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氟马西尼（flumazenil）是苯二氮䓬类受体拮抗剂，临床上常用来逆转由苯二氮䓬类药物麻醉或过量使用后所致的中枢镇静作用[1-4]，在军事应用方面，可用来拮抗镇静药物带来的“宿醉”等副作用，提高作业效能。目前，氟马西尼市售剂型为注射剂，为解决注射给药不便、疼痛不适的问题，提高使用者顺应性，开发一种便捷安全的制剂显得尤为重要。回顾既往研究，氟马西尼已被证明经鼻腔[5, 6]、舌下[7, 8]、口服[9]及直肠[10]等给药途径均有治疗效果。本研究开发氟马西尼舌下片，实现军事条件下作业人员高效、安全促醒。
氟马西尼因难溶于水，直接制备成舌下片会影响其被舌下黏膜吸收及药效发挥。本研究以羟丙基-β-环糊精为包合材料，将氟马西尼制备成包合物后再制备舌下片，以此改善氟马西尼的溶解度及溶出度。此外，还研究了氟马西尼舌下片在比格犬体内的药动学过程，并进行生物利用度评价，以期为进一步临床研发及应用提供依据。
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药物透皮扩散试验仪（TPY-2，上海黄海药检仪器有限公司）；质谱仪（QTRAP® 5500，日本岛津公司）；TDP 单冲压片机（ZPS016，上海天祥·健台制药机械有限公司）；双向磁力搅拌器（上海司乐仪器有限公司）；旋转蒸发仪（R206D，上海申生科技有限公司）；真空干燥箱（VD53，德国Binder公司）；高效液相色谱仪（UltiMate 3000，美国Thermo公司）；色谱柱（SB-C18，美国Agilent公司）；色谱柱（XSelect®HSS T3，美国Waters公司）。
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氟马西尼注射液（5 ml:0.5 mg，宜昌人福药业）；氟马西尼原料药（99%，江苏恩华药业股份有限公司）；内标物甲苯磺丁脲（纯度99%，美国Sigma公司）；羟丙基-β-环糊精（法国Roquette公司）；PVP K30（重庆斯泰克瑞登梅尔公司）；乳糖（荷兰DFE公司）；甘露醇（法国Roquette公司）；硬脂富马酸钠（德国JRS公司）；乙腈、乙酸铵均为质谱纯；实验用水为去离子水。
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比格犬12只，雄性，体重7~9 kg，由北京玛斯生物技术有限公司提供，动物许可证号：SCXK（京）2016-0001。
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以摩尔比2∶1称取适量羟丙基-β-环糊精与氟马西尼，加入90%乙醇溶液，超声使其溶解。将混合溶液置于45 ℃连续搅拌2 h。取混合溶液进行旋蒸，在40 ℃进行干燥，得到白色固体状包合物。
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（1）色谱条件。色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相：水（用磷酸调节pH值至2.0）-甲醇-四氢呋喃（80∶13∶7）；流速：1.0 ml/min；柱温：40 ℃；检测波长:230 nm；进样量：20 μl。
（2）溶液配制。空白溶液：精密称取羟丙基-β-环糊精适量于容量瓶中，加入适量流动相，振摇使其溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得空白溶液。
对照品溶液：精密称取氟马西尼10 mg，置于100 ml容量瓶中，加入适量甲醇超声溶解后定容，制得质量浓度为0.1 mg/ml的氟马西尼溶液。
供试品溶液：精密称取F-羟丙基-β-环糊精适量于容量瓶中，加入适量流动相，振摇使其溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。
（3）专属性。分别取制备的空白溶液、对照品溶液、供试品溶液各20 μl，参照“色谱条件”项下进样，进行样品专属性考察（图1）。A为羟丙基-β-环糊精的HPLC图谱，无特征吸收峰；B为氟马西尼的HPLC图谱，有吸收峰，出峰时间为8.240 min，C为F-羟丙基-β-环糊精的HPLC图谱，有吸收峰，出峰时间为8.247 min。表明该方法测定F-羟丙基-β-环糊精的专属性良好。
图 1 氟马西尼HPLC分析的专属性图谱
（4）线性。分别精密吸取“溶液配制”项下对照品溶液适量，放置于容量瓶中，加流动相稀释定容，配制6.25、12.5、25、50、75、100 μg/ml的氟马西尼系列标准品溶液，进样分析。以峰面积（A）为纵坐标，氟马西尼浓度（C/μg·ml−1）为横坐标，进行线性回归，得回归方程为A=0.738 0C−0.171 9，r=0.999 9。结果表明，氟马西尼浓度在 6.25～100 µg/ml浓度范围内与峰面积线性关系良好，定量下限为6.25 µg/ml。
（5）精密度及准确度考察。分别取“线性”项下低（6.25 μg/ml）、中（25 μg/ml）、高（100 μg/ml）3个浓度的氟马西尼溶液各6份，进样分析，连续测定3 d，考察日内、日间精密度（以RSD表示）。根据随行回归方程计算各样品中氟马西尼的实测质量浓度，以实测质量浓度与理论质量浓度相比较，考察准确度（表1）。结果表明，该方法精密度、准确度良好，符合生物样本分析要求。
表 1 氟马西尼日内、日间精密度与准确度（
$ \bar{x} $ ±s,n=6）样品浓度 （ρB/µg·ml−1） 日内 日间 实测浓度 （ρB/µg·ml−1） 准确度（%） 精密度RSD（%） 实测浓度 （ρB/µg·ml−1） 准确度（%） 精密度RSD（%） 6.25 6.27±0.12 100.32 1.91 6.32±0.05 101.12 0.84 25 25.19±0.46 100.76 1.85 25.26±0.34 101.04 1.36 100 99.85±0.39 99.85 0.39 99.74±1.28 99.74 1.28 -
取氟马西尼和F-HP-β-CD（相当于氟马西尼10 mg），按照溶出度测定法（2020年版《中国药典》四部通则0931溶出度测定法第二法浆法），选用100 ml去离子水为溶出介质，温度设定为（37±0.5）℃，转速为100 r/min，于1、2、5、10、15、30 min时取样过滤，并补充相同体积、相同温度的空白溶出介质。取续滤液稀释后， 参照“ 色谱条件”项下，利用HPLC法进行浓度测定，计算各时间点溶出度，并与原料药进行比较。
如图2所示，5 min时 F-羟丙基-β-环糊精的溶出度大于95%，而氟马西尼30 min溶出度约30%。表明氟马西尼与羟丙基-β-环糊精包合能提高药物的溶出度，进而提高生物利用率，为后续氟马西尼舌下片制备提供了基础。
图 2 氟马西尼及包合物体外溶出曲线
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称取处方量F-HP-β-CD、乳糖、甘露醇、硬脂富马酸钠，过100目筛备用。将辅料（除硬脂富马酸钠外）与F-HP-β-CD等量递增混匀。加入适量10% PVP K30 的 90% 乙醇溶液制成软材，过16目筛制粒，40℃烘干2 h。加硬脂富马酸钠，混匀，单冲压片机制成片剂。每片含氟马西尼0.2 mg。
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取氟马西尼舌下片3批次（批号：20220615-1、20220615-2、20220615-3），按照溶出度测定法，选用50 ml去离子水为溶出介质，温度设定在（37±0.5） ℃，转速为100 r/min，于5、15、30、60 min取样过滤。其余同“2.1.3” 项操作。如表2所示，氟马西尼舌下片15 min内可完全溶出。
表 2 氟马西尼舌下片的溶出度检查结果（
$ \bar{x} $ ±s,n=6）批号 溶出度（%） 5 min 15 min 30 min 60 min 20220615-1 60.14±0.98 95.89±0.62 98.29±1.36 98.86±0.43 20220615-2 63.23±1.91 96.18±2.50 98.76±1.32 98.31±1.52 20220615-3 66.74±1.92 97.56±1.07 97.45±1.26 97.89±1.39 -
（1）色谱柱。XSelect HS T3（2.1 mm×50 mm，2.5 μm）；柱温：15 ℃；流动相： A相为水（含1 mmol/L乙酸铵），B 相为乙腈；梯度洗脱：0.01～1.30 min, 30%B；1.30～1.80 min, 30%~95%B；1.80～1.81 min，95%B；1.81～2.20 min，30%B；流速：0.6 ml/min；进样量：8 μl。
（2）质谱条件。正离子电喷雾离子化（ESI）方式，多反应监测（MRM）；喷雾电压：5.5 kV；源温度：500℃；雾化气为60 psi；辅助加热气为60 psi；气帘气为40 psi；离子对、去簇电压、碰撞室出口电压及碰撞能量等参数见表3。
表 3 质谱条件
检测物 母离子 子离子 去簇电压
（U/V）碰撞室出口
电压（U/V）碰撞能量
（U/V）氟马西尼 304.2 257.9 140 15 25 甲苯磺丁脲 271.0 74.2 70 15 22 -
取100 μl血浆样品到EP管中，加入600 μl内标液（200 ng/ml甲苯磺丁脲的乙腈溶液）。涡旋混匀1 min，13 000 r/min、4 ℃条件下离心10 min。取上清液适当稀释后放置于进样瓶中， 8 μl进样检测。
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在上述提取条件及色谱、质谱条件下，测定空白血浆、含内标溶液的血浆样品、含氟马西尼的血浆样品以及给药后比格犬血浆样品，记录色谱图见图3。结果表明，氟马西尼和内标甲苯磺丁脲保留时间分别为1.63 min和1.94 min，血浆中的内源性物质不干扰测定。
图 3 氟马西尼及内标物甲苯磺丁脲专属性图谱
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比格犬空白血浆中精密加入不同浓度的氟马西尼对照品溶液5 μl，配制浓度分别为0.2、0.5、1、2、10、50、100、200 ng/ml的系列对照品血浆样品，按照“ 2.2.2” 项下方法操作，记录峰面积。以氟马西尼浓度C为横坐标，氟马西尼与内标物的峰面积比值（AF/ATOL）为纵坐标进行线性回归，得回归方程为AF/ATOL=0.008 3C+0.000 9，r=0.998 1。氟马西尼在 0.2～200 ng/ml浓度范围线性关系良好。本法测定血浆中氟马西尼的最低定量限为0.2 ng/ml。
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用空白比格犬血浆配制低（0.6 ng/ml）、中（6 ng/ml）、高（160 ng/ml）3个浓度的对照品血浆样品各6份，按照“2.2.2”项下方法操作，连续测定3 d，随行标曲计算其浓度，算得血浆样品测定方法的精密度和准确度，结果如表4所示。数据表明该方法精密度、准确度良好，符合生物样本分析要求。
表 4 氟马西尼日内、日间精密度与准确度（
$ \bar{x} $ ±s,n=6）样品浓度
（ρB/ng·ml−1）日内 日间 实测浓度
（ρB/ng·ml−1）准确度
（%）精密度
RSD(%)实测浓度
（ρB/ng·ml−1）准确度
（%）精密度
RSD(%)0.6 0.60±0.02 95.35 3.09 0.59±0.03 96.70 9.99 6 6.10±0.23 101.72 3.85 6.25±0.28 104.20 4.42 160 167.76±4.31 104.85 2.57 167.76±5.66 104.85 3.38 -
取空白血浆平行配制氟马西尼、内标物甲苯磺丁脲低（0.6 ng/ml）、中（6 ng/ml）、高（160 ng/ml）浓度样品各6份，按照“ 2.2.2”项下方法预处理并进样分析，记录峰面积A1；取空白血浆按“2.2.2”项下方法预处理后，加入低、中、高浓度氟马西尼及内标物甲苯磺丁脲后进样分析，记录峰面积A2；用甲醇配制含氟马西尼及内标物甲苯磺丁脲低、中、高浓度溶液，进样分析，记录峰面积A3。A1与A2比值为提取回收率； A2与A3比值为基质效应（表5）。实验结果表明，低、中、高浓度氟马西尼提取回收率为86.12 %~87.43 %，基质效应为105.87 %～106.28 %。提取回收率和基质效应均在80 %～120 %，RSD均<15%，符合生物样本分析要求。
表 5 提取回收率及基质效应（
$ \bar{x} $ ±s,n=6）氟马西尼样品浓度
（ρB/ng·ml−1）提取回收率
（%）RSD
（%）基质效应
（%）RSD
（%）0.6 87.43±2.49 2.55 105.87±5.61 5.30 6 86.35±2.67 2.77 105.99±6.61 6.03 160 86.12±3.70 3.85 106.28±3.97 3.73 -
取空白血浆加入氟马西尼标准品溶液，配制成低（0.6 ng/ml）、中（6 ng/ml）、高（160 ng/ml）浓度的血浆样品，每个浓度平行6份，按“2.2.2”项下操作，分别考察其室温放置4 h、反复冻融3次以及−20 ℃放置30 d的稳定性，结果见表6。表明在上述条件下样品均稳定。
表 6 氟马西尼室温放置4 h、冻融及长期冻存稳定性（
$ \bar{x} $ ±s,n=6）放置条件 样品浓度（ρB/ng·ml−1） 回收率（%） RSD（%） 室温4 h 0.6 98.33±1.02 3.51 6 99.67±1.63 3.71 160 106.25±5.26 3.09 反复冻融3次 0.6 95.52±1.03 1.08 6 99.36±2.25 3.52 160 102.71±3.82 2.32 −20 ℃放置30 d 0.6 97.72±1.32 2.73 6 101.37±1.25 3.44 160 105.48±3.69 3.87 -
采用双周期双交叉实验设计方案。将12只比格犬随机分为2组，分别给予氟马西尼舌下片（0.2 mg）和注射剂（0.1 mg），清洗期为1周。给药前禁食12 h，自由饮水。于给药后10 min、20 min、30 min、45 min、1.0 h、1.25 h、1.5 h、1.75 h、2.0 h 、2.5 h、3.0 h、4.0 h、6.0 h、8.0 h由腿静脉取血2 ml，置于肝素钠采血管中，12 000 r/min离心10 min ，取上层血浆按“2.2.2”项下方法处理后测定。
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比格犬给予氟马西尼舌下片与氟马西尼注射液后，血药浓度-时间曲线如图4。用WinNonlin 7.0药动学软件对所测数据进行非房室模型分析，得到主要药动学参数见表7。
图 4 氟马西尼舌下和静注给药的血药浓度-时间曲线图（
$ \bar{x} $ ±s,n=12）表 7 氟马西尼舌下和静注给药的药动学参数（
$ \bar{x} $ ±s，n=12）观测参数 氟马西尼舌下片
（0.2 mg）氟马西尼注射剂
（0.1 mg）t1/2（t/h） 0.78±0.25 0.58±0.08 tmax （t/h） 0.58±0.24 0.18±0.05 Cmax ρB/（ng·ml−1） 6.36±2.14 10.96±2.62 AUClast （h·ng·ml−1） 8.86±2.83 8.41±2.15 MRTlast （t/h） 1.23±0.25 0.66±0.08 Vz （L/kg） 3.21±1.68 0.89±0.21 CL [L/（h·kg）] 2.83±1.02 1.09±0.25 F（%） 52.68 − 舌下片和注射剂的峰浓度分别为（10.96±2.62）和（6.36±2.14） ng/ml，两者达峰时间分别为（0.18±0.05）和（0.58±0.24） h ，AUClast分别为（8.41±2.15）和（8.86±2.83） h·ng·ml−1；根据数据拟合计算得到主要药动学参数，并计算出氟马西尼舌下片的绝对生物利用度，结果如表7。计算得出氟马西尼舌下片绝对生物利用度约为52.68 %。
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本课题首先制备了氟马西尼-羟丙基-β-环糊精包合物，实验表明，包合物能显著改善氟马西尼的溶解性能和溶出度，促进药物透膜吸收，在此基础上将包合物进一步制成氟马西尼舌下片。溶出度测定结果表明，舌下片在5 min时的累积溶出度已超过60%，15 min内可完全溶出。
实验建立了LC-MS法测定比格犬血浆中氟马西尼浓度，经过方法学验证，该方法适用于氟马西尼在比格犬体内的药动学研究。药动学实验结果表明，氟马西尼舌下片在比格犬体内的舌下黏膜吸收迅速， 30 min左右达峰值（Cmax=6.36 ng/ml）。氟马西尼舌下片绝对生物利用度为52.68 %，而根据既往研究报道，氟马西尼口服给药生物利用度仅为16%[11]，说明将氟马西尼与HP-β-CD包合后制备成舌下片给药能够显著提高其透舌下黏膜吸收以及生物利用度。另据文献报道[12]，静脉注射0.1～0.2 mg氟马西尼注射液可有效拮抗苯二氮䓬类药物镇静催眠作用，比较氟马西尼注射剂（0.1 mg）及氟马西尼舌下片（0.2 mg）药动学参数，二者AUClast值无显著性差异，且舌下片在达峰后血药浓度始终高于注射剂，表明氟马西尼舌下片可持续有效拮抗镇静催眠药物。
Preparation and pharmacokinetics of flumazenil sublingual tablet
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摘要:
目的 制备氟马西尼舌下片，对其在比格犬体内的药动学进行研究，评价其生物利用度。 方法 以羟丙基-β-环糊精为包合材料制备氟马西尼包合物，后压片制备氟马西尼舌下片。采用双周期交叉实验设计，将12只比格犬随机分成2组，分别给予氟马西尼舌下片和注射剂。建立LC-MS法测定血浆中氟马西尼含量，并进行方法学验证。利用WinNonlin 药动学软件计算药动学参数及生物利用度。 结果 采用羟丙基-β-环糊精包合后能有效提高氟马西尼溶出度，促进其舌下黏膜吸收。氟马西尼舌下片15 min内可完全溶出。药动学研究中，氟马西尼注射剂和舌下片AUClast分别为（8.41±2.15）和（8.86±2.83） h·ng·ml−1；Cmax分别为（10.96±2.62）和（6.36±2.14） ng/ml；tmax分别为（0.18±0.05）和（0.58±0.24） h。氟马西尼舌下片生物利用度为52.68 %。 结论 该研究利用包合物制备氟马西尼舌下片，达到安全、高效递送的目的。建立LC-MS法测定氟马西尼血药浓度，其优点在于操作简单、准确灵敏。 Abstract:Objective To prepare flumazenil sublingual tablets and study its bioavailability. Methods Flumazenil sublingual tablets were prepared by compressing flumazenil inclusion compound with hydroxypropyl-β-cyclodextrin as the inclusion material. In a double-cycle crossover trial, twelve beagle dogs were randomly divided into two groups, one group receiving flumazenil sublingual tablets and the other receiving flumazenil injections. LC-MS method was developed and validated to determine flumazenil plasma concentration. The pharmacokinetic parameters and bioavailability were calculated using WinNonlin pharmacokinetic software. Results In the pharmacokinetic study, AUClast of flumazenil injection and sublingual tablet was （8.41±2.15） and （8.86±2.83） h·ng·ml−1, respectively; Cmax was （10.96±2.62） and （6.36±2.14） ng/ml, respectively; tmax was （0.18±0.05） and （0.58±0.24） h, respectively. The bioavailability of flumazenil sublingual tablet was 52.68%. Conclusion Clathrates were used to prepare flumazenil sublingual tablets to achieve safe and efficient delivery. LC-MS method was established for the determination of flumazenil plasma concentration, and the advantages were simple, accurate and sensitive. -
Key words:
- flumazenil /
- sublingual tablet /
- beagles /
- pharmacokinetics
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骨质疏松症是一种全身性骨代谢疾病，其典型特征是骨密度下降、骨脆性增加和骨微环境被破坏[1]。骨稳态失衡是其发生的主要病理学基础。骨稳态是指成骨细胞行使的骨形成功能和破骨细胞行使的骨吸收功能处在一个相对平衡的过程[2]。破骨细胞分化及其功能的过度活化是导致骨稳态失衡的重要因素[3]。中国骨质疏松症流行病学调查显示，我国50岁以上人群骨质疏松发病率为19.2%，65岁以上人群发病率为32%[4]。目前临床上治疗骨质疏松症的药物主要是骨吸收抑制剂，其在抑制骨吸收的同时，也干扰骨形成进程。因而发掘更好的治疗骨质疏松的药物是迫切需要的。
骨髓来源的巨噬细胞(BMMs)向破骨细胞分化需要重组小鼠巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子κB受体活化因子配体(RANKL)的持续刺激[5]。M-CSF增加了早期BMMs的增殖，RANKL与受体RANK结合激活肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)，进而激活细胞凋亡信号调节激酶1(ASK1)和NF-κB抑制物激酶(IKKs)，活化的ASK1和IKKs磷酸化JNK、ERK和P38以及NF-κB特异性抑制因子IκB特定部位的丝氨酸，激活MAPK和NF-κB信号。活化的MAPK和NF-κB使c-Fos、NFATc1表达增加，促进DC-STAMP、ATP6V0d2、TRAP、CTSK等破骨细胞特异性基因的转录与表达，导致破骨细胞分化[6]。研究表明，减弱破骨细胞分化及功能，能够有效地治疗骨质疏松症[7]。
冬虫夏草是一味传统中药，有增强免疫、抗炎、抗氧化和延缓衰老等作用[8]。先前的研究表明，富含锶的冬虫夏草菌丝发酵液对去卵巢骨质疏松大鼠有良好的治疗效果，其机制是提高了血清中的雌二醇水平，但是该研究仅基于整体水平解释了冬虫夏草作用于骨质疏松症的机制，对冬虫夏草的菌种也未作鉴定，并且野生的冬虫夏草提取液在骨质疏松症中的作用也未见报道[9-11]。本研究旨在探讨冬虫夏草提取液(CSE)对去卵巢小鼠的治疗作用以及对破骨细胞分化和功能的影响，为CSE防治骨质疏松症提供实验依据。
1. 材料
1.1 动物
SPF级雌性C57BL/6小鼠（上海西普尔-必凯实验动物有限公司），12周龄24只，6周龄7只，体质量20～22 g，合格证号：SCXK（沪）2018-0006。本实验经江西中医药大学实验动物伦理委员会批准（批号JZLLSC2019-0194），且遵循中国伦理委员会指导原则。
1.2 试剂
α-MEM培养基（美国Hyclone，批号：SH30265.01）；胎牛血清（美国Gbico，批号：10099-141）；重组小鼠RANKL、M-CSF蛋白（美国R&D，批号：462-TEC-010、416-ML-010）；TRAP染色试剂盒（浙江卓腾生物公司）；RNAiso Plus、TB Green（日本Takara，批号：9109、RR420B）；p-JNK、JNK、p-ERK1/2、ERK1/2、p-P38、P38和GAPDH兔单克隆抗体（美国CST，批号：4668、9252、4370、4695、4511、8690、5174）；山羊抗兔IgG H&L (IRDye® 800CW)预吸附二抗（美国Abcam，批号：ab216773）；冬虫夏草（上海雷允上药业有限公司）；羟基磷灰石涂板/96孔板（美国Corning，批号：3989）；小鼠抗酒石酸酸性磷酸酶、骨钙素、骨碱性磷酸酶ELISA试剂盒（上海生工，批号：D721140、D721126、D721049）。
1.3 仪器
371型细胞培养箱（美国Thermo）；Cytation 5多功能酶标仪（美国Bio-Tek）；CFX96型实时荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad）；SA型近红外双色激光成像系统（美国odyssey）；TI-SR型倒置显微镜（日本Nikon）；RM2016型病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）；JB-P5型包埋机（武汉俊杰）。
2. 方法
2.1 CSE制备
冬虫夏草(Cordyceps sinensis)药材产地为青海玉树，购自上海雷允上药业有限公司，经海军军医大学黄宝康教授鉴定。提取详情见引文[12]。
2.2 BMMs分离与培养
选取6周龄C57BL/6小鼠，使用颈椎脱臼法处死，取双侧股骨和胫骨，使用PBS将骨髓从骨髓腔中冲出，收集PBS并离心，弃上清液，使用α-MEM培养基重悬，于T75培养瓶内（含10%血清，1%青霉素-链霉素溶液及30 ng/ml M-CSF完全培养基）培养3 d。使用PBS清洗去除未贴壁细胞，加入适量新鲜完全培养基，直至细胞数量达到5×106个[13]。
2.3 CCK-8法检测BMMs细胞活性
在96孔板中，BMMs以8×103个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.125、0.25、0.5、1、2、4 mg/ml CSE干预处理，培养48 h或96 h，加入CCK-8检测液，37 ℃孵育1 h后在波长480 nm处检测吸光度。
2.4 体外破骨细胞分化实验
在96孔板中，BMMs以6×103个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE干预处理，同时加入50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF，阴性对照组不加入RANKL；每2 d更换一次培养基，直至第5天对破骨细胞进行TRAP染色。
将同样密度的BMMs接种于96孔板，孵育过夜；记过夜后为第1天，分别于第1、3、5天加入1 mg/ml CSE干预处理，每2 d更换一次培养基至第7天（仅加药1次，之后更换培养基均不加CSE），进行TRAP染色[14]。
2.5 F-actin环染色和骨吸收实验
在96孔板中，BMMs以6×103个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE干预处理，同时加入50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF，每2 d更换一次培养基。第5天用鬼笔环肽和DAPI分别对F-actin环和细胞核进行染色。
骨吸收实验：BMMs以5×105个/孔的密度接种于6孔板，孵育过夜；加入含50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF完全培养基，每2 d换液，至第4天出现小的破骨样细胞，胰酶消化以8×103个/孔密度重新接种至羟基磷灰石涂板内，并且加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE处理。培养3 d后，用次氯酸钠洗去细胞，PBS清洗后晾干，于光学显微镜下拍照，统计每个孔的骨陷窝面积[15]。
2.6 q-PCR检测
在12孔板中，BMMs以5×104个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE干预处理，同时加入50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF，每2 d更换一次培养基至第5天。抽提RNA，逆转录后使用q-PCR检测DC-STAMP、ATP6V0d2、TRAP、CTSK、NFATc1基因的表达，引物序列详情见引文[16]。
2.7 蛋白印迹法检测
在6孔板中，BMMs以5×105个/孔的密度接种，孵育过夜；使用无血清的α-MEM培养基饥饿细胞1 h，实验组更换含1 mg/ml的CSE的完全培养基，对照组更换含相同体积PBS的完全培养基，孵育3 h；均使用50 ng/ml RANKL刺激5、10、20、30、60 min，未被刺激的细胞作为0 min。刺激完成后，抽提总蛋白。经SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、5%脱脂奶粉封闭1 h，4 ℃下一抗孵育过夜，室温下荧光素偶联的二抗孵育1 h，用odyssey成像系统扫膜，分析JNK(1∶2000)、p-JNK(1∶2000)、ERK(1∶2000)、p-ERK(1∶2000)、P38(1∶2000)、p-P38(1∶2000)的表达。
2.8 动物造模、分组及给药
在24只12周龄小鼠中随机挑选6只作为假手术组（Sham组），其余小鼠使用异氟烷气麻，去除背部毛发，切开皮肤和背膜，使卵巢暴露，切除双侧卵巢并使用可吸收缝合线结扎、缝合（假手术组仅切开背部皮肤和腹膜）[14]。术后1周，按照文献报道方法[17]，将卵巢切除小鼠随机分为3组：模型组（OVX组）、CSE低剂量组、CSE高剂量组，每组6只。术后7 d开始给药，由预实验确定给药浓度为312.5和625 mg/kg，按照每只200 μl/d连续灌胃给药6周。
2.9 HE染色和TRAP染色
小鼠处死后取双侧股骨，4%多聚甲醛固定后进行脱钙处理，之后常规脱水、石蜡包埋，切成4 μm切片，分别进行HE染色和TRAP染色。统计破骨细胞数量/骨表面积（N. Oc/BS）、破骨细胞面积/骨表面积（Oc. S/BS）和骨体积/组织体积（BV/TV）。
2.10 ELISA法检测血清生化指标
小鼠处死前统一摘除小鼠左眼取血，将全血收集并在4 ℃静置30 min，之后在4 ℃下2 000 r/min离心20 min，吸取上清液置于−80 ℃冰箱中保存。按照Elisa试剂盒《用户操作手册》检测血清中TRAP、ALP、BGP含量。
2.11 统计学方法
使用Image J统计破骨细胞面积和个数、F-actin环面积和环内核数、骨陷窝面积、蛋白条带灰度值、N. Oc/BS、Oc. S/BS和BV/TV。使用SPSS 21.0统计学软件对数据进行分析。计量资料用均数±标准差（
$\bar x $ ±s）表示，多组间比较使用方差分析，以P<0.05认为差异具有统计学意义。3. 结果
3.1 CSE对BMMs细胞活力的影响
CCK-8结果显示，与空白组比较，CSE浓度范围在0.125～4 mg/ml时，48 h内和96 h内CSE对BMMs无细胞毒性（图1）。据此结果选择0.5、1、2 mg/ml作为之后的细胞实验浓度。
3.2 CSE对RANKL诱导的破骨细胞分化的影响
TRAP染色显示，与空白组比较，RANKL组的BMMs分化为成熟的TRAP阳性多核巨噬细胞（有完整的圆形状细胞形态且细胞核数目≥3）。与RANKL组比较，CSE不同剂量组的TRAP阳性多核巨噬细胞数量明显减少，且呈剂量依赖的方式下降，并且破骨细胞的大小也被显著抑制（图2A-C）。结果表明CSE不仅抑制破骨细胞的分化也阻碍了破骨细胞前体细胞的融合。
图 2 CSE对破骨细胞分化的影响（n=3）A.破骨细胞图像（×40）；B.每孔TRAP阳性多核细胞（细胞核数≥3）面积百分比；C.每孔TRAP阳性多核细胞（细胞核数≥3）个数；D.不同时间段加入CSE处理后的破骨细胞图像（×40）；E.加药时间示意图；F.每孔TRAP阳性多核细胞（细胞核数≥3）个数**P<0.01，与RANKL组比较在RANKL持续刺激的BMMs中按时段加入CSE。染色结果显示，与空白组比较，0 d组的BMMs几乎全部分化为成熟的破骨细胞，数量多，且形状完整。与0 d组比较，给予CSE1～3 d组的BMMs分化为成熟破骨细胞的数量最少，3～5 d组其次，5～7 d组最多（图2D、2E、2F）。结果表明CSE对破骨细胞生成的任一阶段均有作用，在早期阶段作用最为明显。
3.3 CSE对RANKL诱导的破骨细胞F-actin环形成和骨吸收功能的影响
鬼笔环肽和DAPI染色显示，RANKL组的F-actin环形成完整，数量多且面积大，环内细胞核数量多。与RANKL组比较，CSE不同剂量组的F-actin环数量和大小均下降，环内细胞核数量也明显减少（图3A、3B、3C）。
图 3 CSE对破骨细胞F-actin环形成和骨吸收功能的影响（n=3）A.F-actin环和细胞核共聚焦图像（×100）；B.每孔内F-actin环面积百分比；C.单个F-actin环内细胞核个数；D.骨陷窝图像（×40）；E.每孔未吸收面积百分比**P<0.01，与RANKL组比较骨板吸收显示，RANKL组未被吸收面积为70%， 1 mg/ml CSE组未被吸收面积为85%，2 mg/ml CSE组为95%，与RANKL组比较，不同剂量的CSE均有效的减少了骨板吸收的面积（图3D、3E）。结果表明CSE显著抑制了成熟破骨细胞骨吸收的功能。
3.4 CSE对RANKL诱导的破骨细胞特异性基因表达的影响
q-PCR结果显示，与RANKL组比较，CSE中、高剂量组显著性地抑制了破骨细胞特异性基因TRAP、CTSK、ATP6V0d2、DC-STAMP和NFATc1的表达，且呈剂量依赖性（图4）。这与CSE抑制破骨细胞分化及功能的结果相一致。
图 4 CSE对破骨细胞特异性基因表达的影响（n=3）A.TRAP；B.CTSK; C.ATP6V0d2; D.DC-STAMP; E.NFATc1*P<0.05，**P<0.01，与RANKL组比较3.5 CSE对破骨细胞分化过程中MAPK通路的影响
Wsetern-blot结果显示，RANKL组各时间段JNK、ERK和P38蛋白磷酸化显著。与RANKL组比较， CSE组p-JNK蛋白表达在第10～30 min明显下降，p-ERK蛋白表达在第20～60 min明显下降和p-P38蛋白表达在第10～60 min明显下降，见图5。结果表明在破骨细胞的分化过程中，CSE作用于MAPK通路JNK、ERK和P38的磷酸化。
3.6 CSE对卵巢切除小鼠的影响
HE和TRAP染色显示，与假手术组比较，OVX组小鼠的骨小梁数目和面积明显减少（BV/TV值下降）且间距变大，骨小梁表面破骨细胞数量增多、面积变大（N. Oc/BS、Oc. S/BS值上升）。与OVX组比较，CSE低剂量和高剂量组小鼠的骨小梁数目和面积均增加（BV/TV值上升）且间距减小，骨小梁表面破骨细胞数量减少、面积变小（N. Oc/BS、Oc. S/BS值下降），见图6。结果表明，CSE可以增加卵巢切除小鼠骨小梁数目，抑制破骨细胞活性，缓解骨量流失。
图 6 CSE对去卵巢小鼠股骨破骨细胞数量和骨小梁的影响（n=6）A.HE染色和TRAP染色；B.BV/TV；C.Oc. S/BS；D.N. Oc/BS；**P<0.01，与OVX组比较；##P<0.01，与假手术组比较3.7 CSE对TRAP、ALP、BGP含量的影响
ELISA结果显示，与假手术组比较，OVX组小鼠血清中的TRAP含量明显增加，BGP含量明显减少，ALP含量无明显变化；CSE高剂量组小鼠血清中的TRAP、BGP含量无明显变化， ALP含量明显增加。与OVX组比较，CSE低剂量和高剂量组小鼠血清中的ALP、BGP含量明显增加，TRAP含量明显减少（图7）。结果表明，CSE可以调节骨代谢相关指标，具有平衡骨稳态作用。
图 7 CSE对TRAP、ALP和BGP含量的影响（n=6）A.TRAP；B.ALP；C.BGP；*P＜0.05，**P<0.01，与OVX组比较；##P<0.01，与假手术组比较4. 讨论
骨质疏松症是一种与年龄相关的骨代谢疾病，骨重建失衡是其发生的主要原因，因绝经造成的骨质疏松占骨质疏松症的绝大部分。研究表明，雌激素对骨骼的生长、发育和维持至关重要，因雌激素缺失致使RANKL介导的信号通路过度活化，进而使破骨细胞功能异常，是绝经后骨质疏松症主要原因[18]。因而抑制破骨细胞的分化及其功能是治疗骨质疏松的有效途径[19]。在本研究中，我们发现CSE通过抑制MAPK信号通路的激活来抑制RANKL介导的破骨细胞生成，同时对OVX小鼠的骨质流失具有良好的保护作用。
研究表明，在RANKL的刺激下，BMMs中的MAPK通路被激活，进而刺激破骨细胞特异性基因的表达，促进BMMs分化为破骨细胞[19-21]。NFATc1和DC-STAMP是破骨细胞分化和前体破骨细胞融合的主要调控者，TRAP、CTSK、ATP6V0d2是反映破骨细胞活性和骨吸收状态的特异性指标[22-23]。本研究表明，CSE显著抑制RANKL介导的破骨细胞分化，而且在破骨细胞分化的早期阶段作用最为明显。其机制是抑制JNK、ERK和P38的激活，进而抑制破骨细胞特异性基因的表达。
F-actin环是分化成熟的破骨细胞在骨面上极化，使骨架重排，F-actin紧密排列形成的一个环，是破骨细胞进行骨吸收的先决条件。因而阻碍破骨细胞前体细胞的融合，能够有效抑制F-actin环的形成和骨吸收功能[24]。本研究发现CSE显著性地抑制F-actin环的形成，并降低了环内细胞核数以及骨陷窝面积，这表明CSE阻碍了破骨细胞前体细胞的融合和骨吸收功能，与CSE抑制破骨细胞分化及其特异性基因表达的结果相一致。
我们构建了去卵巢小鼠模型模拟绝经后的骨质疏松症，经CSE灌胃给药6周后，采用HE和TRAP染色对小鼠股骨进行骨组织形态学分析以及ELISA检测血清中ALP、TRAP、BGP含量。TRAP是酸性磷酸酶的同工酶，其血清浓度可反映破骨细胞的活性[25]。ALP是一种磷酸单酯酶，由成骨细胞分泌，能有效地反映成骨细胞的活性[27]。BGP由成骨细胞合成及分泌，绝大部分的BGP随成骨细胞矿化在骨基质中沉积，仅有一小部分进入到血液循环[14]。血液中的BGP是成骨细胞分泌完成后直接进入血液，并非是破骨细胞降解骨基质而进入血液，因而检测血液中的BGP含量，对评判机体经药物治疗后变化有较大的参考价值。结果显示，CSE能有效缓解骨量丢失，表现在CSE各剂量组小鼠的骨小梁数量增多，间距减少，以及骨表面破骨细胞数量和面积减少，表明了CSE对去卵巢小鼠的骨量流失具有良好的保护作用。同时CSE提高了血清中ALP含量，使BGP和TRAP含量回归正常水平，说明其可抑制破骨细胞分化，减弱骨吸收功能，具有缓解骨量流失和调节骨代谢作用。
总之，本研究发现CSE在体外抑制了RANKL诱导的破骨细胞分化及其骨吸收功能，其可能机制部分归因于CSE抑制了级联信号中ERK、JNK和P38的激活，在体内有效的缓解了因卵巢切除造成的骨量丢失，这为CSE防治骨质疏松症提供了初步的药理学证据。
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图 3 氟马西尼及内标物甲苯磺丁脲专属性图谱
A. 比格犬空白血浆色谱图；B. 含内标的比格犬血浆色谱图；C. 含氟马西尼的比格犬血浆色谱图；D. 给药后比格犬血浆样品色谱图；左图: 内标甲苯磺丁脲；右图: 氟马西尼
表 1 氟马西尼日内、日间精密度与准确度（
$ \bar{x} $ ±s,n=6）样品浓度 （ρB/µg·ml−1） 日内 日间 实测浓度 （ρB/µg·ml−1） 准确度（%） 精密度RSD（%） 实测浓度 （ρB/µg·ml−1） 准确度（%） 精密度RSD（%） 6.25 6.27±0.12 100.32 1.91 6.32±0.05 101.12 0.84 25 25.19±0.46 100.76 1.85 25.26±0.34 101.04 1.36 100 99.85±0.39 99.85 0.39 99.74±1.28 99.74 1.28 
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表 2 氟马西尼舌下片的溶出度检查结果（
$ \bar{x} $ ±s,n=6）批号 溶出度（%） 5 min 15 min 30 min 60 min 20220615-1 60.14±0.98 95.89±0.62 98.29±1.36 98.86±0.43 20220615-2 63.23±1.91 96.18±2.50 98.76±1.32 98.31±1.52 20220615-3 66.74±1.92 97.56±1.07 97.45±1.26 97.89±1.39
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表 3 质谱条件
检测物 母离子 子离子 去簇电压
（U/V）碰撞室出口
电压（U/V）碰撞能量
（U/V）氟马西尼 304.2 257.9 140 15 25 甲苯磺丁脲 271.0 74.2 70 15 22
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表 4 氟马西尼日内、日间精密度与准确度（
$ \bar{x} $ ±s,n=6）样品浓度
（ρB/ng·ml−1）日内 日间 实测浓度
（ρB/ng·ml−1）准确度
（%）精密度
RSD(%)实测浓度
（ρB/ng·ml−1）准确度
（%）精密度
RSD(%)0.6 0.60±0.02 95.35 3.09 0.59±0.03 96.70 9.99 6 6.10±0.23 101.72 3.85 6.25±0.28 104.20 4.42 160 167.76±4.31 104.85 2.57 167.76±5.66 104.85 3.38
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表 5 提取回收率及基质效应（
$ \bar{x} $ ±s,n=6）氟马西尼样品浓度
（ρB/ng·ml−1）提取回收率
（%）RSD
（%）基质效应
（%）RSD
（%）0.6 87.43±2.49 2.55 105.87±5.61 5.30 6 86.35±2.67 2.77 105.99±6.61 6.03 160 86.12±3.70 3.85 106.28±3.97 3.73
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表 6 氟马西尼室温放置4 h、冻融及长期冻存稳定性（
$ \bar{x} $ ±s,n=6）放置条件 样品浓度（ρB/ng·ml−1） 回收率（%） RSD（%） 室温4 h 0.6 98.33±1.02 3.51 6 99.67±1.63 3.71 160 106.25±5.26 3.09 反复冻融3次 0.6 95.52±1.03 1.08 6 99.36±2.25 3.52 160 102.71±3.82 2.32 −20 ℃放置30 d 0.6 97.72±1.32 2.73 6 101.37±1.25 3.44 160 105.48±3.69 3.87
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表 7 氟马西尼舌下和静注给药的药动学参数（
$ \bar{x} $ ±s，n=12）观测参数 氟马西尼舌下片
（0.2 mg）氟马西尼注射剂
（0.1 mg）t1/2（t/h） 0.78±0.25 0.58±0.08 tmax （t/h） 0.58±0.24 0.18±0.05 Cmax ρB/（ng·ml−1） 6.36±2.14 10.96±2.62 AUClast （h·ng·ml−1） 8.86±2.83 8.41±2.15 MRTlast （t/h） 1.23±0.25 0.66±0.08 Vz （L/kg） 3.21±1.68 0.89±0.21 CL [L/（h·kg）] 2.83±1.02 1.09±0.25 F（%） 52.68 −
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[1] CHEN X, SANG N E, SONG K C, et al. Psychomotor recovery following remimazolam-induced sedation and the effectiveness of flumazenil as an antidote[J]. Clin Ther, 2020, 42(4):614-624. doi: 10.1016/j.clinthera.2020.02.006 [2] KIM J J, GHARPURE A, TENG J F, et al. Shared structural mechanisms of general anaesthetics and benzodiazepines[J]. Nature, 2020, 585(7824):303-308. doi: 10.1038/s41586-020-2654-5 [3] CIMOLAI N. Zopiclone overdose and flumazenil rescue[J]. Can Med Assoc J, 2017, 189(16):E613. doi: 10.1503/cmaj.732933 [4] BENINI A, GOTTARDO R, CHIAMULERA C, et al. Continuous infusion of flumazenil in the management of benzodiazepines detoxification[J]. Front Psychiatry, 2021, 12:646038. doi: 10.3389/fpsyt.2021.646038 [5] BAILEY A M, BAUM R A, HORN K, et al. Review of intranasally administered medications for use in the emergency department[J]. J Emerg Med, 2017, 53(1):38-48. doi: 10.1016/j.jemermed.2017.01.020 [6] CORRIGAN M, WILSON S S, HAMPTON J. Safety and efficacy of intranasally administered medications in the emergency department and prehospital settings[J]. Am J Health Syst Pharm, 2015, 72(18):1544-1554. doi: 10.2146/ajhp140630 [7] TROTTI L M, SAINI P, KOOLA C, et al. Flumazenil for the treatment of refractory hypersomnolence: clinical experience with 153 patients[J]. J Clin Sleep Med, 2016, 12(10):1389-1394. doi: 10.5664/jcsm.6196 [8] KATZ N, PILLAR G, PELED E, et al. Sublingual flumazenil for the residual effects of hypnotics: zolpidem and brotizolam[J]. Clin Pharmacol Drug Dev, 2012, 1(2):45-51. doi: 10.1177/2160763X12437201 [9] KASTELEIJN-NOLST TRENITÉ D G A, GROENWOLD R H H, SCHMIDT B, et al. Single dose efficacy evaluation of two partial benzodiazepine receptor agonists in photosensitive epilepsy patients: a placebo-controlled pilot study[J]. Epilepsy Res, 2016, 122:30-36. doi: 10.1016/j.eplepsyres.2016.02.003 [10] HARET D. Rectal Flumazenil can save the day[J]. Pediatr Anesth, 2008, 18(4):352. [11] ROUSSEAU-BLASS F, CRIBB A E, BEAUDRY F, et al. A pharmacokinetic-pharmacodynamic study of intravenous midazo-lam and flumazenil in adult New Zealand white-californian rabbits ( Oryctolagus cuniculus)[J]. J Am Assoc Lab Anim Sci, 2021, 60(3):319-328. doi: 10.30802/AALAS-JAALAS-20-000084 [12] SCHULT R F, OMAR D, WIEGAND T J, et al. Experience with lower dose flumazenil at an academic medical center[J]. Am J Emerg Med, 2021, 49:399-401. doi: 10.1016/j.ajem.2021.02.002 期刊类型引用(1)
1. 王楠. 小剂量口服避孕药对妇女血凝的影响研究. 实用妇科内分泌电子杂志. 2023(23): 82-84 . 
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