固醇激素治疗而言，喷雾剂鼻腔给药在缓解症状、改善通气的同时，可以减少激素全身吸收，提高激素使用的安全性[3]。
对于口咽部沉积而言，喷雾剂主要应用于咽炎、扁桃体炎、手足口病、疱疹性咽峡炎的治疗。王凯等[4]研究发现，重组人干扰素α-2b喷雾剂联合热毒宁治疗小儿手足口病，患儿临床症状改善明显，炎性因子水平下降，治疗效果显著。陈建军等[5]对冰连清咽喷雾剂治疗咽炎进行多中心随机对照研究，发现治疗后患者咽部肿痛等不适得到改善，且患者依从性高，不良反应小；李红等[6]对132例疱疹性咽峡炎患儿进行临床研究，发现喜炎平注射液及开喉剑喷雾剂联合治疗效果显著优于仅喜炎平注射液组，联合治疗组咽痛消失时间、发热消失时间及疱疹消退时间均明显缩短。
对于肺部沉积而言，喷雾剂可以利用装置使液体雾化并以气溶胶形式经口吸入，实现药物靶向递送，降低给药剂量，减少全身给药带来的毒副作用。目前FDA批准上市的吸入式喷雾剂主要应用于慢性阻塞性肺疾病的治疗，包括异丙托胺-沙丁胺醇吸入喷雾剂（商品名：Combivent Respimat）、洛达特罗吸入喷雾剂（商品名：Striverdi Respimat）、噻托溴铵吸入喷雾剂（商品名：Spiriva Respimat）和噻托溴铵-洛达特罗吸入喷雾剂（商品名：Stioloto Respimat）[7]。
此外，喷雾剂在呼吸道传染病治疗方面亦有应用[8, 9]。Hassan等[10]研究发现，COVID-19鼻喷疫苗能够有效防止上呼吸道和下呼吸道的SARS-CoV-2感染，促进全身免疫反应；夏宁邵等研制的鼻喷新冠疫苗经免疫机制及临床研究[11, 12]，目前已获批上市，通过鼻腔喷雾方式接种，能够有效在呼吸道形成预防新冠病毒入侵的第一线免疫屏障。
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呼吸道黏膜分布大量的血管网络，能够迅速吸收药物成分并将其输送到全身循环系统中。与口服给药相比，呼吸道黏膜给药可以避免胃肠道不良反应，绕过肝脏首关效应，提高药物的生物利用度。Li等[13]在药代动力学实验中发现，甲氧氯普胺鼻喷雾剂血药浓度达峰时间明显短于口服片剂；生物利用度为62.3%，远高于口服片剂。
喷雾剂用作全身治疗中，激素替代治疗是重要的应用领域。例如，雌二醇鼻腔喷雾剂作为女性更年期症状治疗药物，临床研究表明其与口服制剂等效[14]。此外，喷雾剂在生物大分子如蛋白、多肽类中亦有应用。例如GnRH类似物布舍瑞林喷雾剂（商品名：Suprecur）、那法瑞林喷雾剂（商品名：Synarel）等。随着研发进展，一些激素替代治疗药物在适应证、临床应用上有新的拓展。例如,醋酸去氨加压素鼻喷雾剂可用于治疗成人夜尿症[15]，在对50名夜尿患者的随机双盲实验中发现，治疗组夜尿次数明显减少，生活质量显著改善[16]；Roy等[17]在临床研究中发现，鲑鱼降钙素鼻腔喷雾剂可减轻下颌骨骨折手术后疼痛，促进骨折断端愈合。
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由于皮肤角质层屏障作用的存在，喷雾剂经皮给药后主要作用于局部，常应用于皮肤科疾病治疗。表1为FDA近年批准上市在售的经皮给药喷雾剂列表，主要为治疗湿疹、皮炎的类固醇药物以及治疗皮肤真菌感染的抗真菌药物。此外，喷雾剂经皮给药后也可吸收进入体循环产生药效，例如，血管收缩药雌二醇透皮喷雾剂（商品名：Evamist），用于治疗绝经期更年期血管舒缩等症状，经皮喷雾给药后，血液中雌二醇浓度迅速达到绝经前水平[18]；Fraser等[19]对6名健康女性使用孕激素喷雾（商品名：Nestorone）后体内激素水平进行检测，结果表明，多剂量给药后受试者血中孕激素平均水平为391 pmol/L，可有效抑制排卵；Zech等[20]研发了一款青蒿素喷雾，动物实验证明可有效预防脑型疟疾发生，可作为疟疾透皮治疗的候选药物。
表 1 FDA近年批准上市在售的皮肤外用类喷雾剂列表
分类 商品名 有效成分 首次批准日期 适应证 皮质类固醇药物 Triamcinolone Acetonide 曲安奈德 2015/04/13 局限性瘙痒症、神经性皮炎、接触性皮炎、
脂溢性皮炎以及慢性湿疹等Clobetasol Propionate 丙酸氯倍他索 2019/10/02 Desoximetasone 去羟米松 2018/03/16 Sernivo 丙酸倍他米松 2016/02/05 抗真菌类药物 Lamisil At 盐酸特比萘芬 2000/03/17 皮肤科真菌感染治疗 性激素药物 Evamist 雌二醇 2007/07/27 治疗因绝经期雌二醇下降引起的血管舒缩性症状 近年来，随着新材料、新技术应用发展，经皮喷雾剂应用范畴开始向外伤创面修复拓展，常见的有水凝胶或细胞悬浮液喷雾[21-24]。其中，水凝胶皮肤喷雾作用机理是喷涂于伤口上形成薄层保护膜，防止伤口感染，促进创面愈合。例如，Jin等[25]利用壳聚糖和PDLLA-PEG-PDLLA制备水凝胶喷雾，实现有效止血抑菌，加速伤口愈合；Tavakoli等[26]以角叉菜胶-聚多巴胺（Kappa-carrageenan-polydopamine）为载体，包载氧化锌纳米颗粒及L-谷氨酸，制备针对糖尿病慢性创面治疗的新型喷雾敷料，具有优异的修复、抗菌、凝血能力；Liu等[27]利用热敏水凝胶（PF127）与锌修饰二甲双胍结合，开发一款伤口黏合喷雾剂（ZnMet-PF127），实验证明其在促进皮肤伤口愈合方面比单独使用 ZnCl2或二甲双胍效果更好，并可有效抑菌，是皮肤创伤修复的新选择。而细胞悬液喷雾在皮肤创面修复治疗的研究也是近些年的热点。与传统细胞移植相比较，细胞喷雾移植所需供体部位创伤更小，可减少愈合时间，最大程度减少并发症的发生[28, 29]；且喷雾移植可以确保细胞均匀喷洒，更适用于大型创面或关节处伤口的修复[22]。
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近年来，中枢神经类疾病发病率逐年上升[30, 31]。在中枢神经系统疾病治疗过程中，98%的小分子药物以及几乎所有的大分子药物无法通过血脑屏障进入大脑，故如何使药物分子通过血脑屏障递送至病变位置，是必须解决的关键问题[32, 33]。
“鼻-脑通路”是指药物分子由鼻腔进入脑部的途径，主要包括嗅觉神经通路、嗅黏膜上皮通道及三叉神经通路等[34-36]。对比其他给药方式，鼻腔给药能够绕过血脑屏障将药物直接递送到脑部，避免肝脏首关效应，并且实现药物无创递送，提高患者依从性[37, 38]。基于“鼻-脑途径”研究基础，Dietrich等[39]发现芬太尼鼻喷雾剂比口服吗啡或芬太尼镇痛效果更佳并且可以有效缩短镇痛起效时间；Bouw等[40]在临床药动学及药效学研究中发现，咪达唑仑鼻喷雾剂可以快速、持续起效；Katz等[41]评估了艾氯胺酮鼻喷雾联合口服药物治疗难治性抑郁症风险的获益概况，发现联合使用艾氯胺酮鼻喷雾可更快起效、缓解症状，提示中重度难治性抑郁症患者可使用艾氯胺酮鼻喷雾进行诱导及维持治疗。
临床应用方面，FDA目前批准上市在售的中枢神经类药物鼻喷雾剂，主要集中于镇静催眠药物（咪达唑仑、地西泮等）以及偏头痛的治疗（佐米曲普坦、舒马曲坦、降钙素基因相关肽受体拮抗剂）等方面，关于脑缺血、脑损伤等神经急危重症的应用目前正处于研究阶段。例如，Wen等[42]制备川芎嗪-冰片脂质体喷雾剂，减少大鼠脑缺血再灌注损伤；Wingrove等[43]利用磁共振对鼻腔喷雾递送胰岛素进行研究，实验发现给药后脑内胰岛素受体密集区域（双侧杏仁核）血流量明显减少，表明经鼻-脑通路喷雾递送胰岛素有效，为胰岛素治疗脑缺血、脑损伤等疾病提供了思路[44]。
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喷雾剂是由药物溶液及输送装置组成的闭合系统，这使得喷雾剂质量控制标准更为复杂。喷雾剂的质量控制一方面要结合原料药物及制备工艺，对药液本身性质进行研究；另一方面，需对喷雾剂喷雾性能进行考察，保证药物递送稳定均一[45]。2020年版《中国药典》明确规定了喷雾剂各项质量标准项目，其中包括每喷喷量、每喷主药含量、递送剂量均一性等，是反映药物递送稳定性及均一度的重要指标。此外，对于鼻腔喷雾剂而言，喷雾模式、羽流几何、液滴分布粒径等指标影响喷雾剂进入呼吸道后沉积部位，可作为可靠的质量控制标准[46, 47]。
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喷雾模式是指在特定距离上对喷雾液滴分布水平横截面进行分析[48]，主要观察指标是椭圆度及面积。羽流几何是自喷雾起始点对喷雾垂直（锥形）横断面上羽流角度和宽度进行分析。
对于鼻腔递送给药而言，喷雾模式与羽流几何是影响喷雾鼻后沉积的重要因素，常作为喷雾剂质量表征参数。其中羽流角度影响最为显著[49, 50]，羽流角度小（成人<30°，儿童<20°），药液能更好穿过鼻腔前、中庭，沉积在鼻甲区域[51, 52]；羽流角度越大，药液更容易沉积于鼻腔前侧。而对于喷雾模式的考察可以体现喷雾的均匀度。喷雾模式中的椭圆度为喷雾轮廓内最长轴Dmax与最短轴Dmin的比值，数值越接近于1，羽流形状越接近圆形，喷洒均匀度更好，药物吸收更佳。
研究发现[53]，喷雾模式和羽流几何主要受液体黏度、喷雾泵孔口直径等多方面因素影响。其中，喷雾泵孔口直径是影响喷雾面积的最显著因素，喷雾泵孔口直径越大，喷雾面积越大。处方因素中溶液黏度对喷雾模式及羽流几何有确切影响，溶液黏度越高，喷雾面积越小[54, 55]。
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液滴粒径分布是喷雾剂另一项重要考量指标。目前常利用激光衍射法对喷雾剂液滴粒径进行测定分析[56]。随着拉曼光谱识别技术的运用，可将检测液滴与拉曼光谱数据库进行比对，以区分主药与各辅料成分颗粒[57]；并可与自动化成像技术联用，缩短检测分析时间，减少主观因素影响。一般将喷雾每次泵出分为3个时期，各时期液滴粒径特点见表2。
表 2 单次触发喷雾不同阶段液滴粒径特点
时期分段 特点 形成期 液体自喷雾泵口流过，压力较低，流速较低，液滴粒径较大 稳定期 压力和流速逐渐增加，进入平台期，液滴粒径较小且稳定 消退期 压力和流速降低，雾化不稳定，液滴粒径大小不一，可出现大粒径液滴 液滴粒径是决定喷雾剂黏膜覆盖面积及药物吸收效率的重要因素，喷雾液滴粒径越小，药液与黏膜接触面积越大，药物吸收效率越高[58]。对于鼻腔喷雾给药而言，液滴粒径分布与药液沉积范围密切相关，液滴粒径越大，鼻腔前部药液沉积率更大。故对于制剂研发，需合理控制液滴粒径分布以改善药物沉积效率，确保高效递送。
在对液滴粒径分布的研究过程中，其大小受药液黏度、喷雾泵孔口尺寸、揿动压力[47]等多因素影响。其中黏度为最显著影响因素，药液黏度越小，喷雾液滴粒径越小，雾化越充分。同时，有研究指出[58]，在揿动压力较低条件下，喷雾剂液滴粒径较大，提示儿童使用喷雾剂时存在雾化不足的可能。
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喷雾剂作为一种具备无创性、便利性和精准高效等优点的剂型，具有广泛的研发和市场应用前景，特别是在皮肤疾病、外伤创面修复、呼吸道疾病治疗以及利用鼻-脑循环递送给药等领域具备其他剂型无法比拟的优势。随着新型药物研发及制剂研究深入，喷雾剂应用场景将进一步拓展，特别是在急危重症救治、慢性难愈性创面、神经系统疾病靶向治疗等领域拥有广阔前景。与此同时，由于喷雾剂是药品和器材的组合，其质量控制标准较其他制剂更为复杂，研究工作者需不断完善其质量控制体系，以制定出精准高效的评价方案，确保产品的质量和安全性。
Research progress on clinical application and quality control of sprays
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摘要: 喷雾剂因其起效迅速、安全便利等优势而逐渐受到人们的重视并得到广泛应用。皮肤科、呼吸道疾病治疗、创面修复以及中枢神经系统靶向药物递送已成为喷雾剂研究和应用的重点领域。随着新型药物的发展及现代制剂学研究的深入，喷雾剂研发思路更趋多样，应用场景日渐广泛。本文综述喷雾剂临床应用现状及最新研究进展，对其质量控制参数进行简要介绍，以期为喷雾剂的研究提供借鉴。Abstract: Sprays have gained significant attention and widespread use due to their numerous advantages, including rapid action, safety, and convenience. They are widely used in various fields such as dermatology, respiratory disease treatment, wound repair, and central nervous system targeted drug delivery. With the in-depth research of new drugs and modern pharmaceutics, the development ideas of sprays are more diverse, and the application scenarios are increasingly extensive. In this review the clinical application status of sprays and the latest research progress were summarized. Then the quality control parameters were briefly introduced, which provided reference for the research and development of sprays.
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Key words:
- spray /
- clinical application /
- quality control
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慢性脑缺血(CCI)是指各种原因引发的长期大脑血灌流量不足，在血管性痴呆和阿尔茨海默病等神经系统疾病的发展过程发挥重要作用[1-2]。长期慢性脑缺血会导致慢性神经炎症、海马自噬异常、脑部神经元凋亡[3-4]，为此，CCI已经严重威胁人类的健康。肠道被称为人类的“第二大脑”，肠道微生物参与周围神经系统和中枢神经系统的双向调节，并通过脑-肠互动（即脑-肠轴）与机体的神经系统密切相关[5]。研究证明中枢系统疾病会导致肠道菌群失调[6]，患者发生脑卒中后，不仅会出现胃肠道并发症，还会发生肠道菌群失调，例如肠道菌群中的阿克曼菌属（Akkermansia）会发生变化[7]。同时，肠道菌群失调也推动了脑卒中等疾病的发展，文献报道厚壁菌门增加与认知功能损伤有一定的关联[8-9]。因此，肠道菌群参与了脑部神经系统疾病的进展。中药复方虎杖清脉饮是上海市著名中医脉管病专家奚九一教授数十年临床诊治经验的总结，临床上对辩证属“热郁毒聚，脉滞络痹”的脑小血管损伤疗效显著。有报道虎杖清脉饮通过调节p38和NF-κB信号通路，抑制高糖诱导的人视网膜毛细血管内皮细胞的损伤[10]，提示虎杖清脉饮具有抗炎和抗凋亡作用。然而，虎杖清脉饮对慢性脑缺血的治疗作用缺乏临床前研究，作用机制尚不清楚。因此，本实验研究虎杖清脉饮对慢性脑缺血小鼠认知功能的影响，并基于肠道菌群角度初步探讨其作用机制，为防治慢性脑缺血提供新的思路。
1. 材料
1.1 动物
24只C57BL/6J雄性小鼠(20±5) g，购自常州卡文斯实验动物有限公司（动物合格证号：202112546）。饲养于海军军医大学药学系动物房，饲养条件为温度（24 ± 2） ℃，相对湿度70 %，每天光照时间为08:00至20:00，自由进食饮水。所有操作均符合海军军医大学实验动物伦理要求。
1.2 药物及试剂
虎杖清脉饮由上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院提供。由虎杖、垂盆草、豨莶草、连翘、黄芪、鸡血藤和川芎七味常用中药制备[10]。所有药品粉碎成粗粉，蒸馏水浸泡，煮沸2次，每次40 min，合并滤液，浓缩至0.675 g/ml。银杏叶提取物由上海阿拉丁生物化学技术有限公司提供。
1.3 仪器与设备
Morris 水迷宫（上海奥尔科特生物科技有限公司）；组织脱水机、包埋机（武汉俊杰电子有限公司）；倒置生物显微镜（日本尼康）；病理切片机（上海俫卡仪器有限公司）；DYY-6C 型核酸电泳仪、ND2000 型光度计、9700 型PCR 仪、Quantus™型高灵敏荧光计、Miseq PE300测序平台（美吉生物公司）。
2. 方法
2.1 双侧颈总动脉狭窄模型（BCAS）的建立及动物分组
24只小鼠适应性饲养7 d后，随机分为4组：假手术组、模型组、阳性药组（银杏叶提取物）、虎杖清脉饮组，每组6只。小鼠腹腔注射1 %戊巴比妥钠（10 ml/kg）麻醉，并暴露颈总动脉(CCAs)。在体视显微镜下，将微型弹簧圈(钢丝直径0.08 mm，线圈内径0.18 mm，螺距0.5 mm，总长度2.5 mm)螺旋旋转固定在双侧颈总动脉上致颈总动脉狭窄使脑慢性灌注不足，建立BCAS模型。然后缝合手术部位，并对术后小鼠进行护理，直到它们意识清醒。造模6 w后，各组开始进行灌胃给药12 w。阳性药组给予银杏叶提取物（GBE）30 mg/kg，虎杖清脉饮组（HZQMY）给予虎杖清脉饮13.5 mg/kg，假手术组（Sham）和模型组（BCAS）给予等量生理盐水处理。
2.2 水迷宫实验
Morris水迷宫实验分为前5 d的定位航行实验和第6 d的空间探索实验。定位航行实验：主要用于测试小鼠的空间学习能力。实验历时5 d，每天每只小鼠训练3次。训练时随机选择一个象限开始，按顺时针方向训练3次。每次将该象限的池壁中点作为入水点，将小鼠面向池壁轻轻放入水中，尽量保持每次入水方式的一致，减少人为影响。小鼠每次分别从不同象限入水寻找逃逸平台，若小鼠找到登上平台，并停留5 s以上，则计时结束，水迷宫装置自动记录小鼠从入水到寻台成功的时间，即为逃避潜伏期。如果在60 s后仍未登上平台，计时也将停止，将小鼠人为引上平台休息1 min，且当次的逃避潜伏期记录为60 s。
空间探索实验：主要用于测试小鼠的空间记忆能力。在定位航行实验结束的第2d，撤除平台，选择与第四象限最远的第二象限池壁中点为小鼠入水点，将小鼠面向池壁轻轻放入池中，使小鼠自由游泳60 s并记录这60 s内小鼠在原平台的停留时间、穿过原平台所在位置的次数作为判断小鼠空间记忆能力差异的指标。
2.3 LFB染色
治疗结束后，每组各取6只小鼠，用1 %戊巴比妥钠（10 ml/kg）腹腔注射麻醉，4 %多聚甲醛灌注后，取脑石蜡包埋，切片，厚度5 μm，用于LFB(Luxol Fast Blue stain)染色。将石蜡切片常规脱蜡至水，加入LFB染色液于60 ℃烤箱染色3 h。95 %乙醇洗去多余染色液，蒸馏水冲洗。Luxol分化液分化15 s，70 %乙醇分色。重复分化步骤，直至胼胝体和皮质之间形成鲜明对比。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，在显微镜下采集图片。
2.4 肠道菌群测序分析
末次给药后禁食12 h，脱颈椎处死小鼠，处死方法符合动物福利伦理要求，无菌条件下取盲肠内容物，置于液氮中速冻保存。送至美吉生物技术股份有限公司进行DNA提取，合格样品进一步进行高通量测序。
2.5 数据处理与分析
运用美吉生物信息云（https://cloud.majorbio.com/）进行数据的处理，利用美吉生信云UParse软件（v7.0.1090）进行OTU（operational taxonomic units）分析、Alpha多样性分析、稀释曲线分析；利用美吉生信云tax_summary_a文件夹中的数据表和R语言（version 3.3.1）工具统计和作图进行物种组成分析；利用Qiime计算Beta多样性距离矩阵；利用美吉生信云进行线性判别分析（LEfSe），计算多级物种之间的差异。
2.6 统计分析
采用统计软件SPSS 19.0、GraphPad 9.0进行分析。符合正态分布的计量数据以（
$\bar{x}$ ±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA)。以P<0.05表示有显著性差异，以P<0.01表示有极显著性差异。3. 结果
3.1 虎杖清脉饮对小鼠学习记忆能力和白质损伤的影响
如图1A所示，假手术组小鼠从水迷宫实验第1 d开始到第5 d，逃避潜伏期在不断减少。而模型组小鼠随天数的增加，找到平台的时长并没有明显缩短，并且与假手术组相比，第4天和第5天逃避潜伏期有显著性差异（P<0.05），各给药组小鼠逃避潜伏期在逐渐减少，第5天阳性药组、虎杖清脉饮组与模型组之间的逃避潜伏期差异有统计学意义(P<0.05)。如图1B所示，模型组小鼠的跨越平台次数显著少于假手术组（P<0.01）。而虎杖清脉饮组的跨越平台次数显著大于模型组（P<0.01）。如图1C所示，模型组小鼠的目标象限百分比显著少于假手术组（P<0.05），阳性药组和虎杖清脉饮组的目标象限百分比均显著大于模型组（P<0.05），提示虎杖清脉饮可以改善慢性脑缺血小鼠的学习记忆能力。如图1D所示，假手术组中，小鼠胼胝体的LFB染色，髓鞘排列整齐，无水肿、碎裂及空泡的形成。模型组，LFB着色浅，髓鞘崩解，部分髓鞘空泡化。经银杏叶提取物和虎杖清脉饮治疗，髓鞘病变减轻，染色加深，提示虎杖清脉饮可以改善慢性脑缺血小鼠的白质损伤。
图 1 虎杖清脉饮对小鼠学习记忆能力和白质损伤的影响（n=6，$ \bar{x} $ ±s）Sham-假手术组；BCAS-模型组；GBE-阳性药组；HZQMY-虎杖清脉饮组（下同）A.小鼠的逃避潜伏期；B.平台穿越次数；C.目标象限百分比；D. 小鼠脑组织 LFB染色；* P <0.05，** P <0.01，与假手术比较；# P <0.05，## P <0.01，与模型组比较3.2 小鼠肠道菌群物种注释与评估
各组小鼠肠道菌群优化后序列数目为964830，碱基数目为398083175，平均长度为412 bp，序列长度分布在400~440 bp内。图2A为3组小鼠肠道微生物等级丰度曲线，从丰度曲线可以看到各组在缓慢平稳下降，说明各组小鼠肠道菌群物种丰富度高并且分布均匀。图2B、2C所示，总物种曲线可分析样本包含的物种总和，共享物种曲线可分析样本共享物种数目，本研究各组总数目和共享项目增加或减少趋势均逐步减缓并趋于平坦，表明各组样本量满足评估物种丰富度和核心物种数的要求。
3.3 各组小鼠肠道菌群Alpha多样性分析
如图3A、3B、3C所示，丰富度实际观测值指数、物种丰富度ACE指数和物种丰富度Chao1指数可解释生物群落丰富度。相较于假手术组，模型组小鼠肠道菌群丰富度显著下降（P<0.05）；相较于模型组，虎杖清脉饮组肠道菌群丰富度显著升高（P<0.05），说明虎杖清脉饮可以提升模型组小鼠肠道菌群的丰富度。如图3D所示，3组小鼠肠道菌群的Shannon均匀度测量指数无明显差异。综上，模型组慢性脑缺血小鼠菌群的物种丰富度明显下降，虎杖清脉饮可提升慢性脑缺血小鼠菌群的物种丰富度。
图 3 各组小鼠肠道菌群Alpha多样性分析（n=6，$ \bar{{x}} $ ±s）A .丰富度实际观测值指数；B. 物种丰富度ACE指数；C. 物种丰富度Chao1指数；D. Shannon均匀度测量指数；* P<0.01，与假手术比较；# P<0.05，与模型组比较3.4 小鼠肠道菌群Beta多样性分析
通过主成分分析（PCA）各组小鼠样本菌群群落组成差异，运用反差分解，在图中通过距离反映不同组之间的组成差异，如样本物种组成越相似，反映在主成分分析图中的距离越近。假手术组和模型组聚集在一起，说明模型组对肠道菌群的影响较小。而虎杖清脉饮组与模型组距离较远，说明慢性脑缺血小鼠肠道菌群改变较小，虎杖清脉饮具有调控模型组小鼠肠道菌群组成的作用（图4）。
3.5 小鼠肠道菌群物种组成及差异分析
3.5.1 基于门水平差异性分析
门水平上，3组小鼠肠道中占主导地位的微生物主要有厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidota）、脱硫菌门（Desulfobacterota）、髌骨细菌门（Patescibacteria）、放线菌门（Actinobacteriota），其中后壁菌门和拟杆菌门为优势门类（图5A）。由图5B所示，各组小鼠肠道菌群中髌骨细菌门
和弯曲菌门丰度有显著性差异（P<0.05）。如图5C所示，相较于假手术组，模型组疣微菌门丰度显著升高（P<0.05）。如图5D所示，相较于模型组，虎杖清脉饮组小鼠的疣微菌门丰度显著降低（P<0.05），髌骨细菌门丰度显著增加（P<0.05）。门水平差异性分析显示，慢性脑缺血小鼠疣微菌门丰富度增加；虎杖清脉饮降低慢性脑缺血小鼠疣微菌门和增加髌骨细菌门的群落丰度。 
图 5 各组小鼠肠道菌群门水平组成及差异分析（n=6，$ \bar{x} $ ±s）A.各组样本的优势物种及其相对丰度； B.各组样本门水平群落丰度差异；C. Sham组与BCAS组菌门群落丰度差异；D. BCAS组与HZQMY组菌门群落丰度差异；* P<0.05，与假手术比较；# P<0.05，与模型组比较3.5.2 基于属水平差异性分析
属水平上，3组小鼠肠道中优势菌为毛螺菌科_NK4A136_group、norank_f_Muribaculaceae和乳杆菌属(Lactobacillus)等（图6A）。如图6B所示，3组小鼠的肠道菌群中，阿克曼菌属（Akkermansia）、绿脓杆菌（Turicibacter）、嗜木聚糖真杆菌属（Eubacterium_xylanoPhilum_group）、异杆菌属（Allobaculum）、丹毒荚膜菌属（Erysipelatoclostridium）、回肠杆菌（Ileibacterium）、乳酸球菌属（Lactococcus）群落丰度具有显著性差异（P<0.05，P<0.01）。如图6C所示，与假手术组相比，模型组阿克曼菌属、丹毒荚膜菌属丰度显著上升（P<0.05）；嗜木聚糖真杆菌属、异杆菌属、绿脓杆菌、回肠杆菌和乳酸球菌属丰度显著下降（P<0.05，P<0.01）。如图6D所示，与模型组相比，虎杖清脉饮组的阿克曼菌属、丹毒荚膜菌属丰度显著下降（P<0.05）；嗜木聚糖真杆菌属、异杆菌属、绿脓杆菌、回肠杆菌和乳酸球菌属丰度显著上升（P<0.05，P<0.01）。
图 6 各组小鼠肠道菌群属水平组成及差异分析（n=6，$ \bar{x} $ ±s）A.各组样本的优势物种及其相对丰度；B.各组样本属水平群落丰度差异；C.假手术组与模型组菌属群落丰度差异；D.模型组与虎杖清脉饮组菌属群落丰度差异；* P<0.05，**P<0.01，与假手术比较；# P<0.05，## P<0.01，与模型组比较3.6 各组小鼠肠道菌群LEfSe多级物种差异判别分析
如表1所示，LEfSe可以检测各组之间存在显著丰度差异特征。相较于假手术组，模型组疣微菌门（P_Verrucomicrobiota）、疣微菌纲（c_Verrucomicrobiae）、疣微菌目（o_Verrucomicrobiales）、阿克曼菌科（f_Akkermansiaceae）等相对丰度显著上调；嗜木聚糖真杆菌属（g_Eubacterium_xylanophilum_group）、罗氏菌属（g_Roseburia）、回肠杆菌属（g_Ileibacterium）等相对丰度显著下调，表明慢性脑缺血小鼠上述肠道菌群丰度发生显著性变化。
表 1 各组小鼠肠道菌群LEfSe多级物种差异判别分析菌群 模型组vs
假手术组虎杖清脉饮组vs
模型组疣微菌门（P_Verrucomicrobiota） ↑ ↓ 疣微菌纲（c_Verrucomicrobiae） ↑ ↓ 疣微菌目（o_Verrucomicrobiales） ↑ ↓ 克里斯滕菌目（o_Christensenellales） ↑ 阿克曼菌科（f_Akkermansiaceae） ↑ ↓ 克里斯滕菌科（f_Christensenellaceae） ↑ 粪芽孢菌属（g_Coprobacillus） ↑ ↓ 阿克曼菌属（g_Akkermansia） ↑ ↓ 嗜胆菌属（g_Bilophila） ↑ 克里斯滕菌属
（g_Christensenellaceae_R-7_group）↑ 丹毒荚膜菌属（g_Erysipelatoclostridium） ↑ ↓ 嗜木聚糖真杆菌属（g_Eubacterium_xylanophilum_group） ↓ 罗氏菌属（g_Roseburia） ↓ 未分类克里斯滕森菌科（g_unclassified_f_Christensenellaceae） ↓ 异杆菌属（g_Allobaculum） ↓ ↑ 理研菌属（g_Rikenella） ↓ 绿脓杆菌属（g_Turicibacter） ↓ ↑ g_Tyzzerella ↓ 回肠杆菌属（g_Ileibacterium） ↓ 蓝细菌纲（c_Cyanobacteriia） ↓ f_Tannerellaceae ↓ f_norank_o_Chloroplas ↓ g_norank_f_norank_o_Chloroplast ↓ 副杆菌属（g_Parabacteroides） ↓ o_PeptostrePtococcales-Tissierellales ↑ 髌骨细菌门（P_Patescibacteria） ↑ c_Saccharimonadia ↑ o_Saccharimonadales ↑ f_Saccharimonadaceae ↑ 丹毒丝菌科（f_Erysipelotrichaceae） ↑ 消化链球菌科（f_Peptostreptococcaceae） ↑ g_Candidatus_Saccharimonas ↑ g_UCG-005 ↑ g_Romboutsia ↑ 嗜木聚糖真杆菌属（g_Eubacterium_xylanophilum_group） ↑ g_norank_f_Atopobiaceae ↑ 安德克氏菌属（g_Adlercreutzia） ↑ 分节丝状菌属（g_Candidatus_Arthromitus） ↑ g_Lachnospiraceae_UCG-006 ↑ g_NK4A214_group ↑ 注：↑表示相对丰度增加，↓表示相对丰度降低。 相较于模型组，虎杖清脉饮组疣微菌纲（c_Verrucomicrobiae）、蓝细菌纲（c_Cyanobacteriia）、疣微菌门（P_Verrucomicrobiota）、阿克曼菌科（f_Akkermansiaceae）、阿克曼菌属（g_Akkermansia）、粪芽孢菌属（g_Coprobacillus）、丹毒荚膜菌属（g_Erysipelatoclostridium）、副杆菌属（g_Parabacteroides）等相对丰度显著下调；丹毒丝菌科（f_Erysipelotrichaceae）、消化链球菌科（f_PeptostrePtococcaceae）、绿脓杆菌属（g_Turicibacter）、异杆菌属（g_Allobaculum）、嗜木聚糖真杆菌属（g_Eubacterium_xylanophilum_group）等相对丰度显著上调。说明虎杖清脉饮通过调节嗜木聚糖真杆菌属、异杆菌属、绿脓杆菌、疣微菌、阿克曼菌和丹毒荚膜菌的丰度，达到治疗慢性脑缺血的治疗作用。
4. 讨论
慢性脑缺血会损害脑血管，导致患者身体残疾、认知障碍或抑郁样行为。慢性脑缺血(CCI)被认为是血管性痴呆的一个病理生理标志[1-2]，它是血管认知障碍(VCI)最严重的阶段和形式，与推理、学习和记忆方面的问题有关[11-12]。
近年来，大量的研究展示了肠道微生物对人体的生长发育有重要作用，当肠道微生物失调时，可能造成神经功能缺陷，进而出现神经退行性疾病[13-14]。肠道微生物参与周围神经系统和中枢神经系统的双向调节，并通过脑-肠轴调节参与机体的免疫、代谢、神经、内分泌等系统，进而影响多种神经系统疾病的发生[15-16]。研究显示，神经类疾病如阿尔兹海默症、抑郁症、帕金森疾病等都存在宿主肠道菌群紊乱的现象，并且发现肠道菌群能通过神经内分泌和自主神经实现脑-肠信号转导，从而参与调节宿主的神经-内分泌-免疫网络，影响宿主的情绪、认知或行为改变[17]。
虎杖清脉饮由虎杖、垂盆草、豨莶草、连翘、黄芪、鸡血藤和川芎组成，虎杖为君药，《药性论》曰：“虎杖，压一切热毒”。虎杖性味苦，寒，在方中起清热解毒、凉血祛瘀的功效。虎杖对神经具有保护作用，如虎杖苷可通过调控lncRNA-MALAT1发挥脑微血管内皮细胞保护作用；虎杖苷可以激活SIRT1信号通路减轻大鼠创伤性脑损伤[18]。连翘[19]、垂盆草及豨莶草[20-21]共为臣药。连翘味苦，微寒，属于清热解毒药，《医学衷中参西录》：连翘具升浮宣散之力，可流通气血。垂盆草味甘、淡，性凉，豨莶草性味辛、苦，寒，二者具有清热解毒，祛风通络之功。三药联用助虎杖清热解毒，又能增强通络的作用。鸡血藤[22]、黄芪共为方中佐药。鸡血藤温而不烈，活血祛瘀兼有补血功效；黄芪甘温，具有益气扶正之功，治久病气虚。三者可治血瘀气虚兼症，并能制君药和臣药苦寒，保护脾胃。川芎[23]辛温，既能祛风，又能行气活血，引诸药上行巅顶，为佐而兼使之用。其中的川芎嗪、阿魏酸、藁本内酯等[24-25]化学成分有明显脑保护作用。诸药合用，共奏清热解毒、活血通络之功。本研究通过减少颈总动脉的血流量，成功建立慢性脑缺血小鼠的模型。
通过水迷宫实验和LFB染色表明虎杖清脉饮对小鼠慢性脑缺血具有保护作用，从肠道菌群的角度观察发现慢性脑缺血将会导致小鼠菌群的物种的丰富度有所下降，并且其中疣微菌门、阿克曼菌属和丹毒荚膜菌属相对丰度上升，而嗜木聚糖真杆菌属和异杆菌属的相对丰度下降；虎杖清脉饮具有增加小鼠肠道菌群物种丰富度的作用，以及回调因为慢性脑缺血而导致菌属变化的作用。阿克曼菌隶属于疣微菌门，是肠道微生物中唯一一个来自疣微菌门的细菌。阿克曼菌[26] 是一种以肠黏膜层中的黏蛋白为食，降解黏蛋白和黏液层。当艾克曼菌异常增加时，会导致肠道屏障的受损，进而诱发肠道炎症和LPS大量进入血液影响其他脏器。有相关文献报道[27] ，在中风患者的肠道艾克曼菌中异常增长。同时，丹毒荚膜菌[28]的丰度也随着帕金森患者胃肠功能障碍增加而增加，这与我们的实验结果相符。嗜木聚糖真杆菌和异杆菌[29-30] 属于短链脂肪酸产生菌，短链脂肪酸[31-32] 可以降低肠道的通透性以及加强肠道屏障的防御力，调节免疫细胞趋化性、活性氧（ROS）释放以及细胞因子释放而具有抗炎功能，短链脂肪酸也可以促进脑内海马神经的发生和延长。虎杖清脉饮减少阿克曼菌属的相对丰度；增加嗜木聚糖真杆菌属和异杆菌属的相对丰度，进而维持肠道屏障功能的完整性，降低机体内的炎症反应，保护血脑屏障[5]。综上所述，虎杖清脉饮对慢性脑缺血小鼠的治疗作用与其对慢性脑缺血小鼠肠道菌群失调的改善作用具有相关性。
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表 1 FDA近年批准上市在售的皮肤外用类喷雾剂列表
分类 商品名 有效成分 首次批准日期 适应证 皮质类固醇药物 Triamcinolone Acetonide 曲安奈德 2015/04/13 局限性瘙痒症、神经性皮炎、接触性皮炎、
脂溢性皮炎以及慢性湿疹等Clobetasol Propionate 丙酸氯倍他索 2019/10/02 Desoximetasone 去羟米松 2018/03/16 Sernivo 丙酸倍他米松 2016/02/05 抗真菌类药物 Lamisil At 盐酸特比萘芬 2000/03/17 皮肤科真菌感染治疗 性激素药物 Evamist 雌二醇 2007/07/27 治疗因绝经期雌二醇下降引起的血管舒缩性症状 
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表 2 单次触发喷雾不同阶段液滴粒径特点
时期分段 特点 形成期 液体自喷雾泵口流过，压力较低，流速较低，液滴粒径较大 稳定期 压力和流速逐渐增加，进入平台期，液滴粒径较小且稳定 消退期 压力和流速降低，雾化不稳定，液滴粒径大小不一，可出现大粒径液滴
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[1] SHRESTHA K, VAN STRIEN J, SINGH N, et al. Primary break-up and atomization characteristics of a nasal spray[J]. PLoS One, 2020, 15(8):e0236063. doi: 10.1371/journal.pone.0236063 [2] CHENG Y S. Mechanisms of pharmaceutical aerosol deposi-tion in the respiratory tract[J]. AAPS PharmSciTech, 2014, 15(3):630-640. doi: 10.1208/s12249-014-0092-0 [3] SOUDRY E, WANG J, VAEZEAFSHAR R, et al. Safety analysis of long-term budesonide nasal irrigations in patients with chronic rhinosinusitis post endoscopic sinus surgery[J]. Int Forum Allergy Rhinol, 2016, 6(6):568-572. doi: 10.1002/alr.21724 [4] 王凯, 孔慧霞, 刘静炎, 等. 重组人干扰素α-2b喷雾剂联合热毒宁治疗小儿手足口病的疗效分析[J]. 中华全科医学, 2020, 18(4):561-563,567. [5] 陈建军, 殷善开, 刘世喜, 等. 冰连清咽喷雾剂治疗急性咽炎及慢性咽炎急性发作多中心随机对照研究[J]. 临床耳鼻咽喉头颈外科杂志, 2018, 32(1):1-6. [6] 李红, 鄢素琪, 邓玉萍, 等. 喜炎平注射液联合开喉剑喷雾剂治疗小儿疱疹性咽峡炎疗效观察[J]. 中国医院药学杂志, 2014, 34(11):923-926. [7] 万妮, 陈斌, 李合, 等. 肺部吸入给药系统的研究进展[J]. 中国新药杂志, 2021, 30(15):1386-1395. [8] LEYVA-GRADO V H, TAN G S, LEON P E, et al. 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