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氟马西尼（flumazenil）是苯二氮䓬类受体拮抗剂，临床上常用来逆转由苯二氮䓬类药物麻醉或过量使用后所致的中枢镇静作用[1-4]，在军事应用方面，可用来拮抗镇静药物带来的“宿醉”等副作用，提高作业效能。目前，氟马西尼市售剂型为注射剂，为解决注射给药不便、疼痛不适的问题，提高使用者顺应性，开发一种便捷安全的制剂显得尤为重要。回顾既往研究，氟马西尼已被证明经鼻腔[5, 6]、舌下[7, 8]、口服[9]及直肠[10]等给药途径均有治疗效果。本研究开发氟马西尼舌下片，实现军事条件下作业人员高效、安全促醒。
氟马西尼因难溶于水，直接制备成舌下片会影响其被舌下黏膜吸收及药效发挥。本研究以羟丙基-β-环糊精为包合材料，将氟马西尼制备成包合物后再制备舌下片，以此改善氟马西尼的溶解度及溶出度。此外，还研究了氟马西尼舌下片在比格犬体内的药动学过程，并进行生物利用度评价，以期为进一步临床研发及应用提供依据。
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药物透皮扩散试验仪（TPY-2，上海黄海药检仪器有限公司）；质谱仪（QTRAP® 5500，日本岛津公司）；TDP 单冲压片机（ZPS016，上海天祥·健台制药机械有限公司）；双向磁力搅拌器（上海司乐仪器有限公司）；旋转蒸发仪（R206D，上海申生科技有限公司）；真空干燥箱（VD53，德国Binder公司）；高效液相色谱仪（UltiMate 3000，美国Thermo公司）；色谱柱（SB-C18，美国Agilent公司）；色谱柱（XSelect®HSS T3，美国Waters公司）。
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氟马西尼注射液（5 ml:0.5 mg，宜昌人福药业）；氟马西尼原料药（99%，江苏恩华药业股份有限公司）；内标物甲苯磺丁脲（纯度99%，美国Sigma公司）；羟丙基-β-环糊精（法国Roquette公司）；PVP K30（重庆斯泰克瑞登梅尔公司）；乳糖（荷兰DFE公司）；甘露醇（法国Roquette公司）；硬脂富马酸钠（德国JRS公司）；乙腈、乙酸铵均为质谱纯；实验用水为去离子水。
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比格犬12只，雄性，体重7~9 kg，由北京玛斯生物技术有限公司提供，动物许可证号：SCXK（京）2016-0001。
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以摩尔比2∶1称取适量羟丙基-β-环糊精与氟马西尼，加入90%乙醇溶液，超声使其溶解。将混合溶液置于45 ℃连续搅拌2 h。取混合溶液进行旋蒸，在40 ℃进行干燥，得到白色固体状包合物。
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（1）色谱条件。色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相：水（用磷酸调节pH值至2.0）-甲醇-四氢呋喃（80∶13∶7）；流速：1.0 ml/min；柱温：40 ℃；检测波长:230 nm；进样量：20 μl。
（2）溶液配制。空白溶液：精密称取羟丙基-β-环糊精适量于容量瓶中，加入适量流动相，振摇使其溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得空白溶液。
对照品溶液：精密称取氟马西尼10 mg，置于100 ml容量瓶中，加入适量甲醇超声溶解后定容，制得质量浓度为0.1 mg/ml的氟马西尼溶液。
供试品溶液：精密称取F-羟丙基-β-环糊精适量于容量瓶中，加入适量流动相，振摇使其溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。
（3）专属性。分别取制备的空白溶液、对照品溶液、供试品溶液各20 μl，参照“色谱条件”项下进样，进行样品专属性考察（图1）。A为羟丙基-β-环糊精的HPLC图谱，无特征吸收峰；B为氟马西尼的HPLC图谱，有吸收峰，出峰时间为8.240 min，C为F-羟丙基-β-环糊精的HPLC图谱，有吸收峰，出峰时间为8.247 min。表明该方法测定F-羟丙基-β-环糊精的专属性良好。
图 1 氟马西尼HPLC分析的专属性图谱
（4）线性。分别精密吸取“溶液配制”项下对照品溶液适量，放置于容量瓶中，加流动相稀释定容，配制6.25、12.5、25、50、75、100 μg/ml的氟马西尼系列标准品溶液，进样分析。以峰面积（A）为纵坐标，氟马西尼浓度（C/μg·ml−1）为横坐标，进行线性回归，得回归方程为A=0.738 0C−0.171 9，r=0.999 9。结果表明，氟马西尼浓度在 6.25～100 µg/ml浓度范围内与峰面积线性关系良好，定量下限为6.25 µg/ml。
（5）精密度及准确度考察。分别取“线性”项下低（6.25 μg/ml）、中（25 μg/ml）、高（100 μg/ml）3个浓度的氟马西尼溶液各6份，进样分析，连续测定3 d，考察日内、日间精密度（以RSD表示）。根据随行回归方程计算各样品中氟马西尼的实测质量浓度，以实测质量浓度与理论质量浓度相比较，考察准确度（表1）。结果表明，该方法精密度、准确度良好，符合生物样本分析要求。
表 1 氟马西尼日内、日间精密度与准确度（
$ \bar{x} $ ±s,n=6）样品浓度 （ρB/µg·ml−1） 日内 日间 实测浓度 （ρB/µg·ml−1） 准确度（%） 精密度RSD（%） 实测浓度 （ρB/µg·ml−1） 准确度（%） 精密度RSD（%） 6.25 6.27±0.12 100.32 1.91 6.32±0.05 101.12 0.84 25 25.19±0.46 100.76 1.85 25.26±0.34 101.04 1.36 100 99.85±0.39 99.85 0.39 99.74±1.28 99.74 1.28 -
取氟马西尼和F-HP-β-CD（相当于氟马西尼10 mg），按照溶出度测定法（2020年版《中国药典》四部通则0931溶出度测定法第二法浆法），选用100 ml去离子水为溶出介质，温度设定为（37±0.5）℃，转速为100 r/min，于1、2、5、10、15、30 min时取样过滤，并补充相同体积、相同温度的空白溶出介质。取续滤液稀释后， 参照“ 色谱条件”项下，利用HPLC法进行浓度测定，计算各时间点溶出度，并与原料药进行比较。
如图2所示，5 min时 F-羟丙基-β-环糊精的溶出度大于95%，而氟马西尼30 min溶出度约30%。表明氟马西尼与羟丙基-β-环糊精包合能提高药物的溶出度，进而提高生物利用率，为后续氟马西尼舌下片制备提供了基础。
图 2 氟马西尼及包合物体外溶出曲线
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称取处方量F-HP-β-CD、乳糖、甘露醇、硬脂富马酸钠，过100目筛备用。将辅料（除硬脂富马酸钠外）与F-HP-β-CD等量递增混匀。加入适量10% PVP K30 的 90% 乙醇溶液制成软材，过16目筛制粒，40℃烘干2 h。加硬脂富马酸钠，混匀，单冲压片机制成片剂。每片含氟马西尼0.2 mg。
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取氟马西尼舌下片3批次（批号：20220615-1、20220615-2、20220615-3），按照溶出度测定法，选用50 ml去离子水为溶出介质，温度设定在（37±0.5） ℃，转速为100 r/min，于5、15、30、60 min取样过滤。其余同“2.1.3” 项操作。如表2所示，氟马西尼舌下片15 min内可完全溶出。
表 2 氟马西尼舌下片的溶出度检查结果（
$ \bar{x} $ ±s,n=6）批号 溶出度（%） 5 min 15 min 30 min 60 min 20220615-1 60.14±0.98 95.89±0.62 98.29±1.36 98.86±0.43 20220615-2 63.23±1.91 96.18±2.50 98.76±1.32 98.31±1.52 20220615-3 66.74±1.92 97.56±1.07 97.45±1.26 97.89±1.39 -
（1）色谱柱。XSelect HS T3（2.1 mm×50 mm，2.5 μm）；柱温：15 ℃；流动相： A相为水（含1 mmol/L乙酸铵），B 相为乙腈；梯度洗脱：0.01～1.30 min, 30%B；1.30～1.80 min, 30%~95%B；1.80～1.81 min，95%B；1.81～2.20 min，30%B；流速：0.6 ml/min；进样量：8 μl。
（2）质谱条件。正离子电喷雾离子化（ESI）方式，多反应监测（MRM）；喷雾电压：5.5 kV；源温度：500℃；雾化气为60 psi；辅助加热气为60 psi；气帘气为40 psi；离子对、去簇电压、碰撞室出口电压及碰撞能量等参数见表3。
表 3 质谱条件
检测物 母离子 子离子 去簇电压
（U/V）碰撞室出口
电压（U/V）碰撞能量
（U/V）氟马西尼 304.2 257.9 140 15 25 甲苯磺丁脲 271.0 74.2 70 15 22 -
取100 μl血浆样品到EP管中，加入600 μl内标液（200 ng/ml甲苯磺丁脲的乙腈溶液）。涡旋混匀1 min，13 000 r/min、4 ℃条件下离心10 min。取上清液适当稀释后放置于进样瓶中， 8 μl进样检测。
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在上述提取条件及色谱、质谱条件下，测定空白血浆、含内标溶液的血浆样品、含氟马西尼的血浆样品以及给药后比格犬血浆样品，记录色谱图见图3。结果表明，氟马西尼和内标甲苯磺丁脲保留时间分别为1.63 min和1.94 min，血浆中的内源性物质不干扰测定。
图 3 氟马西尼及内标物甲苯磺丁脲专属性图谱
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比格犬空白血浆中精密加入不同浓度的氟马西尼对照品溶液5 μl，配制浓度分别为0.2、0.5、1、2、10、50、100、200 ng/ml的系列对照品血浆样品，按照“ 2.2.2” 项下方法操作，记录峰面积。以氟马西尼浓度C为横坐标，氟马西尼与内标物的峰面积比值（AF/ATOL）为纵坐标进行线性回归，得回归方程为AF/ATOL=0.008 3C+0.000 9，r=0.998 1。氟马西尼在 0.2～200 ng/ml浓度范围线性关系良好。本法测定血浆中氟马西尼的最低定量限为0.2 ng/ml。
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用空白比格犬血浆配制低（0.6 ng/ml）、中（6 ng/ml）、高（160 ng/ml）3个浓度的对照品血浆样品各6份，按照“2.2.2”项下方法操作，连续测定3 d，随行标曲计算其浓度，算得血浆样品测定方法的精密度和准确度，结果如表4所示。数据表明该方法精密度、准确度良好，符合生物样本分析要求。
表 4 氟马西尼日内、日间精密度与准确度（
$ \bar{x} $ ±s,n=6）样品浓度
（ρB/ng·ml−1）日内 日间 实测浓度
（ρB/ng·ml−1）准确度
（%）精密度
RSD(%)实测浓度
（ρB/ng·ml−1）准确度
（%）精密度
RSD(%)0.6 0.60±0.02 95.35 3.09 0.59±0.03 96.70 9.99 6 6.10±0.23 101.72 3.85 6.25±0.28 104.20 4.42 160 167.76±4.31 104.85 2.57 167.76±5.66 104.85 3.38 -
取空白血浆平行配制氟马西尼、内标物甲苯磺丁脲低（0.6 ng/ml）、中（6 ng/ml）、高（160 ng/ml）浓度样品各6份，按照“ 2.2.2”项下方法预处理并进样分析，记录峰面积A1；取空白血浆按“2.2.2”项下方法预处理后，加入低、中、高浓度氟马西尼及内标物甲苯磺丁脲后进样分析，记录峰面积A2；用甲醇配制含氟马西尼及内标物甲苯磺丁脲低、中、高浓度溶液，进样分析，记录峰面积A3。A1与A2比值为提取回收率； A2与A3比值为基质效应（表5）。实验结果表明，低、中、高浓度氟马西尼提取回收率为86.12 %~87.43 %，基质效应为105.87 %～106.28 %。提取回收率和基质效应均在80 %～120 %，RSD均<15%，符合生物样本分析要求。
表 5 提取回收率及基质效应（
$ \bar{x} $ ±s,n=6）氟马西尼样品浓度
（ρB/ng·ml−1）提取回收率
（%）RSD
（%）基质效应
（%）RSD
（%）0.6 87.43±2.49 2.55 105.87±5.61 5.30 6 86.35±2.67 2.77 105.99±6.61 6.03 160 86.12±3.70 3.85 106.28±3.97 3.73 -
取空白血浆加入氟马西尼标准品溶液，配制成低（0.6 ng/ml）、中（6 ng/ml）、高（160 ng/ml）浓度的血浆样品，每个浓度平行6份，按“2.2.2”项下操作，分别考察其室温放置4 h、反复冻融3次以及−20 ℃放置30 d的稳定性，结果见表6。表明在上述条件下样品均稳定。
表 6 氟马西尼室温放置4 h、冻融及长期冻存稳定性（
$ \bar{x} $ ±s,n=6）放置条件 样品浓度（ρB/ng·ml−1） 回收率（%） RSD（%） 室温4 h 0.6 98.33±1.02 3.51 6 99.67±1.63 3.71 160 106.25±5.26 3.09 反复冻融3次 0.6 95.52±1.03 1.08 6 99.36±2.25 3.52 160 102.71±3.82 2.32 −20 ℃放置30 d 0.6 97.72±1.32 2.73 6 101.37±1.25 3.44 160 105.48±3.69 3.87 -
采用双周期双交叉实验设计方案。将12只比格犬随机分为2组，分别给予氟马西尼舌下片（0.2 mg）和注射剂（0.1 mg），清洗期为1周。给药前禁食12 h，自由饮水。于给药后10 min、20 min、30 min、45 min、1.0 h、1.25 h、1.5 h、1.75 h、2.0 h 、2.5 h、3.0 h、4.0 h、6.0 h、8.0 h由腿静脉取血2 ml，置于肝素钠采血管中，12 000 r/min离心10 min ，取上层血浆按“2.2.2”项下方法处理后测定。
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比格犬给予氟马西尼舌下片与氟马西尼注射液后，血药浓度-时间曲线如图4。用WinNonlin 7.0药动学软件对所测数据进行非房室模型分析，得到主要药动学参数见表7。
图 4 氟马西尼舌下和静注给药的血药浓度-时间曲线图（
$ \bar{x} $ ±s,n=12）表 7 氟马西尼舌下和静注给药的药动学参数（
$ \bar{x} $ ±s，n=12）观测参数 氟马西尼舌下片
（0.2 mg）氟马西尼注射剂
（0.1 mg）t1/2（t/h） 0.78±0.25 0.58±0.08 tmax （t/h） 0.58±0.24 0.18±0.05 Cmax ρB/（ng·ml−1） 6.36±2.14 10.96±2.62 AUClast （h·ng·ml−1） 8.86±2.83 8.41±2.15 MRTlast （t/h） 1.23±0.25 0.66±0.08 Vz （L/kg） 3.21±1.68 0.89±0.21 CL [L/（h·kg）] 2.83±1.02 1.09±0.25 F（%） 52.68 − 舌下片和注射剂的峰浓度分别为（10.96±2.62）和（6.36±2.14） ng/ml，两者达峰时间分别为（0.18±0.05）和（0.58±0.24） h ，AUClast分别为（8.41±2.15）和（8.86±2.83） h·ng·ml−1；根据数据拟合计算得到主要药动学参数，并计算出氟马西尼舌下片的绝对生物利用度，结果如表7。计算得出氟马西尼舌下片绝对生物利用度约为52.68 %。
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本课题首先制备了氟马西尼-羟丙基-β-环糊精包合物，实验表明，包合物能显著改善氟马西尼的溶解性能和溶出度，促进药物透膜吸收，在此基础上将包合物进一步制成氟马西尼舌下片。溶出度测定结果表明，舌下片在5 min时的累积溶出度已超过60%，15 min内可完全溶出。
实验建立了LC-MS法测定比格犬血浆中氟马西尼浓度，经过方法学验证，该方法适用于氟马西尼在比格犬体内的药动学研究。药动学实验结果表明，氟马西尼舌下片在比格犬体内的舌下黏膜吸收迅速， 30 min左右达峰值（Cmax=6.36 ng/ml）。氟马西尼舌下片绝对生物利用度为52.68 %，而根据既往研究报道，氟马西尼口服给药生物利用度仅为16%[11]，说明将氟马西尼与HP-β-CD包合后制备成舌下片给药能够显著提高其透舌下黏膜吸收以及生物利用度。另据文献报道[12]，静脉注射0.1～0.2 mg氟马西尼注射液可有效拮抗苯二氮䓬类药物镇静催眠作用，比较氟马西尼注射剂（0.1 mg）及氟马西尼舌下片（0.2 mg）药动学参数，二者AUClast值无显著性差异，且舌下片在达峰后血药浓度始终高于注射剂，表明氟马西尼舌下片可持续有效拮抗镇静催眠药物。
Preparation and pharmacokinetics of flumazenil sublingual tablet
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摘要:
目的 制备氟马西尼舌下片，对其在比格犬体内的药动学进行研究，评价其生物利用度。 方法 以羟丙基-β-环糊精为包合材料制备氟马西尼包合物，后压片制备氟马西尼舌下片。采用双周期交叉实验设计，将12只比格犬随机分成2组，分别给予氟马西尼舌下片和注射剂。建立LC-MS法测定血浆中氟马西尼含量，并进行方法学验证。利用WinNonlin 药动学软件计算药动学参数及生物利用度。 结果 采用羟丙基-β-环糊精包合后能有效提高氟马西尼溶出度，促进其舌下黏膜吸收。氟马西尼舌下片15 min内可完全溶出。药动学研究中，氟马西尼注射剂和舌下片AUClast分别为（8.41±2.15）和（8.86±2.83） h·ng·ml−1；Cmax分别为（10.96±2.62）和（6.36±2.14） ng/ml；tmax分别为（0.18±0.05）和（0.58±0.24） h。氟马西尼舌下片生物利用度为52.68 %。 结论 该研究利用包合物制备氟马西尼舌下片，达到安全、高效递送的目的。建立LC-MS法测定氟马西尼血药浓度，其优点在于操作简单、准确灵敏。 Abstract:Objective To prepare flumazenil sublingual tablets and study its bioavailability. Methods Flumazenil sublingual tablets were prepared by compressing flumazenil inclusion compound with hydroxypropyl-β-cyclodextrin as the inclusion material. In a double-cycle crossover trial, twelve beagle dogs were randomly divided into two groups, one group receiving flumazenil sublingual tablets and the other receiving flumazenil injections. LC-MS method was developed and validated to determine flumazenil plasma concentration. The pharmacokinetic parameters and bioavailability were calculated using WinNonlin pharmacokinetic software. Results In the pharmacokinetic study, AUClast of flumazenil injection and sublingual tablet was （8.41±2.15） and （8.86±2.83） h·ng·ml−1, respectively; Cmax was （10.96±2.62） and （6.36±2.14） ng/ml, respectively; tmax was （0.18±0.05） and （0.58±0.24） h, respectively. The bioavailability of flumazenil sublingual tablet was 52.68%. Conclusion Clathrates were used to prepare flumazenil sublingual tablets to achieve safe and efficient delivery. LC-MS method was established for the determination of flumazenil plasma concentration, and the advantages were simple, accurate and sensitive. -
Key words:
- flumazenil /
- sublingual tablet /
- beagles /
- pharmacokinetics
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高脂血症是指血液中脂质水平异常，通常表现为总胆固醇(TC)和/或甘油三酯(TG)升高，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)降低[1]。高脂血症是心脑血管疾病的重要危险因素，可诱发动脉粥样硬化，导致冠心病、脑卒中、心肌梗死，增加心脑血管疾病的发病率和病死率。因此，预防和控制高脂血症具有重要意义[2]。国内外研究和临床实践证明，血脂异常是可以预防和控制的。胆固醇水平降低可显著减少心肌梗死、缺血性卒中事件、心血管死亡，提高心血管病患者的生活质量，有效减轻疾病带来的负担[3]。据统计全球每年约有3000万人死于高脂血症等脂代谢紊乱疾病，且呈逐年增长趋势[4]。
姜黄素是从姜科植物姜黄的干燥根茎中提取的一种多酚类物质[5]。它被认为是姜黄中最重要一类活性成分，具有一系列药理活性，如抗氧化、抗癌、抗炎、细胞保护和降低血脂等[6]。有研究表明，姜黄素对氧化应激、抑制癌症和炎症的进展有显著疗效[7]。此外，姜黄素的降脂作用也被广泛研究。综上所述，姜黄素可作为一种潜在的候选药物用于控制高脂血症所诱导的疾病，如动脉粥样硬化。众所周知，他汀类药物是一种临床常用的治疗高胆固醇血症和相关动脉粥样硬化疾病的处方药，而目前姜黄素已被证明在降低血浆总胆固醇和甘油三酯方面与他汀类药物疗效相当。然而姜黄素存在溶解度低和渗透差的问题，从而导致其口服给药时药物生物利用度低，对于高脂血、动脉粥样硬化等需要达到一定血药浓度为疗效前提的病症来说，姜黄素的传统剂型与市售剂型均无法达到理想的治疗效果。
本研究前期成功构建了姜黄素纳米乳口服给药系统，改善了姜黄素水溶性差的特性。基于此，本文继续探究了姜黄素纳米乳在大鼠体内的药动学特性，观察其对高脂血症模型大鼠的治疗作用，为姜黄素的临床应用提供更多的理论依据。
1. 仪器与试药
1.1 仪器
101A-2型干燥箱（上海实验仪器总厂）；AG285十万分之一电子分析天平（瑞士MettlerToledo公司）；SB100D超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；Agilent 1100高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；EPPENDORF5804R 高速冷冻离心机（德国Eppendorf有限公司）；DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市英峪予华仪器厂）；Agilent 6410 Triple Quad LC/MS（美国Agilent科技有限公司）；全自动生化分析仪Chemray 240 （深圳雷杜生命科技有限公司）；微型旋涡混合器（上海沪西分析仪器厂有限公司）。
1.2 药品与试剂
姜黄素原料药（批号XC20190521，西安小草植物科技有限公司）；姜黄素对照品（批号1108135-201412，纯度>99.8 %，中国食品药品检定研究院）；1,2-丙二醇（批号20190418，上海凌峰化学试剂有限公司）；Tween-80（批号2018161，上海凌峰化学试剂有限公司）；丙二醇单辛酸酯（Capryol 90，批号18139，上海嘉法狮贸易有限公司）；高脂饲料（批号20036219，常州鼠一鼠二生物科技有限公司）；姜黄素片（批号20190925，美国自然之宝®股份有限公司）；辛伐他汀片（SV，批号J20190011，舒降之®杭州默沙东制药公司）；TG试剂盒（批号2020012）、TC试剂盒（批号2020006）、HDL-c试剂盒（批号2020003）、LDL-c试剂盒（批号2020010，长春汇力生物技术有限公司）；SOD试剂盒（批号20200617）；MDA试剂盒（批号20200720）；肝脏匀浆TG试剂盒（批号20200810）；肝脏匀浆TC试剂盒（批号20200411，南京建成有限公司）；乌来糖（国药集团化学试剂有限公司）；甲醇、乙腈（色谱纯，美国 TEDIA 有限公司）；水为重蒸水。
1.3 实验动物
雄性SD大鼠，SPF级，体重（180±20）g，海军军医大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（沪）2019-0004。温度：20~25 ℃；相对湿度：40 %~70 %；饮用水：高压灭菌，符合SPF级动物饮用水标准；光照条件：人工光线，12 h照射，12 h黑暗。
2. 方法与结果
2.1 姜黄素纳米乳的制备
姜黄素纳米乳的处方如下：油相Capryol 90在体系中占比为33.10 %，表面活性剂Tween-80为 34.16 %，助表面活性剂1,2-丙二醇为17.21 %，水相占比为15.52 %。制备方法为：精密称取处方量油相Capryol 90、表面活性剂Tween-80和助表面活性剂1,2-丙二醇，混合置于锥形瓶中，于45 ℃ 恒温搅拌至全溶，称取适量姜黄素原料药，搅拌至原料药完全溶解于上述体系中，冷却至室温后向体系中缓慢滴加蒸馏水至体系变为透明均匀的液体，即得姜黄素纳米乳，测得载药量为0.919 mg/g。对姜黄素纳米乳进行特性表征，结果表明所制备的纳米乳粒径分布范围窄且呈正态分布，平均粒径为（123.5±1.2）nm，PDI为(0.204±0.07)，表明该制剂的粒径分布及均匀性均符合纳米乳制剂要求。最优处方制备的纳米乳的透射电镜如图1所示。结果表明，纳米乳呈圆整均一的球体或类球体，具明显层状结构，粒径大小约为123.5 nm。
2.2 血浆中姜黄素的LC/MS含量测定方法的建立
2.2.1 色谱质谱条件[8]
色谱条件：色谱柱：Dikma Inspire C18柱（2.1 mm×100 mm，3 μm）；流动相：乙腈-0.1 %（V/V）甲酸水溶液（70∶30）；流速：0.3 ml/min；进样量：5 μl；柱温：35 ℃。
质谱条件：ESI离子源，正离子化模式，扫描方式为多反应监测（MRM模式），干燥气温度：350 ℃，干燥气流速：10 L/min，雾化压力：35 psi，裂解电压145eV，碰撞能量30 eV，定量离子对为m/z=369.3→286.4和m/z=369.3→177.0。
2.2.2 方法学考察
取7份大鼠空白血浆，每份600 μl，分别加入各浓度姜黄素标准品溶液 600 μl，涡旋震荡2 min，再加入1 000 μl甲醇及2 000 μl乙腈沉淀蛋白，涡旋震荡5 min，于4 ℃ 12 000 r/min离心15 min。上清液用氮气吹干，1 000 μl甲醇复溶，过0.22 μm针式微孔滤膜，所得滤液即加药血浆样品。同法处理空白血浆。按2.2.1项下条件进样测定，记录色谱图及峰面积。方法学考察表明，血浆中姜黄素在2.00~500.00 ng/ml浓度范围内线性关系良好，回归方程为：Y = 411.32 X+2071.88（r= 0.999 9）。专属性考察结果表明，血浆内源物质对姜黄素的含量测定没有干扰，方法专属性良好（结果如图2）。低、中、高3个浓度的姜黄素-血浆溶液的日内精密度分别为0.54 %、1.21 %、0.93 %，日间精密度分别为0.91 %、0.76 %、0.42 %。3个浓度血浆中的姜黄素提取回收率分别为72.9.2%、78.3%、80.2%，表明该方法可用于血浆中姜黄素的含量测定。
2.3 姜黄素纳米乳的药动学研究
2.3.1 给药方案
18只大鼠随机分为3组（姜黄素原料药组、姜黄素片剂组、姜黄素纳米乳组），每组6只，适应性饲养3 d后，禁食不禁水12 h。3组大鼠分别给予姜黄素原料药混悬液（62.8 mg/kg，以姜黄素含量计算）、姜黄素片剂粉末混悬液（62.8 mg/kg，以姜黄素含量计算）各1 ml，姜黄素纳米乳（31.4 mg/kg，以姜黄素含量计算）2 ml。于灌胃给药后的0、1、2、4、8、12、16、24、30、36 h时眼球后静脉丛取血1 ml，置预肝素化离心管中，上下颠倒混匀后3 000 r/min离心15 min，上清液即为含药血浆样品。吸取含药血浆样品600 μl，照“2.2.2”项下方法处理，上清液照“2.2.1”项下色谱条件进样测定。
2.3.2 药动学参数计算
药动学参数计算通过软件Kinetica 5.0对数据进行分析处理得到，计算结果如图3及表1所示。结果表明，与原料药相比，片剂的相对生物利用度为112.10 %，纳米乳的相对生物利用度为313.47 %。与纳米乳组相比，原料药组的cmax为201.48 %，片剂组的cmax为193.02 %，且平均滞留时间（MRT）比原料药组及片剂组更高（为原料药组的183.52 %，是片剂组的154.21 %），表明纳米乳组具有延缓药物吸收的效果，从而在更大程度上发挥稳定血药浓度，提高药物生物利用度的作用。
表 1 各给药组姜黄素的药动学参数($\bar x $ ±s，n=6)原料药组 片剂组 纳米乳组 cmax (ng/ml) 116.18±11.33 121.27±12.12 234.08±17.55 Tmax (t/h) 2.00±0.00 2.00±0.00 4.00±0.00 AUC0→36(ng·h/ml) 1151.12±125.77 1341.34±103.59 2914.42±323.15 AUC0→∞(ng·h/ml) 1202.71±115.28 1348.77±131.39 3770.15±333.28 t1/2 (t/h) 6.66±0.33 7.52±0.51 12.17±0.35 MRT(t/h) 9.89±0.59 11.77±0.31 18.15±0.38 2.4 药效学研究
2.4.1 动物分组、造模及给药
取SD大鼠56只，进行为期一周的适应性饲养后随机分为空白对照组（n=8）和模型组（n=48），空白组饲喂正常饲料，模型组饲喂定制高脂饲料（饲料含2-硫氧嘧啶0.2 %，可可脂17.18 %，胆固醇1.25%，蔗糖12.5 %，胆盐0.22 %）。整个造模周期为16 d，造模期间每日观察各组大鼠的精神、活动、食量、排便量变化等。结束造模后，所有大鼠禁食不禁水12 h，于眼球后静脉丛取血1 ml，室温静置30 min，3 000 r/min离心20 min，取上层血清检测各项生化指标（TC、TG、HDL-c、LDL-c）[9,10]。
造模成功后将上述模型组大鼠再随机分为模型组、姜黄素片剂组、阳性药（SV）组和姜黄素纳米乳低、中、高剂量组，每组8只。空白组（A组）及模型组（B组）给予生理盐水5 ml/ (kg·d)；阳性药组（C组）给与辛伐他汀20 mg/ (kg·d)（以辛伐他汀含量计）；姜黄素片剂组（D组）给与姜黄素片 62.8 mg/ (kg·d)（以姜黄素的含量计）；姜黄素纳米乳低（E组）、中（F组）、高（G组）3组给药剂量分别为15、30、60 mg/ (kg·d)（以姜黄素的含量计），连续21天灌胃给药。第21天给药结束后，各组大鼠禁食不禁水12 h，于第22天眼球后静脉丛取血1 ml离心取血清待测。
2.4.2 统计学处理
实验所得数据采用SPSS Statistics 22.0统计软件进行处理，方差齐性检验后，采用单因素方差分析，其中组间比较采用LSD法，两两比较采用独立样本t检验；若方差不齐，采用非参数检验。实验结果均以（
$\bar x $ ±s）表示，P<0.01表示具极显著性差异，P<0.05表示具显著性差异。采用 GraphPad Prism 6 绘制图表。2.4.3 肝脏指数
大鼠颈椎脱臼处死，称定体重后解剖取肝脏，冰PBS洗净血迹，称定肝脏湿重并记录，计算肝脏指数；肝脏指数=肝脏湿重/体重×100 %。
图4为给药前后各组大鼠的体重变化。结果表明，给药3周后，与空白组相比，各组均存在极显著性差异（P<0.001）。给药的前2周纳米乳组的体重均表现出正向增长趋势，而模型组、阳性药组以及姜黄素片剂组体重则呈现负增长情况；给药第3周时，仅姜黄素纳米乳高剂量组的体重出现正向增长，阳性药组以及姜黄素纳米乳低、中剂量组大鼠体重降低幅度略有缩小但仍呈下降趋势。
实验结束后剖取大鼠肝脏，肉眼观察到空白组大鼠的肝脏呈现出鲜红色且有光泽，边缘清晰锐利，质地软，与周围组织无明显黏连；模型组大鼠的肝脏肥大，色泽偏黄，边缘圆钝，质地稍硬，且表面的白色沉积明显，与周围组织黏连明显。各给药组大鼠的肝脏比空白组略大，颜色呈不同程度的泛黄白带红，其中以姜黄素纳米乳中剂量组肝脏的颜色与空白组最为接近。
肝脏湿重：如图5所示，除空白组外，各给药组与模型组间均无显著差异，但各给药组肝脏湿重与空白组均具极显著性差异（P<0.001）；
肝脏指数：如图5所示，除姜黄素纳米乳低剂量组外，其他各给药组与模型组之间均存在显著性差异，表明肝脏指数的降低与药物剂量间存在依赖性。阳性药组和片剂组肝脏指数尚未恢复到正常水平，推测原因可能是阳性药和片剂的给药周期还不能完全抵消造模导致的肝脏增重所致。
2.4.4 HE染色、油红O染色及病理切片
取肝脏左、右外叶上端分别于多聚甲醛中固定，脱水，切片，染色后置于光镜下观察。图6为肝脏的HE染色切片。其中A组肝细胞排列整齐，呈索状，内壁边界清晰，无中性粒细胞浸润，仅有零星小泡性脂肪病变；B组视野内可见明显的弥漫性大泡性脂肪病变，肝细胞肿胀，胞浆基质疏松，淡染，存在严重的气球样病变，可见Mallory小体，肝小叶边界不清，汇管区肿大，呈现中性粒细胞浸润，存在重度的肝细胞脂变率；C组和D组以中轻度脂肪病变为主，脂肪细胞占比显著减少；E组汇管区细胞排列比C、D两组更为整齐，肝细胞整体肿胀程度减轻，大泡性脂肪病变仅存在于Ⅲ带，炎性浸润程度减轻，水样病变减轻；F组和G组以小泡性脂变为主，少见大泡性脂变。
图 6 各组大鼠肝脏病理切片H&E染色（200×）A.空白组；B.模型组；C.阳性药组；D.姜黄素片剂组；E.姜黄素纳米乳低剂量组；F.姜黄素纳米乳中剂量组；G.姜黄素纳米乳高剂量组；黑色箭头指大泡样脂肪病变，黄色箭头指小泡样脂肪病变，黄色无柄箭头指气球样病变，黑色无柄箭头指Mallory小体。染色结果：空泡为脂滴，细胞核为蓝紫色，细胞质为紫红色。图7为油红O染色切片。A组大鼠肝细胞结构完整，细胞核颜色明显；B组肝细胞存在大片鲜艳脂滴，细胞核萎缩、色浅，存在重度脂肪病变；C组和D组仍存在大片连续脂滴，但汇管区附近脂滴颜色明显变淡；E组Ⅲ带脂滴色浅且小；F组和G组视野内所见均为浅色小脂滴，细胞核体积趋向空白组细胞核体积。
图 7 各组大鼠肝脏病理切片油红O染色（200×）A.空白组；B.模型组；C.阳性药组；D.姜黄素片剂组；E.姜黄素纳米乳低剂量组；F.姜黄素纳米乳中剂量组；G.姜黄素纳米乳高剂量组；染色结果：脂滴呈橘红色至鲜红色，细胞核呈蓝色。2.4.5 血清中TC、TG、HDL-c、LDL-c的表达水平
第21天给药结束后，所有大鼠禁食不禁水12 h，于第22天眼球后静脉丛取血1ml，室温静置2 h后3 000 r/min离心15 min取血清，按试剂盒操作说明检测血清中TC、TG、HDL-c、LDL-c的表达水平。
给药3周后，大鼠血清中各生化指标变化如表2所示。与模型组相比，姜黄素纳米乳低、中、高3个剂量组对TC降低效果均有统计学意义（P<0.001），其中，以中剂量组为佳，低剂量组对LDL-c的改善效果更为明显。对于血清中TG、TC的改善情况，与阳性药组相比，纳米乳低、中、高3个剂量组之间差异无统计学意义（P<0.05）；中、高剂量组TC与HDL比值的降低具有统计学意义（P<0.05），表明血脂比存在纳米乳剂量依赖性。
表 2 大鼠血清中TG、TC、HDL-c、LDL-c的表达水平及TC/HDL-C的变化趋势($\bar x $ ±s，n=8）组别 TG（mmol/L） TC（mmol/L） HDL-c（mmol/L） LDL-c（mmol/L） TC/HDL 空白组 1.34±0.09 2.90±0.44 0.31±0.10 1.88±0.17 9.35±0.41 模型组 2.88±0.51 12.45±0.13 1.84±0.10 3.56±0.66 6.77±1.14 阳性药组 1.41±0.25## 10.81±0.36## 3.03±0.53# 2.87±0.20## 3.57±0.47 姜黄素片剂组 1.79±0.22## 11.24±1.21 3.42±0.42# 4.08±0.32 3.29±0.89 姜黄素纳米乳低剂量组 1.29±0.20## 8.88±0.73## 2.39±0.62## 2.85±0.33# 3.72±0.57# 姜黄素纳米乳中剂量组 1.44±0.04## 7.68±0.34## 1.94±0.78## 2.57±0.82 3.96±0.36# 姜黄素纳米乳高剂量组 1.38±0.28## 8.89±0.64## 1.83±0.34## 2.85±0.67 4.86±0.49## *P<0.05， **P<0.001，与空白组比较；#P<0.05，##P<0.001，与模型组比较 2.4.6 肝脏中TC、TG、MDA、SOD的表达水平
将肝脏分为4份，一份置于−80 ℃冷冻保存，一份按如下步骤处理后待测：冰PBS冲洗肝组织表面血迹→研磨后制成10 %匀浆→离心→取上清液→测定各生化指标。
给药3周后大鼠肝脏匀浆中各生化指标表达水平如表3所示。结果表明，模型组肝脏匀浆中TG、TC表达水平的增幅与空白组相比具有统计学意义（P<0.001）；给药3周后，阳性药组和纳米乳低、中剂量组的TG、TC表达水平与模型组相比均有统计学差异（P<0.001），姜黄素纳米乳低、中、高3个剂量对大鼠肝脏中TG、TC表达水平的降低均具有统计学意义（P<0.05），其中，低剂量组效果最佳，这也与血清中TC水平变化趋势相一致。
表 3 大鼠肝脏匀浆中TG、TC、SOD以及MDA的变化趋势（$\bar x $ ±s，n=8）组别 TG（mmol/L） TC（mmol/L） SOD（U/mgprot） MDA（nmol/mgprot） 空白组 0.42±0.16 0.11±0.03 956.31±142.64 0.47±0.06 模型组 0.69±0.05** 0.09±0.02** 769.26±141.64**## 1.98±0.26** 阳性药组 0.50±0.11*## 0.7±0.01*## 988.25±168.90## 0.64±0.15*## 姜黄素片剂组 0.66±0.10**# 0.04±0.01*## 933.99±103.39# 0.79±0.11** 姜黄素纳米乳低剂量组 0.64±0.07**## 0.06±0.02*## 972.23±142.10## 0.80±0.03**# 姜黄素纳米乳中剂量组 0.58±0.05**## 0.07±0.02**## 916.55±117.32# 0.59±0.09## 姜黄素纳米乳高剂量组 0.54±0.13## 0.10±0.03** 799.81±121.85** 0.70±0.23*## *P<0.05， **P<0.001，与空白组比较；#P<0.05，##P<0.001，与模型组比较 超氧化物歧化酶（SOD）是机体内重要的抗氧化酶，能催化自由基清除反应，保护细胞免受自由基的攻击，明显改善肝肾等组织的氧化损伤，能直观的反映体内抗氧化酶的活性[11]。MDA是脂质过氧化反应的产物，反映了自由基的活跃程度，可用于评价机体内脂质过氧化的程度[12]。因此，选择SOD和MDA作为评价高脂血症大鼠肝功能损伤程度的指标。
给药3周后，与模型组相比，阳性药组及姜黄素纳米乳低剂量组均能够上调大鼠肝脏中SOD的表达水平（P<0.001），姜黄素纳米乳中剂量组对其表达水平也有正向影响（P<0.05）；此外，实验中发现，与姜黄素纳米乳低、中剂量组相比，高剂量组对体内SOD的表达呈现出抑制，推测此现象与姜黄素的双向调节机制有关；对于MDA的表达水平，与模型组相比，阳性药组和姜黄素纳米乳各剂量组对其表达的抑制作用均具有统计学意义（P<0.001），但效果仍以中剂量组为佳。
3. 讨论
姜黄素是一种被广泛研究的中药多酚类物质，具有抗氧化、抗炎和降血脂的药理活性。已有报道将他汀类与姜黄素对于改善血脂的功效进行了比较。他汀类药物是治疗高胆固醇血症和高脂血症的一线药物。研究表明，姜黄素在降低甘油三酯(TG)方面最有效，而他汀类药物在降低低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)方面最有效。姜黄素影响血浆脂质改变的途径与他汀类药物相似[13]。几乎所有胆固醇运输的途径都会受到药物制剂的影响，包括胃肠道对膳食中胆固醇的吸收、肝细胞对血浆胆固醇的清除、胆固醇逆向运输的介质以及从外周组织中清除胆固醇。此外，姜黄素的活性氧(ROS)清除能力降低了脂质过氧化的风险，而脂质过氧化会引发炎症反应，导致心血管疾病(CVD)和动脉粥样硬化[14]。综上所述，姜黄素或可作为一种安全且耐受性良好的他汀类药物辅助药物，更有效控制高脂血症。
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图 3 氟马西尼及内标物甲苯磺丁脲专属性图谱
A. 比格犬空白血浆色谱图；B. 含内标的比格犬血浆色谱图；C. 含氟马西尼的比格犬血浆色谱图；D. 给药后比格犬血浆样品色谱图；左图: 内标甲苯磺丁脲；右图: 氟马西尼
表 1 氟马西尼日内、日间精密度与准确度（
$ \bar{x} $ ±s,n=6）样品浓度 （ρB/µg·ml−1） 日内 日间 实测浓度 （ρB/µg·ml−1） 准确度（%） 精密度RSD（%） 实测浓度 （ρB/µg·ml−1） 准确度（%） 精密度RSD（%） 6.25 6.27±0.12 100.32 1.91 6.32±0.05 101.12 0.84 25 25.19±0.46 100.76 1.85 25.26±0.34 101.04 1.36 100 99.85±0.39 99.85 0.39 99.74±1.28 99.74 1.28 
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表 2 氟马西尼舌下片的溶出度检查结果（
$ \bar{x} $ ±s,n=6）批号 溶出度（%） 5 min 15 min 30 min 60 min 20220615-1 60.14±0.98 95.89±0.62 98.29±1.36 98.86±0.43 20220615-2 63.23±1.91 96.18±2.50 98.76±1.32 98.31±1.52 20220615-3 66.74±1.92 97.56±1.07 97.45±1.26 97.89±1.39
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表 3 质谱条件
检测物 母离子 子离子 去簇电压
（U/V）碰撞室出口
电压（U/V）碰撞能量
（U/V）氟马西尼 304.2 257.9 140 15 25 甲苯磺丁脲 271.0 74.2 70 15 22
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表 4 氟马西尼日内、日间精密度与准确度（
$ \bar{x} $ ±s,n=6）样品浓度
（ρB/ng·ml−1）日内 日间 实测浓度
（ρB/ng·ml−1）准确度
（%）精密度
RSD(%)实测浓度
（ρB/ng·ml−1）准确度
（%）精密度
RSD(%)0.6 0.60±0.02 95.35 3.09 0.59±0.03 96.70 9.99 6 6.10±0.23 101.72 3.85 6.25±0.28 104.20 4.42 160 167.76±4.31 104.85 2.57 167.76±5.66 104.85 3.38
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表 5 提取回收率及基质效应（
$ \bar{x} $ ±s,n=6）氟马西尼样品浓度
（ρB/ng·ml−1）提取回收率
（%）RSD
（%）基质效应
（%）RSD
（%）0.6 87.43±2.49 2.55 105.87±5.61 5.30 6 86.35±2.67 2.77 105.99±6.61 6.03 160 86.12±3.70 3.85 106.28±3.97 3.73
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表 6 氟马西尼室温放置4 h、冻融及长期冻存稳定性（
$ \bar{x} $ ±s,n=6）放置条件 样品浓度（ρB/ng·ml−1） 回收率（%） RSD（%） 室温4 h 0.6 98.33±1.02 3.51 6 99.67±1.63 3.71 160 106.25±5.26 3.09 反复冻融3次 0.6 95.52±1.03 1.08 6 99.36±2.25 3.52 160 102.71±3.82 2.32 −20 ℃放置30 d 0.6 97.72±1.32 2.73 6 101.37±1.25 3.44 160 105.48±3.69 3.87
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表 7 氟马西尼舌下和静注给药的药动学参数（
$ \bar{x} $ ±s，n=12）观测参数 氟马西尼舌下片
（0.2 mg）氟马西尼注射剂
（0.1 mg）t1/2（t/h） 0.78±0.25 0.58±0.08 tmax （t/h） 0.58±0.24 0.18±0.05 Cmax ρB/（ng·ml−1） 6.36±2.14 10.96±2.62 AUClast （h·ng·ml−1） 8.86±2.83 8.41±2.15 MRTlast （t/h） 1.23±0.25 0.66±0.08 Vz （L/kg） 3.21±1.68 0.89±0.21 CL [L/（h·kg）] 2.83±1.02 1.09±0.25 F（%） 52.68 −
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